CN104788365B - 异烟酰胺衍生物、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了式(I)异烟酰胺衍生物和其药学上可接受的盐，其中R1、R2、R3和A如说明书中所定义。本发明还公开了这些化合物的制备方法，含有所述化合物的药物组合物，以及所述化合物在治疗哺乳动物尤其人类过度增殖性疾病以及用于制备治疗哺乳动物尤其人类过度增殖性疾病的药物方面的应用。
Description
技术领域
本发明涉及可用于治疗哺乳动物过度增殖性疾病如肿瘤的异烟酰胺衍生物及其制备方法，含有所述化合物的药物组合物，以及所述化合物在治疗哺乳动物尤其人类过度增殖性疾病以及用于制备治疗哺乳动物尤其人类过度增殖性疾病的药物方面的应用。
背景技术
细胞信号传导途径对细胞生长、增殖和分化起着重要作用。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族信号转导是细胞内重要的信号通路，包括细胞外信号调控的蛋白激酶(ERK)、c-JunN端激酶(JNK)/应激激活的蛋白激酶(SAPK)、P38MAPK以及ERK5/BMK1等4条途径。其中ERK(extracellular regulated kinase)是MAPK家族的重要成员细胞外信号调节激酶，其信号转导通路(Ras-Raf-MEK-ERK)能被多种生长因子、细胞因子及促***剂激活，在细胞的增殖、分化和凋亡中发挥重要作用，是多种信号交汇点或共同通路。活化的GTP结合Ras引发丝氨酸/苏氨酸激酶的级联激活，Raf被激活后继而激活MEK，MEK属于少有的双重特异性激酶，使Tyr和Thr两个调节位点磷酸化而激活ERK族(ERK-1、ERK-2)。该通路中人们重点关注的3个重要的靶分子为：Ras、Raf和MEK。
Ras基因是一个原癌基因，家族成员包括K-Ras、H-Ras和N-Ras。其中K-Ras与肿瘤的发生及进展关系最大，其在肿瘤中突变频率也最高。研究发现：胰腺癌(90％)、结肠癌(50％)、肺癌(30％)、卵巢癌(15％)、甲状腺癌(50％)、膀胱癌(6％)，红斑性狼疮(SLE)、乳腺癌、肝癌、皮肤癌、类风湿性关节炎(RA)、肾癌及某些的白血病(Leukemia)都有较高的KRas突变水平。
Raf是人类最重要的原癌基因之一，Raf蛋白是一个丝苏氨酸激酶，有三个亚型A-Raf，B-Raf和C-Raf。在催化底物方面，A-Raf只能以MEK1为底物；B-raf则以MEK1/2为底物，也是MEK最主要的上游活化激酶；而C-Raf除以MEK1/2为底物外，还以视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)、BCL2/BCL-XL相关死亡促进因子(BAD)等为底物，因此B-Raf的作用更倾向于在Ras-Raf-MEK-ERK信号通路中连接Ras和MEK。大约有8％的人类肿瘤发生B-Raf突变。B-Raf的绝大部分突变形式为B-RafV600E突变，该突变导致下游MEK-ERK信号通路持续激活，对肿瘤的生长增殖和侵袭转移至关重要。B-Raf突变主要发生于黑色素瘤、结肠癌和甲状腺癌中。在黑色素瘤中B-Raf突变率最高，约有40％～68％恶性(转移性)黑色素瘤发生B-Raf突变。该突变是第一个在黑色素瘤中被发现的高频率突变基因，目前已经成为黑色素瘤的治疗靶标。另外5％～8％结肠癌也发生B-Raf突变。此外B-Raf在甲状腺癌中突变率约为30％，其中甲状腺***状癌亚型中突变率最高，突变率为30％～70％。在肺癌中B-Raf突变也有报道，但突变率较低，为2％左右。
MEK属于双重特异性激酶，家族成员包括MEK1/MEK2，通常表示为MEK1/2。它们的作用底物只有ERK1和ERK2。被持续激活的MEK1能将哺乳动物细胞转化为肿瘤表型，而通过抑制MEK进而阻止ERK的激活能阻止Ras突变的细胞在体外的生长。MEK抑制剂与一般激酶抑制剂不同，其不与ATP竞争目标激酶的ATP结合位点，亦不与ERK1/2竞争MEK1/2结合位点，而是与MEK临近的疏水区域结合。由于MEK抑制剂是非ATP竞争抑制剂，所以相比B-Raf抑制剂，选择性更好，同时MEK抑制剂的结合部位在其他激酶上没有同源序列，是所有激酶抑制剂中特异性最强的。此外，很多此类MEK抑制剂的作用是可逆的，停用后激酶可被重新激活。也减少了由于MEK抑制剂导致的不可逆副作用的发生。
由于K-RAS突变、B-Raf突变各自在肿瘤中的高发生率，且两者往往互斥的，导致肿瘤中Ras-Raf-MEK异常高的活化几率。因此通过抑制MEK，中断Ras-Raf-MEK-ERK信号通道活化给予肿瘤的增殖信号，从而达到肿瘤治疗效果，在理论上展现了一个良好的前景。
抑制MEK已经在多项研究中显示出潜在的治疗益处。国际专利申请WO2002/006213公开了如下(1)式的4-碘苯氨基苯氧肟酸的氧合酯，作为MEK抑制剂，可用于治疗各种增值性疾病状态，例如涉及MEK机能亢进的病症以及受MEK级联调节的疾病。其中代表性化合物为PD0325901，但目前为临床II期停止状态。
国际专利申请WO2003/077914公开了作为MEK抑制剂的N3烷基化苯并咪唑衍生物，用于治疗哺乳动物中过度增殖性疾病，如癌症和炎症，结构通式如下式(2)所示，其中代表性化合物为AZD6244，目前其与化疗药物多西他赛(Docetaxel)联用治疗KRas突变非小细胞肺癌已进入临床III期。
