CN104814983A - 用于预防和/或治疗变形链球菌群引起的龋的用途和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及属于乳酸菌组的微生物,或其变体或衍生物在制备用于治疗或预防除了变形链球菌的变形链球菌群引起的龋的防龋组合物中的用途。本发明的另一个方面是预防或治疗除了变形链球菌的变形链球菌群引起的龋的方法,其包括施用属于乳酸菌组的微生物,或其变体、衍生物、类似物或碎片,所述微生物特征在于能够特异性结合属于变形链球菌群组的细菌。
Description
本申请是发明人于2007年12月18日提交的题为“用于预防和/或治疗变形链球菌群引起的龋的用途和方法”的中国专利申请200780047062.6号的分案申请。
本发明涉及属于乳酸菌组的微生物,或其变体或衍生物在制备用于治疗或预防除了(other than)变形链球菌(Streptococcus mutans)的变形链球菌群(mutans Streptococci)引起的龋的防龋组合物中的用途,所述微生物特征在于其能够特异性结合属于变形链球菌群组的细菌,其中特异性结合是(i)抗热处理;和/或(ii)抗蛋白酶处理;和/或(iii)是钙依赖性的;和/或(iv)在pH 4.5和8.5范围间形成;和/或(v)在唾液存在下形成。
优选地,此特异性结合可如下分析:
(a)将所述微生物培养至稳定期;
(b)将所述微生物与已经培养至稳定期的属于变形链球菌群组的细菌混合;
(c)将步骤(b)得到的混合物在允许所述微生物与变形链球菌群组的细菌形成聚集物的条件下孵育,和
(d)通过沉淀的出现检测聚集物。
本发明的另一个方面是预防或治疗除了变形链球菌的变形链球菌群引起的龋的方法,其包括施用属于乳酸菌组的微生物,所述微生物特征在于其能够特异性结合属于变形链球菌群组的细菌,或所述微生物的变体、衍生物、类似物或碎片。
第一颗牙齿长出后变形链球菌群在宿主建群(Carlson等,Caries Res.9(1975),333-339)。它们定位在牙齿表面,且它们在最初损伤上的蚀斑(plaque)中的多度最高(Duchin和van Houte Arch.Biol.Biol.23(1978)779-786)。它们在蚀斑中建群的水平由蔗糖的消费提高(Staat等,J.Dent.Res.54(1975)872-880)。它们能够从蔗糖合成某些促进其与牙齿结合的大分子(Tanzer等,Infect.Immun.10(1974)197-203)。变形链球菌群是来自包括蔗糖的简单糖类的酸的快速生产者,并耐受低pH(Edwardsson,Arch.Biol.13(1968)637-646)。另外,它们基本总是在最初和建立的龋损伤位点恢复繁殖(Littleton等,Arch.Oral.Biol.15(1979)461-463)。
在证实它们在包括单菌性传染的悉生生物的多种实验动物的龋损伤中的有力诱导和提高后,对它们产生兴趣。它们的毒力表达与糖类的消费,尤其是蔗糖的消费密切相关。
与龋发展有关的其他细菌物种如乳酸菌或放线菌(actinomycetes)的作用仍无定论。这些细菌常常在龋性损害中发现,但是仅在变形链球菌群同时发现时。根据目前所知,存在变形链球菌群是龋发生的必备条件。(Tanzer等,J.Dent.Educ.65(2001)1028-1037)。已定义变形链球菌群组至少包含变形链球菌,远缘链球菌(S.sobrinus)、仓鼠链球菌(S.cricetus)、大鼠链球菌(S.ratti)、野鼠链球菌(S.ferus)和猕猴链球菌(S.macacae)(Loesche等,Microbio.Rev.50(4)(1986)353-380)。由于变形链球菌是人类变形链球菌群最主要的代表,大部分的微生物龋损伤研究和抗龋治疗集中于该具体的物种。
变形链球菌对牙齿表面的初始结合通过两种机制发生。第一种机制是变形链球菌通过链球菌的一种表面蛋白质-抗原I/II(SA I/II)结合表膜,这是在牙齿表面上的一层唾液蛋白质,其中抗原I/II的同义词还称作B、IF、P1、SR、MSL-1或Pac。已经证实抗此表面蛋白质的抗体在体外(invitro)阻止了变形链球菌的附着。
因此,链球菌抗原I/II(SA I/II)是用于接种的靶标。在不同的重组组合即完整抗原、唾液结合区域、与霍乱毒素缀合或在无毒沙门氏菌菌株表面表达的蛋白质中,已经证实成功地免疫动物。这产生IgA高滴度以及变形链球菌群集减少(Huang等,Infect.Immun.69(2001),2154-2161)。可比较的结果已经使用编码SA I/II的DNA疫苗成功获得(Fan等,J.Dent.Res.81(2002),784–787)。
被动免疫已经通过抗SA I/II抗体在乳酸菌表面的重组表达成功实施。这些乳杆菌属(lactobacilli)细菌使变形链球菌聚集并且向大鼠施用细菌导致龋发展减少(Krueger等,Nature Biotechnology 20(2002),702–706)。
WO 06/027265为了抑制与牙齿的附着的目的,提供了能够结合变形链球菌的乳酸菌。
链球菌抗原的最重要结合对象是唾液凝集素,这种蛋白质与来自清除受体富含半胱氨酸的超家族的肺糖蛋白糖蛋白gp-340a相似(Prakobphol等,J.Biol.Chem.275(2000)39860-39866)。
凝集素在龋发生中的作用迄今未完全了解。当凝集素结合表面上存在时,它可以导致变形链球菌的附着,当凝集素以可溶性状态存在时,它可以导致变形链球菌的聚集。后一情况可能导致聚集的变形链球菌通过唾液流从口腔排出。唾液中高浓度的凝集素在体外导致变形链球菌附着的增加,而唾液中的凝集素浓度与龋风险间在体内则没有明显相关性(Stenudd等,J.Dent.Res.80(2001),2005-2010)。
抗凝集素的单克隆抗体完全阻断变形链球菌在体外结合唾液包被的羟基磷灰石并防止凝集素依赖性聚集(Carlen und Olsson,J.Dent.Res.74(1995),1040-1047;Carlen等,J.Dent.Res.77(1998),81-90)。Brady等,Infect.Immun.60(1992),1008-1017证实表面的附着以及聚集可以通过不同抗体分别独立地进行抑制。这表明凝集素的不同表位分别引起这两种效应。
其他常与龋发展有关的唾液蛋白质是富含脯氨酸的蛋白质(PRP)。然而,对这些蛋白质在成龋细菌附着过程中的作用存在激烈争论。这些蛋白质由两个基因座(PRH-1和PRH-2)编码并且存在仅仅差异数个氨基酸的不同变体(PRP-1、PRP-2、PIF、Db-双带)。这些变体可以被蛋白水解切割,产生所谓的小PRPs(PRP-3、PRP-4、PIF-f和Db-f)。
PRPs介导共生体如内氏放线菌(Actinomyces naeslundii)或非变形链球菌属的强烈结合。有趣的是,这种结合仅在PRPs蛋白质附着至牙齿表面产生构象改变而使结合位点可接近后才发生。变形链球菌仅微弱结合。PRP-变体Db与有效结合变形链球菌相关。高浓度的Db与变形链球菌的高度附着和龋的强烈发展有关。总PRP浓度高而PRP-Db浓度降低与龋的缓慢发展有关(Stenudd等,J.Dent.Res.80(2001),2005-2010)。人们不知道变形链球菌是否直接结合PRP。
变形链球菌黏附至牙齿表面的第二种途径是通过蔗糖依赖性附着。变形链球菌表达能够合成糖聚合物-葡聚糖的三种不同糖基转移酶(GTF)。葡聚糖以水溶性形式(1-6糖苷键)和称作齿斑葡聚糖(1-3糖苷键)的非水溶性形式存在。齿斑葡聚糖不能由口腔细菌或由唾液中的酶降解。它形成牙蚀斑中作为变形链球菌蔗糖依赖性附着基础的粘性基质。负责齿斑葡聚糖形成的优势酶-糖基转移酶GTFB和GTFC位于变形链球菌细胞表面。相反,糖基转移酶GTFD合成可溶性葡聚糖并且由变形链球菌分泌。使用变形链球菌GTF缺陷型变体的实验证实所有这三种酶的相互作用对蔗糖依赖性附着是必需的(Ooshima等,J.Dent.Res.80(2001),1672-1677)。
糖基转移酶具有N端蔗糖结合位点和C端葡聚糖结合位点。抗糖基转移酶抗体或抗葡聚糖结合位点抗体导致对变形链球菌蔗糖依赖性附着的抑制。使用抗体已经不可能封闭N端蔗糖结合位点(Yu等,Infect.Immun.65(1997),2292-2298).
还可以通过某些黄酮类化合物或萜类化合物(US 2004/0057908)或蜂胶提取物(Duarte等,Biol.Pharmacol.Bull.26(2003),527–531)实现糖基转移酶的抑制以及随后变形链球菌降低的附着。
已经发现名为S11的乳酸菌在体外减少齿斑葡聚糖形成并且因此减少变形链球菌的黏着。如上所述,齿斑葡聚糖的形成对变形链球菌黏附至牙齿表面重要。因此,Chung等(Oral Microbiol.Immunol.19(2004),214–216)发现当变形链球菌细胞与据称减少齿斑葡聚糖形成的乳酸菌S11菌株孵育后,变形链球菌细胞不附着。变形链球菌通过细菌结合蛋白(葡聚糖结合蛋白)结合齿斑葡聚糖。这种结合的确切机制仍待确定(Sato等,Infect.Immun.65(1997),668-675)。
真菌哈茨木霉(Trichoderma harzianum)和产紫青霉菌(Penicilliumpurpurogenum)产生同源的α-1,3-葡聚糖酶(Fuglsang等,J.Biol.Chem.275(2000),2009-2018)。有效抗葡聚糖产生和蚀斑形成的肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属和乳球菌属(Lactococcus)物种的用途(US 6,036,952)已经描述。其作用机制需要阐明。
抑制龋的另一种方法是中和蚀斑中的低pH。尿素和精氨酸是唾液的成分。尿素以浓度3–10mmol/L存在,其浓度在无龋的人和患龋人之间没有大差异。游离的精氨酸浓度在4和40μmol/L间变化。无龋个体在唾液内具有的平均游离精氨酸浓度有比龋患者高(van Wuyckhuyse等,J.Dent.Res.74(1995),686-690)。
某些蚀斑细菌如血链球菌和内氏放线菌能够分解尿素或精氨酸,引起氨形成。碱性的氨升高蚀斑的pH并且因此减少龋(Curran等,Appl.Environm.Microbiol.61(1995),4494-4496;Morou-Bermudez and Burne,Infect.Immun.68(2000),6670-6676)。因此,建议将这些细菌用于治疗龋。另一个建议用于治疗龋的方法是通过PRP-1和PRP-3的蛋白水解产生精氨酸丰富的肽,再经口腔细菌如血链球菌、口腔链球菌(S.oralis)和缓症链球菌(S.mitis)进一步蛋白酶解后,该肽可以引起蚀斑内更高的pH。通过应用这些肽的重组变体,pH的蔗糖依赖性降低受到抑制(Li等,Infect.Immun.68(2000),5425-5429)。此外,据称在蔗糖摄入后通过使用含尿素的口香糖,可以抑制pH的下降,因此,例如变形链球菌可能对龋没有如此大的贡献。
然而,如以上显而易见,现有技术集中在针对变形链球菌的抗龋治疗。尽管变形链球菌群具有可能的龋发生作用,没有允许靶定除了变形链球菌的变形链球菌群的治疗的描述。由此,需要满足以上提及的期望标准并用于预防和/或治疗除了变形链球菌的细菌导致的龋的手段和方法。
因此构成本发明基础的技术问题将符合如上所述的需要。通过提供权利要求书中所表征的实施方案解决了这个技术问题。
因此,本发明的第一个方面涉及属于乳酸菌组的微生物,或其变体或衍生物在制备用于治疗或预防除了变形链球菌的变形链球菌群引起的龋的防龋组合物中的用途,其特征在于该微生物能够特异性的结合属于变形链球菌群组的细菌,其中特异性结合为(i)抗热处理;和/或(ii)抗蛋白酶处理;和/或(iii)是钙依赖性的;和/或(iv)在pH 4.5和8.5范围间形成和/或(v)在唾液存在下形成。
优选地,该特异性结合可以如下检测:
(a)将所述微生物培养至稳定期;
(b)将所述微生物与已经培养至稳定期的属于变形链球菌群组的细菌混合;
(c)将步骤(b)得到的混合物在允许形成所述微生物与属于变形链球菌群组的细菌聚集物的条件下孵育,和
(d)通过沉淀的出现检测聚集物。
在优选的实施方案中,用于此类检测的属于变形链球菌群组的细菌是变形链球菌。
特异性结合优选地如本文以下实施例4中所述检测。具体地,为了如下文实施例4所述的沉淀聚集检测变形链球菌群,属于乳酸菌组的微生物优选与变形链球菌群以体积比3:1至60:1(变形链球菌群:乳杆菌(lactobacillus))混合。将乳酸菌和变形链球菌群如实施例1中所述培养至稳定期。优选地,光密度在波长600nm以光度方式测量。所提及比率对应于从1:50至1:2.5比率的菌落形成单位。优选地,1ml中的OD600=1与变形链球菌群(mutans Streptococcus)的3×108个菌落形成单位相关。优选地,1ml中的OD600=1与本文如下所述的乳杆菌的7×109个菌落形成单位相关。优选地,为检测通过沉淀的聚集反应,细菌处于15ml Falcon管内的2ml体积。根据需要,将培养物悬浮液用PBS缓冲液稀释以获得以上提及的体积比,同时保证终体积在2ml。优选地,将混合物涡旋混合大约15秒并在室温即16℃至25℃间任意温度静止放置至少5、10、15分钟且更优选地至少20分钟。聚集作为悬浮液立即变混浊而可以见到,并且在至少20分钟后,聚集因沉降为可视的沉淀物是可见的(示例性显示在图1,左边Falcon管),而非变形链球菌群聚集性混合物在悬浮液中(示例性显示在图1,右边Falcon管)。作为对照,乳酸菌和变形链球菌群菌株的自我聚集分别可以通过缺省变形链球菌群或乳酸菌进行分析。
如上所述的乳杆菌和变形链球菌群的聚集检测可以通过离心,例如500x g,30秒分离形成的聚集物来定量。随后,通过测定留在上清中的未聚集的细胞的量确定聚集的量。该测定可用本领域技术人员已知的任何合适的方法进行。优选地,测定通过移除一定体积(例如1ml)上清进行。然后,在本领域技术人员已知的任何合适的波长,例如600nm处测定移除上清的光密度。测定的值减去没有乳杆菌的对应的对照测试的值后代表没有聚集的细胞的量。
备选的,为了解决可能的自聚集问题,可以使用染色,优选荧光染色。因此,在更优选的实施方案中,特异性结合可以如下检测:
(a)培养所述微生物至稳定期;
(b)将所述微生物与属于变形链球菌群组的细菌混合,所述属于变形链球菌群组的细菌已培养至稳定期,并已使用合适的染色剂,优选荧光染色剂染色;
(c)在允许所述微生物和变形链球菌群组的细菌形成聚集物的条件下,孵育步骤(b)中获得混合物;且
(d)通过检测染色剂,优选荧光染色剂测定聚集物。
同样,在优选的实施方案中,用于此类检测的属于变形链球菌群组的细菌是变形链球菌。优选地,此类聚集检测如本文下面的实施例5所述进行。具体地,为了如下文实施例5所述聚集检测变形链球菌群,将乳酸菌和变形链球菌群均如实施例1中所述培养至稳定期。优选地,光密度在波长600nm以光度方式测量。优选地,1ml中的OD600=1与变形链球菌群的3×108个菌落形成单位相关。优选地,1ml中的OD600=1与本文如下所述的乳杆菌的7×109个菌落形成单位相关。随后,染色变形链球菌群。在进一步优选的实施方案中,染色乳杆菌,而变形链球菌群不染色。对于染色可以使用任何合适的染色剂,优选使用本领域技术人员已知的荧光染色剂。优选地,可使用特异性的或非特异性的荧光染色剂,例如CFDA-SE。具体地,通过离心,优选3200x g,5分钟收获细胞。然后,获得的沉淀可重悬于本领域技术人员已知的任何合适的缓冲液中,例如在PBS-缓冲液中。可以计算缓冲液的量,使得得到的悬浮液具有例如4.2/ml的OD600。之后,悬浮液与合适的染色剂混合,例如与荧光染色剂混合,优选与5,6-羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE)混合,更优选与2μl CFDA-SE溶液(Invitrogen)混合。接着,细胞在本领域技术人员已知的合适的温度下,例如37℃下孵育本领域技术人员已知的合适的时期,例如2小时。在下一步中,例如通过离心收获染色的细胞。优选地,离心3200x g进行5分钟。细胞然后可以重悬于本领域技术人员已知的合适的缓冲液中,例如在2mlPBS-缓冲液中。为了聚集,属于乳酸菌组的微生物优选与变形链球菌群以体积比3:1至1:3(变形链球菌群:乳杆菌)混合。更优选地,混合物的体积比是1:1。菌落形成单位的比率对应的所述比率是1:50to 1:150。为了经由测定染色,优选荧光染色检测聚集,乳杆菌和变形链球菌群以本领域技术人员已知的任何合适的体积使用,优选50μl体积。优选混合在微量滴定板中进行,例如在96孔微量滴定板中进行。然后,涡旋混合物,优选全速涡旋12分钟。接着,离心混合物,例如500x g,10秒。移除上清,在任何合适的体积中,例如100μl中,用本领域技术人员已知的任何合适的缓冲液重悬沉淀,优选用PBS-缓冲液重悬沉淀。混合物中染色的重悬液通过本领域技术人员已知的任何合适的方法测定。优选地,在荧光的情况下,荧光在荧光读数仪中测定,例如激发波长495nm,发射波长525nm。作为对照。测定单独的乳杆菌和单独的染色变形链球菌群。对于单独测定的变形链球菌群,测定任何背景染色,例如荧光染色,优选从对应的乳杆菌的聚集值中减去。如果测定的含有本文上述乳杆菌和本文上述测定的变形链球菌群的样品的染色,例如荧光染色减去如本文上述测定的例如荧光的背景染色,且得到的结果至少大约零,则存在聚集作用。更优选地,如果在系列本文上述进行的测定中得到的值均大于零,则存在聚集作用。“系列实验”意指至少2个测定,优选3个测定,更优选4个测定,最优选5个测定。
