CN104391061A

CN104391061A - 免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法

Info

Publication number: CN104391061A
Application number: CN201410603308.5A
Authority: CN
Inventors: 张小军; 王莹; 伦丽丽
Original assignee: MEIZHENG BIO-TECH Co Ltd; Zhejiang Marine Fisheries Research Institute
Current assignee: MEIZHENG BIO-TECH Co Ltd; Zhejiang Marine Fisheries Research Institute
Priority date: 2014-10-31
Filing date: 2014-10-31
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2034-10-31
Also published as: CN104391061B

Abstract

本发明公开了一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法，其基于液相色谱串联质谱的高灵敏性和精确性，利用免疫亲和柱的独特选择识别性，能快速、简便、高效测定海洋生物中的河豚毒素。

Description

免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法

技术领域

本发明涉及一种河豚毒素的检测方法，特别涉及一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法。

背景技术

河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一种天然海洋生物神经毒素，分布广泛，主要存在于河豚鱼中，圆尾鲎、蓝环章鱼、螺类等其他动物体内也有存在。河豚毒素毒性极强，食用0.5mg就可致人死亡，其带正电荷的胍基能伸入钠通道的离子选择过滤器，和通道内壁上的游离羧基结合，阻碍钠离子进入，从而抑制神经冲动的传导，使人感觉神经麻痹，四肢瘫痪，呼吸困难，最后因呼吸抑制而死亡。我国每年都有因食带有TTX的海洋生物而导致中毒的事件发生。鉴于河豚毒素的严重危害，有必要建立一种简便、能有效检测河豚毒素的方法。

目前，河豚毒素的检测方法有生物测定法、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱串联质谱法(LC-MS)及酶联免疫法(ELISA)等。其中生物测定法一般需要专门动物，适用性差，且操作繁琐，费时费力重复性差；酶联免疫法虽特异性强，但酶联免疫反应耗时长，操作难度较大；液相色谱串联质谱法灵敏度高，但现有的文献方法检出限偏高，前处理复杂，且采用的固相萃取技术净化样品不理想、易受基质干扰，回收率低。免疫亲和柱(IAC)是一种基于抗原抗体反应的新型层析柱，利用生物大分子具有对一类生物大分子特异识别和可逆结合的特性制作而成，具有独特的选择专一性和良好的吸附净化性能。目前，尚未有以免疫亲和柱作为前处理净化手段检测河豚毒素的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法，其基于液相色谱串联质谱的高灵敏性和精确性，利用免疫亲和柱的独特选择识别性，能快速、简便、高效测定海洋生物中的河豚毒素。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法，包括以下步骤：

(1)样品处理：准确称取已充分均质样品2.00g于50mL具塞离心管中，加入10mL含有1％乙酸的甲醇溶液，涡旋振荡2min，60℃水浴超声提取15min，冷却至室温后，6000r/min离心5min，移取5mL上清液至另一50mL离心管中，加入20ml PBS溶液进行稀释，用1mol/L氢氧化钠溶液调节PH至7～8，得样品液；

(2)免疫亲和柱净化：免疫亲和柱上样品液，上样结束后，用水淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用含有1％乙酸的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液于60℃氮气吹干，用1mL流动相定容溶解得净化液；

(3)液相色谱-质谱分析：净化液经滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱仪测定获得河豚毒素的峰面积，将峰面积代入标准曲线分析计算，从而获得样品中河豚毒素的含量。

本发明开发了独特的样品处理工艺及制备了对TTX独特选择识别性的免疫亲和柱，配合优化的液相色谱-质谱分析方法，能快速、简便、高效测定海洋生物中的河豚毒素

作为优选，步骤(2)中流动相配比为：含0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液：乙腈＝5％:95％。

作为优选，步骤(3)中色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide柱；样品室温度10℃；柱温40℃；进样体积10μL；流速0.3mL/min；流动相A为含0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈，梯度洗脱：0～1.5min，5％～80％A；1.5～3.0min，80％A；3.0～3.5min，80％～5％A；3.5～5min，5％A。