国际专利申请WO2006/045514公开了可用于治疗过度增殖性疾病如癌症和炎症的一系列取代的3-芳基氨基吡啶衍生物，结构通式如下式(3)所示。
国际专利申请WO2007/044515公开了可用于治疗增生性疾病的MEK抑制剂的吖丁啶，结构通式如下式(4)所示，代表性化合物GDC0973是良好的MEK抑制剂(Exelixis Inc.，210East Grand Avenue，South San Francisco，California94080，United States，ACSMed.Chem.Lett.2012，3，416-421)，目前与威罗菲尼(Vemurafenib)联合治疗一线转移性疾病的研究已进入临床III期。
GSK1120212(Trametinib)是同类药物中首先被FDA批准的(2013年5月)MEK抑制剂，作为单药上市，用于治疗具有B-RafV600E/V600K突变基因的转移性黑色素瘤和不能行手术治疗的黑色素瘤病人。GSK1120212结构如下所示。
目前国内对MEK抑制剂的开发处于初步阶段，尚没有化合物进入临床。提供新的抑制剂，抑制Ras-Raf-MEK-ERK信号传导，从而有效抑制细胞增殖，进而开发安全有效的抗肿瘤药物，仍然是临床应用所需要的，这无疑将有助于推进癌症的治疗进展。
发明内容
本发明提供了一种新的抑制剂，能够有效抑制Ras-Raf-MEK-ERK信号传导，不仅能抑制上游激酶对MEK的磷酸化，还能够抑制MEK对ERK的磷酸化，具有双重抑制效果，能够更加有效的抑制细胞增殖，治疗哺乳动物过度增殖性疾病如肿瘤。
就此，本发明提供了一种如下式(I)化合物，或其药学上可接受的盐：
式中，R1和R2各自独立地选自氢、C1-C4烷基、-O(CH2)2OH、或R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成
R3选自卤素、-S-(C1-C4烷基)或C1-C4烷氧基；
A为带有1～3个选自B组基团的取代基的芳基、带有1～3个选自B组基团的取代基的杂芳基、带有1～3个选自B组基团的取代基的C3-C8环烷基、带有1～3个选自B组基团的取代基的杂环烷基，
其中，B组基团选自下列一组：氢、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、-OH、-SH、-NO2、-CN、-COH、-COOH、-CONH2、-CONH-C1-C4烷基、-CONH-C3-C6环烷基、-C1-C4烷基-OH、-S-C1-C4烷基、-NR4R5、-SO2R6、-COR6、-COOR6、-芳基、-O-芳基、-NH-芳基、-S-芳基、-SO2-芳基、-CO-芳基、-CO2-芳基、-CONH-芳基、-环烷基、-杂芳基、-杂环烷基；
R4和R5各自独立地为氢、-COR6、-SO2R6、-COOR6；
R6选自-C1-C4烷基、-C1-C4卤代烷基、-C3-C6环烷基。
本发明还提供了所述式(I)化合物的制备方法。
本发明还提供了一种药物组合物，含有所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
本发明还提供了所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐以及含有所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物作为治疗过度增殖性疾病的药物。
本发明还提供了所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐以及含有所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物在制备治疗过度增殖性疾病的药物方面的应用。
本发明还提供了所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐以及含有所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物在制备***的药物方面的应用。
本发明还提供了一种能抑制丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)活性和阻碍丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(Raf)对MEK的磷酸化的方法，包括对患者施用治疗有效量的式(I)化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
本发明还提供了治疗过度增殖性疾病的方法，包括给予有需要的对象有效量的所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐或者含有所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物的步骤。
本发明还提供了***的方法，包括给予有需要的对象有效量的所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐或者含有所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药物组合物的步骤。
在本发明的一个优选实施方案中，所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐，式中R1和R2各自独立地为氢、或R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成更优选的R1和R2为氢。