上述特异性结合不需要镁。该特征可以如后续实施例中所述测试。
如所附实施例所示,令人惊讶的发现乳酸菌显示聚集多种其他变形链球菌群,例如远缘链球菌(Streptococcus sobrinus)、仓鼠链球菌(Streptococcus cricetus)、大鼠链球菌(Streptococcus ratti)、野鼠链球菌(Streptococcus ferus)和猕猴链球菌(Streptococcus macacae)的能力,所述乳酸菌由于其结合变形链球菌,而不结合其他变形菌属物种,唾液链球菌(S.salivarius)、口腔链球菌(S.oralis)、轻链球菌(S.mitis)和/或血链球菌(S.sanguinis)(参见WO 06/27265)的能力,最初通过上述结合检测鉴定和分离。因此,鉴定显示上述与变形链球菌相关的结合特征的乳酸菌(其中结合优选通过上述检测测定),提供不仅具有聚集变形链球菌能力,还具有聚集其他变形链球菌群(即,具有如下进一步描述的常规特征并与龋发展相关)能力的乳酸菌。因此,发现显示上述与属于变形链球菌群组的一种类型的细菌(例如,变形链球菌)相关的结合特征的乳酸菌还能够聚集属于变形链球菌群的其他细菌,由此用于预防和/或治疗此类其他细菌导致的龋。因此,上述测试乳酸菌与一种属于变形链球菌群的细菌结合的鉴定检测允许鉴定也结合/聚集属于变形链球菌群的其他细菌的乳酸菌。因此,本发明提供解决除了变形链球菌的变形链球菌群导致的龋的手段和方法的重要改进。
如上提及的所有特征使得上述属于乳酸菌组的微生物成为用于预防和/或治疗龋(尤其是由除了变形链球菌的变形链球菌群所致的龋)的合适物质。因此,上述属于乳酸菌组的微生物产生防龋效果并且因此是用于预防和/或治疗龋,尤其是由除了变形链球菌的变形链球菌群所致的龋的有用物质。“龋”或“齿龋”或“空洞”是可互换的术语,它们描述与牙齿中已腐蚀的柔软区域有关的逐步导致牙齿死亡的慢性感染性疾病。它通常发生在儿童和年轻人中,但是可以影响任何人。它是在较年轻的人中导致牙齿损失的最重要原因。龋可以通过本领域已知的方法诊断(参见例如,Angmar-Mansson and ten Bosch,Adv.Dent.Res.7(1993),70-79)。
术语“变形链球菌群”意指链球菌属分类学组的微生物,其在口腔蚀斑中发现,发酵甘露醇和山梨糖醇。优选地,其是具有还能够从蔗糖产生胞外葡聚糖的上述特征的微生物。优选地,所述微生物是龋发生的微生物,尤其在人和/或动物模型中。更优选地,该术语涉及显示所有上述特征的微生物。山梨糖醇和甘露醇的发酵可通过使用本领域技术人员已知的任何合适的测试,例如API 20Strep测试(Biomerieux,法国)检测。
更优选地,该术语涉及属于变形链球菌种的微生物,远缘链球菌、仓鼠链球菌、大鼠链球菌、野鼠链球菌或猕猴链球菌。更优选地,该术语涉及属于变形链球菌血清型c(DSMZ 20523)、变形链球菌血清型e(NCTC10923)、变形链球菌血清型f(NCTC 11060)、远缘链球菌DSM 20742、大鼠链球菌DSM 20564、仓鼠链球菌DSM 20562、野鼠链球菌DSM20646或猕猴链球菌DSM 20714的微生物。术语“变形链球菌群”指至少一种如上文所述的变形链球菌群组的微生物。优选地,该术语意指属于如上文所述的变形链球菌群组的微生物的任何组合和亚组。
术语“防止龋”包括预防龋。因此就受试者将不患龋而言,从未接触过龋的病原体-变形链球菌群,但有接触即被变形链球菌群感染风险的该受试者从例如自本文迄今所述的用途和方法中获益。因此,本发明的用途和方法例如用于婴儿、儿童或年幼动物以预防龋,因为婴儿或年幼动物的口腔通常没有变形链球菌群。然而,本发明所用的组合物不限于施用至婴儿、儿童或年幼动物。
术语“治疗龋”包括将文本如下所述的组合物施用至患有龋的受试者,目的是减少变形链球菌群的细胞数目和/或彻底将变形链球菌群从嘴里、尤其从包括牙齿在内的口腔中清除。当然,在已经治愈变形链球菌群后,预计相应受试者获得来自本发明的用途和方法在对变形链球菌群产生的预防性抗龋效果方面的益处。
任选地,上述微生物属于乳酸菌组,是除了其防龋效果以外,具有对其所施用的宿主生物的有益效果的益生微生物。通常所认可的定义“益生菌”是“一种活微生物性饲料添加剂,其通过改善宿主动物肠道的微生物平衡有益地影响该宿主动物”。
变形链球菌群存在于口腔作为正常菌群的部分。它们参与引起人和动物,尤其是哺乳动物龋。牙蚀斑附着在靠近齿龈的齿沟和齿窝上。牙蚀斑最初由沉淀并吸附至牙釉质上的糖蛋白组成。口腔细菌随后与此糖蛋白结合。食用蔗糖对龋产生有重要贡献,尤其当蔗糖处于其部分可以在嘴里停留一段时间的粘性甜食的形式时。蔗糖因此更彻底地由变形链球菌群代谢以形成酸。由于含蔗糖的饮料被吞咽,因此蔗糖滞留在嘴里的时间较短。重要的是定期刷牙和使用牙签和牙线以控制牙蚀斑。已证实将1ppm氟化物添加至饮用水十分有效地降低了龋。并且,科学界已设想使用抗变形链球菌的疫苗的可能性。因此,除了一般安排的影响口腔中主要细菌的口腔卫生,现有技术主要关注针对变形链球菌的特定措施。然而,由于本发明令人惊讶地发现属于乳酸菌组、优选属于乳杆菌属的天然存在微生物(通过它们结合变形链球菌的能力)还具有能够特异性结合变形链球菌群菌株(例如远缘链球菌、仓鼠链球菌、大鼠链球菌、野鼠链球菌或猕猴链球菌),有可能有效地预防和/或治疗除了变形链球菌的变形链球菌群所致的龋,因为上述属于乳酸菌组的微生物能够聚集和冲走变形链球菌群,例如远缘链球菌、仓鼠链球菌、大鼠链球菌、野鼠链球菌或猕猴链球菌。因此,本发明提供容易施用的细菌的用途,它们是食品级的生物,除了它们的防龋特性外,还可以用作益生菌。
具体地,当分析属于乳酸菌组、优选属于乳杆菌属的微生物(通过它们结合变形链球菌,而不是唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、轻链球菌(Streptococcus mitis)和血链球菌(Streptococcus sanguinis)的能力,之前已鉴定),令人惊讶的发现所述微生物不仅具有结合变形链球菌的能力,还具有结合龋的病原体的其他变形链球菌群物种,例如远缘链球菌、仓鼠链球菌、大鼠链球菌、野鼠链球菌或猕猴链球菌的能力。通过结合这些变形链球菌群,本文所述属于乳酸菌组、尤其优选属于乳杆菌属的微生物结合并聚集变形链球菌群,因此,作为结果,通过天然的唾液流冲走变形链球菌群,由此预防和/或治疗龋。除此之外,本文所述,尤其是下面实施例6所述的,存在于口腔的上述属于乳酸菌组的微生物优选不结合不属于变形链球菌群组的微生物。因此,口腔的微环境未受到干扰,因为只有作为龋病原体的变形链球菌群被消除。按照所知,变形链球菌群对口腔没有任何有益作用,因此除去它们对相应宿主没有副作用。
令人瞩目的是,本文所述的上述属于乳酸菌组的微生物,尤其是乳杆菌物种与变形链球菌群的特异性结合是抗热处理和/或抗蛋白酶处理的。另外,该特异性结合依赖于钙和/或不依赖于镁,并在酸性点(acidic point)4.5处稳定,其在唾液存在时发生,这使其特别适合用于口腔应用的形式或作为添加剂用于可能含有较高浓度钙的食品、饲料或饮料,如牛奶。引人注目的是热灭活或冻干的本文中所公开微生物的类似物、衍生物或碎片依然能够特异性结合变形链球菌群。这种令人惊讶的效果有利于将所述微生物的所述类似物或碎片在用于动物,优选人或哺乳动物的组合物中使用,以预防和/或治疗龋齿。特别地,所述类似物或碎片可以容易地添加至任意组合物,例如美容组合物或药物组合物、食品或饲料或饮料等。此外,此类类似物或碎片的生产便宜而容易,并且它们可以长时间储存且其特异性结合变形链球菌群的能力不下降。上述属于乳酸菌组的微生物的另一个优势是即便将它冻干或喷雾干燥或干燥,所述微生物仍保留特异性结合变形链球菌群的能力。这使本发明微生物成为用于本文中所公开的组合物中受欢迎的成分。
本发明的其他实施方案和优点部分在本文描述里陈述,并且可以从该描述中部分地显而易见,或可自本发明的实践中学到。
在详细描述本发明之前,应当理解本发明不限于本文中所述的特定方法学、方案、细菌、载体和试剂等,因为这些可加以变化。还应当理解本文中所用的术语仅用于说明特定实施方案的目的,并且不意图限制本发明的范围,该范围仅由后附的权利要求书限制。除非另外定义,本文中所用的全部技术术语和科学术语具有如本领域内普通技术人员通常所理解的相同含义。
优选地,本文中所用术语如在“生物技术术语多国语言词汇表:(IUPAC推荐)”,Leuenberger,H.G.W、Nagel,B.和 H.编辑(1995),HelveticaChimica Acta,CH-4010巴塞尔,瑞士)中描述.
在本说明书和随后的权利要求书整个范围内,除非内容需要,否则词汇“包含”和其变体如“包含了”和“包含着”将理解为包含所述的整数或步骤或整数组或步骤组,是不排除任何其他的整数或步骤或整数组或步骤组。
几份文献在本说明书文本中全篇引用。本文中所引用的每一份文献(包括全部专利、专利申请、科学公开、制造商说明书、指南等),无论在前或在后,在本文中均完整引用作为参考。本文中任何内容不构成为承认本发明由于在先发明而未进行授权以使此公开提前。
必须指出如本文中所用以及在后续权利要求书中,单数形式“一个”和“该”包括复数,除非内容清楚地标明。因此,例如谈及的“一种试剂”包括一份或多份此类不同试剂,并且谈及的“该方法”包括对可以加以修改或替换本文中所述方法的本领域技术人员所知的等效步骤和方法。
当用于本发明上下文中时,术语“属于乳酸菌组的微生物”包含属于细菌的,尤其属于革兰氏阳性发酵型真细菌,更特别地属于包括乳酸菌在内的乳杆菌科的细菌。此外,该术语还包含所述微生物的衍生物或变体或保留特异性结合变形链球菌群的能力的类似物或碎片,如文中所述的膜部分。术语“衍生物”、“变体”、“类似物”和“碎片”在本文其他地方描述。从分类学观点看,乳酸菌划分为亚类:链球菌属(Streptococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)和乳杆菌。上述属于乳酸菌组的微生物优选是乳杆菌属物种。乳酸菌组的成员通常缺乏卟啉和细胞色素,不实施电子转运磷酸化作用,因此它们仅通过底物水平磷酸化作用得到能量。即在乳酸菌中,ATP通过糖类发酵合成。所有乳酸菌均厌氧生长,然而,与众多厌氧菌不同,大部分乳酸菌对氧不敏感并且因此可以在氧存在以及氧不存在时生长。因此,上述属于乳酸菌组的微生物优选是耐氧的厌氧乳酸菌,优选地属于乳杆菌属。
上述乳杆细菌优选地呈杆状或球形,从修长和纤细的杆菌变化至短的弯曲杆菌,更优选地是不游动的和/或是不产生孢子的,并且产生乳酸作为主要或唯一的发酵代谢产物。在一个优选施方案中,上述微生物所属的乳杆菌属按照如下特征分为三个主要亚组,因此预计上述乳杆菌属物种可以属于这三个主要亚组的每一个亚组:
(a)同型发酵的乳杆菌属
(i)通过糖酵解途径从葡萄糖产生至少85%量的乳酸,优选是L-、D-或DL-乳酸异构体;
(ii)在45℃温度生长,但在15℃温度不生长;
(iii)为长杆形;并且
(iv)在细胞壁中具有磷壁酸甘油;
(b)同型发酵的乳杆菌属
(i)通过糖酵解途径产生乳酸,优选是L-或DL-乳酸异构体;
(ii)在15℃温度生长,但在45℃显示可变生长;
(iii)为短杆形或棒状;并且
(iv)在它们的细胞壁中具有磷壁酸核糖醇和/或磷壁酸甘油;
(c)异型发酵的乳杆菌属
(i)通过磷酸戊糖途径从葡萄糖产生至少50%量的乳酸,优选是DL-乳酸异构体;
(ii)产生二氧化碳和乙醇;
(iii)在15℃或45℃温度显示可变生长;
(iv)为长杆状或短杆状;并且
(v)在它们的细胞壁中具有磷壁酸甘油。
基于上述特征,上述微生物可以划分为属于乳酸菌组,尤其乳杆菌属。通过运用经典分类学,例如参考“伯杰氏***细菌学手册”(Williams&Wilkins Co.,1984)中的相关描述,可以确定微生物属于乳杆菌属。备选地,微生物可以通过本领域已知方法划分为属于乳杆菌属,例如,通过它们的代谢指纹,即此类一种或多种微生物的糖类代谢能力的比较性概览,或通过例如在Schleifer等,System.Appl.Microb.,18(1995),461-467或Ludwig等,System.Appl.Microb.,15(1992),487-501中所描述的其他方法。上述微生物能够代谢对属于乳杆菌属的微生物为典型并在本领域中已知的糖源。然而优选地,上述微生物具有选自如下的代谢指纹:
(i)它代谢D-乳糖,但不代谢L-山梨糖和/或D-蔗糖和/或D-菊粉,
(ii)它代谢菊粉,
(iii)它代谢L-山梨糖,但不代谢D-乳糖和/或D-蔗糖和/或菊粉,和
(iv)它代谢L-山梨糖,D-乳糖和菊粉。
优选地,上述微生物具有选自如下的代谢指纹:
(i)它代谢D-乳糖,但不代谢L-山梨糖,D-蔗糖和菊粉,
(ii)它代谢L-山梨糖,D-乳糖和菊粉,但不代谢D-蔗糖,
(iii)它代谢L-山梨糖,但不代谢D-乳糖,D-蔗糖和菊粉,和
(iv)它代谢L-山梨糖,D-乳糖,D-蔗糖,但不代谢菊粉。
当然,上述微生物不限于以前述代谢指纹形式代谢所提及的糖,但可以具有代谢通常为乳杆菌属物种所代谢的其他糖类的能力。
上述微生物属于乳杆菌属还可以使用本领域内已知的其他方法表征,如将待确定物种的总蛋白用SDS-PAGE凝胶电泳并将它们与已知且已表征的乳杆菌属菌株进行比较。本领域技术人员众所周知用于制备如上所述总蛋白图谱的技术以及此类图谱的数值分析。然而,只有当此过程的每一阶段充分标准化后,结果才可靠。为了满足在测定微生物附着于乳杆菌属时所需的精确性,标准化的方法通常由这些方法的创始人向公众提供,如Pot等在1994年9月12日至16日比利时根特大学由欧盟组织的“专题讨论会”期间提出的标准化方法(用于细菌分类和鉴定的指纹技术、全细胞蛋白的SDS-PAGE)。该技术中用于分析SDS-PAGE电泳凝胶的软件非常重要,因为物种相关程度依赖于该软件所使用的参数和算法。无需深入理论细节,由密度计测量并通过计算机归一化的条带的定量比较优选以Pearson相关系数进行。如此得到的相似性基线可以借助UPGMA(使用平均连锁的非加权配对分组方法)算法组织,UPGMA不仅能将最相似的图谱分成一组,而且还能构建进化树(参见在M.Goodfellow,A.G. O'Donnell编辑的Computer-assisted Bacterial Systematic中第337-368页Kerster,Numerical Methods in the classification and identification ofbacteria by electrophoresis,John Wiley and Sons Ltd,1985)。
备选地,所述的微生物来源于乳杆菌属还可以在所谓Riboprinter.RTM中从核糖体RNA方面表征。更优选地,上述物种与乳杆菌属的关系通过将所述细菌的16S核糖体RNA的核苷酸序列或编码16S核糖体RNA的基因组DNA的核苷酸序列与迄今所知乳酸菌的其他属和物种的核苷酸序列比较得到证实。另一种用于测定该物种与乳杆菌属的结合的优选替代方法是使用靶向16S-23S rRNA间隔区的种属特异性PCR引物。又一个优选的替代方法是借助产生株特异性DNA带型的RAPD-PCR(Nigatu等在Antonie van Leenwenhoek(79),1-6,2001),该方法允许确定鉴定的微生物来源于乳杆菌属。用于测定微生物来源于乳杆菌属的另一些技术是限制性片段长度多态性(RFLP)(Giraffa等,Int.J.Food Microbiol.82(2003),163-172)、重复元件指纹图谱(Gevers等,FEMS Microbiol.Lett.205(2001)31-36)或细菌细胞的脂肪酸甲酯(FAME)图式分析(Heyrman 等,FEMS Microbiol.Lett.181(1991),55-62)。备选地,乳杆菌属细菌可以通过凝集素分型(Annuk等,J.Med.Microbiol.50(2001),1069-1074)或通过分析细菌的细胞壁蛋白质(Gatti等,Lett.Appl.Microbiol.25(1997),345-348)确定。
上述微生物优选地是属于乳杆菌属的乳酸菌,更优选地是如本文中所述的乳杆菌属物种。甚至更优选地,所述乳杆菌是副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)或鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)。然而,乳杆菌属物种不因此受限。上述微生物可优选经过“分离”或“纯化”。术语“分离”意指将物质从其原始环境中移出,例如当物质天然存在时从其天然环境中移出。例如,在天然***中与某些或全部共同存在物质分开的天然存在的一种微生物优选乳杆菌属物种是分离的。此种微生物可以是组合物的部分,并且被视作仍是分离的,因为该组合物不是此微生物天然环境的部分。
术语“纯化的”不需要绝对纯净;实际上,它意为一个相对的定义。自文库所获得的单个微生物已常规地纯化至微生物学上的均一,即当通过领域内已知方法在琼脂平板上划线时,它们长成单个的菌落。优选地,用于此目的的琼脂平板对乳杆菌属物种有选择性。此类选择性琼脂平板在本领域内已知。
