CN104789624A - 一种乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙的新方法，该工艺主要包括以下步骤：将活化好的乳酸链球菌素种子液接入发酵培养基，开始发酵后，通过流加一定浓度氢氧化钙悬浊液控制发酵液pH至6.0-7.0，发酵20-30h结束后，发酵液经过预处理、除菌、浓缩、干燥的方式提取乳酸链球菌素，浓缩产生的废液经过结晶、离心、干燥后提取乳酸钙。利用本方法能有效提高乳酸链球菌素发酵效价的同时，将发酵副产物乳酸转化为乳酸钙，提高发酵液的利用率，降低环境污染，降低生产成本。

Description

一种乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙的方法

技术领域

本发明涉及一种乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙的方法，属于生物工程领域。

背景技术

乳酸链球菌素(Nisin)亦称乳酸链球菌肽，是由乳酸链球菌或乳酸乳球菌部分菌株发酵产生的一类小分子多肽类化合物。Nisin是由34个氨基酸组成的小分子多肽，分子量约为3500Da，在天然状态下主要有2种结构形式，分别为Nisin A和Nisin Z。它能有效地抑制引起食品腐败的***，并对芽孢杆菌的孢子有强烈的抑制作用。同时，Nisin容易被人体消化道中的一些蛋白酶所降解，不会在人体内蓄积，是世界公认安全的天然防腐剂。继1961年FAO/WHO批准Nisin作为食品添加剂使用后，全世界已有50多个国家和地区批准其作为食品防腐剂。1990年，我国将其列入国家标准GB2760-86，可以用于罐藏食品、植物蛋白食品、乳制品和肉制品中。

在乳酸链球菌素发酵过程中，一个主要的副产物为乳酸，乳酸的存在会导致发酵液pH的下降，同时乳酸对微生物细胞代谢有明显的抑制作用，一般发酵过程流加碱液维持发酵液pH在最佳的范围内，常见使用的碱液为氢氧化钠。但现有乳酸链球菌素发酵存在发酵产率较低，发酵成本较高，市场竞争力不足等问题。

乳酸钙是新发展的食品强化剂，是经美国食品药品管理局(FDA)批准作为食品使用的一种钙制剂，因其钙含量高、溶解度大、安全性高、价格合理等优点而备受重视。国内外乳酸钙的生产工艺主要有化学合成法和生物发酵生产法，后者更为常见和重要。在我国，西安试剂厂于1985年开始生产乳酸钙食品添加剂，到目前为止，国内生产乳酸钙的厂家已经上百家，生产的工艺一般都采用发酵糊化法。

发明内容

为克服现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙的方法。利用发酵液中的乳酸生产乳酸钙，不仅提高乳酸链球菌素的发酵产率，其发酵液效价从7000-8000IU/mL提高到12000-14000IU/mL，同时降低成本，开辟新产品，提高企业效益。

本发明的技术方案是：

一种乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①将活化好的乳酸链球菌种子液接入发酵培养基，开始发酵后，通过流加氢氧化钙悬浊液控制发酵液pH至6.0-7.0，发酵20-30h；

②发酵结束后，发酵液经过预处理、除菌、浓缩、干燥提取乳酸链球菌素；

③浓缩废液经过结晶、离心、干燥后提取乳酸钙。

进一步的，步骤①中所述活化步骤为：

(1)取保存于-80℃的乳酸链球菌甘油管在固体培养基上划线，29-30℃条件下培养12-20h，得单菌落；

(2)将步骤(1)中固体培养基上的单菌落接种于种子培养基中，于29-30℃条件下培养8-12h，得到活化好的乳酸链球菌种子液种子液。

更进一步的，所述步骤(1)中的固体培养基成分为蔗糖0.6-2％，酵母膏0.3-2％，蛋白胨0.3-2％，KH₂PO₄0.9-2％，NaCl 0.5％，Mg SO₄0.01-0.2％，琼脂1.2-2％；

所述步骤(2)中的种子培养基成分为蔗糖0.6-2％，酵母膏0.3-2％，蛋白胨0.3-2％，KH₂PO₄0.9-2％，NaCl 0.5％，Mg SO₄0.01-0.2％。

进一步的，步骤①中所述的发酵培养基成分为：蔗糖20-35％，酵母膏9-15％，玉米浆1-2％，KH₂PO₄0.9-2％，NaCl 0.5％，Mg SO₄0.01-0.2％，吐温6-10％；