在本发明的一个优选实施方案中，所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐，式中R3选自卤素或-S-(C1-C4烷基)，更优选的R3为I或-SMe。
在本发明的一个优选实施方案中，所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐，式中A为带有1～3个选自B组基团的取代基的芳基、带有1～3个选自B组基团的取代基的杂芳基、带有1～3个选自B组基团的取代基的C3-C8环烷基、带有1～3个选自B组基团的取代基的杂环烷基，
其中，B组基团选自下列一组：氢、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、-OH、-SH、-NO2、-CN、-COH、-COOH、-CONH2、-CONH-C1-C4烷基、-CONH-C3-C6环烷基、-C1-C4烷基-OH、-S-Ｃ1-C4烷基、-NR4R5、-SO2R6、-COR6、-COOR6；R4和R5各自独立地为氢、-COR6、-SO2R6、-COOR6；R6选自-C1-C4烷基、-C1-C4卤代烷基、-C3-C6环烷基；
更优选的，B组基团为氢或-NR4R5，R4为氢、-COR6、-SO2R6或-COOR6，R5为氢，R6为-C1-C4烷基、-C1-C4卤代烷基或-C3-C6环烷基。
在本发明的一个优选实施方案中，所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐，式中A为带有1～3个选自B组基团的取代基的芳基，其中，B组基团选自下列一组：氢、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、-OH、-SH、-NO2、-CN、-COH、-COOH、-CONH2、-CONH-C1-C4烷基、-CONH-C3-C6环烷基、-C1-C4烷基-OH、-S-C1-C4烷基、-NR4R5、-SO2R6、-COR6、-COOR6、-芳基、-O-芳基、-NH-芳基、-S-芳基、-SO2-芳基、-CO-芳基、-CO2-芳基、-CONH-芳基、-环烷基、-杂芳基、-杂环烷基；R4和R5各自独立地为氢、-COR6、-SO2R6、-COOR6；R6选自-C1-C4烷基、-C1-C4卤代烷基、-C3-C6环烷基。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐，式中A为带有1～3个选自B组基团的取代基的芳基，其中B组基团选自下列一组：氢、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、-OH、-SH、-NO2、-CN、-COH、-COOH、-CONH2、-CONH-C1-C4烷基、-CONH-C3-C6环烷基、-C1-C4烷基-OH、-S-C1-C4烷基、-NR4R5、-SO2R6、-COR6、-COOR6；R4和R5各自独立地为氢、-COR6、-SO2R6、-COOR6；R6选自-C1-C4烷基、-C1-C4卤代烷基、-C3-C6环烷基；
更优选的，B组基团为氢或-NR4R5，R4为氢、-COR6、-SO2R6或-COOR6，R5为氢，R6为-C1-C4烷基、-C1-C4卤代烷基或-C3-C6环烷基。
在本发明的一个优选实施方案中，所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐，式中A为带有1～3个选自B组基团的取代基的苯基，其中，B组基团选自下列一组：氢、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、-OH、-SH、-NO2、-CN、-COH、-COOH、-CONH2、-CONH-C1-C4烷基、-CONH-C3-C6环烷基、-C1-C4烷基-OH、-S-C1-C4烷基、-NR4R5、-SO2R6、-COR6、-COOR6、-芳基、-O-芳基、-NH-芳基、-S-芳基、-SO2-芳基、-CO-芳基、-CO2-芳基、-CONH-芳基、-环烷基、-杂芳基、-杂环烷基；R4和R5各自独立地为氢、-COR6、-SO2R6、-COOR6；R6选自-C1-C4烷基、-C1-C4卤代烷基、-C3-C6环烷基。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐，式中A为带有1～3个选自B组基团的取代基的苯基，其中B组基团选自下列一组：氢、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、-OH、-SH、-NO2、-CN、-COH、-COOH、-CONH2、-CONH-C1-C4烷基、-CONH-C3-C6环烷基、-C1-C4烷基-OH、-S-C1-C4烷基、-NR4R5、-SO2R6、-COR6、-COOR6；R4和R5各自独立地为氢、-COR6、-SO2R6、-COOR6；R6选自-C1-C4烷基、-C1-C4卤代烷基、-C3-C6环烷基；
更优选的，B组基团为氢或-NR4R5，R4为氢、-COR6、-SO2R6或-COOR6，R5为氢，R6为-C1-C4烷基、-C1-C4卤代烷基或-C3-C6环烷基。
