CN107655984A - 一种禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于禽肉药物残留检测技术领域，提供了一种禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法，包括以下步骤：A、配制标准储备液；B、样液提取；C、样液衍生化、萃取处理；D、固相萃取净化；E、将步骤D中得到的样液进行液相色谱分析，分析条件如下：色谱柱：CN柱，250mm×4.6mm，5μm；流动相：乙腈+异丙醇+冰乙酸+0.05％庚烷磺酸钠溶液，体积比为10：10：0.1：80；流速：1.0mL/min；检测波长：280nm；柱温：30℃；F、用标准曲线计算待测物质浓度。本发明从色谱分析条件的检测波长、色谱柱、流动相等五个方面通过试验对比，得出优化测定方案，检出限达到5.0ng/mL且加标回收效果理想。

Description

一种禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法
技术领域
本发明涉及禽肉药物残留检测技术领域，尤其涉及一种禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法。
背景技术
硝基呋喃类药物是人工合成的具有5-硝基基本结构的广谱抗菌药物，因其具有广谱抗菌作用和促生长作用曾广泛应用于畜禽和水产品等养殖行业中疾病的预防和治疗，它主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因等4种。其中呋喃唑酮和呋喃它酮价格便宜，疗效确切，广泛应用于家畜、家禽的痢疾、肠炎的预防和治疗。呋喃西林主要用于家禽白痢疾和兔球虫病的预防和治疗，但由于毒性较大，一般用作外用消毒药物。呋喃妥因主要用于水产养殖中疾病的预防和治疗。
经过长期研究表明硝基呋喃类药物及其代谢物具有很大的危害，主要具有潜在致癌和诱导有机体产生突变的物质。呋喃类药物的半衰期很短，在动物体内数小时内可降解，但其代谢产物能与蛋白质紧密结合，形成稳定的残留物，残留时间达数周之久，甚至在蒸煮、烘烤、蜜碎和微波加热过程中也无法有效降解。因此检测硝基呋喃类药物的代谢产物，才能起到较好的监控作用。欧盟2377/90/EEC已全面禁止硝基呋喃类抗菌药物作为生长剂和杀菌剂用在动物饲料中，欧盟要求以代谢物为目标分析物，检测硝基呋喃原药残留。硝基呋喃类代谢产物分别是3-氨基-2-嗯唑烷基酮(AOZ)、5-甲基吗啉-3-氨基-2-嗯唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、1-氨基-乙内酰脲(AHD)。
由于硝基呋喃类药物的慢性毒性和世界各国对其的禁用，其在体内的残留分析研究成为热点，该类药物的单残留检测发展比较迅速，文献报道的呋喃类药物残留的分析方法中的HPLC、SPE-HPLC、LC-MS等方法因其测定成分单一，或者检测灵敏度不高等缺点而不能满足检测一种基质是否同时含有四种药物的需要，故发展用一种方法可同时检测在同一基质中的四种药物则非常必要。目前，硝基呋喃类代谢物残留检测方法主要有液相色谱—质谱法和液相色谱—串联质谱法等。
庞国芳用0.2mol/L盐酸水解禽肉组织中与蛋白结合的硝基呋喃代谢物，用2-硝基苯甲醛37℃衍生16小时。上清液调pH＝7.4后，用EN固相萃取柱净化，乙酸乙酯洗脱，流动相定容。检出限AMOZ，AOZ为5μg/kg，SEM、AHD分别为10μg/kg和5μg/kg；Rosa Draisci报道采用高效液相-二极管阵列检测了鸡蛋中的呋喃西林、呋喃它酮，又用液相-质谱技术对其进行验证；蒋原报道采用高效液相色谱-电喷雾多级质谱同时快速、准确测定了蜂蜜中硝基呋喃代谢物。方法是硝基呋喃代谢物在酸性条件下经过邻硝基苯甲醛衍生化，加标样品平均回收率达到64％～79％，检测线限到10μg/kg。
综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。
发明内容
针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法，其从液相色谱分析条件的检测波长、色谱柱、流动相、流速、柱温五个方面通过试验对比，得出优化测定方案，检出限达到5.0ng/mL且加标回收效果理想。