作为优选，步骤(3)中质谱条件为：电喷雾离子源，正离子扫描；检测方式：多反应监测；毛细管电压：3.0kV；离子源温度：110℃；脱溶剂气温度：350℃；锥孔气流量：50L/h；脱溶剂气流量：600L/h。

作为优选，步骤(3)中标准曲线的制作方法为：配制浓度为0.3μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L和20.0μg/L的标准工作溶液，以TTX浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

作为优选，所述免疫亲和柱的制备方法为：

A、抗原合成

免疫原的合成：

在小烧瓶中依次加入10mg的BSA，2mL 0.05M pH7.4乙酸钠缓冲液，1mg的TTX，60μL的37％(质量浓度)的甲醛，混匀，37℃搅拌48h。然后用0.1M pH7.3的PBS缓冲液，于4℃透析3天，每天换液2次，免疫原TTX-BSA；此抗原用作免疫。

检测原的合成：

用OVA替代BSA，按照免疫原的合成方法合成检测原TTX-OVA，用于ELISA实验的包被。

B、单克隆抗体制备及纯化

取5只，6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，背部皮下多点注射TTX-BSA，20μg/只，免疫4周后开始加强免疫，每隔2周加强免疫1次；初次免疫时，用TTX-BSA与等体积弗氏完全佐剂乳化，加强免疫时用TTX-BSA与等体积弗氏不完全佐剂乳化，免疫剂量、免疫方式不变；

第2次加强免疫10天后，取小鼠尾静脉血检测，包被TTX-OVA，用间接竞争ELISA法检测血清的效价，选择效价最高的BALB/c小鼠用于制备杂交瘤细胞，融合前3天小鼠腹腔加强免疫一次，取效价最高的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合，筛选获得杂交瘤细胞；

BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡致敏，8天后向小鼠腹腔内注射1×10⁷个杂交瘤细胞，10天后开始用注射器从小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔1天抽取腹水1次，离心，收集上清液，采用饱和硫酸铵法纯化上清液，再用ProteinG亲和层析法进一步纯化获得TTX单克隆抗体；

C、亲和柱制备

称取0.5g CNBr活化的Sepharose 4B干粉用100mL 1M HCl溶胀，并洗涤；再用100mL偶联缓冲液(0.1mol·L^-1NaHCO₃，0.5mol·L^-1NaCl,pH8.3)洗涤得凝胶；

取1.5mL溶胀后的凝胶，加入1.5mL 10mg/mL的TTX单克隆抗体，室温振荡偶联反应2h，抽滤，并用30mL偶联缓冲液洗涤凝胶，抽滤，加入10mL封闭缓冲液(0.1mol·L-1Tris-HCl，pH 8.0)，室温振荡反应2h，抽滤，再用100mLPBS(0.01M pH7.3)缓冲液洗涤凝胶，并转移到5mL柱管中，加入含有0.05％硫柳汞及0.05％BSA的0.01M pH7.3PBS溶液，于2～8℃储存。

作为优选，偶联缓冲液组成为：0.1mol/L NaHCO₃，0.5mol/L NaCl，pH8.3。

作为优选，封闭缓冲液为0.1mol/L的Tris-HCl，pH 8.0。

本发明的有益效果是：本发明基于液相色谱串联质谱的高灵敏性和精确性，利用免疫亲和柱的独特选择识别性，能快速、简便、高效测定海洋生物中的河豚毒素。

附图说明

图1是TTX一级质谱全扫描图。

图2是提取试剂酸度对TTX提取效果的影响。

图3是样品液PH对样品中TTX的回收率的影响。

图4是10μg/kg加标阴性样品经免疫亲和柱净化后的MRM图谱。

图5是0.3μg/mL的TTX标准溶液的MRM图。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

仪器和试剂

ACQUITY超高效液相色谱-串联质谱仪Quattro Premier XE(美国Waters公司)；MS2漩涡混合器(德国IKA公司)；氮气吹干仪(美国Organomatio公司)；Centrifuge5810高速离心机(德国Eppendorf公司)；12通道固相萃取装置(美国supelco公司)。