步骤①中所述氢氧化钙悬浊液的浓度为10％-30％，并且使用搅拌装置不断搅拌，保持混匀悬浮状态。

更进一步的，步骤①中所述氢氧化钙悬浊液的浓度为12％-16％。

进一步的，

步骤②中所述液预处理为调节发酵液pH至1.5-3.0，60-80℃保温30-60min；

步骤②中所述除菌的方式为陶瓷膜过滤或板框过滤；

步骤②中所述浓缩的方式为超滤膜浓缩；所述超滤膜浓缩时，浓缩回流一侧用于提取乳酸链球菌素，透过液一侧提取乳酸钙，所述透过液也即为浓缩废液；

步骤②中所述乳酸链球菌菌素的干燥提取方法为：将经过超滤浓缩后的透过液进行检测，待透过液一侧检测不到效价时，结束浓缩，收集回流液，进行喷雾干燥即得。

进一步的，所述超滤膜为卷式膜，膜截留分子量为1000-2000DA。

进一步的，

所述步骤③中乳酸钙的提取方法为：将经过超滤浓缩的浓缩透过液一侧，添加氢氧化钙调节PH至7.0-7.5，然后过滤掉不溶物，进行结晶操作，结晶完成后进行离心分离，即得乳酸钙的固体，进行干燥得到最终的乳酸钙产品。

再进一步的，

步骤③浓缩废液结晶的参数：控制结晶起始温度为50-80℃，乳酸钙浓度100-150g/L，温速率为5-10℃/h，降温至30℃以下，并且在结晶过程中一直维持搅拌转速100-200r/min。

本发明的有益效果是：

本发明创新性地使用氢氧化钙作为流加碱液控制发酵液的pH，相比于目前普遍使用的氢氧化钠，有下述优点：①钙离子相比钠离子，对细胞代谢的影响明显较小，更有利于细胞合成Nisin；②发酵效价能达到12000-14000IU/mL(氢氧化钠控制发酵液pH，发酵效价仅为7000-8000IU/mL)，发酵效价大大提高；③通过实现乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙，利用本发明的方法，能在一次发酵过程，同时生产两种产品，增加了单位发酵体积产出量，相对降低乳酸链球菌素的成本，提高了发酵经济效益；④浓缩过程中产生的废液，进行废物利用，同时制备出乳酸钙，既减少了环境污染，又相对降低乳酸链球菌素的成本。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例，实施例不应视作对本发明保护范围的限定。

实施例1

①发酵：取保存于-80℃的乳酸链球菌甘油管在固体培养基上划线，29℃条件下培养12h，挑单菌落接入种子培养基，于29℃条件下培养8h，然后其种子液接入发酵培养基，控制发酵温度30℃，控制葡萄糖浓度为5-10g/L，控制搅拌转速为50r/min，发酵过程中通过流加浓度为10％的氢氧化钙悬浊液控制发酵液pH至6.0，发酵时间20h后，结束发酵，发酵后乳酸链球菌素的效价为12300IU/mL。

②发酵液预处理：用盐酸调节发酵液调节至pH＝1.5-2.0，升温至60-70℃，维持时间为30min。

③发酵液除菌：使用陶瓷膜过滤的方式，除出微生物细胞及大分子的不溶物。

④浓缩：使用截留分子量为1000-2000DA的超滤膜进行超滤浓缩，浓缩回流一侧用于提取乳酸链球菌素，透过液一侧提取乳酸钙。

⑤待透过液一侧检测不到效价时，结束浓缩，收集回流液，添加辅料后，进行喷雾干燥得到乳酸链球菌素。

⑥透过液一侧，添加氢氧化钙调节pH至7.5左右，然后过滤掉不溶物，进行结晶操作，具体结晶参数：控制结晶起始温度为50-65℃，乳酸钙浓度100-120g/L，降温速率为5-8℃/h，降温至30℃以下，并且在结晶过程中一直维持搅拌转速100-150r/min，结晶完成后进行离心分离，得到乳酸钙的固体，进行干燥得到最终的乳酸钙产品。

实施例2

①发酵：乳酸链球菌的活化方法如实施例1中步骤①所述，发酵过程中通过流加浓度为20％的氢氧化钙悬浊液控制发酵液pH至6.5-7.0，发酵时间25h后，结束发酵，发酵后乳酸链球菌素的效价为12780IU/mL。

②发酵液预处理：用盐酸调节发酵液调节至pH＝1.5-2.5，升温至75-80℃，维持时间为45min。

③发酵液除菌：使用板框过滤的方式，除出微生物细胞及大分子的不溶物。

④浓缩：使用截留分子量为1000-2000DA的超滤膜进行超滤浓缩，浓缩回流一侧用于提取乳酸链球菌素，透过液一侧提取乳酸钙。

⑤待透过液一侧检测不到效价时，结束浓缩，收集回流液，进行喷雾干燥得到乳酸链球菌素。

⑥透过液一侧，添加氢氧化钙调节pH至7.0左右，然后过滤掉不溶物，进行结晶操作，具体结晶参数：控制结晶起始温度为70-75℃，乳酸钙浓度120-130g/L，降温速率为6-8℃/h，降温至30℃以下，并且在结晶过程中一直维持搅拌转速120-160r/min，结晶完成后进行离心分离，得到乳酸钙的固体，进行干燥得到最终的乳酸钙产品。