为了实现上述目的，本发明提供一种禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法，包括以下步骤：
A、配制标准储备液；
称取呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物和呋喃妥因代谢物标准品各10mg，加甲醇溶解并定容于100mL棕色容量瓶中，-18℃下保存；
B、样液提取；
称取样品置于离心管中，加入固体提取剂和液体提取剂，混合后离心取上清液，重复提取一次，合并上清液；
C、样液衍生化、萃取处理；
D、固相萃取净化；
将C18-CN混合净化柱依次用5mL甲醇、5mL水活化后，加入5％的甲醇水溶解液以1mL/min的速度过柱，待样液全部过完后用5mL水淋洗柱子并抽干，弃去流出液，用2mL甲醇洗脱，接收全部洗脱液40℃下氮气吹干；残留物用1.0mL的乙腈溶解，振荡混匀，用0.22μm的滤膜过滤；
E、将步骤D中得到的样液进行液相色谱分析，分析条件如下：
色谱柱：CN柱，250mm×4.6mm，5μm；
流动相：乙腈+异丙醇+冰乙酸+0.05％庚烷磺酸钠溶液，体积比为10：10：0.1：80；
流速：1.0mL/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μL；
柱温：30℃；
F、用标准曲线计算待测物质浓度。
根据本发明的禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法，所述固体提取剂为酸性氧化铝和硅胶的混合粉末。
根据本发明的禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法，所述液体提取剂为三氯乙酸-甲醇溶液。
根据本发明的禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法，所述衍生化试剂具体为：吸取100μL 2-氯苯甲醛溶解于5mL冰乙酸和20mL甲醇的混合液中。
本发明提供一种禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法，该方法首先需配制待测物质的标准储备液作为对比分析基础，然后对样品进行样液提取，并对提取的样液进行衍生化、萃取处理，上述步骤完成后，将样液与标准储备液进行液相色谱分析，通过标准储备液所得色谱图的标准曲线得到回归方程，通过回归方程计算样品的待测物质浓度。本发明对比现有技术，在前处理中进行了衍生化处理，使分析物在紫外区响应更加灵敏，并确立了液相色谱分析最佳分析条件：乙腈：异丙醇：冰乙酸：0.05％庚烷磺酸钠溶液的体积比为10:10:0.1:80；流速为1.0mL/min；检测波长：280nm。结果表明，该方法操作简单、提取快捷、准确性高、重复性强，适用于禽肉中硝基呋喃类药物残留量的分析测定。
附图说明
图1是硝基呋喃代谢物标准溶液色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供了一种禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法。该方法具体分析过程包括如下步骤：
步骤一、配制标准储备液。
准确称取呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物和呋喃妥因代谢物标准品各10mg，加甲醇溶解并定容于100mL棕色容量瓶中，-18℃下保存、备用。
步骤二、样液提取。
称取样品置于离心管中，加入固体提取剂和液体提取剂，混合后离心取上清液，重复提取一次，合并上清液。
以10g样品为例，将样品置于离心管中，加入固体提取剂及液体提取剂，提取剂添加量依样品重量而定，此处固体提取剂和液体提取剂的添加量分别为7g和10mL，将样品与提取剂漩涡混合后于40℃水浴中超声30min，然后于6000r/min转速下离心10min，取上清液，残渣中再加入10mL液体提取剂，重复提取一次，合并上清液。
步骤三、样液衍生化、萃取处理。
上清液中加入衍生化试剂，于恒温水浴中超声处理，取出冷却至室温；然后调节pH至7.0，并用乙酸乙酯进行萃取，重复操作一次，合并乙酸乙酯层于水浴中减压旋转蒸发至干，然后加入甲醇水溶液溶解残渣。