在本发明的一个优选实施方案中，所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐，式中A为被选自B组基团取代基取代的苯基，其中B组基团选自下列一组：氢、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、-OH、-SH、-NO2、-CN、-COH、-COOH、-CONH2、-CONH-C1-C4烷基、-CONH-C3-C6环烷基、-C1-C4烷基-OH、-S-C1-C4烷基、-NR4R5、-SO2R6、-COR6、-COOR6、-芳基、-O-芳基、-NH-芳基、-S-芳基、-SO2-芳基、-CO-芳基、-CO2-芳基、-CONH-芳基、-环烷基、-杂芳基、-杂环烷基。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐，式中A为被选自B组基团取代基取代的苯基，其中B组基团选自下列一组：氢、卤素、烷基、烷氧基、卤代烷基、-OH、-SH、-NO2、-CN、-COH、-COOH、-CONH2、-CONH-C1-C4烷基、-CONH-C3-C6环烷基、-C1-C4烷基-OH、-S-C1-C4烷基、-NR4R5、-SO2R6、-COR6、-COOR6；R4和R5各自独立地为氢、-COR6、-SO2R6、-COOR6；R6选自-C1-C4烷基、-C1-C4卤代烷基、-C3-C6环烷基；
更优选的，B组基团为氢或-NR4R5，R4为氢、-COR6、-SO2R6或-COOR6，R5为氢，R6为-C1-C4烷基、-C1-C4卤代烷基或-C3-C6环烷基。
在本发明的一个优选实施方案中，所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐，式中A为被-NR4R5取代的苯基，所述化合物具有如下式(Ia)结构：
其中，R4选自氢、-COR6、-SO2R6、-COOR6，R5为氢；
R6选自-C1-C4烷基、-C1-C4卤代烷基、-C3-C6环烷基；
R1和R2各自独立地选自氢、C1-C4烷基、-O(CH2)2OH、或R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成
R3选自卤素、-S-(C1-C4烷基)或C1-C4烷氧基。
在本发明式(Ia)化合物的一个优选实施方案中，R4为-COR6，其中R6为-C1-C4烷基或-C1-C4卤代烷基，更优选的R6为-C1-C4烷基。
在本发明式(Ia)化合物的一个优选实施方案中，R4为-SO2R6，其中R6为-C1-C4烷基或-C3-C6环烷基。
在本发明式(Ia)化合物的一个优选实施方案中，R4为-COOR6，其中R6为-C1-C4烷基。
在本发明式(Ia)化合物的一个优选实施方案中，R4为氢。
在本发明式(Ia)化合物的另一个优选实施方案中，R1和R2各自独立地选自氢、或R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成R3为卤素。
在本发明式(Ia)化合物的另一个优选实施方案中，R1和R2各自独立地选自氢或R3为卤素或-S-(C1-C4烷基)。
在本发明式(Ia)化合物的另一个优选实施方案中，R1和R2为氢；R3为卤素。
在本发明中，作为式(I)所表示的化合物或其药学上可接受的盐，可具体提及：
3-[(3-叔丁氧羰基氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺；
3-(3-氨基苯硫基)-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺；
3-[(3-乙酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺；
3-[(3-甲磺酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺；
3-[(3-环丙磺酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺；
3-[(3-三氟乙酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺；
3-[(3-甲磺酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-甲硫基苯基)氨基]异烟酰胺；
(S)-3-[(3-乙酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-N-[(2，3-二羟基)丙基]异烟酰胺；
(S)-3-[(3-甲磺酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-甲硫基苯基)氨基]-N-[(2，3-二羟基)丙基]异烟酰胺；
1-({3-[(3-乙酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]吡啶-4-基}羰基)-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-3-醇。
本发明还提供制备式(Ia)化合物的方法，它包括以下步骤：
其中，R4选自氢、-COR6、-SO2R6、-COOR6，R5为氢；R6选自-C1-C4烷基、-C1-C4卤代烷基、-C3-C6环烷基；R1和R2各自独立地选自氢、C1-C4烷基、-O(CH2)2OH、或R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成R3选自卤素、-S-(C1-C4烷基)或C1-C4烷氧基。