更优选地,上述属于乳酸菌组的微生物选自具有DSMZ保藏号DSM16667(副干酪乳杆菌类干酪亚种(L.paracasei ssp.paracasei)Lb-Ob-K1)、DSMZ保藏号DSM 16668(副干酪乳杆菌类干酪亚种Lb-Ob-K2)、DSMZ保藏号DSM 16669(副干酪乳杆菌类干酪亚种Lb-Ob-K3)、DSMZ保藏号DSM 16670(副干酪乳杆菌类干酪亚种Lb-Ob-K4)、DSMZ保藏号DSM16671(副干酪乳杆菌类干酪亚种Lb-Ob-K5)、DSMZ保藏号DSM16672(鼠李糖乳杆菌Lb-Ob-K6)和DSMZ保藏号DSM 16673(鼠李糖乳杆菌Lb-Ob-K7)的副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌或其变体或衍生物,其中所述变体或衍生物保留特异性结合变形链球菌群的能力。术语“具有DSMZ保藏号的副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌”涉及属于副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌物种的微生物细胞,所述微生物于2004年8月26日保藏至德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen GmbH;“DSMZ”),具有如下保藏号DSM 16667、16668、16669、16670、16671、16672或16673。DSMZ位于德国D-38124不伦瑞克,马舍尔欧德路1b。前述的DSMZ保藏根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款进行。
上述属于乳酸菌组的微生物,优选已保藏的副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌细胞的“变体或衍生物”优选地具有与所保藏各菌株相同的特征,即它保留了特异性结合变形链球菌群的能力,优选地具有如本文中上述的特征。例如,所述衍生物可以进行基因工程化。在本发明的上下文中,术语“基因工程化”以其最广泛的含义用于本领域技术人员已知的方法以便在体外和体内修饰目的核酸,以至通过重组DNA技术实施了遗传修饰并改变了基因。因此,所述的方法包括重组核酸的克隆、测序和转化为优选。为此目的,包括用于乳杆菌属物种的适宜载体例如在EP-B1 506 789、EP-B1 316 677、EP-B1 251 064、EP-B1 218 230、EP-B1 133 046或WO 89/01970中描述。
引物、酶、用于中间构建体的其他宿主细胞等可以得到使用并且为技术人员所知。优选地,基因工程变体包含上述属于乳酸菌组的微生物的细胞,优选地包含携带了包含在细菌染色体内和/或质粒里的重组核酸的已保藏乳杆菌属物种的细胞。该重组核酸优选地对上述属于乳酸菌组的微生物为外来。说到“外来”,这意指多核苷酸和核酸分子对宿主细胞是异源的,即意味衍生自具有不同基因组背景的细胞或生物,或多核苷酸和核酸分子对宿主细胞是同源的但是处在与该核酸分子的天然存在对应物不同的基因组环境中。这意味如果核酸分子与宿主细胞同源,该核酸分子不处在所述宿主细胞基因组内该核酸分子的天然位置上,尤其该核酸分子由不同基因所包围。此时,多核苷酸可以受自身启动子控制或受异源启动子控制。在宿主细胞中存在的上述载体或核酸分子可以整合至宿主细胞基因组或可以以某种形式存在于染色体外。就此而言,还应当理解上述核酸分子可以用于通过同源重组恢复或创造突变基因。
质粒可以是低、中等或高拷贝数的质粒。所述基因工程变体可以携带编码能降解蔗糖亚单位中的齿斑葡聚糖特异性1,3-糖苷键的葡聚糖酶或齿斑葡聚糖酶(mutanase)的核酸。真菌的葡聚糖酶例如在Fuglsang等,J.Biol.Chem.275(2000),2009-2018中描述。还可以预期基因工程变体包含了携带编码抗体的重组核酸的细胞,其中抗体优选地被分泌或被固定在细菌细胞壁上。术语“抗体”包括完整抗体及其抗体片段,如分别的轻链和重链、Fab、Fab/c、Fv、Fab’、F(ab’)2。术语“抗体”还包含人源化抗体、双功能抗体和抗体构建体,如单链Fvs(scFv)或抗体融和蛋白。还可以在本发明的上下文中预期术语“抗体”包含可以在上述保藏微生物的衍生物的细胞内表达的抗体构建体,例如可以通过本领域已知方法尤其经载体得以转化的抗体构建体。尤其可以预期此类抗体构建体特异性地识别例如链球菌抗原I/II。此种方法例如在Krueger等,Nat.Biotechnol.20(2002),702-706或Shiroza,Biochim Biophys Acta 1626(2003),57-64中描述。
分泌所表达的抗体优选通过将编码抗体的核酸有效连接至分泌信号序列来实现。锚定在细菌细胞壁内可利用分选酶机制完成。也就是说,***的表面蛋白质通过涉及切割保守性Leu-Pro-X-Thr-Gly(LPXTG)基序和发生在装配肽聚糖细胞壁期间的机制连接于细菌细胞壁。因此,编码抗体的核酸分子可以与编码前述保守基序的序列融合,该保守基序由分选酶利用以将蛋白质锚定至细菌细胞壁内。
还可以预计上述属于乳酸菌组的微生物、优选地已保藏的乳杆菌属物种经遗传修饰以携带编码抗变形链球菌尤其有效的抗微生物物质reuterin的核酸分子。Reuterin例如在Talarico等,Chemother.33(1989),674-679中描述。
上述属于乳酸菌组的微生物的变体,优选地所保藏乳杆菌属菌株的变体优选地受到人工突变。根据本发明,术语“突变”意指例如天然引起或通过物理方法或化学化合物/物质/药剂如EMS或ENU引起遗传物质即核酸的永久性修饰。所述修饰包括点突变,如在核酸/基因/染色体内转换或颠换、缺失/***/添加一个或多个碱基因而修饰核酸/基因/染色体,这尤其可能导致异常的基因表达/转录/翻译或无活性基因产物、组成型活化的/失活的基因产物,引起例如显性失活效应。优选地,突变导致特异性结合变形链球菌群的能力提高。因此,还优选这样的已保藏微生物的突变细胞,它在所需的基因内携带突变或在所需基因内的突变由本领域技术人员已知的方法诱导。现有技术中也已知突变的或遗传修饰的细菌细胞可以通过任何合适的方法/表型加以选择。在本发明上下文中,具有提高的特异性结合变形链球菌群能力的变体可以根据后续实施例中所述方法测试。然而,术语“变体”还包括在基因组内即在细菌染色体内携带天然存在的自发突变的上述属于乳酸菌组的微生物的细胞,优选地是已保藏的微生物的细胞。“自发突变”是天然发生的突变,即没有经过人工直接遗传操作或通过暴露于诱变剂。自发变体的选择可以通过培养菌株并选择所需要的变体完成,通过例如变异细菌显示受到提高的结合变形链球菌群的能力来选择。用于选择自发变体的方法在本领域内众所周知(参见例如,Sambrook,Russell"Molecular Cloning,A Laboratory Manual",Cold Spring HarborLaboratory,N.Y.(2001);Ausubel,"Current Protocols in MolecularBiology",Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989))。例如,此类突变可以在培养期间发生,例如在与DNA复制偶联的正常细胞***期间或在上述属于乳酸菌组的微生物的变体传代和/或保存期间。
口腔是众多不同种的链球菌的住所,并且由于它们分享相同的栖居地,因此毫不令人惊讶它们具有很多共同特点。因而优选上述属于乳酸菌组的微生物特异性结合变形链球菌群。因此。术语“特异性结合”在本发明上下文中意指上述属于乳酸菌组的微生物,优选地是属于结合变形链球菌群,尤其是变形链球菌,但不结合大多数其他链球菌,优选地不结合属于链球菌属的其他物种的乳杆菌属的微生物,其中属于链球菌属的其他物种是在实施例6中所述的物种。也就是说,上述属于乳酸菌组的微生物优选地不结合属于唾液链球菌(streptococus salivarius)物种(优选地属于嗜热亚种的细菌)、口腔链球菌(streptococus oralis)、轻链球菌(streptococusmitis)和/或至血链球菌(streptococus sanguis)。更优选地,它不结合唾液链球菌嗜热亚种(streptococus salivarius subsp.thermophilus)(由API 50CH鉴定(Biomerieux,法国))、口腔链球菌(DSMZ 20066)、口腔链球菌(DSMZ 20395)、口腔链球菌(DSMZ 20627)、缓症链球菌(DSMZ 12643)和/或血链球菌(DSMZ 20567)。此外,所述微生物优选地不结合除链球菌属之外属于其他属的细菌,例如葡萄球菌属(Staphylococcus)。更优选地,它不结合属于表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)物种的细菌。最优选地,它不结合表皮葡萄球菌(DSMZ 1798)和/或表皮葡萄球菌(DSMZ20044)。
如上所述,令人惊讶的发现选自它们与变形链球菌结合,而不与其他链球菌属物种,唾液链球菌、口腔链球菌、轻链球菌和或血链球菌结合的乳酸菌,显示还结合其他变形链球菌群,即显示上述常规性质,且也怀疑是龋的病原体的其他链球菌属物种的能力。因此,显示上述对变形链球菌特异性结合特征的乳酸菌,显示和还可用于预防或治疗除了变形链球菌的变形链球菌群导致的龋的能力。因此,在优选的实施方案中,乳酸菌的特征在于其显示上述与变形链球菌的结合特征(即(i)抗热处理;和/或(ii)
抗蛋白酶处理;和/或(iii)是钙依赖性的;和/或(iv)在pH 4.5和8.5范围间形成结合和/或(v)在唾液存在下形成结合),且该结合在本文所述检测中测试,其中使用的变形链球菌是属于变形链球菌群组的细菌。
为测试特异性结合,优选地将每一种前述的口腔细菌以体积比3:1与本文上述乳杆菌属培养物混合,并且如本文,例如实施例4或实施例5(优选如实施例5)中所述检测聚集。
已经证实上述副干酪乳杆菌,优选副干酪乳杆菌类干酪亚种不聚集任何前述属于链球菌属的口腔细菌并且它不结合属于上文中提及的葡萄球菌属细菌。证实上述鼠李糖乳杆菌菌株除了唾液链球菌嗜热亚种以外,不聚集以上提及的全部链球菌属和葡萄球菌属物种。术语“特异性结合”优选地还意指上述属于乳酸菌组的微生物结合能够成为致牙龋病原体的变形链球菌群菌株。
特异性结合作用包括通过上述属于乳酸菌组的微生物结合和优选地聚集口中如本文所述变形链球菌群细胞。这种特异性结合随后导致变形链球菌群细胞冲走,例如通过唾液流或如本文中所述的口腔清洁剂或漱口剂等。嘴定义为的哺乳动物的口腔、优选是人或动物如宠物的口腔,由口腔粘膜(齿龈、唇、颊、腭和口底)、舌和牙齿(包括人造结构物)组成。优选地,上述属于乳酸菌组的微生物对变形链球菌群的特异性结合阻止变形链球菌群细胞附着在牙齿表面(或不被理论所束缚,可引起变形链球菌群细胞从牙齿表面脱落)。结果,特异性结合作用引起变形链球菌群细胞被冲洗出口腔,因而减少龋病原体,并因此预防和/或治疗龋。
据认为上述属于乳酸菌组的微生物可特异性结合链球菌抗原Ⅰ/Ⅱ,该抗原又称作抗原B、IF、P1、SR、MSL-1或Pac。然而如本文中所述,上述属于乳酸菌组的微生物可以结合变形链球菌群的任何其他蛋白质或表面结构,因此聚集变形链球菌群并将其冲洗出口腔。已知变形链球菌通过所述链球菌抗原I/II结合表膜。因此,当上述属于乳酸菌组的微生物可以例如结合所述链球菌抗原I/II时,变形链球菌以及属于变形链球菌组的其他微生物对牙齿表面的结合受到阻碍,这因此有助于预防和/或治疗龋。
表膜是含有唾液中所存在的蛋白质和脂类(脂肪)的清亮薄覆盖物。它在牙齿表面清洁后数秒内形成。表膜形成是牙蚀斑形成的第一个步骤。牙蚀斑是一种聚集在牙齿上的柔软沉积物。蚀斑可以定义为复合的微生物群落,每毫克蚀斑中有超过1010个细菌。据估计可以在蚀斑中找到多达400种不同的细菌物种。除了细菌细胞外,蚀斑还含有少量上皮细胞、白细胞和巨噬细胞。细胞包含在由细菌产物和唾液形成的胞外基质内。胞外基质含有蛋白质、多糖和脂类。凝集素是存在于唾液中的一种蛋白质,据认为凝集素一方面部分地导致变形链球菌自嘴里除去,然而,另外一方面,据怀疑凝集素方便了变形链球菌附着于牙齿表面,因而促进变形链球菌对牙齿的最初附着,故促进龋发生。
可容易地测试上述属于乳酸菌组的微生物是否如上文中所定义特异性地结合变形链球菌群,尤其通过优选地应用如本文上述和后续实施例中所述方法,比较具有变形链球菌群细胞的微生物与同样属于乳杆菌属但不会特异性结合变形链球菌群的微生物的作用。
优选地,上述属于乳酸菌组的微生物能够特异性结合变形链球菌血清型c(DSMZ 20523)和/或血清型e(NCTC 10923)和/或血清型f(NCTC11060)和/或远缘链球菌DSM 20742和/或大鼠链球菌DSM 20564和/或仓鼠链球菌DSM 20562和/或野鼠链球菌DSM 20646和/或猕猴链球菌DSM 20714。
这意味着上述属于乳酸菌组的微生物优选结合少一种微生物,所述微生物选自变形链球菌血清型c(DSMZ 20523)、血清型e(NCTC 10923)、血清型f(NCTC 11060)、远缘链球菌DSM 20742、大鼠链球菌DSM 20564、仓鼠链球菌DSM 20562、野鼠链球菌DSM 20646和猕猴链球菌DSM20714,更优选的上述属于乳酸菌组的微生物结合上述细菌的任何组合、亚组的组。进一步优选地,上述属于乳酸菌组的微生物结合所有上述细菌。根据本发明“血清型”是细菌细胞的抗原特性、优选是由本领域内已知血清学方法所鉴定的变形链球菌或远缘链球菌细胞抗原性特性。
如上所述,上述属于乳酸菌组的微生物对变形链球菌群的特异性结合抗热处理。因此,上述属于乳酸菌组的微生物用热加以处理,例如在高于15℃或37℃的温度。更优选地,将细胞在超过55℃、甚至更优选地超过65℃、特别优选超过95℃和最优选在121℃温度时孵育。冷却后,如本文中所述测量上述属于乳酸菌组的微生物特异性结合变形链球菌群的能力。
相应的温度可能取决于特定乳杆菌属物种,但是可以轻易地通过常规实验由技术人员测得,例如通过将相应细胞在不同温度上孵育并通过使用如本文实施例中所述的方法测定仍能够特异性结合变形链球菌群的乳杆菌属细胞量。
通常,热处理应当持续至少1分钟时间。优选地,热处理应当持续至少n分钟时间,其中n是范围从2至60的整数,特别优选n=20。不过,对于孵育时间原则上没有上限。然而,它优选地不超过4、3、2或1小时。最优选的热处理是在温度121℃在具有2巴大气压饱和蒸汽内持续至少20分钟。将最优选的热处理视为消除了蛋白质的任何功能和细胞的任何活力,因此这区别了上述属于乳酸菌组的微生物和其他微生物,因为上述属于乳酸菌组的微生物仍能够特异性结合变形链球菌群。因此当需要微生物不需要是活的时,本发明的微生物对任何本发明的食品、饲料、饮料或组合物非常有用。
优选地,已经经历本文上述热处理的上述属于乳酸菌组的微生物具有特异性结合属于变形链球菌群组的细菌的增加的能力。术语“增加的能力”意指如检测的,例如通过本文上述检测的,优选如实施例5所述检测的,增加至少的5%,优选至少10%,更优选至少20%且最优选至少30%结合。在优选的实施方案中,已经经历热处理,具有特异性结合属于变形链球菌群组的细菌的增加的能力的上述属于乳酸菌组的微生物,属于副干酪乳杆菌物种,更优选属于副干酪乳杆菌类干酪亚种,最优选属于副干酪乳杆菌类干酪亚种Lb-Ob-K5(DSM 16671)。
上述属于乳酸菌组的微生物的特异性结合进一步通过它的抗蛋白酶处理表征,其中蛋白酶处理用选自链霉蛋白酶E、蛋白酶K、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的蛋白酶处理。这些蛋白酶是不表现特异性并且因此被认为可降解存在于微生物细胞表面的任何蛋白质的蛋白酶。其他已知对氨基酸残基的某种模式具有偏好性的蛋白酶是弹性蛋白酶、凝血酶、氨肽酶Ⅰ、羧肽酶、dostripain、内切蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或蛋白酶。后面的这些蛋白酶还可以用于测试上述属于乳酸菌组的微生物对变形链球菌群的特异性结合是否抵抗后面这些更特异的蛋白酶。因此,经过后续实施例中所述蛋白酶处理后,上述属于乳酸菌组的微生物仍能够特异性结合变形链球菌群。
此外,上述属于乳酸菌组的微生物的特异性结合进一步通过其对钙的依赖性表征。优选地,特异性结合在存在0.05mM至500mM之间、优选地1mM至100mM之间的钙离子浓度时发生。特别优选钙浓度在2mM至30mM之间。特异性结合对钙的依赖性可以如后续实施例中所述测试。
此外,与上述属于乳酸菌组的微生物特异性结合在pH范围4.0至9.0之间、优选地4.0至7.0之间得到维持。特别地,特异性结合仍发生的pH值优选地是4.5。特异性结合在如上所述pH范围内维持的分析在后续实施例中显示。
此外,特异性结合不受镁影响。因此,不需要镁离子或镁盐的存在,这在后续实施例中加以证实。
特异性结合的又一个特征是它在唾液存在时发生。唾液是由唾液腺合成的外分泌物。唾液是一种复杂液体,除了大约99%的水外,还含有多种有机化合物和无机化合物。唾液的生理成分尤其是酶,例如淀粉酶、糖酶、溶菌酶、过氧化物酶或蛋白质例如黏蛋白、乳铁蛋白、富含脯氨酸的蛋白、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白、histatines或statherines或可溶性IgA。因此,虽然唾液中存在多种潜在的干扰性物质,上述属于乳酸菌组的微生物的特异性结合未受干扰或阻碍。为了存在唾液时测试特异性结合,使用优选地包含实施例6中所述链球菌属物种和/或实施例6的葡萄球菌属物种的唾液为优选。然而,如果测试上述鼠李糖乳杆菌物种在存在唾液时对变形链球菌群的特异性结合,优选缺省唾液链球菌嗜热亚种。如本文中所述分析此特异性结合。
上述属于乳酸菌组的微生物的前述特征使其成为耐用和有效的用于预防和/或治疗龋的物质,因为将它以多种形式主要地施用至包括口腔和牙齿在内的嘴中,在那里尤其存在包含某些蛋白质的唾液以及在摄入含糖食品后的低pH值。此外,抗热性对于将上述属于乳酸菌组的微生物作为添加剂在食品制备期间添加至所述食品内具有有益的效果。也就是说,食品经常受到对微生物活力不利的加热灭菌、预先烹制、巴斯德消毒等作用。