具体的，以10g样品的上清液为例，加入衍生化试剂0.5mL，于40℃恒温水浴中超声60min，取出冷却至室温，用NaOH调节pH至为7.0，加入15mL乙酸乙酯萃取，4000r/min离心10min，取出乙酸乙酯层于梨形瓶中，再加入15mL乙酸乙酯，重复操作一次，合并乙酸乙酯层并于35℃水浴中减压旋转蒸发至干，加入5mL 5％的甲醇水溶液溶解残渣。
步骤四、固相萃取净化。
将C18-CN混合净化柱依次用5mL甲醇、5mL水活化后，加入5％的甲醇水溶解液以1mL/min的速度过柱，待样液全部过完后用5mL水淋洗柱子并抽干，弃去流出液，用2mL甲醇洗脱，接收全部洗脱液40℃下氮气吹干；残留物用1.0mL的乙腈溶解，振荡混匀，用0.22μm的滤膜过滤。
步骤五、将步骤四中得到的样液进行液相色谱分析，分析条件如下：
色谱柱：CN柱，250mm×4.6mm，5μm。
流动相：乙腈+异丙醇+冰乙酸+0.05％庚烷磺酸钠溶液，体积比为10：10：0.1：80。
流速：1.0mL/min。
检测波长：280nm。
进样量：20μL。
柱温：30℃。
步骤六、用标准曲线计算待测物质浓度。
将步骤四所得样液注入高效液相色谱仪进行分析，参照标准曲线回归方程和色谱图，求取样品的待测物质浓度。标准曲线回归方程、相关系数和线性范围见表1；色谱图见图1。
还需要说明，步骤二中的固体提取剂为酸性氧化铝和硅胶的混合粉末；液体提取剂为三氯乙酸-甲醇溶液；另外步骤三中的衍生化试剂为100μL 2-氯苯甲醛与5mL冰乙酸和20mL甲醇的混合溶解液。
分析测定过程中涉及参数的优选、确定说明：
(1)检测波长
经过对400ng/mL混合标准溶液进行扫描，确定吸收带有两个，分别在265～300nm及320～370nm，在300nm处，杂质峰虽相对较少，但灵敏度不够，AHD、SEM达不到定量限的要求，结果表明：在波长280nm处4个组分的回收率和灵敏度均可以满足检测要求，故选择280nm作为该方法的检测波长。
(2)色谱柱和流动相的选择
利用既有的方法作为参考，比较了C18柱和CN柱对四种组分的分离效果。C18色谱柱由于干扰较大，不能有效地分离4种目标组分，而选择CN柱时，经过对流动相的改变可以较好地分离4个组分。初步确定选用10:90的乙腈和0.05％庚烷磺酸钠作为流动相的成分，分离度并不是很理想，然后经过不断的微调、试验，加入微量有利于保持溶液pH的乙酸、促进峰形改变的异丙醇，当乙腈、异丙醇、冰乙酸、0.05％庚烷磺酸钠溶液的体积比为10:10:0.1:80时，标准物质的分离度为2.13而且峰形很清楚，由此确定流动相的比例为10:10:0.1:80。
(3)流速的选择
流速的大小直接影响色谱柱及检测***的压力、各组分的分离度、洗脱时间，在流动相选定之后，需要选择最佳的分离度和最短分析时间的流速。流速太小，分析时间太长，色谱峰会很宽；流速太大，***的压力太高，而且会致使各个色谱峰重叠并且容易损坏色谱柱。因此，本实验选择流速分别为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL/min进行实验，结果表明当流速在1.0mL/min时可以充分的满足实验的要求。
(4)柱温的选择
在流动相和流速确定之后，检测柱温的选择可以控制色谱峰的检出时间。现在以20℃、25℃、30℃、35℃进行实验，结果表明，当检测温度为30℃时，各组分的保留时间提前，并且不影响各个组分之间的分离，因此选定30℃作为最佳检测温度。
(5)线性回归方程
精密量取标准储备液适量，用甲醇稀释成一系列不同浓度的标准溶液，分别进样2次，以标准溶液浓度(ng/mL)X对锋面积Y进行线性回归，计算公式为:
所得标准曲线的回归方程、相关系数和线性范围，见表1，所得色谱图见图1。
表1标准曲线的回归方程、相关系数和线性范围
以3倍信噪比计算，确定本方法的最低检出限为5.0μg/kg，由此可看出使用本方法可以有效检测禽肉中硝基呋喃代谢物的含量。
为了更好的说明本发明的优越性，分别对其加样回收率和精密度进行测定试验：
(1)加样回收率
分别以阴性样品鸡肉作为测试对象，称取样品10g，同时做平行试验，分别在样品中混入5.0μg/kg及50.0μg/kg两种浓度的标准混合溶液(即①加入50μL②500μL浓度为100μg/mL的标准储备液)。
)，充分混合均匀，按照本发明的操作步骤进行测试，测定结果和回收率见表2，由表2可见测定结果符合药物残留检测分析的要求。
表2四种硝基呋喃类代谢物添加回收率
(2)精密度