以3，5-二氟异烟酸为起始原料，3，5-二氟异烟酸在合适的条件下与化合物(b)发生取代反应，得到化合物(c)；化合物(c)在CDI存在下与氨水缩合得到通式化合物(d)；化合物(d)与3-巯基苯氨甲酸叔丁酯在碱存在下有机溶剂中发生取代反应，得到化合物(Ie)；化合物(Ie)在酸存在下有机溶剂中脱Boc保护得到化合物(If)；化合物(If)在有机碱存在下有机溶剂中与酰氯或酸酐发生酰化反应，得到化合物(Ig)；化合物(Ig)水解得到化合物(Ih)；化合物(Ih)在缩合剂、有机胺存在下有机溶剂中经酸胺缩合得到化合物(Ia)。
本发明所述式(Ia)化合物的制备方法，其中化合物(d)发生取代反应得到化合物(Ie)，所述碱为常用无机碱，包括但不限于碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、氢氧化钠、氢氧化钾等，所述有机溶剂为常用有机溶剂，包括但不限于DMF、THF、DMSO、丙酮等；化合物(Ie)脱Boc保护得到化合物(If)，所述酸为常用有机酸或无机酸，包括但不限于盐酸、三氟乙酸等，所述有机溶剂为常用有机溶剂，包括但不限于乙酸乙酯、二氯甲烷、DMF等；化合物(If)经酰化得到化合物(Ig)，所述有机碱包括但不限于吡啶、三乙胺等，所述有机溶剂为常用有机溶剂，包括但不限于二氯甲烷、THF、DMF等；化合物(Ig)水解得到化合物(m)，所述水解条件包括但不限于在亚硝酸钠/浓硫酸存在下于乙酸中进行水解、在氢氧化钠存在下于乙醇中水解等；化合物(Ih)经酸胺缩合得到化合物(Ia)，所述有机胺包括但不限于DIPEA、TEA，所述缩合剂包括但不限于HOBT/EDCI、HOBT/HATU、PyBOP，所述有机溶剂包括但不限于DMF、CH2Cl2、THF。
在本发明另一个制备方法实施方案中，化合物V的制备方法如下：
以2-溴-吡啶为原料，在正丁基锂存在下与1-叔丁氧羰基-3-氮杂环丁酮发生反应得到化合物(i)；化合物(i)经还原得到化合物(j)；再用三氟乙酸脱保护得到化合物(a)。
上述各制备步骤中的缩写名词分别表示：
THF 四氢呋喃
CH2Cl2 二氯甲烷
DMSO 二甲基亚砜
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DIPEA N，N-二异丙基乙胺
TFA 三氟乙酸
TEA 三乙胺
CDI 羰基二咪唑
HOBT 1-羟基苯并***
EDCI 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯
PyBOP 六氟磷酸苯并***-1-基-氧基三吡咯烷基
在本发明中，卤素是指氟、氯、溴、碘等，优选氟、氯、溴。
C1-C4烷基是指甲基、、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基；优选甲基、乙基、丙基、异丙基或丁基，更优选甲基。
C1-C4烷氧基是指甲氧基、乙氧基、正-丙氧基、异丙氧基、正-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基；优选甲氧基、乙氧基、正-丙氧基、异丙氧基或正-丁氧基；更优选甲氧基。
-S-(C1-C4烷基)是指甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基、丁硫基、异丁硫基、仲丁硫基或叔丁硫基；优选甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙硫基或丁硫基，更优选甲硫基。
C3-C6环烷基是指环丙基、环丁基、环戊基、环己基；优选环丙基。
C3-C8环烷基是指环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基；优选环己基。
-C1-C4卤代烷基是指被一个或多个卤素，优选一至五个卤原子取代的如本文定义的C1-C4烷基，包括但不限于三氟甲基、三氟乙基、二氟甲基、1-氯-2氟乙基等。
卤代烷基是指被一个或多个卤素，优选一至五个卤原子取代的如本文定义的烷基，包括但不限于三氟甲基、三氟乙基、二氟甲基、1-氯-2氟乙基等。
烷基是指一至八个碳原子的直链饱和一价烃基或三至八个碳原子的支链饱和一价烃基，包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基(包括所有异构形式)、戊基(包括所有异构形式)等。
烷氧基是指-OR基团，其中R是本文定义的烷基，包括但不限于甲氧基、乙氧基、正-丙氧基、异丙氧基、正-丁氧基等。
环烷基是指单环或稠合二环的、饱和或部分不饱和的(但非芳族的)、三至十个碳环原子的一价烃基团。一个或两个环碳原子可以被-C(O)-、-C(S)-、或-C(=NH)-基团替代。所述环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己-3-烯基等。
杂环烷基是指饱和或部分不饱和的(但非芳族的)三至八个环原子的一价单环基团，或饱和或部分不饱和的(但非芳族的)五至十二个环原子的一价稠合二环基团，其中一个或多个环杂原子独立地选自O、S、N，其余环原子为碳。一个或两个环碳原子可以被-C(O)-、-C(S)-、或-C(＝NH)-基团替代。所述杂环烷基包括但不限于吖丁啶基、吡咯烷基、哌啶基、吗啉基、哌嗪基、2-氧代哌嗪基、四氢吡喃基、2-氧代哌啶基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、噁唑啉基、噁唑烷基、异噁唑烷基、噻唑啉基、噻唑烷基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、四氢呋喃基、四氢吡哺基等。