在本发明的另一方面,上述属于乳酸菌组的微生物的衍生物用于上述用途中。术语“上述属于乳酸菌组的微生物的衍生物”意指上述属于乳酸菌组的微生物的热灭活或冻干的非活性形式、类似物或片段,其中所述非活性形式、类似物或片段保留特异性结合变形链球菌群的能力。
根据本发明,术语“上述属于乳酸菌组的微生物的失活形式或类似物”包括上述属于乳酸菌组的微生物的、优选本文中所公开的乳杆菌属物种的死细胞或灭活细胞,该细胞不再能够在对属于乳杆菌属的微生物为特异性的平板上形成单个菌落。所述的死细胞或灭活细胞可以具有完整的细胞膜或破损的细胞膜。用于杀死或灭活上述属于乳酸菌组的微生物细胞的方法在本领域内已知。El-Nezami等,J.Food Prot.61(1998),466-468描述了通过紫外线照射用于灭活乳杆菌属物种的方法。优选地,将上述属于乳酸菌组的微生物的细胞如后续实施例中所述进行热灭活或冻干。上述细胞冻干的有利之处在于这些细胞可以容易地贮存并操作,与此同时保留了它们特异性结合变形链球菌群的能力。此外在本领域内已知的条件下将冻干的细胞施加至合适的液体或固体培养基上时,它们可以再次培养。冻干通过本领域已知方法完成。优选地,冻干在室温即16℃至25℃间的任何温度上进行至少2小时。此外如下文实施例7或8中所示,上述属于乳酸菌组的微生物的冻干细胞在4℃稳定至少4周以至其仍特异性地结合变形链球菌群。热灭活可以通过将上述属于乳酸菌组的微生物的细胞在170℃温度孵育至少2小时完成。然而,热灭活优选地通过将所述细胞在121℃温度存在2巴大气压的饱和蒸汽下高压灭菌至少20分钟实现。作为备选,上述属于乳酸菌组的微生物细胞的热灭活通过将所述细胞在-20℃冷冻至少4周、3周、2周、1周、12小时、6小时、2小时或1小时完成。优选至少70%、75%或80%,更优选85%、90%或95%并且特别优选至少97%、98%、99%并且更特别优选99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%以及最特别优选100%上述属于乳酸菌组的微生物的类似物的细胞是死亡或灭活的,然而,它们仍具有特异性结合变形链球菌群的能力。可以通过本领域已知方法测试上述属于乳酸菌组的微生物的失活形式、类似物或碎片确实是否是死亡或灭活的,例如通过用于活力的试验。
术语“上述属于乳酸菌组的微生物的失活形式或类似物”还涵盖上述属于乳酸菌组的微生物的、优选是本文中公开的乳杆菌属物种的微生物的裂解物或部分(fraction)或提取物,其中所述裂解物、部分或提取物优选能够特异性结合属于变形链球菌群组的细菌。此结合能力如本文所述,尤其是如所附实施例所述测定。在本文上述根据本发明的方面(i)的微生物的裂解物、部分或提取物不特异性结合属于变形链球菌群组的细菌的情况下,本领域技术人员因而可以例如通过本领域已知的方法(下文所示例)进一步纯化所述裂解物、部分或提取物,由此除去抑制结合的物质。然后,本领域技术人员可以再次测定所述裂解物、部分或提取物是否特异性结合属于变形链球菌群组的细菌。
根据本发明,术语“裂解物”意指上述属于乳酸菌组的微生物已破裂细胞在含水介质中的溶液或悬浮液。然而,本术语不应当以任何限制性方式进行解释。细胞裂解物包含例如大分子如DNA、RNA、蛋白质、肽、糖、脂类等和/或小分子如氨基酸、糖、脂肪酸等,或其部分。此外,该裂解物包含可能是具光滑结构或颗粒结构的细胞碎片。优选地,所述裂解物包括细胞壁、细胞膜或其两者,或细胞壁、细胞膜或其两者的部分或片段。用于制备微生物细胞裂解物的方法在本领域内已知,例如,通过使用法氏挤压(French press)、使用玻璃珠或铁珠的细胞磨或细胞的酶裂解法。此外,细胞的裂解涉及本领域内已知用于打开/破坏细胞的多种方法。用于裂解细胞的方法不重要并且可以采用能够完成裂解上述属于乳酸菌组的微生物细胞的任意方法。适宜方法可以由本领域的技术人员选择,例如细胞的打开/破坏可以通过酶、化学或物理方式实现。对酶和酶混合物的非限制性实例是蛋白酶,如蛋白酶K、脂肪酶或糖苷酶。对化学品的非限制性实例是离子载体、洗涤剂如十二烷基硫酸钠、酸或碱;并且物理方法的非限制性实例是高压如法式挤压(French pressing)、渗透压、温度如热或冷。此外也可以利用采用了除蛋白水解酶以外的酶、酸、碱等适宜组合的方法。例如,上述属于乳酸菌组的微生物的细胞可以通过冷冻和融化裂解,更优选地在低于-70℃的温度冷冻并在超过30℃的温度融化,特别地特别优选在低于-75℃的温度冷冻并且在超过35℃的温度融化并且最优选用于冷冻的温度低于-80℃并且用于融化的温度超过37℃。还优选将所述的冷冻/融化重复至少1次、更优选地至少2次、甚至更优选至少3次、特别优选至少4次并且最优选至少5次。
因此,本领域技术人员可以通过参考以上一般性说明制备所需的裂解物并根据需要适当调整或改变这些方法。优选地,如所述用于裂解物的含水介质是水、生理盐水或缓冲溶液。细菌细胞裂解物的有利之处在于因为它需要较少的技术设施,故可以容易地产生并低成本地贮存。
优选的,术语“提取物”意指上述属于乳酸菌组的微生物的亚细胞成份,例如大分子,如蛋白质、DNA、RNA、肽、糖类、脂类等,和/或小分子,例如氨基酸、糖、脂酸等,或任何其他的有机化合物或分子,或所述大分子和/或小分子的组合,或其部分,其中,所述提取物保留特异性结合属于变形链球菌群组的细菌的能力。该特异性结合可如本文所述,尤其如所附实施例所述测定。优选地,所述提取物包含细胞壁或细胞膜或其两者,或细胞壁或细胞膜或其两者的部分或碎片。更优选地,术语“提取物”指在无细胞培养基中任意的上述亚细胞成份。
在另一优选的实施方案中,可以通过本领域公知的多种打开/损坏细胞的方法裂解细胞获得提取物,其如上所述和/或作为上述属于乳酸菌组的微生物培养物在本领域技术人员公知的任何合适的液体、培养基或缓冲液中的离心操作的上清、或这类培养物的裂解物或任何其他适合的细胞悬浮液的离心操作的上清。更优选的,该提取物可以是纯化的裂解物或细胞培养物上清或其任何部分或亚部分,其中所述纯化的裂解物或细胞培养物上清或其任何部分或亚部分保留特异性结合属于变形链球菌群组的细菌的能力。该结合可如本文所述,尤其如所附实施例所述测定。分部分离和纯化裂解物或培养物上清或提取物的合适的方法是本领域技术人员公知的并且包括,例如,亲合色谱法、离子交换色谱法、大小排阻色谱法、反相色谱法和使用其他材料柱或分批处理法的色谱法;其他分级方法,例如过滤法,例如超滤、透析、透析和使用离心中的大小排阻色谱法浓缩、密度梯度或分步基质(step matrices)离心;沉淀,例如亲合沉淀、盐溶或盐析(硫酸铵沉淀)、乙醇沉淀或其他合适的蛋白质化学、分子生物、生化、免疫、化学或物理方法。
根据本发明,裂解物还是来自如上所提及裂解物的分子级分制备物。这些级分可以通过本领域技术人员已知的方法得到,例如层析,包括例如亲和层析、离子交换层析、大小排阻层析、反相层析和柱子内具有其他层析材料的层析或分批处理法、其他分级方法例如过滤方法如超滤、透析、透析和在离心时附带大小排阻作用的浓缩、在密度梯度或阶梯基质内的离心或者沉淀,例如亲和沉淀、盐析或盐溶(硫酸铵沉淀)、醇沉淀或其他蛋白质化学、分子生物学、生物化学、免疫学、化学或物理方法以分离裂解物的以上成分。在一个优选的实施方案中,优选免疫原性比其他级分更强的那些级分。本领域技术人员还能够选择合适方法并通过参考以上的一般描述和本文实施例中的具体描述测定其免疫原潜力,并根据需要适宜地修改或改变这些方法。
因此,术语“上述属于乳酸菌组的微生物的无活性形式或类似物”还包括如本文上述的本发明微生物(优选这里公开的乳杆菌物种)的滤液,其中所述滤液优选保留特异性结合属于变形链球菌群组的细菌的能力。该结合可如本文所述,尤其如所附实施例所述测定。在本文上述属于乳酸菌组的微生物的滤液不特异性结合属于变形链球菌群组的细菌的情况下,本领域技术人员因而可以例如通过本领域已知的方法(下文所示例)进一步纯化所述滤液,由此除去抑制结合的物质。然后,本领域技术人员可以再次测定所述滤液是否特异性结合属于变形链球菌群组的细菌。
术语“滤液”意指本文如上所述的本发明微生物的无细胞溶液或悬浮液,其作为对在本领域技术人员公知的任何合适的液体、培养基或缓冲液中上述属于乳酸菌组的微生物培养物离心操作已经获得的上清液。然而,不应该以任何限制的方式解释该术语。滤液包含,例如大分子,如DNA、RNA、蛋白质、肽、糖类、脂类等,和/或小分子,例如氨基酸、糖、脂酸等,或其部分。用于制备微生物的滤液的方法是本领域公知的。此外,“过滤”涉及本领域公知的多种方法。具体的方法并不重要,并且可以使用能够获得本文如上所述的本发明的微生物的滤液的任何方法。
“上述属于乳酸菌组的微生物的碎片(fragment)”包括上述属于乳酸菌组的微生物的细胞的任意部分。优选地,所述碎片是通过膜制备物得到的膜级分。属于乳杆菌属的微生物的膜制备物可以通过本领域已知方法得到,例如,通过采用在Rollan等,Int.J.食品Microbiol.70(2001),303-307,Matsuguchi等,Clin.Diagn.Lab.Immunol.10(2003),259-266或Stentz等,Appl.Environ.Microbiol.66(2000),4272-4278或Varmanen等,J.Bacteriology 182(2000),146-154中描述的方法。备选地,还考虑了完整细胞制备物。优选地,在本文中所述的上述属于乳酸菌组的微生物的衍生物或碎片保留了本文中详细描述的特异性结合变形链球菌群的能力。
另一方面,本发明涉及包含上述属于乳酸菌组的微生物,或其衍生物、变体或类似物或碎片在制备防龋组合物中的用途,特别是制备用于治疗或预防除了变形链球菌的变形链球菌群导致的龋的药物或美容组合物中的用途。优选地,组合物包含属于乳酸菌组的微生物,所述微生物能够特异性结合变形链球菌群或该微生物的变体、衍生物、类似物或碎片。更优选地,该微生物是本文上述保藏的微生物,或该微生物的变体、衍生物、类似物或碎片。在进一步优选的实施方案中,该组合物包括上述微生物的量在每mg固体形式的组合物中102至1012细胞,优选103至108个细胞之间。在液体形式的组合物的情况下,微生物的量是在每毫升102至1013个细胞之间。然而对于特定组合物,微生物的数量如本文中所述可以不同。本发明优选的防龋组合物不含范围在1%(w/w)和6%(w/w)之间的乳糖。还优选该组合物含有不超过1%(w/w)的乳糖,例如它含有少于1%、优选地少于0.9%(w/w)、0.8%(w/w)等的乳糖或该组合物含有超过6%、7%、8%等(w/w)的乳糖。备选地,但也优选该组合物不含乳糖。
另一个方面,可产生此类防龋组合物,其包括将能够特异性结合变形链球菌群的属于乳酸菌组的微生物,或这种微生物的变体、衍生物、类似物或碎片与可美容用、可口腔用或可药用的载体或赋形剂制剂的步骤。优选地,所述微生物是本文上述保藏的微生物,或其变体、衍生物、类似物或碎片。本发明优选的防龋组合物不含范围在1%(w/w)和6%(w/w)之间的乳糖。还优选该组合物含有不超过1%(w/w)的乳糖,例如它含有少于1%、优选地少于0.9%(w/w)、0.8%(w/w)等的乳糖或该防龋组合物含有超过6%、7%、8%等(w/w)的乳糖。备选地,但也优选该防龋组合物不含乳糖。
术语“组合物”当根据本发明使用时涉及这样的组合物,其包含如上所述的至少一种微生物或变体或衍生物,优选地是上述保藏的微生物或变体,或所述微生物的衍生物或者类似物或碎片。可以预计下文中所述的本发明所用的组合物包含了任意组合的前述成分。本发明的组合物可以任选地包含至少一种适用于预防和/或治疗龋的其他成分。因此,本发明的组合物可以任选地包含此后所述的另外成分的任意组合。术语“含有适用于预防和/或治疗龋的成分”包括抑制变形链球菌对牙齿表面、表膜的结合和/或灭活变形链球菌群的化合物或组合物和/或其组合。更优选地,该术语包括如下将要描述的可以抑制变形链球菌群附着至牙齿表面、抑制变形链球菌群糖基转移酶活性、抑制或灭活变形链球菌群、抑制变形链球菌群凝集素依赖性结合和/或抑制变形链球菌群蔗糖依赖性结合的化合物或组合物和/或其组合。
特别地,可以预计此组合物还任选地包含抑制变形链球菌群附着至牙齿表面的化合物。因此,可以预计此化合物是变形链球菌的感应性信号肽(competence signal peptide;CSP)的抑制物。该抑制物在CA 2,302,861中描述为所述CSP的衍生物或片段,其中该抑制物竞争性地抑制CSP结合其天然受体(一种组氨酸激酶受体)或者它是抗CSP抗体。所述抑制物阻止牙蚀斑的生物膜环境在牙齿表面上的发展,因此阻止变形链球菌群的结合。备选地,用于本发明的组合物可以还任选地包含用于治疗和/或预防龋的变形链球菌I/II抗原的多肽片段。此类多肽片段在US 6,500,433中描述。也就是说,所述的多肽片段可以通过与天然存在的变形链球菌抗原I/II竞争的方式结合凝集素而具有黏附至哺乳动物牙齿表面的能力,因此预防或减弱变形链球菌对牙齿的附着。已经证实US 6,500,433中的某些肽抑制变形链球菌对牙齿表面模型(人的完全唾液吸附至聚苯乙烯微量滴定平板孔或羟基磷灰石珠)的附着。因此,US 6,500,433描述了包含一个或多个附着位点并以与天然存在的SA I/II竞争的方式粘附至哺乳动物牙齿的这类肽。用于本发明的组合物的另一任选成分是如WO 00/66616中所述的来自变形链球菌的菌毛相关黏着蛋白SmaA或其片段。SmaA蛋白是来自变形链球菌菌毛的介导细菌对唾液表膜附着的黏着蛋白质,据认为该附着通过结合52kd唾液蛋白-淀粉酶完成。在还原型聚丙烯酰胺凝胶上测量成熟SmaA蛋白时,它具有大约65,000道尔顿(kd)的分子量,表现淀粉酶结合能力并且是变形链球菌的主要免疫优势菌毛蛋白。因此,据信SmaA与变形链球菌群竞争牙齿表面的附着位点。
如上所述,可以预计抑制变形链球菌群糖基转移酶活性的化合物也任选地包括在用于本发明的组合物内。例如,US 2004/0057908描述了抑制所述的糖基转移酶活性的萜类化合物和黄酮类的混合物。Duarte等,Biol.Pharm.Bull.26(2003),527-531描述了新型蜂胶及其化学级分对糖基转移酶以及对变形链球菌生长和附着的影响。因此,预期该新型蜂胶及其化学级分将是用于本发明的组合物的又一任选成分。Koo等,J.Antimicrob.Chemother.52(2003),782-789描述了芹菜苷配基和tt-法尼醇抑制变形链球菌生物膜的积累和多糖产生。因此,预期芹菜苷配基和tt-法尼醇将任选地包含在本发明的组合物内。由于在Devulapalle等,Carbohydr.Res.339(2004),1029-1034中描述了糖脂肪酸酯影响糖基转移酶活性,故预期所述糖脂肪酸酯将任选地包含于用于本发明的组合物内。
直接抑制变形链球菌例如在WO 2004/000222中描述。也就是说,将遗传修饰的变形链球菌特异性噬菌体用于治疗由变形链球菌所致的细菌性龋。WO 2004/017988描述了生物活性蛋白酶和至少一种用于治疗细菌性龋的生物活性糖苷酶的组合物。Imazato等,Biomaterials 24(2003),3605-3609描述了异丁烯酰基氧基十二烷基溴化吡啶(MDPB)用于抑制变形链球菌生长。因此,可以预计前述该化合物可以任选地也包含在用于本发明的组合物内。
预期由Mitoma等,J.Biol.Chem.276(2001),18060-18065所述的牛乳乳铁蛋白或Nostro等,Lett.Appl.Microbiol.38(2004),423-427所述抑制变形链球菌凝集素依赖性结合或蔗糖依赖性结合的意大利蜡菊(Helichrysum italicum)提取物也任选地包含在用于本发明的组合物内。
此外,用于本发明的组合物还可以任选地包含例如在DE 2152620或Fuglsang(2000),loc.cit.中描述的齿斑葡聚糖酶(1,3-葡聚糖酶)或抗变形链球菌的抗生素,如那些在US 6,342,385;US 5,932,469;US 5,872,001或US 5,833,958中描述的抗生素。此外,应当指出用于本发明的组合物可以任选地包含一种或多种适用于预防和/或治疗龋的任选前述成分。因此,该组合物可以含有至少二、三、四、五等即“n”种任选成分,其中“n”不受限制地是大于二的整数。所述的任选成分可以在任何可能的组合中组合。
组合物可以为固体、液体或气体形式,并且可以尤其是粉剂、片剂、膜制备物、溶液剂、气雾剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊剂、糖浆剂、液体制剂、酏剂、提取物、酊剂或流体提取物的形式或处于特别适合经口施用的形式。
可以使用水、常见糖如蔗糖、山梨醇和果糖、二元醇如聚乙二醇和丙二醇、油如芝麻油、橄榄油和大豆油、抗菌剂如对羟基苯甲酸酯、防腐剂如对羟基苯甲酸酯衍生物例如对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠以及其他材料如香料,例如草莓香料或欧薄荷制备适合经口施用的液体制剂,例如糖浆剂。
此外可以使用常见的糖如蔗糖、葡萄糖、甘露醇和山梨醇、淀粉如马铃薯、小麦和玉米淀粉、无机材料如碳酸钙、硫酸钙、碳酸氢钠和氯化钠、植物粉末如结晶纤维素、甘草粉和龙胆粉、赋形剂如pinedex、崩解剂如淀粉、琼脂、明胶粉末、结晶纤维素、羧甲纤维素钠、羧甲纤维素钙、碳酸钙、碳酸氢钠和海藻酸钠、润滑剂如硬脂酸镁、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇和硅油、粘合剂如聚乙烯醇、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、明胶和淀粉胶流体(starch glue fluid)、表面活性剂如脂肪酸酯和增塑剂如甘油产生适合经口施用的制剂例如片剂、粉剂和颗粒剂。膜制备物可以通过本领域已知方法制备。用于制备膜的实施例在本文实施例27中给出。