实验采用阴性鸡肉样品进行，4种硝基呋喃类代谢物的添加水平为20μg/kg时，连续6次测定，RSD分别为：AOZ 3.9％、SEM 4.8％、AMOZ 4.7％、AHD4.2％，表明仪器稳定性良好。
为了证明本发明的可靠性和实用性，现将现有检测工作中通用的液相色谱—串联质谱法和酶联免疫法与本发明进行对比试验说明，取阴性鸡肉样品加入4种硝基呋喃类代谢物，添加水平为10μg/kg，采用本发明的高效液相色谱法(LC-UV)与与现有检测工作中通用的液相色谱—串联质谱法(LC-MS/MS)和酶联免疫法(ELISA)进行比较，测定结果如表3所示。
表3不同测定方法的试验结果
从测定结果可知，由于线性与定量的原因，测定结果存有一定差异，LC-UV法与LC-MS/MS法的测定结果误差小于3％，ELISA法与LC-MS/MS法测定结果的误差小于4％，测定结果理想。
综上所述，本发明提供一种禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法，该方法首先需配制待测物质的标准储备液作为对比分析基础，然后对样品进行样液提取，并对提取的样液进行衍生化、萃取处理，上述步骤完成后，将样液与标准储备液进行液相色谱分析，通过标准储备液所得色谱图的标准曲线得到回归方程，通过回归方程计算样品的待测物质浓度。本发明对比现有技术，在前处理中进行了衍生化处理，使分析物在紫外区响应更加灵敏，并确立了液相色谱分析最佳分析条件：乙腈：异丙醇：冰乙酸：0.05％庚烷磺酸钠溶液的体积比为10:10:0.1:80；流速为1.0mL/min；检测波长：280nm。结果表明，该方法操作简单、提取快捷、准确性高、重复性强，适用于禽肉中硝基呋喃类药物残留量的分析测定。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (4)

1.一种禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、配制标准储备液；
称取呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林代谢物和呋喃妥因代谢物标准品各10mg，加甲醇溶解并定容于100mL棕色容量瓶中，-18℃下保存；
B、样液提取；
称取样品置于离心管中，加入固体提取剂和液体提取剂，混合后离心取上清液，重复提取一次，合并上清液；
C、样液衍生化、萃取处理；
D、固相萃取净化；
将C18-CN混合净化柱依次用5mL甲醇、5mL水活化后，加入5％的甲醇水溶解液以1mL/min的速度过柱，待样液全部过完后用5mL水淋洗柱子并抽干，弃去流出液，用2mL甲醇洗脱，接收全部洗脱液40℃下氮气吹干；残留物用1.0mL的乙腈溶解，振荡混匀，用0.22μm的滤膜过滤；
E、将步骤D中得到的样液进行液相色谱分析，分析条件如下：
色谱柱：CN柱，250mm×4.6mm，5μm；
流动相：乙腈+异丙醇+冰乙酸+0.05％庚烷磺酸钠溶液，体积比为10：10：0.1：80；
流速：1.0mL/min；
检测波长：280nm；
进样量：20μL；
柱温：30℃；
F、用标准曲线计算待测物质浓度。
2.根据权利要求1所述的禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法，其特征在于，所述固体提取剂为酸性氧化铝和硅胶的混合粉末。
3.根据权利要求1所述的禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法，其特征在于，所述液体提取剂为三氯乙酸-甲醇溶液。
4.根据权利要求1所述的禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法，其特征在于，所述衍生化试剂具体为：吸取100μL 2-氯苯甲醛溶解于5mL冰乙酸和20mL甲醇的混合液中。
CN201710654476.0A 2017-08-03 2017-08-03 一种禽肉中硝基呋喃类药物残留检测方法 Withdrawn CN107655984A (zh)

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CN108680410A (zh) * 2018-05-17 2018-10-19 北京和合医学诊断技术股份有限公司 代谢组学组织样本处理方法
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