芳基是指芳香族环烃基，优选碳原子数为6至14个，更优选为6至10个的芳基，如苯基和萘基，更优选苯基。
杂芳基是指含有1至4个选自N、S或O的杂原子的5至6元单环杂芳基或其与苯环稠而成的双环式杂芳基。所述杂芳基包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并咪唑基、吲哚基、异吲哚基、喹啉基、异喹啉基和喹唑啉基，优选咪唑基、噻唑基、吡嗪基、苯并咪唑基和喹啉基。
本发明还包含式(I)化合物在药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”是指相对无毒的本发明化合物的酸加成盐或碱加成盐。所述酸加成盐为本发明式(I)化合物与合适的无机酸或者有机酸形成的盐，这些盐可在化合物最后的分离和提纯过程中制备，或者可用过使纯化的式(I)化合物一起游离碱形式与适宜的有机酸或无机酸进行反应来制备。代表性酸加成盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、亚硫酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月硅酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯甲酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、葡萄糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。所述碱加成盐为式(I)化合物与合适的无机碱或者有机碱形成的盐，包括例如与碱金属、碱土金属、季铵阳离子形成的盐，例如钠盐、锂盐、钾盐、钙盐、镁盐、四甲基季铵盐、四乙基季铵盐等；胺盐，包括与氨(NH3)、伯胺、仲胺或叔胺形成的盐，如甲胺盐、二甲胺盐、三甲胺盐、三乙胺盐、乙胺盐等。
本发明的化合物可给药于哺乳动物包括人，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药(粉剂、软膏剂或滴剂)、或瘤内给药。所述化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。需要指出，本发明的化合物可以混合给药。
本发明还提供药物组合物，它含有本发明式(I)化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分，以及药学上可接受载体、赋形剂或稀释剂。在制备药物组合物时，通常是将本发明式(I)化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受载体、赋形剂或稀释剂混合。
可以按常规制备方法将所述本发明组合物配制为常规药物制剂。例如片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、乳液剂、混浮剂、分散液、溶液剂、糖浆剂、酏剂、软膏剂、滴剂、栓剂、吸入剂、喷射剂等。
本发明组合物用于口服给药的固体剂型包括例如胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂等。在这些固体剂型中，本发明式(I)化合物作为活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，例如与柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(1)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸等；(2)粘合剂，例如羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和***胶等；(3)保湿剂，例如，甘油等；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠等；(5)缓溶剂，例如石蜡等；(6)吸收加速剂，例如，季铵化合物等；(7)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯等；(8)吸附剂，例如，高岭土等；和(9)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠等，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中也可包含缓冲剂。
所述固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材料例如肠溶衣和其他本领域公知的材料进行包衣或微囊化。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性成分也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