在常规经口施用时,上述微生物或类似物或碎片的剂量可以(以干重计算)如本文上述相对于细胞数目或相对于质量是例如每日一次或每日数次对每个受试者1μg至50g、1μg至10g、1μg至5mg、1μg至1mg或任何其他重量。在向非人动物施用时,剂量根据动物年龄和种类及其症状特点或严重性变化。不做特定限制,用于动物的剂量是每日一次或每日数次以每1公斤体重0.1mg至10g、优选每1公斤体重1mg至1g施用。然而,这些剂量和剂量数根据个体状况改变。
优选地,用于本发明的防龋组合物是还包含可美容用的载体或赋形剂的美容组合物。更优选地,该美容组合物是具有抗变形链球菌群活性的牙膏、口香糖、锭剂、漱口剂、口腔清洗剂、牙线或洁牙带。用于本发明的优选美容组合物不含范围在1%(w/w)和6%(w/w)之间的乳糖。还优选该美容组合物含有不超过1%(w/w)的乳糖,例如它含有少于1%、优选地少于0.9%(w/w)、0.8%(w/w)等的乳糖或该美容组合物含有超过6%、7%、8%等(w/w)的乳糖。备选地,但也优选该美容组合物不含乳糖。
用于本发明的美容组合物包含与本发明组合物结合的如上所述微生物、其变体、衍生物、类似物或碎片并且还含有可美容用或可口腔用的载体。优选地,如所提及与用于本发明的组合物结合的微生物、其变体、衍生物、类似物或碎片是本文上述的微生物、变体、衍生物、类似物或碎片。用于本发明的美容组合物优选地用于口腔应用。因此,它可以是牙膏、牙粉(dentifrice)、牙粉、局部口用凝胶剂(topical oral gel)、口腔清洁剂、假牙产品(denture product)、口腔喷剂、锭剂、经口施用片剂、口香糖、牙线或洁牙带形式。
术语“可口腔用或可美容用的载体”如本文中所用意指可以用于将本组合物以安全和有效的方式施用至口腔的合适载体。此类载体可以包括如下材料,如氟化物离子源、额外的防牙垢剂、缓冲剂、其他研磨材料、过氧化物源、碱金属碳酸氢盐、增稠材料、湿润剂、水、表面活性剂、二氧化钛、香料***、甜味剂、木糖醇、着色剂及其混合物。术语“安全且有效的量”如本文中所用意指足以清洁和减少污点/蚀斑/龈炎/牙石而不损坏口腔中组织和结构的量。
本文中所述的本组合物的pH范围优选地是大约3.0至大约9.0,优选的pH是大约5.5至大约9.0并且最优选的pH是从7.0至大约8.5或9.0。
美容组合物是这样的产品,它在日常应用过程中为了特定治疗剂的全身施用目的不用于吞咽,但是为了口腔活性在口腔中滞留足够的时间以充分接触所有的牙齿表面/或口腔组织。口腔用组合物可以是单一相的口腔用组合物或可以是两种或多种口腔用组合物的组合。术语“牙粉”如本文中所用指膏、凝胶或液体制剂,除非另外说明。牙粉组合物可以处于任何所需要的形式,如深度带条的(deep striped)、表面带条的(Surface striped)、多层的、膏体周围包围凝胶或其任意组合。牙粉组合物可以包含在分散***中物理分隔的区室内并且逐步分发。牙粉组合物例如在EP-B1 0 617 608中描述。
优选的牙粉组合物描述于实施例21至24。除上述成分外,本发明的牙粉组合物可以含有多种任选的牙粉成分,其中某些描述如下。任选的成分包括例如,但不限于胶粘剂、发泡剂、增香剂、甜味剂、其他抗蚀斑剂、额外磨料和着色剂。这些任选的成分和其他任选的成分也例如在US 5,004,597;US 4,885,155;US 3,959,458和US 3,937,807中描述。
例如,牙粉可以包含表面活性剂、螯合剂、氟化物源、牙齿增白活性物质和牙齿颜色调节材料、增稠剂、湿润剂、增香剂及甜味剂、碱金属碳酸氢盐、各种载体和/或其他活性物质。
用于本发明的优选的任选试剂中的一种试剂是表面活性剂,优选地是选自肌氨酸酯表面活性剂、羟乙基磺酸盐(isethionate)表面活性剂或牛磺酸盐表面活性剂中的一种表面活性剂。这些表面活性剂的碱金属盐或铵盐优选地用于本文中。本文中最优选如下表面活性剂的钠盐和钾盐:月桂酰基肌氨酸盐、肉豆蔻酰基肌氨酸盐、棕榈酰基肌氨酸盐、硬脂酰基肌氨酸盐和油酰基肌氨酸盐。
另一种优选的任选物质是螯合剂,如酒石酸及其可药用的盐、柠檬酸和碱金属柠檬酸盐及其混合物。螯合剂能够复合细菌细胞壁中发现的钙。螯合剂还可以通过将钙从有助于维持此生物质完整的钙桥中移去而破坏蚀斑。
通常使牙粉和其他口腔用组合物中具有额外的水溶性氟化物化合物,它的量足以于25℃在组合物中和/或在使用时产生大约0.0025%至大约5.0%重量、优选地大约0.005%至大约2.0%重量的氟化物浓度以提供额外的抗龋效力。种类多样的产生氟化物离子的材料可以用于本组合物中作为可溶性氟化物的来源。产生氟化物离子的适宜材料实例在US 3,535,421和US 3,678,154中找到。代表性氟化物离子源包括氟化亚锡、氟化钠、氟化钾、单氟磷酸钠及众多氟化物。特别优选氟化亚锡和氟化钠及其混合物。
用于本发明的口腔护理组合物还可以包含牙齿增白活性物,所述牙齿增白活性物包含漂白剂或氧化剂,如过氧化物、过硼酸盐、过碳酸盐、过氧酸、过硫酸盐、金属亚氯酸盐及其组合。合适的过氧化物化合物包括过氧化氢、过氧化物脲、过氧化钙及其混合物。优选的过碳酸盐是过碳酸钠。其他合适的增白剂包括钾、铵、钠和锂的过硫酸盐和过硼酸盐单水合物和四水合物以及焦磷酸钠过氧水合物。合适的金属亚氯酸盐包括亚氯酸钙、亚氯酸钡、亚氯酸镁、亚氯酸锂、亚氯酸钠和亚氯酸钾。优选的亚氯酸盐是亚氯酸钠。其他的增白活性物可以是次氯酸盐和二氧化氯。
除了漂白剂作为牙齿增白剂外,牙齿颜色修饰物质可以在用于本发明的口腔护理活性物中考虑。这些物质适于修饰牙齿的颜色以满足消费者。这些物质包含了在施加至牙齿表面后在光的吸收或反射方面修饰牙齿表面的颗粒。当含有此类颗粒的膜施加至牙齿表面上时,此类颗粒引起外观改善。
在制备牙膏或凝胶时,需要添加某些增稠材料以提供组合物所需要的稠度、提供使用时所需要的活性物释放特征、提供货架稳定性并提供组合物的稳定性等。优选的增稠剂是羧乙烯聚合物、角叉菜聚糖、羟乙基纤维素、锂皂石以及纤维素醚的水溶性盐如羧甲基纤维素钠和羧甲基羟乙基纤维素钠。也可以是使用天然树胶,如刺梧桐树胶、黄原胶、***树胶和黄蓍树胶。还可以使用胶体性镁铝硅酸盐或精细粉碎的二氧化硅作为增稠剂的部分以进一步改善质地。
本发明组合物中局部用于口腔的载体的另一种任选成分是湿润剂。湿润剂的作用是防止牙粉组合物在接触于空气时***、给予组合物湿润口腔的感觉并且对于特定湿润剂而言赋予牙粉组合物受欢迎的甜美风味。在纯的湿润剂基础上,湿润剂通常占本文中组合物重量的大约0%至大约70%、优选地大约5%至大约25%。适用于主题发明组合物中的湿润剂包括可食的多元醇如甘油、山梨醇、木糖醇、丁二醇、聚乙二醇和丙二醇,尤其是山梨醇和甘油。
还可以将增香剂和甜味剂添加至组合物。合适的增香剂包括冬青油、薄荷油、留兰香油、丁香花蕾油、薄荷脑、茴香脑、水杨酸甲酯、桉树脑、肉桂(cassia)、乙酸1-薄荷醇酯、鼠尾草、丁香酚、欧芹油、oxanone、α紫罗兰酮、马郁兰、柠檬、橙、丙烯基乙基愈创木酚、肉桂(cinnamon)、香草醛、麝香草酚、芳樟醇、称作CGA的肉桂醛乙酸甘油酯及其混合物。增香剂通常以占组合物重量大约0.001%至大约5%的水平用于组合物。
可以使用的甜味剂包括蔗糖、葡萄糖、糖精、右旋糖、左旋糖、如上文中所述的乳糖、甘露醇、山梨醇、果糖、麦芽糖、木糖醇、糖精盐、竹芋蛋白、阿斯帕坦、D-色氨酸、二氢查耳酮、丁磺氨和环拉酸盐,尤其是环拉酸钠和糖精钠,以及其混合物。组合物优选地包含大约0.1%至大约10%的这些物质,优选地占组合物重量的大约0.1%至大约1%。
本发明还可以包括碱金属碳酸氢盐。碱金属碳酸氢盐可溶于水并且倾向于在含水***中释放二氧化碳,除非加以稳定。碳酸氢钠又称作苏打粉,是优选的碱金属碳酸氢盐。本组合物可以含有大约0.5%至大约30%、优选地大约0.5%至大约15%、并且最优选地大约0.5%至大约5%的碱金属碳酸氢盐。
用于制备商业合适的口腔用组合物中的水应当优选地具有低离子浓度并且无有机杂质。水通常包含本文中含水的牙粉组合物重量的大约10%至大约50%并且优选地是大约20%至大约40%。水的这些量包括额外添加的随同其他材料如山梨醇引入的游离水。还可以将二氧化钛添加至本组合物。二氧化钛是白色粉末,它增加了组合物的不透明性。二氧化钛通常占牙粉组合物重量的大约0.25%至大约5%。
本组合物的pH优选地通过使用缓冲剂调节。如本文中所用的缓冲剂指可以用于调节组合物pH至范围大约4.5至大约9.5。缓冲剂包括磷酸二氢钠、磷酸钠、氢氧化钠、碳酸钠、焦磷酸钠、柠檬酸和柠檬酸钠。缓冲剂可以以本组合物重量大约0.5%至大约10%的水平施用。牙粉组合物的pH可以从3:1的含水牙粉浆例如3份水对1份牙膏进行测量。
可用于本组合物中的其他任选物质包括选自烷基和烷氧基-聚二甲基硅氧烷共聚醇如C12至C20烷基聚二甲基硅氧烷共聚醇的聚二甲基硅氧烷共聚醇及其混合物。高度优选的是商品名称作Abil EM90的为十六烷基聚二甲基硅氧烷共聚醇。聚二甲基硅氧烷共聚醇通常占大约0.01%至大约25%、优选地大约0.1%至大约5%、更优选地大约0.5%至大约1.5%的重量水平。聚二甲基硅氧烷共聚醇有助于提供良好的牙齿感觉益处。其他有用载体包括双相牙粉制剂,如在US 5,213,790;US 5,145,666;US 5,281,410;US 4,849,213和US 4,528,180中公开的那些载体。
美容组合物还可以包括其他活性剂,如抗菌剂。此类物质包括非水溶性的非阳离子抗菌剂,如卤化的二苯醚、酚类化合物包括酚及其同系物、单烷基和多烷基的和芳香的卤代酚、间苯二酚及其衍生物、双酚化合物和卤化N-水杨酰替苯胺、苯甲酸酯和卤化N-碳酰苯胺。水溶性抗菌剂包括在其他水溶性抗菌剂中的季铵盐和bis-biquanide盐。三氯生单磷酸是额外的水溶性抗菌剂。季铵剂包括这样的季铵剂,在其中四价氮上的一个或两个取代基具有大约8至大约20个,通常大约10至大约18个碳原子的碳链长度(一般是烷基),与此同时剩余取代基(一般是烷基或苄基)具有数量较少的碳原子,例如大约1至大约7个碳原子,一般是甲基或乙基。溴化十二烷基三甲铵、氯化十四烷基吡啶、度米芬溴、氯化N-十四烷基-4-乙基吡啶、溴化十二烷基二甲基(2-苯氧乙基)铵、氯化苄二甲基硬脂基铵、氯化十六烷基吡啶、季铵化5-氨基-1,3-双(2-乙基-己基)-5-甲基六氢嘧啶、苯扎氯铵、苄索氯铵和甲基苄索氯铵是示例性的常用季铵抗菌剂。其他化合物是如在US 4,206,215中公开的双[4-(R-氨基)-1-吡啶]烷。还可以包括其他抗菌剂如双氨基乙酸铜、氨基乙酸铜、柠檬酸锌和乳酸锌。酶是可用于本组合物中的另外类型的活性物。有用的酶包括属于蛋白酶、裂解酶、蚀斑基质抑制剂和氧化酶组别的酶:蛋白酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶;细胞壁裂解酶包括溶菌酶;蚀斑基质抑制剂包括葡聚糖酶、齿斑葡聚糖酶;并且氧化酶包括葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、半乳糖氧化酶、尿酸氧化酶、过氧化物酶包括辣根过氧化物酶、髓过氧化物酶、乳过氧化物酶、氯过氧化物酶。除抗菌活性外,氧化酶还具有增白/清洁活性。此类物质在US 2,946,725并在US 4,051,234中公开。抗菌剂包括氯己定、三氯生、三氯生单磷酸和香料油如麝香草酚。三氯生和此类型的其他物质在US 5,015,466和US 4,894,220中公开。这些提供抗蚀斑益处的物质可以占牙粉组合物重量的大约0.01%至大约5.0%。
术语“口香糖”如本文中定义意指适合咀嚼并包含本领域技术人员已知的任何合适量(优选为2%或更高的组合物重量)的高弹体的糖食组合物。合适锭剂和口香糖成分例如在US 4,083,955;US 6,770,264或US 6,270,781中公开。优选的锭剂是在实施例19和20中描述的那些锭剂。优选的口香糖组合物在实施例25描述。
用于本发明的组合物优选地包含一种高弹体或数种不同高弹体的混合物。高弹体材料通常在本领域已知,不过示例性实例包括丁苯橡胶(SBR);合成树胶;聚异丁烯和异丁烯-异戊二烯共聚物;天然树胶;糖胶树胶;天然橡胶;节路顿胶;巴拉塔树胶;杜仲胶;莱开欧胶(lechi caspi);sorva及其混合物。用于本发明的组合物优选地包含大约2%至大约30%、更优选地大约5%至大约25%重量的高弹体。这些含量由口香糖所需要的最终质感确定,因为当高弹体的总含量低于大约2%时,基础组合物缺乏弹性、咀嚼质感和粘性,而高于大约30%时,制品发硬,有弹性并且维持为硬的口香糖。高弹体溶剂也优选地存在于用于本发明的组合物内,因为它们辅助软化高弹体成分。用于本文的高弹体溶剂优选的实例包括部分氢化的木松香的季戊四醇酯、木松香的季戊四醇酯、部分二聚化化的松香的甘油酯、聚合松香的甘油酯、浮油松香、木松香或松香的甘油酯、部分氢化的松香的甘油酯、部分氢化的松香的甲基酯及其混合物。用于本发明的组合物优选地包含大约2%至大约50%、更优选地大约10%至大约35%重量的高弹体溶剂。
可以制备根据本发明使用的锭剂,例如,通过本领域认可的用于形成压缩片剂的技术,其中将二糖分散在可压缩的固体载体上,任选地与任何适宜的压片助剂如润滑剂(例如硬脂酸镁)结合并被压缩为片剂。用于压片制剂的固体载体成分可以是可溶于唾液的固体如冷水可溶性淀粉或单糖,以至当锭剂含在嘴里时,它在嘴内迅速溶解以将所含的二糖酸释放于唾液溶液内,用于接触口/喉粘膜并且由其吸收。如上所述制剂的pH范围可以是大约4至大约8.5。
还可以利用其他本领域认可的固体单一剂量制剂技术制备根据本发明使用的锭剂。
用于本发明的漱口剂或口腔清洁剂可以优选地如下所示:
将A充分混合,将B在搅拌下加入并且随后加入C。得到的清亮液体在制备后48小时内过滤。另一种优选的漱口剂在实施例26中描述。
无论剂型如何,是液体或固体,在本发明的一个优选实施方案中该剂型在患者嘴里停留一段时间以促进微生物或上述属于乳酸菌组的微生物的类似物或碎片接触患者口腔。
本文所用术语“牙线”和“洁牙带”意指移去和去除堆积在牙间和龈下表面的可分解的食物材料的物质,和移去和去除堆积在口腔中的细菌、蚀斑和/或结石的物质。牙线或洁牙带除了含有本文上述的本发明微生物外,还可含有清洁剂、研磨剂、牙石控制组分、增白剂、表面活性剂和/或诸如氟化物、抗微生物剂、化疗剂或抗生素的活性组分。其他的物质是抗蚀斑剂、增香剂和着色剂。牙线或洁牙带可以是本领域技术人员已知的任何合适的形式,例如以PTFE(Teflon)牙线的形式,其例如在US 3,664,915、US 3,953,566、US 3,962,153、US 4,096,227、US 4,187,390、US 4,256,806、US 4,385,093、US 4,478,665、US 4,776,358、US 5,033,488、US 5,209,251、US 5,220,932、US 5,518,012、US 5,718,251、US 5,765,576或US 5,911,228中所述;以单丝牙间器械的形式,其例如在US 3,800,812、US 4,974,615、US 5,760,117、US 5,433,226、US 5,479,952、US 5,503,842、US 5,755,243、US 5,884,639、US 6,003,525或US 6,027,592中所述;或以生物相容性带的形式。优选地,牙线或洁牙带可以是弹性体包被的单丝的形式,其例如在US 20050226820中所述,或是基于定向热塑的洁牙带的形式,其例如在US 20020144704中所述。
本文上述的防龋美容组合物可用于人类口腔施用的范畴,和兽医口腔施用的范畴,优选用于非人哺乳动物,更优选用于宠物。如果防龋美容组合物用于兽医口腔施用的范畴,该组合物可包含本领域技术人员已知的适合此类施用的其他组分。
另一方面,本发明涉及属于乳酸菌组的微生物在制备用于治疗或预防除了变形链球菌的变形链球菌群导致的龋的药物组合物中的用途,所述微生物能够特异性结合如本文上述的属于变形链球菌群组的细菌。优选地,所述药物组合物包含上述微生物,或其衍生物、变体、类似物或碎片。更优选地,药物组合物还包含可药用载体或赋形剂。
药物组合物包含治疗有效量的上述属于乳酸菌组的微生物或衍生物或变体或者本发明中所述与用于本发明的组合物结合的微生物的类似物或碎片并且可以配制为多种形式,例如为固体、液体、粉末、含水、冻干的形式。
药物组合物可以如本文中所述与可药用的载体一同施用于患者。在特定的实施方案中,术语“可药用”意指由管理部门或其他广泛受到认可的药典批准可用于动物并且特别可用于人。用于本发明的优选的药物组合物不含范围在1%(w/w)和6%(w/w)之间的乳糖。还优选该组合物含有不超过1%(w/w)的乳糖,例如它含有少于1%、优选地少于0.9%(w/w)、0.8%(w/w)等的乳糖或该药物组合物含有超过6%、7%、8%等(w/w)的乳糖。备选地,但也优选该药物组合物不含乳糖。