TTX标准品(纯度≥98.0％，德国Dr.Ehrenstorfer公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，德国Merck公司)；乙酸铵、甲酸(美国Sigma公司)；乙酸、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、氢氧化钠(上海国药集团)；实验用水均为超纯水。

溶液的配制

(1)TTX标准溶液：准确称取5,00mgTTX标准品，用含有0.1％甲酸乙腈-水溶液(1：1(V/V))溶解定容至50mL，4℃避光保存，保存期限为6个月；使用时逐级用含有0.1％甲酸乙腈-水溶液(1：1(V/V))稀释至100ng/mL。

(2)磷酸盐缓冲液(PBS)：分别称取十二水合磷酸氢二钠6.45g，二水合磷酸二氢钠1.09g，氯化钠4.25g，用水溶解并定容至500mL。

实施例：

(1)样品处理：准确称取已充分均质样品2.00g于50mL具塞离心管中，加入10mL含有1％乙酸的甲醇溶液，涡旋振荡2min，60℃水浴超声提取15min，冷却至室温后，6000r/min离心5min，移取5mL上清液至另一50mL离心管中，加入20ml PBS溶液进行稀释，用1mol/L氢氧化钠溶液调节PH至7～8，得样品液。

(2)免疫亲和柱净化：免疫亲和柱上样品液，上样结束后，用水淋洗亲和柱，挤干柱内残留液，并弃去以上全部流出液，最后用含有1％乙酸的甲醇溶液洗脱，收集的洗脱液于60℃氮气吹干，用1mL流动相(含0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液：乙腈＝5％:95％)定容溶解得净化液。

免疫亲和柱的制备方法为：

A、抗原合成

免疫原的合成：

检测原的合成：

B、单克隆抗体制备及纯化

取5只，6～8周龄的雌性Balb/c小鼠，背部皮下多点注射TTX-BSA，20μg/只，免疫4周后开始加强免疫，每隔2周加强免疫1次；初次免疫时，用TTX-BSA与等体积弗氏完全佐剂乳化，加强免疫时用TTX-BSA与等体积弗氏不完全佐剂乳化，免疫剂量、免疫方式不变。

第2次加强免疫10天后，取小鼠尾静脉血检测，包被TTX-OVA，用间接竞争ELISA法检测血清的效价，选择效价最高的BALB/c小鼠用于制备杂交瘤细胞，融合前3天小鼠腹腔加强免疫一次，取效价最高的BALB/c小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合，筛选获得杂交瘤细胞(现有常规方法)。

BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL液体石蜡致敏，8天后向小鼠腹腔内注射1×10⁷个杂交瘤细胞，10天后开始用注射器从小鼠腹腔抽取腹水，之后每隔1天抽取腹水1次，离心，收集上清液，采用饱和硫酸铵法纯化上清液，再用ProteinG亲和层析法进一步纯化获得TTX单克隆抗体。

C、亲和柱制备

称取0.5g CNBr活化的Sepharose 4B干粉(市售)用100mL 1M HCl溶胀，并洗涤；再用100mL偶联缓冲液(0.1mol·L^-1NaHCO₃，0.5mol·L^-1NaCl,pH8.3)洗涤得凝胶(已溶胀)。

取1.5mL溶胀后的凝胶，加入1.5mL 10mg/mL的TTX单克隆抗体，室温振荡偶联反应2h，抽滤，并用30mL偶联缓冲液洗涤凝胶，抽滤，加入10mL封闭缓冲液(0.1mol·L-1Tris-HCl，pH 8.0)，室温振荡反应2h，抽滤，再用100mLPBS(0.01M pH7.3)缓冲液洗涤凝胶，并转移到5mL柱管中，加入含有0.05％硫柳汞及0.05％BSA的0.01MpH7.3PBS溶液，于2～8℃储存。

(3)液相色谱-质谱分析：

色谱条件为：色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide柱；样品室温度10℃；柱温40℃；进样体积10μL；流速0.3mL/min；流动相A为含0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈，梯度洗脱：0～1.5min，5％～80％A；1.5～3.0min，80％A；3.0～3.5min，80％～5％A；3.5～5min，5％A。