本发明组合物用于口服给药的液体剂型包括要学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酊剂等。除了作为活性成分的式(I)化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水和其他溶剂，增溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油类，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油等或这些物质的混合物等。
除了这些惰性稀释剂外，本发明液体剂型也可包含常规助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料等。
所述悬浮剂包括，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇只、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂等或这些物质的混合物。
本发明组合物用于肠胃外注射的剂型可包括生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的本发明混合物的制剂剂型包括软膏剂、散剂、栓剂、滴剂、喷射剂和吸入剂等。作为活性成分的本发明式(I)化合物在无菌条件下和生理上可接受的载体及任选的防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
因此，本发明还提供一种药物制剂，它含有1-1000mg本发明式(I)化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
本发明还提供一种***的方法。所述肿瘤可通过抑制MEK活性得以减轻或治疗，包括给需要治疗的病人使用0.1-50mg/kg体重/天的本发明式(I)化合物或其药学上可接受的盐的步骤。
通过细胞实验和动物实验，证明本发明式(I)化合物具有癌细胞增殖抑制作用，可用于治疗癌症和制备用于治疗癌症的药物，所述癌症包括但不限于黑素瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌或小细胞肺癌、肝癌、肾癌等。
本发明化合物抑制癌细胞增殖的药效可用常规方法测定，一种优选的评价方法为磺酰罗丹明B(SulforhodamIne B，SRB)蛋白染色法，通过测定药物作用于癌细胞后所产生的光吸收值的变化来计算药物对癌细胞增殖的抑制率。
抑制率(％)=[(空白对照OD-加药OD)/空白对照OD]×100％
空白对照OD：指没有药物作用正常生长的细胞的孔的OD值。
加药OD：指加入待筛选的化合物作用的细胞的孔的OD值。
半数抑制剂浓度(IC50)值采用GraphPad公司PrIsm软件5.0版本，四参数拟合方法计算。每个实验重复3次，求出3次实验的平均IC50值为抑制能力的最终指标。
通过蛋白质免疫印迹试验，还证明本发明化合物具有MEK抑制活性，能有效抑制MEK的激酶活性。
附图说明
附图1是本发明化合物If-2和化合物Ig-3对Raf-MEK-ERK信号通路MEK磷酸化和ERK磷酸化抑制作用实验图。
附图2是本发明化合物Ig-3和阳性对照AZD6244及GSK1120212给药下的人结肠癌HT-29荷瘤鼠肿瘤增长曲线。
附图3是本发明化合物Ig-3和阳性对照GSK1120212给药下的人结肠癌HCT116荷瘤鼠肿瘤增长曲线。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则份数和百分比分别为重量份和重量百分比。
具体实施方式
I.本发明化合物制备实施例
中间物(a)：3-羟基-3-(哌啶-2-基)氮杂环丁烷三氟乙酸盐(a)
N-Boc-3-羟基-3-(吡啶-2-基)氮杂环丁烷(i)
将2-溴吡啶(1.57g，10mmol)溶于无水THF中，氮气保护，冷却至-78℃，缓慢滴加4.8mL2.5M正丁基锂溶液。在-78℃下搅拌1小时，将1-Boc-氮杂环丁酮(1.71g，10mmol)的10mLTHF溶液缓慢滴加至反应液中，-78℃下搅拌1小时即反应完全。用饱和氯化铵水溶液淬灭，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得粗产物，过柱纯化(二氯甲烷∶甲醇=100∶1)得到1.8g产物，收率为72％。
1HNMR(400MHz，CDCl3)δ8.55-8.50(m，1H)，7.84(td，J=7.8，1.7Hz，1H)，7.70(d，J＝8.0Hz，1H)，7.31(ddd，J=7.4，5.0，0.9Hz，1H)，5.97(br s，1H)，4.32(d，J=9.5Hz，2H)，4.13(d，J=9.5Hz，2H)，1.50(s，9H)。
N-Boc-3-羟基-3-(哌啶-2-基)氮杂环丁烷(j)
将2g N-Boc-3-羟基-3-(吡啶-2-基)氮杂环丁烷(i)溶于100mL乙醇中，加入20mg二氧化铂，在60atm，60℃反应40小时，过柱(二氯甲烷∶甲醇=100∶1-甲醇∶三乙胺=100∶1)得到1g产物。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ3.91(dd，J=9.2，4.1Hz，2H)，3.82(t，J=9.5Hz，2H)，3.19-3.10(m，1H)，2.79-2.77(m，1H)，2.72-2.66(m，1H)，1.98-1.89(m，1H)，1.71-1.64(m，2H)，1.44(s，9H)，1.40-1.34(m，3H)。