实施例3

①发酵：乳酸链球菌的活化方法如实施例1中步骤①所述，发酵过程中通过流加浓度为30％的氢氧化钙悬浊液控制发酵液pH至6.5-7.0，发酵时间30h后，结束发酵，发酵后乳酸链球菌素的效价为13020IU/mL。

②发酵液预处理：用盐酸调节发酵液调节至pH＝2.0-3.0，升温至75-80℃，维持时间为60min。

③发酵液除菌：使用陶瓷膜过滤的方式，除出微生物细胞及大分子的不溶物。

④浓缩：使用截留分子量为1000-2000DA的超滤膜进行超滤浓缩，浓缩回流一侧用于提取乳酸链球菌素，透过液一侧提取乳酸钙。

⑤待透过液一侧检测不到效价时，结束浓缩，收集回流液，进行喷雾干燥得到乳酸链球菌素。

⑥透过液一侧，添加氢氧化钙调节pH至7.0左右，然后过滤掉不溶物，进行结晶操作，具体结晶参数：控制结晶起始温度为75-80℃，乳酸钙浓度130-150g/L，降温速率为8-10℃/h，降温至30℃以下，并且在结晶过程中一直维持搅拌转速160-200r/min，结晶完成后进行离心分离，得到乳酸钙的固体，进行干燥得到最终的乳酸钙产品。

Claims (9)

1.一种乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙的方法，其特征在于，包括以下步骤：

①将活化好的乳酸链球菌种子液接入发酵培养基，开始发酵后，通过流加氢氧化钙悬浊液控制发酵液pH至6.0-7.0，发酵20-30h；

②发酵结束后，发酵液经过预处理、除菌、浓缩、干燥提取乳酸链球菌素；

③浓缩废液经过结晶、离心、干燥后提取乳酸钙。

2.根据权利要求1所述的一种乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙的方法，其特征在于，步骤①中所述活化步骤为：

(1)取保存于-80℃的乳酸链球菌甘油管在固体培养基上划线，29-30℃条件下培养12-20h，得单菌落；

(2)将步骤(1)中固体培养基上的单菌落接种于种子培养基中，于29-30℃条件下培养8-12h，得到活化好的乳酸链球菌种子液种子液。

3.根据权利要求2所述的一种乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的固体培养基成分为蔗糖0.6-2％，酵母膏0.3-2％，蛋白胨0.3-2％，KH₂PO₄ 0.9-2％，NaCl 0.5％，Mg SO₄ 0.01-0.2％，琼脂1.2-2％；

所述步骤(2)中的种子培养基成分为蔗糖0.6-2％，酵母膏0.3-2％，蛋白胨0.3-2％，KH₂PO₄0.9-2％，NaCl 0.5％，Mg SO₄ 0.01-0.2％。

4.根据权利要求1所述的一种乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙的方法，其特征在于，

步骤①中所述的发酵培养基成分为：蔗糖20-35％，酵母膏9-15％，玉米浆1-2％，KH₂PO₄0.9-2％，NaCl 0.5％，Mg SO₄ 0.01-0.2％，吐温6-10％；

步骤①中所述氢氧化钙悬浊液的浓度为10％-30％，并且使用搅拌装置不断搅拌，保持混匀悬浮状态。

5.根据权利要求4所述的一种乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙的方法，其特征在于，步骤①中所述氢氧化钙悬浊液的浓度为12％-16％。

6.根据权利要求1所述的一种乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙的方法，其特征在于，

步骤②中所述液预处理为调节发酵液pH至1.5-3.0，60-80℃保温30-60min；

步骤②中所述除菌的方式为陶瓷膜过滤或板框过滤；

步骤②中所述浓缩的方式为超滤膜浓缩；所述超滤膜浓缩时，浓缩回流一侧用于提取乳酸链球菌素，透过液一侧提取乳酸钙，所述透过液也即为浓缩废液；

步骤②中所述乳酸链球菌菌素的干燥提取方法为：将经过超滤浓缩后的透过液进行检测，待透过液一侧检测不到效价时，结束浓缩，收集回流液，进行喷雾干燥即得。

7.根据权利要求6所述的一种乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙的方法，其特征在于，所述超滤膜为卷式膜，膜截留分子量为1000-2000DA。

8.根据权利要求1所述的一种乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙的方法，其特征在于，

所述步骤③中乳酸钙的提取方法为：将经过超滤浓缩的浓缩透过液一侧，添加氢氧化钙调节PH至7.0-7.5，然后过滤掉不溶物，进行结晶操作，结晶完成后进行离心分离，即得乳酸钙的固体，进行干燥得到最终的乳酸钙产品。

9.根据权利要求8所述的一种乳酸链球菌素发酵联产乳酸钙的方法，其特征在于，

步骤③浓缩废液结晶的参数：控制结晶起始温度为50-80℃，乳酸钙浓度100-150g/L，温速率为5-10℃/h，降温至30℃以下，并且在结晶过程中一直维持搅拌转速100-200r/min。