术语“载体(carrier)”指随同治疗剂一起施用的稀释剂、辅助剂、赋形剂或运载体(vehicle)。此种载体可药用。即在所用的剂量和浓度上对受者无毒。它优选地是等渗的、低渗的或微弱高渗的并且具有如由蔗糖溶液所提供的相对低的离子强度。此类药用载体可以是无菌液体如水和油,包括石油、动物油、植物油或合成来源的油,如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。盐溶液和右旋糖和甘油的水溶液可以用作液体载体,尤其用于可注射的溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、碳酸钙、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石粉、钠离子、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。赋形剂可以如上文文中所述含有乳糖,最优选地它不含乳糖。根据需要,组合物还可以含有少量湿润剂或乳化剂,或pH缓冲剂。这些组合物可以采用溶液、悬浮液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释剂等形式。经口施用制剂可以包括标准载体如药用级的甘露醇、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适药用载体的实施例在E.W.Martin的“Remington's PharmaceuticalSciences”中描述。还可以使用脱脂乳、脱脂乳粉、不含乳或不含乳糖的产品。通常将脱脂乳粉在磷酸盐缓冲盐水(PBS)内混悬,高压灭菌或过滤以除去蛋白质杂质和活着的污染物,随后冷冻干燥、加热干燥、真空干燥或冻干。可以充当药用载体的物质的某些其他实例是糖,如葡萄糖和蔗糖;淀粉如玉米淀粉和马铃薯淀粉;纤维素及其如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸酯;粉化的黄蓍糖;麦芽;明胶;滑石;硬脂酸;硬脂酸镁;硫酸钙;碳酸钙;植物油如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可属植物的油;多元醇如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇;琼脂;海藻酸;无热原的水;等渗盐水;蔓越橘(Cranberry)提取物和磷酸盐缓冲溶液;脱脂乳粉;以及药物制剂中所用的其他无毒的可兼容物质例如维生素C、***和紫松果菊属(Echinacea)植物。湿润剂和润滑剂如十二烷基硫酸钠以及着色剂、增香剂、润滑剂、赋形剂、压片剂、稳定剂、抗氧化剂和防腐剂也可以存在。
优选地,经口施用制剂含有如本文中所述的乳糖并且最优选地不含乳糖。多种在本领域内众所周知的适合经口施用的载体和/或赋形剂可以为本发明目的使用。根据需要,抑制成龋的组合物还可以含有多种已知的添加剂如防腐剂、硬化剂、润滑剂、乳化剂、稳定剂、香料等。此类组合物含有与合适量载体结合的治疗有效量的前述化合物,这些化合物优选地为纯化的形式,以便提供正确施用于患者的形式。制剂应当适应施用的模式。
通常,将成分以单位剂量形式例如作为干燥的冻干粉或无水浓缩物在标明活性制剂量的气密封接容器如安瓿或sachette内单独提供或混合在一起提供。在组合物通过输注施用时,组合物可以用含有药用级的无菌水或盐水的输注瓶递送。
本发明的药物组合物可以配制为中性形式或盐形式。可药用盐包括与阴离子所形成的可药用盐如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些可药用盐,以及与阳离子所形成的可药用盐如衍生自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些可药用盐。
可以任选地采用体外分析法帮助确定最适的剂量范围。在制剂中待使用的精确剂量还取决于施用途径和疾病或病症的严重性,并且应当根据执业医生的判断和每一患者的状况确定。可以从衍生自体外或动物模型测试***的剂量反应曲线外推出有效剂量。优选地,药物组合物直接施用或与辅助剂组合施用。辅助剂可以选自氯喹、质子极化性化合物如丙二醇、聚乙二醇、甘油、EtOH、1-甲基-L-2-吡咯烷酮或其衍生物或者非质子极化性化合物如二甲亚砜(DMSO)、二乙基亚砜、二正丙基亚砜、二甲基砜、环丁砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、四甲基脲、乙腈或它们的衍生物。将这些化合物在各自pH界限的条件下添加。可以将用于本发明的组合物施用于脊椎动物。“脊椎动物”如本文中所用将具有如本领域技术人员通常所理解的相同意思。特别地,“脊椎动物”包含哺乳动物,并且更特别地是人。
术语“施用”意指施用治疗有效剂量的前述组合物。通过“治疗有效量”意指这样的剂量,其产生施用该剂量时意图产生的效果,这种效果优选地是防龋。确切剂量将取决于治疗目的,并且由本领域技术人员使用已知技术确定。如本领域内已知并且如上所述,可能需要针对全身递送或局部性递送、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和疾病严重性进行调整,并且由本领域技术人员用常规实验确定。
本方法可应用于人的治疗和兽医用途。本文中所述的具有所需要的治疗活性的化合物可以如本文中所述在生理上可接受载体内施用于患者。化合物可以如下所述以多种方式配制,其取决于导入方式。制剂中的治疗活性化合物的浓度可以在大约0.1-100wt%变化。物质可以单独施用或于其他治疗组合施用。
可以以如下所述的多种方式完成药物组合物的施用,包括但不限于经口、皮下、静脉内、动脉内、节内、脊髓内、鞘内、心室内、鼻内、支气管内、经皮的、结节内、直肠内、腹膜内、肌内、肺内、***、直肠或眼内。
施用优选经过口或颊。住院医生和临床因素将决定剂量方案。医学领域内众所周知用于任一患者的剂量取决于多种因素,包括患者体形大小、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用的时间和途径、一般健康和同时施用的其他药物。一般剂量范围可以是例如0.001至1000μg;然而,低于和高于这种示例性范围的剂量得到预期,尤其当考虑前述因素时。
剂量优选地每周给予一次,然而,随着治疗进行,剂量可以在更长的时间间隔上给予并且根据需要可以在更短时间间隔例如每日给予。在优选的情况下,免疫反应使用本文中所述方法和本领域技术人员所知的其他方法监测并且剂量得到优化,例如在时间、数量和/或组合方面。可以通过定期评估监测进展。本发明的药物组合物可以局部施用或全身施用。还可以预计药物组合物在共治疗方法中使用,即与其他药剂或药物共同施用,例如用于预防、治疗或改善本文中所述龋的药物。
在另一优选的实施方案中,本发明涉及属于乳酸菌组的微生物在制备用于治疗或预防除了变形链球菌的变形链球菌群导致的龋的防龋组合物中的用途,所述微生物能够特异性结合如本文上述的属于变形链球菌群组的细菌,其中该防龋组合物是食品或饲料。优选地,食品或饲料形式的防龋组合物是食品组合物或饲料组合物,其包含本文上述的微生物、其变体、衍生物、类似物或碎片,还包含可口腔用的载体或赋形剂。更优选地,所述微生物、其变体、衍生物、类似物或碎片是本文上述保藏的微生物、变体、衍生物或片段。
“食品”或“饲料”包含如本文中所述的用于哺乳动物,例如人或动物,例如宠物的任何latable、可食的和/或可饮用的材料。食品和饲料在文中其他处描述。“可口腔用的载体”如上文所描述并且优选地是无毒的和为食品和/或饲料级别。不过,该术语还包括所提及的与用于本发明的药物组合物结合的载体。用于本发明的优选的食品组合物或饲料组合物不含范围在1%(w/w)和6%(w/w)之间的乳糖。还优选食品组合物或饲料组合物含有不超过1%(w/w)的乳糖,例如它含有少于1%,优选地少于0.9%(w/w)、0.8%(w/w)等的乳糖,或食品组合物或饲料组合物含有超过6%、7%、8%等(w/w)的乳糖。备选地,但也优选食品组合物或饲料组合物不含乳糖。
根据本发明,术语“食品”包含所有可食用和可饮用的食品和饮料。因此,微生物或类似物或碎片可以包含在食品或饮料中。这些食品或饮料例如是口香糖、喷雾剂(spray)、饮料、糖果、婴儿配方食品、冰淇淋、冷冻食品、甜色拉酱、奶制品、乳酪、凝乳、无乳糖酸奶、酸化乳、coffeecream或搅打稀奶油等.
以基于乳的产品也在本发明的预期范围内。然而应当将乳理解为动物来源如奶牛、山羊、绵羊、水牛、斑马、马、猴或骆驼的乳。乳可以是天然状态、还原乳、脱脂乳或这样的乳,其补充了为细菌生长所需或为后续的发酵乳加工所需的物质,例如脂肪、酵母提取物的蛋白质、胨和/或表面活性剂。术语“乳”还适用于通常称作的植物乳,即已经处理的植物材料的提取物,或豆科植物(大豆、鹰嘴豆、小扁豆等)或油籽(油菜籽、大豆、芝麻、棉籽等等)的提取物,这些提取物含有在溶液或胶体性悬浮液中的蛋白质,其通过化学作用、酸性发酵和/或加热可凝结。最后,词语“乳”还指动物乳和植物乳的混合物。
当将本发明的微生物或类似物或碎片添加至酸奶和具有相似内容物的饮料时,添加浓度为大约105-107个细胞/ml的本发明微生物就足够。在这种情况下,有可能因饮料本身的品质完全抑制防止或抑制由变形链球菌群成龋菌株引起的龋而没有明显副作用。
此类食品、饮料或饲料可以通过用于产生食品和饮料或饲料的的常用方法产生,包括将活性成分添加至食品、饮料或饲料的原材料或烹制的材料内。本发明食品、饮料或饲料可以用如通常用于食品、饮料或饲料的相同方式成型和制粒。成型和制粒的方法包括造粒法如流体层造粒法、搅拌造粒法、挤出造粒法、滚动造粒法、气流造粒法、压模造粒法、破碎造粒法、喷雾造粒法和喷射造粒法,包衣方法如锅包衣法(pan coating)、流体层包衣法和干法包衣、吹干法(puff dry)、过量蒸汽(excess steam)法、发泡垫(foam mat)法、膨胀法如微波孵育法以及用挤压造粒机和挤压机的挤压方法。
用于本发明的食品、饮料或饲料包括任何食品、饮料或饲料,其包含本发明的微生物、其衍生物、类似物或片段作为活性成分的食品、饮料或饲料。食品、饮料或饲料中的活性成分不特别地限于任何浓度只要最后的食品、饮料或饲料可以发挥特异性结合变形链球菌群的活性。活性成分的浓度优选地是占0.001至100%重量的、更优选是0.01至100%重量的并且最优选是0.1至100%重量的包含此类活性成分或具有本文中所述那些细胞数目的食品、饮料或饲料。
添加活性成分的特定食品或饮料包括例如果汁、提神饮料、汤、茶、酸奶饮料、乳制品如发酵乳、冰淇淋、冰、黄油、乳酪、加工奶和脱脂乳、肉制品如火腿、腊肠和汉堡牛排、鱼肉饼制品、蛋制品如调味炸蛋卷和蛋凝乳、糖果糕点如饼干、果冻、零食和口香糖、面包、面条、腌菜、烟熏制品、干鱼和调味品。食品或饮料的形式包括例如粉末食品、层样食品、瓶装食品、罐头食品、蒸煮食品、胶囊食品、食品片和流体食品。
将由婴儿摄入的具有特异性结合变形链球菌群活性的食品或饮料优选地用于婴儿的营养组合物。此类用于婴儿的营养组合物包括为婴儿制备的改性乳、蛋白质分解乳、特定营养改性乳或婴儿食品和为幼儿制备的食品。用于婴儿营养组合物的形式包括但不特别限于已脱脂和粉碎的奶粉以及婴儿食品,并且还包括适合婴儿摄入的日常食品如冰淇淋、发酵乳和果冻。
根据本发明用于婴儿的营养组合物主要由蛋白质、脂类、糖、微生物和/或矿物质组成。在营养组合物中,活性成分与这些成分混合。
蛋白质包括乳蛋白质,如脱脂乳、酪蛋白、乳清干酪、乳清蛋白质浓缩物和乳清蛋白质分离物及它们的级分如α酪蛋白、β酪蛋白、α乳白蛋白和β乳球蛋白。此外,卵蛋白质如蛋黄蛋白质、蛋清蛋白质和卵清蛋白,或大豆蛋白质如大豆脱脂蛋白质、大豆分离蛋白质和大豆浓缩蛋白质可以使用。除这些蛋白质以外,蛋白质如面筋、鱼肉蛋白质、牛肉蛋白质和胶原也可以令人满意地加以使用。此外,这些蛋白质的级分、来自它们的酸处理或酶处理的肽或无酸的肽也可以令人满意地加以使用。游离氨基酸可以起到氮源作用并且还可以用于产生特定的生理作用。此类游离氨基酸包括例如牛磺酸、精氨酸、半胱氨酸、胱氨酸和谷氨酸。脂包括动物脂肪和动物油,如乳脂、猪油、牛油和鱼油、植物油如大豆油、油菜籽油、玉米油、椰油、棕榈油、红花油、亚麻子油、月见草油、中链脂肪酸三酰甘油和棉籽油、细菌产生的脂肪和油以及其经过级分的油,其氢化油和其酯交换油。待掺入脂类的量根据用途变化。
糖类包括例如淀粉、可溶性多糖、糊精中的一种或多种、单糖如蔗糖、如本文中所述的乳糖、麦芽糖、葡萄糖和果糖以及其他寡糖。这类糖的总量优选地占营养组合物中总固体重量的40至80%。此外,人造甜味剂如阿斯帕坦可以令人满意地加以使用。人工甜味剂的量大约是营养组合物中总固体重量的0.05至1.0%。
维生素包括但不限于作为必需成分的番茄红素,此外包括例如维生素,如维生素A、维生素B族、维生素C、D和E和维生素K族、叶酸、泛酸、烟酰胺、肉碱、胆碱、肌醇和生物素,只要该维生素可以施用于婴儿即可。此类维生素的重量在用于婴儿的营养组合物中优选地为每份总固体10mg至5g。
此外,矿物质包括钙、镁、钾、钠、铁、铜、锌、磷、氯、镁、硒和碘。此类矿物质的重量在用于婴儿的营养组合物中优选地为每份总固体1mg至5g。
除以上所述这些成分以外,用于本发明的婴儿的营养组合物可以与想要混入营养组合物的任何成分混合,例如膳食纤维、核苷酸、核酸、香料和色料。
用于本发明的食品或饮料可以用作保健食品或饮料或功能食品或饮料以预防和/或治疗除了变形链球菌的变形链球菌群导致的龋。
当摄入本发明的食品或饮料时,不特别限制待摄入的量。基于活性成分的总量,待摄入的量通常是每日0.1至50g、优选0.5g至20g。连续以这个量摄入该食品或饮料一段时间,从一天至5年、优选地从2周至一年。这里摄入量可以调整至适宜的范围,这取决于摄入食品和饮料的个体的症状严重程度、年龄和体重等。
用于本发明的饲料可以是包含活性成分的任何饲料。饲料包括例如用于狗、猫和大鼠的宠物饲料、用于奶牛和猪的牛饲料、用于鸡和火鸡的鸡饲料和用于鲷和黄狮鱼的鱼饲料。
饲料可以通过将本文上述的活性成分适宜地混入饲料原料中产生,其中饲料原料包括例如谷物、糠、油籽粕、动物源饲料原料、其他饲料原料和纯化的产物。
谷物包括例如mile、小麦、大麦、燕麦、黑麦、糙米、荞麦、粟米(Fox-tailmillet)、中国粟(Chinese millet)、Deccan grass、玉米和大豆。
麸糠包括例如米糠、脱脂米糠、麸皮、等级最低的面粉、小麦胚、大麦麸、screening pellet、玉米麸和玉米胚。
油籽粕包括例如大豆粕、大豆粉,亚麻子粕、棉籽粕、花生粕、红花籽粕、椰子粕、棕榈油粕、芝麻粕、葵花籽粕、油菜籽粕、木棉籽粕和芥末粕。
动物源饲料原料包括例如鱼粉、导入粉(import meal)、全粉(wholemeal)和烤粉(coast meal)、鱼膏、肉粉、肉骨粉、血粉、水解毛发、骨粉、屠宰副产品、羽毛粉、蚕蛹、脱脂乳、酪蛋白、干乳清和磷虾。
其他饲料原料包括例如植物茎和叶如苜蓿、干草块、苜蓿叶粉和洋槐叶粉,来自玉米加工工业的副产品如玉米蛋白粉、玉米蛋白饲料和玉米浸液、淀粉、糖、酵母、来自发酵工业的副产品如啤酒糟、麦芽根、酒糟(liquorresidue)和酱油渣、以及农副产品如柑桔加工残渣、***、咖啡渣和可可渣、木薯、蚕豆、瓜尔豆粕、海藻、螺旋藻(spirulina)和小球藻(chlorella)。
纯化的产物包括例如蛋白质,如酪蛋白和白蛋白、氨基酸、淀粉、纤维、糖如蔗糖和葡萄糖、矿物质和维生素。
在将本发明的饲料供给动物时,待摄入的饲料量不特别加以限制,但基于活性成分的量优选地是例如每日每公斤体重0.1mg至50g、优选地每日每公斤体重0.5mg至20g。饲料以这个量连续被摄入持续从一天直至5年、优选地从2周至一年的时间。所摄入的量也可以调整至适宜范围,这取决于摄入饲料的物种、年龄和体重。
在另一实施方案中,本发明涉及属于乳酸菌组的微生物在制备用于治疗或预防除了变形链球菌的变形链球菌群导致的龋的防龋组合物中的用途,所述微生物能够特异性结合如本文上述的属于变形链球菌群组的细菌,其中该防龋组合物是食物、饮料和饲料的添加剂。优选地,由于本文上述微生物,或其衍生物、变体、类似物或碎片的存在,该食物、饮料和饲料的添加剂尤其能够特异性结合变形链球菌群,由此预防和/或治疗除了变形链球菌的变形链球菌群导致的龋。优选地,所述微生物、其变体、衍生物、类似物或碎片是本文上述保藏的微生物、或其变体、衍生物或片段。用于食品或饮料的添加剂包括婴儿营养组合物的添加剂。
用于食品的添加剂可以通过产生用于食品、饮料或饲料的添加剂的常用方法生产。根据需要,可以令人满意地添加通常用于食品、饮料或饲料的添加剂,例如Food Addictive Handbook(日本食品添加剂协会1997年1月6日发行)中所述的添加剂,包括甜味剂、色料、防腐剂、增稠剂和稳定剂、抗氧剂、固色剂、漂白剂、防腐剂、树胶基、苦味剂、酶、增白剂、酸化剂、调料、乳化剂、强化剂、用于制造的制剂、香料和香料提取物。此外,可以令人满意地添加先前所提及的用于药物片剂的常见糖、淀粉、无机材料、植物粉末、赋形剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、表面活性剂和增塑剂。
添加剂包括如下添加剂。
甜味剂包括阿斯帕坦、甘草、甜菊、木糖和罗汉果(罗汉果(Momordicagrosvenori)的果实)。色料包括类胡萝卜素和姜黄油树脂、类黄酮、焦糖色素、螺旋藻色素、小球藻、紫甘薯红色素、紫山药色素、紫苏红色素、兰莓色素。
防腐剂包括例如亚硫酸钠、苯甲酸盐、安息香提取物、山梨酸酯和丙酸盐。增稠剂和稳定剂包括例如,树胶如***树胶和黄原胶、藻酸盐、壳多糖、脱乙酰壳多糖、芦荟提取物、瓜儿豆树胶、羟丙基纤维素、酪蛋白钠、玉米淀粉、羧甲基纤维素、明胶、琼脂、糊精、甲基纤维素、聚乙烯醇、微纤维纤维素、微晶纤维素、海藻纤维素、聚丙烯酰胺钠、聚磷酸钠、角叉菜聚糖或酵母细胞壁。
抗氧化剂包括例如维生素C组、乙二胺四乙酸钠、乙二胺四乙酸钙、赤藻糖酸、谷维素、儿茶素、槲皮素、丁香提取物、酶处理的芸香苷、苹果提取物、芝麻籽提取物、二丁基甲酚、小茴香提取物、辣根提取物、水芹提取物、茶提取物、生育酚、油菜籽提取物、咖啡豆提取物、葵花籽提取物、阿魏酸、丁基羟基苯甲醚、兰莓叶提取物.蜂胶提取物、胡椒提取物、凤仙花提取物、没食子酸、桉树属植物提取物和迷迭香提取物.