质谱条件为：电喷雾离子源，正离子扫描；检测方式：多反应监测；毛细管电压：3.0kV；离子源温度：110℃；脱溶剂气温度：350℃；锥孔气流量：50L/h；脱溶剂气流量：600L/h。

锥孔电压、碰撞能量、分析物母离子及子离子等质谱多反应监测实验条件如表1所示。

表1 河豚毒素的质谱多反应监测实验条件

“*”为定量离子(Quantitative ion)。

净化液经滤膜过滤后供液相色谱-串联质谱仪测定获得河豚毒素的峰面积，将峰面积代入标准曲线分析计算，从而获得样品中河豚毒素的含量。

1、色谱和质谱条件选择

TTX由于亲水性和极性较强，在一般的反向色谱柱上不易保留，而ACQUITY UPLCBEH Amide色谱柱作为专用于强极性化合物分析的亲水色谱柱，对TTX保留性强，且较好的色谱峰形，完全满足TTX液相色谱分析的需要。TTX分子结构中具有带正电荷的胍基，乙酸铵溶液能促进胍电离，并为阳离子的形成提供了质子来源，提高TTX离子化效率；甲酸能通过调节流动相PH达到合适的分离效果，改善色谱峰形。本发明研究比较了多组不同体积分数甲酸及不同浓度乙酸铵溶液对色谱分析的影响。结果表明，以0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液与乙腈为流动相具有良好的色谱分离效果，且峰形尖锐对称。

由于TTX分子结构中具有带正电荷的胍基，本发明选择在正离子扫描模式下用蠕动泵以3.0μg/mL的TTX标准溶液进行流动注射分析，对质谱参数进行优化。通过一级质谱扫描分析，得到TTX的分子离子，调试选择最佳锥孔电压和毛细管电压，其中[M+H]⁺(m/z 320)丰度最高，从而可选择离子m/z 320进行检测，如图1所示。对分析物离子进行二级质谱分析，获取碎片离子信息，并对碰撞能量等质谱参数进行优化，见表1。

2、提取试剂的选择

TTX是一种氨基全氢喹唑啉型化合物，只溶于酸性水或醇溶液。考虑到甲醇作为常用的提取试剂，能迅速穿透组织，沉淀蛋白质，并具脱水性，本发明选择甲醇作为提取试剂。为考察TTX提取所需的合适酸度，通过添加不同体积分数的乙酸获取不同酸度的提取试剂，比较各酸度下提取试剂对5μg/kg阴性加标样品的提取效率，结果如图2所示。当提取试剂中乙酸体积分数小于1％时，提取得到的峰面积随乙酸的体积分数增大而增大；当体积分数大于1％后，峰面积基本保持不变，而且过量的乙酸不利于调节样品液PH，因此选择含1％乙酸甲醇作为TTX提取试剂。

3、免疫亲和柱条件优化

免疫亲和柱的亲和结合作用与上样液的PH直接相关，不适宜的PH会使亲和作用减弱或破坏。本发明采用盐酸和氢氧化钠调节样品液PH，通过比较不同PH下TTX的回收率，考察不同PH下免疫亲和柱的亲和作用能力，结果如图3所示。当PH在7～8时，亲和作用能力最佳，TTX回收率最高；当PH小于6.5或大于9时，亲和能力明显减弱，由此确定PH在7～8时为TTX免疫亲和柱的最适宜PH。当使用8mL水淋洗亲和柱时，杂质可基本除去，而TTX未被洗脱下来；当4mL含有1％乙酸甲醇洗脱亲和柱时，TTX几乎已完全洗脱，回收率也趋于稳定。因此本发明采用8mL水作为淋洗液，4mL含有1％乙酸甲醇作为洗脱液。海洋生物样品经免疫亲和柱的净化后，目标峰能与杂峰有效分离，且响应强度高，回收率好，如图4所示。