固色剂包括例如亚硝酸钠。漂白剂包括例如亚硫酸钠.
抗菌剂包括例如邻苯基苯酚。树胶基包括例如乙酰基蓖麻酸甲酯、漆蜡、酯胶、榄香树脂、棕小叶蜡、贝壳杉树胶、巴西棕榈蜡、甘油脂肪酸酯、鲸蜡、香脂、树脂、橡胶、米糠蜡、蔗蜡、虫胶、节路顿胶、蔗糖脂肪酸酯、解聚的天然橡胶、石蜡、加拿大香脂、丙二醇脂肪酸酯、纸浆粉、稻壳粉、霍霍巴油、聚异丁烯、聚丁烯、微晶蜡、乳香、蜂蜡和磷酸钙。
苦味剂包括例如异-α-苦酸、咖啡因、云芝(Coriolus versieolor)提取物、红金鸡纳树(redbark cinchona)提取物、黄檗(Phellodendron)树皮提取物、龙胆(gentian)根提取物、香料提取物、经酶修饰的柚皮苷、牙买加决明属(Jamaica cassia)植物提取物、茶褐素(theabromine)、柚皮苷、决明属植物提取物、苦艾(absinth)提取物、香茶菜(isodonis)提取物、橄榄茶(olive tea)、酸橙(Citrus aurantium)提取物、啤酒花提取物和苦艾(wormwood)提取物。
酶包括例如淀粉酶、胰蛋白酶或皱胃酶。
增白剂包括例如漆蜡和野漆树蜡。酸化剂包括例如己二酸、衣康酸、柠檬酸、琥珀酸、乙酸钠、酒石酸、二氧化碳、乳酸、植酸、富马酸、苹果酸和磷酸。调料包括例如氨基酸如天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、胱氨酸、酪氨酸、亮氨酸和脯氨酸,核酸如肌苷钠、尿苷酸钠、鸟苷酸钠、胞苷酸钠、核糖核苷酸钙和钠核糖核苷酸,有机酸如柠檬酸和琥珀酸、氯化钾、低氯化钠卤水、粗氯化钾、乳清盐、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠和小球藻提取物.
强化剂包括例如锌盐、维生素C组、多种氨基酸、5-腺苷酸、氯化铁、橙皮苷、多种煅烧的钙、多种非煅烧的钙、二苯甲酰基硫胺素、氢氧化钙、碳酸钙、硫胺素盐酸盐、盐藻、胡萝卜素、生育酚、烟酸、胡萝卜的胡萝卜素、棕榈油胡萝卜素、泛酸钙、维生素A、羟脯氨酸、焦磷酸二氢钙、焦磷酸亚铁、焦磷酸铁、铁蛋白、血红素铁、甲基萘醌类、叶酸和核黄素。
用于制造的物质包括例如加工助剂,如丙酮和离子交换树脂。香料包括例如香子兰精而香料提取物包括例如辣椒属(capsicum)植物提取物.
这些多种添加剂可以根据本发明在考虑施用的模式下添加至活性成分。
用于本发明的防龋组合物包括一定量的如本文中所述的与本发明组合物结合的上述属于乳酸菌组的微生物或其衍生物或变体或类似物或其碎片。优选地,微生物、其变体、衍生物、类似物或碎片是本文上述保藏的微生物、变体、衍生物或碎片。可以预计组合物并且尤其防龋组合物包含如益生微生物形式的上述属于乳酸菌组的微生物。也就是说、除了益生效果外,上述属于乳酸菌组的益生微生物还用于治疗和/或预防除了变形链球菌外的变形链球菌群导致的龋。该益生微生物的量足够高以至于明显有效地改善待治疗的疾病,优选地是龋,但是它的量足够低以至于避免严重副作用(在合理的效益/风险比例上),处于理性的医学判断范围内。该益生微生物的有效量随着要实现的特定目标、治疗中的患者年龄和身体状况、基础疾病的严重性、治疗持续期、目前治疗特点、所采用的特定微生物而变化。该益生微生物的有效量因此是提供所需要的特异性结合变形链球菌群的最小量。例如当以大约0.05ml至大约20ml的量施用时,在0.05ml磷酸盐缓冲盐溶液或在0.05ml琼脂悬浮液中存在1×109个活细菌细胞或死细菌细胞或等量干重的细胞壁碎片是有效的。
已确定的实践优势是益生素可以用方便的方式施用,如通过经口施用途径。包含这种益生素的活性成分可能需要包裹在一种材料内以保护所述生物免受酶、酸或其他可以灭活该生物的天然因素作用,这取决于施用途径。为了通过其他的胃肠道外施用方式施用益生素,益生素应当由一种材料包裹或与该材料结合进行施用以防止被灭活。例如,益生素可以与酶抑制剂一起或在脂质体内共同施用。酶抑制剂包括胰脏的胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(DFP)和特斯乐。脂质体包括水-油-水的P40乳剂以及常规设计和专门设计的转运乳杆菌或其副产物至尿生殖道表面的脂质体。分散系还可以例如在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油里制备。通常,分散系通过将多种已消毒的益生素掺入含有基础分散介质和来自如上所列举成分中所需要的其他成分的无菌载体进行制备。当无菌散剂用于制备无菌注射溶液时,优选的制备方法是从事先无菌过滤的其成分溶液中形成活性成分加任何额外所需要成分的粉末的真空干燥技术和冷冻干燥技术。额外优选的制备方法包括但不限于冻干和热干燥。
防龋组合物还包含用于经口施用或***施用的包含如本文中所述的可药用载体的产物,其中上述属于乳酸菌组微生物的细胞例如以新鲜的、浓缩的或干燥的形式添加至可药用载体或其表面。当然,还可以添加所述微生物的衍生物或类似物或碎片或如文本所述的微生物、其衍生物和/或类似无和/或碎片的任意组合。这些产品可以以可摄入的混悬剂、凝胶剂、扩散体、胶囊剂、硬明胶胶囊剂、糖浆剂或以任何本领域技术人员所知的植物制剂形式提供。
当益生素如上所述受到适宜保护时,活性化合物可以例如随惰性稀释剂或可吸收的可食载体经口施用或它可以密封在硬质或软质的明胶胶囊层内,或它可以压制为设计通过胃的片剂(即肠包衣的)或它可以直接掺入膳食食品。为了经口治疗性施用,益生素可以与赋形剂混合并以可摄入的片剂、***片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、糯米纸囊剂等形式使用。本发明的组合物或制备物如此制备以至经口施用单位剂型含有每毫升例如大约1×109个活的或死亡的例如乳杆菌。为方便且有效地以有效量施用,将益生素与合适的可药用或可食品用载体复合为如文中前述的单位剂型。单位剂型可以例如含有量为大约每毫升109个活的或死的例如乳杆菌的主要活性复合物。在含有补充成分如益生素的组合物的情况下,通过参考所述成分的常用剂量和常见施用方式确定剂量。
在另一实施方案中,本发明涉及预防或治疗除了变形链球菌的变形链球菌群导致的龋的方法。优选地,该预防或治疗方法包括对受试者施用属于乳酸菌组的微生物,或本文上述微生物的变体、衍生物、变体、类似物或碎片,所述微生物特征在于能够特异性结合属于变形链球菌群组的细菌。更优选地,该微生物是如本文上述的微生物,进一步优选的,该微生物是如本文上述保藏在DSMZ的乳杆菌。
上述属于乳酸菌组的微生物的类似物或碎片可以是如本文上述的任意类似物或碎片。
优选地,待治疗的受试者是动物。更优选地,该动物是哺乳动物,进一步优选地,该哺乳动物是宠物哺乳动物。在优选的实施方案中,该宠物是狗、猫、仓鼠、猴、大鼠或小鼠。在另一优选的实施方案中,该动物是牛、马、猪、驴、绵羊或山羊。在另一优选的实施方案中,该哺乳动物是人。
优选地,变形链球菌群是属于以下物种的微生物:变形链球菌、远缘链球菌、仓鼠链球菌、大鼠链球菌、野鼠链球菌或猕猴链球菌。更优选地,变形链球菌群与属于以下的微生物相关:变形链球菌血清型c(DSMZ20523)、变形链球菌血清型e(NCTC 10923)、变形链球菌血清型f(NCTC11060)、远缘链球菌DSM 20742、大鼠链球菌DSM 20564、仓鼠链球菌DSM 20562、野鼠链球菌DSM 20646或猕猴链球菌DSM 20714。
待治疗或预防的龋是除了变形链球菌的变形链球菌群导致的龋,优选的该龋是选自如下的至少一种细菌导致的龋:远缘链球菌、仓鼠链球菌(Streptococcus cricatus)、大鼠链球菌,野鼠链球菌和猕猴链球菌。
在本发明治疗或预防方法范围内的上述属于乳酸菌组的微生物的施用可以用本领域技术人员已知的任何合适的形式进行。优选地,施用包括使用和应用本文上述的组合物,所述组合物可任选包含例如本文上述的药物或美容载体或赋形剂。施用的剂量和时间过程可根据本领域技术人员已知的任何合适的信息建立。优选地,所述剂量和时间过程可如本文上述建立。
本发明通过下面描述的图1-3阐明:
图1显示乳杆菌属物种对变形链球菌的聚集。具体地,该图描述和非聚集的乳杆菌和变形链球菌混合物(右管)相比的,聚集的乳杆菌和变形链球菌混合物(左管)。此实验如实施例4所述进行,管静置20分钟以使聚集沉淀。
图2显示图1中所示的乳杆菌和变形链球菌之间的聚集(左侧管)的显微镜图像。本图像使用相差显微镜在1000倍放大倍率下摄制。
图3显示乳杆菌对不同变形链球菌群的聚集。此检测如实施例5所述进行。简言之,使用荧光染色剂染色变形链球菌群。乳杆菌对变形链球菌群聚集后,离心分离得到的沉淀。沉淀的荧光的量作为聚集的变形链球菌群的量的度量。
本发明和其众多优点将从如下实施例更好地得以理解,其中这些实施例仅为了说明目的提供,并且无论如何不意图限制本发明的范围。
实施例1:贮藏和培养
菌株的贮藏和培养可以根据常规方法进行。例如,菌株可以在-80℃贮藏为冷冻原种。1ml培养物可以在MRS培养基中培养至稳定期(OD600/ml4-8)并与500μl无菌的50%甘油溶液混合并冷冻。变形链球菌群的培养物可以在TSY培养基中培养至稳定期(OD600/ml 1-2)并如上所述进行处理。
变形链球菌群(变形链球菌、远缘链球菌、大鼠链球菌、仓鼠链球菌、野鼠链球菌或猕猴链球菌)的培养以及乳杆菌的培养可以在封闭的Falcon管内的5ml中于37℃过夜完成,无需振荡。
特别地,将本申请中所用的菌株贮藏在-80℃作为冷冻原种。1ml在MRS肉汤中培养至稳定期(OD600/ml 4-8)的培养物与500μl无菌的50%甘油溶液混合并冷冻。
特别地,将变形链球菌群的培养物在TSY肉汤中培养至稳定期(OD600/ml 1-2)并如上所述进行处理。
变形链球菌群(变形链球菌(DSM 20523,血清型c;NCTC 10923,血清型e;NCTC 11060,血清型f)、远缘链球菌DSM 20742、大鼠链球菌DSM20564、仓鼠链球菌DSM 20562、野鼠链球菌DSM 20646或猕猴链球菌DSM 20714)的培养,和乳杆菌的培养可以在封闭的Falcon管内的5ml中于37℃过夜完成,无需振荡。为了实施例5所述的荧光检测,使用变形链球菌DSM 20523。
为了聚集检测,乳杆菌培养在MRS-培养基中。5ml MRS-培养基接种10μl原种,在有氧条件下37℃培养3天。测定600nm(OD600)处培养物而定光密度。然后使用PBS-缓冲液将培养物稀释到OD600为2。变形链球菌群在7ml TSY-培养基中培养。7ml of TSY-培养基接种10μl原种,在有氧条件下37℃培养。
实施例2:菌株的命名分类
菌株的命名分类根据它们的糖发酵模式完成。糖发酵模式使用API 50CH(bioMerieux,法国)***测定并使用使用APILAB PLUS软件3.3.3版(bioMerieux,法国)分析。
实施例3:细胞染色
如实施例1所述培养乳杆菌和变形链球菌群之后,变形链球菌群使用荧光染色剂染色。为此,测定培养物的OD600。3200x g离心5分钟收获培养物。沉淀重悬在PBS-缓冲液中。计算缓冲液的量,由此得到的悬浮液每毫升OD600为4.2,此悬浮液混合2μl根据产品说明书制备的CFDA-SE溶液(Invitrogen,美国)。细胞的染色通过37℃下孵育混合物2小时进行。3200x g离心5分钟收获染色的细胞。此细胞随后重悬在2mlPBS-缓冲液中。
实施例4:变形链球菌群的沉淀聚集检测
为了检测,乳杆菌与变形链球菌的混合以体积比3:1至60:1(变形链球菌:乳杆菌属)进行,这对应于菌落形成单位的比率1:50至1:2.5。在1ml中于600nm波长处所测量的光密度对于变形链球菌群优选地意指3x 108个菌落形成单位并且对于乳杆菌优选地意指7x 109个菌落形成单位。混合在15ml Falcon管中的2mL体积中完成。培养悬浮液用PBS缓冲液稀释以得到如上提及的体积比,同时保持终体积为2ml。混合物涡旋混合15秒。聚集作为悬浮液的立即混浊是可见到的。将管静置20分钟,在此时间段后聚集物沉积为可见到的沉淀,与此同时未聚集的混合物仍在悬浮液中。
500x g离心30秒分离形成的聚集物。然后,通过测定留在上清中的未聚集的细胞的量定量聚集的量。对应地,小心移出1ml上清来测定光密度。在600nm处测定该光密度。减去没有乳杆菌的对应的对照实验的值代表没有聚集的细胞的量。
作为对照,始终通过开展仅以乳杆菌属菌株或变形链球菌群菌株添加至管内的试验研究相应的乳杆菌属菌株和变形链球菌群菌株的自我聚集。变形链球菌被乳杆菌属菌群的聚集在图1(左侧管)和2中显示。
本文上述的乳杆菌属菌株,尤其以DSMZ保藏的那些菌株显示聚集所有变形链球菌血清型,而没有表现自我聚集行为。
培养基:
MRS-肉汤:
MRS-混合物(Difco,USA) 55g/L
pH:6.5
TSY-肉汤:
TSY-混合物(Difco,USA) 30g/L
酵母提取物(Deutsche Hefewerke,德国) 3g/L
缓冲液:
PBS缓冲液:
Na2HPO4*2H20 1.5g/L
KH2PO4 0.2g/L
NaCl 8.8g/L
用HCl调节pH
实施例5.变形链球菌群的荧光聚集检测
为了检测,各乳杆菌和各染色的变形链球菌群的悬浮液混合(变形链球菌DSM 20523和Lb-OB-K1(DSM 16667)、变形链球菌DSM 20523和Lb-OB-K2(DSM 16668)、变形链球菌DSM 20523和Lb-OB-K3(DSM16669)、变形链球菌DSM 20523和Lb-OB-K4(DSM 16670)、变形链球菌DSM 20523和Lb-OB-K5(DSM 16671)、变形链球菌DSM 20523和Lb-OB-K6(DSM 16672)、变形链球菌DSM 20523和Lb-OB-K7(DSM16673);
远缘链球菌DSM 20742 和Lb-OB-K1(DSM 16667)、远缘链球菌DSM 20742和Lb-OB-K2(DSM 16668)、远缘链球菌DSM 20742和Lb-OB-K3(DSM 16669)、远缘链球菌DSM 20742和Lb-OB-K4(DSM16670)、远缘链球菌DSM 20742 和Lb-OB-K5(DSM 16671)、远缘链球菌DSM 20742和Lb-OB-K6(DSM 16672)、远缘链球菌DSM 20742和Lb-OB-K7(DSM 16673);
S.cricetus DSM 20562和Lb-OB-K1(DSM 16667)、S.cricetus DSM20562和Lb-OB-K2(DSM 16668)、S.cricetus DSM 20562和Lb-OB-K3(DSM 16669)、S.cricetus DSM 20562和Lb-OB-K4(DSM 16670)、S.cricetus DSM 20562和Lb-OB-K5(DSM 16671)、S.cricetus DSM 20562和Lb-OB-K6(DSM 16672)、S.cricetus DSM 20562和Lb-OB-K7(DSM16673);
大鼠链球菌DSM 20564和Lb-OB-K1(DSM 16667)、大鼠链球菌DSM 20564和Lb-OB-K2(DSM 16668)、大鼠链球菌DSM 20564和Lb-OB-K3(DSM 16669)、大鼠链球菌DSM 20564和Lb-OB-K4(DSM16670)、大鼠链球菌DSM 20564和Lb-OB-K5(DSM 16671)、大鼠链球菌DSM 20564和Lb-OB-K6(DSM 16672)、大鼠链球菌DSM 20564和Lb-OB-K7(DSM 16673);
野鼠链球菌DSM 20646和Lb-OB-K1(DSM 16667)、野鼠链球菌DSM 20646和Lb-OB-K2(DSM 16668)、野鼠链球菌DSM 20646和Lb-OB-K3(DSM 16669)、野鼠链球菌DSM 20646和Lb-OB-K4(DSM16670)、野鼠链球菌DSM 20646和Lb-OB-K5(DSM 16671)、野鼠链球菌DSM 20646和Lb-OB-K6(DSM 16672)、野鼠链球菌DSM 20646和Lb-OB-K7(DSM 16673);
猕猴链球菌DSM 20724和Lb-OB-K1(DSM 16667)、猕猴链球菌DSM 20724和Lb-OB-K2(DSM 16668)、猕猴链球菌DSM 20724和Lb-OB-K3(DSM 16669)、猕猴链球菌DSM 20724和Lb-OB-K4(DSM16670)、猕猴链球菌DSM 20724和Lb-OB-K5(DSM 16671)、猕猴链球菌DSM 20724和Lb-OB-K6(DSM 16672),以及猕猴链球菌DSM 20724和Lb-OB-K7(DSM 16673))。在96孔微量滴定板上50μl乳杆菌悬浮液加入至50μl染色的变形链球菌群中。全速涡旋该平板12分钟。之后500x g离心该平板10秒。小心移除上清并弃去。沉淀重悬在100μl PBS-缓冲液中。
悬浮液的荧光在微量滴定板荧光读数仪中测定,激发波长495nm,发射波长525nm。
作为对照,如所述处理并测定单独的乳杆菌和染色的变形链球菌群。从测定的各乳杆菌的聚集的值中减去对应的单独变形链球菌群测定的背景荧光。所有的测定进行三次。变形链球菌群用所有测定的乳杆菌聚集(参见图3)。