4、线性范围和定量限

用TTX标准使用液配制浓度为0.3、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0μg/L标准工作溶液，以TTX浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。其线性回归方程：y＝72.2835x+13.5344(r²＝0.9972)，TTX在0.3～20.0μg/L内线性良好。以3倍信噪比确定本方法的检出限(LOD)为0.1μg/kg，以10倍信噪比确定本方法的定量限(LOQ)为0.3μg/kg，如图5所示。较现有相关文献(刘希、金玉娥、戴月等采用相关分析方法测定TTX的检出限为7.6～30μg/kg)，本方法检出限更低，灵敏度更高，更适宜海洋生物体中TTX的测定。

5、回收率和精密度

准确称取2.00g阴性对虾样品，添加水平为0.30、1.50、5.00μg/kg的TTX标准溶液，每个添加水平平行测定6次，计算回收率和精密度，结果见表2。TTX在0.30～5.00μg/kg添加水平的平均回收率88.7％～102.3％，相对标准偏差为1.99％～6.36％。

表2 TTX的平均回收率和相对标准偏差(n＝6)

6、实际样品分析

采用本方法对鹰爪虾、对虾、海鳗、荔枝螺、单齿螺、织纹螺、枪乌贼、曼氏无针乌贼、贻贝、花蛤、三疣梭子蟹、细点圆趾蟹、圆尾鲎等共计13种样品进行检测，在织纹螺、花蛤、圆尾鲎样品中检出TTX，浓度依次为56.4μg/kg、2.43μg/kg和174μg/kg。分析结果表明，本方法采用免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱法检测海洋生物中河豚毒素，灵敏度高，精密度和回收率均能满足检测分析的要求。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims

1.一种免疫亲和柱净化-液相色谱-串联质谱测定海洋生物中河豚毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中流动相配比为：含0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液：乙腈＝5％:95％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中色谱条件为：色谱柱：ACQUITYUPLC BEH Amide柱；样品室温度10℃；柱温40℃；进样体积10μL；流速0.3mL/min；流动相A为含0.1％甲酸的5mmol/L乙酸铵溶液，B为乙腈，梯度洗脱：0～1.5min，5％～80％A；1.5～3.0min，80％A；3.0～3.5min，80％～5％A；3.5～5min，5％A。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中质谱条件为：电喷雾离子源，正离子扫描；检测方式：多反应监测；毛细管电压：3.0kV；离子源温度：110℃；脱溶剂气温度：350℃；锥孔气流量：50L/h；脱溶剂气流量：600L/h。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于：步骤(3)中标准曲线的制作方法为：配制浓度为0.3μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L、10.0μg/L和20.0μg/L的标准工作溶液，以TTX浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述免疫亲和柱的制备方法为：

A、抗原合成

免疫原的合成：

在小烧瓶中依次加入10mg的BSA，2mL 0.05M pH7.4乙酸钠缓冲液，1mg的TTX，60μL的37％的甲醛，混匀，37℃搅拌48h，然后用0.1M pH7.3的PBS缓冲液，于4℃透析3天，每天换液2次，免疫原TTX-BSA；

检测原的合成：

用OVA替代BSA，按照免疫原的合成方法合成检测原TTX-OVA；

B、单克隆抗体制备及纯化

C、亲和柱制备

称取0.5g CNBr活化的Sepharose 4B干粉用100mL 1M HCl溶胀，并洗涤；再用100mL偶联缓冲液洗涤得凝胶；

取1.5mL溶胀后的凝胶，加入1.5mL 10mg/mL的TTX单克隆抗体，室温振荡偶联反应2h，抽滤，并用30mL偶联缓冲液洗涤凝胶，抽滤，加入10mL封闭缓冲液，室温振荡反应2h，抽滤，再用100mLPBS缓冲液洗涤凝胶，并转移到5mL柱管中，加入含有0.05％硫柳汞及0.05％BSA的0.01M pH7.3PBS溶液，于2～8℃储存。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：偶联缓冲液组成为：0.1mol/L NaHCO₃，0.5mol/L NaCl，pH8.3。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：封闭缓冲液为0.1mol/L的Tris-HCl，pH8.0。