培养基:
MRS-肉汤:
MRS-混合物(Difco,USA) 55g/L
pH:6.5
TSY-肉汤:
TSY-混合物(Difco,USA) 30g/L
酵母提取物(Deutsche Hefewerke,德国) 3g/L
缓冲液:
PBS缓冲液:
Na2HPO4*2H20 1.5g/L
KH2PO4 0.2g/L
NaCl 8.8g/L
用HCl调节pH
实施例6:对口腔菌群典型成员的聚集特异性
乳杆菌培养物如实施例1所述培养。
将口腔细菌–也即:唾液链球菌嗜热亚种(由OrganoBalance分离,由API 50 CH(Biomerieux,法国)根据制造商说明书鉴定);口腔链球菌(DSMZ 20066);口腔链球菌(DSMZ 20395);口腔链球菌(DSMZ 20627);表皮葡萄球菌(DSMZ 1798);表皮葡萄球菌(DSMZ 20044);缓症链球菌(DSMZ 12643);血链球菌(DSMZ 20567)–在封闭的15mL Falcon管中的5ml BHI培养基内在37℃培养过夜。将上述口腔细菌中的每种细菌优选地以体积比3:1与乳杆菌属培养物混合并且如实施例4进行分析。对于每个聚集/非聚集的测试,仅有一种前述的细菌优选地使用以立即确定该测试的结果。作为对照,始终通过开展仅以乳杆菌属菌株或口腔菌群菌株添加至管内的试验研究相应口腔细菌和测试的乳杆菌属菌株的自我聚集。
副干酪乳杆菌类干酪亚种菌株Lb-OB-K1(DSM 16667)、Lb-OB-K2(DSM 16668)、Lb-OB-K3(DSM 16669)、Lb-OB-K4(DSM 16670)、Lb-OB-K5(DSM 16671)不聚集以上提及的口腔细菌。鼠李糖乳杆菌菌株Lb-OB-K6(DSM 16672)和Lb-OB-K7(DSM 16673)聚集唾液链球菌嗜热亚种。
BHI-肉汤:
BHI-混合物(Difco,USA) 37g/L
pH:7.2
实施例7:乳杆菌聚集能力的温度抗性
细菌如实施例1中所述培养。
培养的乳杆菌属培养物在饱和蒸汽中于2巴,121℃孵育20分钟(高压灭菌)。在将高压灭菌的培养物冷却至室温后,将乳杆菌以体积比1:3与培养的变形链球菌培养物混合并且聚集如实施例4中进行分析,包括对照实验。
聚集还使用如实施例6中所述的口腔细菌进行分析。
发现乳杆菌对所测试变形链球菌血清型或对口腔细菌的聚集特性未受高压灭菌方法改变。
实施例8:热灭活乳杆菌的聚集
乳杆菌如实施例1中所述培养。变形链球菌群如实施例1个3中所述培养和染色。如实施例1所述将培养的乳杆菌培养物调整到OD600为2。1ml该悬浮液在2巴下121℃温育20分钟(高压灭菌)。高压灭菌的培养物冷却至室温后,如实施例5所述(包括对照试验)测定聚集。
热灭活的乳杆菌仍然聚集变形链球菌群。
实施例9:聚集对pH值的依赖。
细菌如实施例1中所述培养。0.5ml乳杆菌属和1.5ml变形链球菌通过3200*g离心10分钟收获并弃去上清。将细胞在调节至不同pH值的不同PBS-缓冲剂中重悬浮至其原始体积(分别是0.5ml和1.5ml)。将缓冲剂的pH值以0.5pH单位递增调节至从7.0至3.0的值。将培养物在具有待用于聚集特性分析的相应pH值的缓冲液内重悬浮。
此后,将乳杆菌优选地以体积比1:3与变形链球菌培养物混合并且聚集如实施例4进行分析,包括对照实验。在pH值低于4.5时未见乳杆菌聚集变形链球菌的发生。
实施例10:聚集对pH值的依赖。
乳杆菌如实施例1中所述生长。变形链球菌群如实施例1个3中所述培养和染色。之后在不同的pH-值测定聚集。为此目的,乳杆菌和变形链球菌群重悬在乙酸缓冲液中,调整各pH。测定的pH值为4.0、4.5和5.0。聚集如实施例5所述检测。在低于4.5的pH值没有发生变形链球菌群的聚集。
实施例11:聚集行为对冻干的敏感性
细菌如实施例1中所述培养。
1ml份的乳杆菌属培养物通过3200*g离心10分钟收获。弃去上清并将沉淀在室温真空下冻干两小时。将得到的每种所测试乳杆菌属菌株的干燥沉淀分别在室温和在4℃贮藏1天、1周、2周、3周和4周。在此贮藏时间后,将冻干的沉淀重悬于1ml PBS缓冲液,pH 7.0。将重悬浮的乳杆菌属菌株以体积比1:3与新鲜培养的变形链球菌培养物混合并且如实施例4所述(包括对照试验)测定聚集。
所提及的乳杆菌对变形链球菌的聚集行为未受冻干或贮藏方法改变。
实施例12:聚集行为对冻干的敏感性
乳杆菌如实施例1中所述生长。变形链球菌群如实施例1个3中所述培养和染色。如实施例1所述将培养的乳杆菌培养物调整到OD600为2。室温下真空冻干1ml该悬浮液。然后冻干的沉淀重悬在1ml PBS-缓冲液中。如实施例5所述(包括对照试验)测定聚集。
所述乳杆菌对变形链球菌群的聚集行为未被冻干改变。
实施例13:对蛋白酶抗性的测试
细菌如实施例1中所述培养。
所用的蛋白酶是链霉蛋白酶E、蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(均自德国Sigma获得)。1ml份乳杆菌属菌通过在3200*g离心10分钟收获并在1ml PBS缓冲液(pH 7.0)内重悬沉淀而在PBS缓冲液中洗涤。此后细胞如上所述再次收获并重悬于含有终浓度2.5mg/ml的各个蛋白酶的PBS-缓冲液(pH 7.0)。将悬浮液在37℃孵育1小时。此后如上所述洗涤细胞并重悬于PBS缓冲液(pH 7.0)内。
如实施例3所述(包括对照试验)测定聚集。
所述乳杆菌对变形链球菌的聚集行为未被任何所提及的蛋白酶改变。
实施例14:乳杆菌聚集行为的蛋白酶敏感性
乳杆菌如实施例1中所述生长。变形链球菌群如实施例1个3中所述培养和染色。所用的蛋白酶是链霉蛋白酶E、蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(均自德国Sigma获得)。1ml份乳杆菌属菌通过在3200*g离心10分钟收获并在1ml PBS缓冲液(pH 7.0)内重悬沉淀而在PBS缓冲液中洗涤。此后细胞如上所述再次收获并重悬于含有终浓度2.5mg/ml的各个蛋白酶的PBS-缓冲液(pH 7.0)。将悬浮液在37℃孵育1小时。此后如上所述洗涤细胞并重悬于PBS缓冲液(pH 7.0)内。如实施例5所述(包括对照试验)测定聚集。乳杆菌对变形链球菌群的聚集行为未被任何所提及的蛋白酶改变。
实施例15:聚集行为的离子依赖性
细菌如实施例1中所述培养。
如上所述将1ml份的乳杆菌在1ml 200mM EDTA溶液中洗涤两次。此后收获细胞并重悬于1ml PBS缓冲液(pH 7.0)内。
如实施例4所述测定聚集并且观察到聚集能力的完全丧失。乳杆菌在200mM EDTA溶液中洗涤两次后在1ml的2mM钙溶液内的重悬浮恢复了聚集变形链球菌的能力。将EDTA洗涤后的细胞重悬浮至高达100mM的镁溶液中没有恢复聚集变形链球菌的能力。
实施例16:聚集行为的离子依赖性
乳杆菌如实施例1中所述生长。变形链球菌群如实施例1个3中所述培养和染色。如上所述将1ml份的乳杆菌在1ml 200mM EDTA溶液中洗涤两次。此后收获细胞并重悬于1ml PBS缓冲液(pH 7.0)内。
如实施例5所述测定聚集并观察到聚集能力的完全丧失。乳杆菌在200mM EDTA-溶液中洗涤两次后在1ml的2mM钙溶液内的重悬浮恢复聚集变形链球菌的能力。将EDTA洗涤后的细胞重悬浮至高达100mM的镁溶液中没有恢复聚集变形链球菌群的能力。
实施例17:在唾液存在下测试聚集
细菌如实施例1中所述培养。
将2ml份的变形链球菌培养物如上所述收获并重悬于2ml唾液内。唾液由两位志愿者提供并在获得后立即使用。
如实施例4所述测定聚集。
所述乳杆菌对变形链球菌的聚集行为在唾液存在时没有变化。
实施例18:唾液存在下变形链球菌群的聚集
从志愿者取样新鲜的唾液。通过咀嚼无糖的口香糖诱导唾液流。志愿者每次取样收集15ml唾液。新鲜收集的唾液用PBS-缓冲液1:2稀释用于检测过程。乳杆菌和变形链球菌群如实施例1所述培养。变形链球菌群如实施例3所述染色,除了染色过程后染色的细胞重悬于唾液中,而不是PBS-缓冲液中。如实施例5所述(包括对照实验)测定聚集。唾液的存在没有抑制聚集。
实施例19:锭剂组合物(I)
锭剂组合物优选地如在DE-C2 36 45 147第8页实施例4中所述制备,其中,在除所述实施例4中所提及的成分之外,还将上述属于乳酸菌的微生物以每毫克锭剂102至1012个、优选地103至108个细胞的量添加。
实施例20:锭剂组合物(II)
锭剂组合物优选地如在DE-C2 36 45 147第8页实施例5中所述制备,其中,在除所述实施例4中所提及的成分之外,还将上述属于乳酸菌的微生物以每毫克锭剂102至1012个、优选地103至108个细胞的量添加。
实施例21:牙粉组合物
牙粉组合物优选地如DE-C2 36 45 147第8页实施例3中所述制备,其中,在除所述实施例3中所提及的成分之外,还将上述属于乳酸菌的微生物以每毫克牙粉组合物102至1012个、优选地103至108个细胞的量添加。
实施例22:基于白垩的牙粉组合物
基于白垩的牙粉组合物优选地如W.Umbach(编者)的教科书“Kosmetik”第二版,Thieme Verlag,1995第205页第7.1.4.4章“Rezepturbeispiel”中所述制备,其中,在除第205页该章中所提及的成分之外,还将上述属于乳酸菌的微生物以每毫克基于白垩的牙粉102至1012个、优选地103至108个细胞的量添加。
实施例23:基于硅酸/氟化钠的凝胶牙粉
基于硅酸/氟化钠的凝胶牙粉优选地如W.Umbach(编者)的教科书“Kosmetik”第二版,Thieme Verlag,1995第205页第7.1.4.4章“Rezepturbeispiel”中所述制备,其中,在除第205页该章节中所提及的成分之外,还将上述属于乳酸菌的微生物以每毫克基于硅酸/氟化钠的凝胶牙粉102至1012个、优选地103至108个细胞的量添加。
实施例24:抗牙石的牙粉组合物
抗牙石的牙粉组合物优选地如W.Umbach(编者)的教科书“Kosmetik”第二版,Thieme Verlag,1995第206页第7.1.4.4章“Rezepturbeispiel”中所述制备,其中,在除第206页该章节中所提及的成分之外,还将上述属于乳酸菌的微生物以每毫克抗牙石的牙粉102至1012个、优选地103至108个细胞的量添加。
实施例25:口香糖组合物
口香糖组合物优选地如DE-C2 36 45 147第9页实施例6中所述制备,其中,在除所述实施例4中所提及的成分之外,还将上述属于乳酸菌的微生物以每毫克口香糖102至1012个、优选地103至108个细胞的量添加。
实施例26:浓缩的漱口组合物
浓缩的漱口组合物优选地如W.Umbach(编者)的教科书“Kosmetik”第二版,Thieme Verlag,1995第206页第7.1.4.4章“Rezepturbeispiel”中所述制备,其中,在除第206页该章节中所提及的成分之外,还将上述属于乳酸菌的微生物以每毫升浓缩的漱口组合物102至1013个细胞的量添加。
实施例27:膜制备物
膜的制备:
1.水相
-加热水至60℃
-将阿斯帕坦(甜味剂)在搅拌下加入
-完全溶解阿斯帕坦
-将水溶性聚合成膜剂如Kollicoat IR(在聚乙烯醇上的聚乙二醇)或PVP(聚乙烯吡咯烷酮)或天然聚合物如藻酸盐在搅拌下加入直至它们溶解。
-十分钟后,除去剩下的泡沫
-将上述属于乳酸菌的微生物以每份成品香味薄膜102至1012个、优选地103至108个细胞的量在冷却混合物后添加;备选地,可以添加上述属于乳酸菌的微生物的变体或衍生物或者上述属于乳酸菌的类似物或碎片。
2.油相
-将薄荷醇溶解于薄荷油
-将聚山梨酯80搅拌下添加至薄荷油–薄荷醇混合物
-随后将该混合物搅拌下添加至丙二醇
-可以添加任选的色料(如色素、色淀)
3.-在搅拌下将油相与水相缓慢混合
4.-薄膜使用切割装置机械地生成。
样品配方:
本发明的其他实施方案和用途对本领域技术人员而言在本文中公开的本发明说明书和实施例后是明显的。本文中无论出于何种原因所引用的全部参考文献,包括所有出版物、全部美国专利和外国专利以及美国专利申请和外国专利申请均具体而完整地引用作为参考用于全部目的。说明书和实施例旨在仅应当视为起说明性,同时本发明的范围和精神由如下权利要求书描述。
Claims (28)
1.属于乳酸菌组的微生物,或其热灭活或冻干形式或碎片在制备用于通过结合变形链球菌群治疗或预防除了变形链球菌的变形链球菌群引起的龋的防龋组合物中的用途,其特征在于所述属于乳酸菌组的微生物,或其热灭活或冻干形式或碎片能够特异性结合属于变形链球菌群组的细菌,其中所述特异性结合是
(i)抗热处理;和/或
(ii)抗蛋白酶处理;和/或
(iii)是钙依赖性的,
其中所述除了变形链球菌的变形链球菌群是至少一种选自远缘链球菌、仓鼠链球菌、大鼠链球菌、野鼠链球菌和猕猴链球菌的细菌,
其中所述微生物是属于乳杆菌属的微生物。
2.权利要求1的用途,其中所述特异性结合如下分析:
(a)将所述微生物培养至稳定期;
(b)将所述微生物与已经培养至稳定期的属于变形链球菌群组的细菌混合;
(c)将步骤(b)得到的混合物在允许所述微生物与变形链球菌群组的细菌形成聚集物的条件下孵育,和
(d)通过沉淀的出现检测聚集物。
3.权利要求1的用途,其中所述乳杆菌是副干酪乳杆菌或鼠李糖乳杆菌。
4.权利要求3的用途,其中所述副干酪乳杆菌选自具有DSMZ保藏号DSM 16667、DSMZ保藏号DSM 16668、DSMZ保藏号DSM 16669、DSMZ保藏号DSM 16670或DSMZ保藏号DSM 16671的副干酪乳杆菌,或其热灭活形式或冻干形式或碎片,其中所述热灭活形式或冻干形式或碎片保留结合属于变形链球菌群组的细菌的能力。
5.权利要求3的用途,其中所述鼠李糖乳杆菌选自具有DSMZ保藏号DSM 16672和DSMZ保藏号DSM 16673的鼠李糖乳杆菌,或其热灭活形式或冻干形式或碎片,其中所述热灭活形式或冻干形式或碎片保留结合属于变形链球菌群组的细菌的能力。
6.权利要求1的用途,其中所述微生物热灭活形式或冻干形式或碎片能够结合至少一种选自变形链球菌、远缘链球菌、仓鼠链球菌、大鼠链球菌、野鼠链球菌和猕猴链球菌的细菌。
7.权利要求6的用途,其中所述变形链球菌是DSMZ 20523所示例的变形链球菌血清型c和/或NCTC 10923所示例的血清型e和/或NCTC11060所示例的血清型f。
8.权利要求6的用途,其中所述远缘链球菌是远缘链球菌DSM20742.
9.权利要求6的用途,其中所述大鼠链球菌是大鼠链球菌DSM 20564.
10.权利要求6的用途,其中所述仓鼠链球菌是仓鼠链球菌DSM20562.
11.权利要求6的用途,其中所述野鼠链球菌是野鼠链球菌DSM20646.
12.权利要求6的用途,其中所述猕猴链球菌是猕猴链球菌DSM20714.
13.权利要求1的用途,其中所述热处理在4℃和121℃的温度间进行至少20分钟。
14.权利要求1的用途,其中所述蛋白酶处理是用选自链霉蛋白酶E、蛋白酶K、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的蛋白酶处理。
15.权利要求1的用途,其中所述防龋组合物是美容组合物或药物组合物,所述美容组合物或药物组合物还包含可美容用的、可药用的、可口腔用的载体或赋形剂。
16.权利要求1的用途,其中所述防龋组合物是牙粉、口香糖、锭剂、漱口剂、口腔清洗剂、牙线或洁牙带。
17.权利要求1的用途,其中所述防龋组合物是防龋食品或饲料。
18.权利要求1的用途,其中所述防龋组合物是食品、饲料或饮料的添加剂。
19.权利要求1的用途,其中所述组合物用于人类。
20.权利要求1的用途,其中所述组合物用于动物。
21.权利要求1的用途,其中龋由至少一种选自远缘链球菌、仓鼠链球菌、大鼠链球菌、野鼠链球菌和猕猴链球菌的细菌所致。
22.权利要求1的用途,其中所述微生物是属于乳杆菌属的微生物,所述属于乳酸菌组的微生物的热灭活或冻干形式或碎片是属于乳杆菌属的微生物的热灭活或冻干形式或碎片,所述除了变形链球菌的变形链球菌群是至少一种选自远缘链球菌、仓鼠链球菌、大鼠链球菌、野鼠链球菌和猕猴链球菌的细菌。
23.权利要求22的用途,其中所述热处理在4℃和121℃的温度间进行至少20分钟,和/或所述蛋白酶处理是用选自链霉蛋白酶E、蛋白酶K、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的蛋白酶处理。
24.权利要求23的用途,其中所述微生物是下述副干酪乳杆菌,其选自具有DSMZ保藏号DSM 16667、DSMZ保藏号DSM 16668、DSMZ保藏号DSM 16669、DSMZ保藏号DSM 16670或DSMZ保藏号DSM 16671的副干酪乳杆菌。
25.权利要求22或24的用途,其中所述防龋组合物是牙粉、口香糖、锭剂、漱口剂、口腔清洗剂、牙线或洁牙带。
26.权利要求22或24的用途,其中所述防龋组合物是防龋食品或饲料。
27.权利要求22或24的用途,其中所述防龋组合物是食品、饲料或饮料的添加剂。
28.权利要求1的用途,其中所述特异性结合也是
(iv)在pH 4.5和8.5范围间形成;和/或
(v)在唾液存在下形成。
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