3-羟基-3-(哌啶-2-基)氮杂环丁烷三氟乙酸盐(a)
500mg N-Boc-3-羟基-3-(哌啶-2-基)氮杂环丁烷(j)中加入4ml二氯甲烷，冰浴下冷却，缓慢滴加2ml三氟乙酸，自然升温至室温反应过夜，浓缩，粗品溶于甲苯，再次浓缩成为粘性的固体，直接用于后续反应。
实施例1：3-[(3-叔丁氧羰基氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺(Ie-1)
参考PCT专利WO2012/055953中间体2.A的制备方法合成得到化合物(d-1)。化合物(d-1)(0.35mmol)，(3-巯基苯)氨甲酸叔丁酯(0.455mmol)，碳酸铯(1.05mmol)在DMF(7mL)中60℃反应4小时，加入20ml水，用乙酸乙酯反复萃取3次，合并有机相，饱和食盐水洗涤2次后无水硫酸钠干燥。制备分离纯化得到固体3-[(3-叔丁氧羰基氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺(Ie-1)0.25mmol，收率为71.4％。
ESI(+)m/z：581
实施例2：3-(3-氨基苯硫基)-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺(If-2)
化合物(Ie-1)(0.5mmol)溶于20ml乙酸乙酯中，O℃下加入5ml三氟醋酸，室温搅拌过夜，加入40ml饱和碳酸氢钠溶液中和，分离有机相，有机相无水硫酸钠干燥，制备分离纯化得到固体3-(3-氨基苯硫基)-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺(If-2)0.41mmol，收率为82％。
ESI(+)m/z：481
H1-NMR(氘代DMSO)：δ8.13(s，1H)，δ8.04(s，1H)，δ7.88(d，2H)，δ7.61(d，1H)，δ7.47(s，1H)，δ7.41(d，1H)，δ7.04(t，1H)，δ6.93(t，1H)，δ6.63(s，1H)，δ6.54(dd，2H)，δ5.30(s，2H)。
实施例3：3-[(3-乙酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺(Ig-3)
化合物(If-2)(0.26mmol)溶于3ml吡啶与3ml二氯甲烷的混合溶剂中，冰浴下加入乙酰氯(0.52mmol)。室温搅拌5小时，加入1Oml水和10ml二氯甲烷，分离有机相，有机相无水硫酸钠干燥。制备分离纯化得到固体3-[(3-乙酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺(Ig-3)0.21mmol，收率为81％。
ESI(+)m/z：523
H1-NMR(氘代DMSO)：δ10.05(s，1H)，δ8.18(s，1H)，δ8.07(s，1H)，δ7.90-7.93(d，2H)，δ7.68(s，1H)，δ7.59(d，1H)，δ7.51(m，2H)，δ7.42(d，1H)，δ7.32(t，1H)，δ7.05(d，1H)，δ6.96(t，1H)，δ7.05(s，3H)。
实施例4：3-[(3-甲磺酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺(Ig-4)
化合物(If-2)(0.26mmol)溶于3ml吡啶与3ml二氯甲烷的混合溶剂中，冰浴下加入甲磺酰氯(0.52mmol)。室温搅拌5小时，加入10ml水和10ml二氯甲烷，分离有机相，有机相无水硫酸钠干燥。制备分离纯化得到固体3-[(3-甲磺酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺(Ig-4)0.16mmol，收率为61.5％。
ESI(+)m/z：559
实施例5：3-[(3-环丙磺酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺(Ig-5)
化合物(If-2)(0.26mmol)溶于3ml吡啶与3ml二氯甲烷的混合溶剂中，冰浴下加入环丙磺酰氯(0.52mmol)。室温搅拌5小时，加入10ml水和10ml二氯甲烷，分离有机相，有机相无水硫酸钠干燥。制备分离纯化得到固体3-[(3-环丙磺酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺(Ig-5)0.23mmol，收率为88％。
ESI(+)m/z：585
实施例6：3-[(3-三氟乙酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺(Ig-6)
化合物(If-2)(0.26mmol)溶于3ml吡啶与3ml二氯甲烷的混合溶剂中，冰浴下加入三氟醋酸酐(0.52mmol)。室温搅拌5小时，加入10ml水和10ml二氯甲烷，分离有机相，有机相无水硫酸钠干燥。制备分离纯化得到固体3-[(3-三氟乙酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺(Ig-6)0.14mmol，收率为53.8％。
ESI(+)m/z：577
实施例7：3-[(3-甲磺酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-甲硫基苯基)氨基]异烟酰胺(Ig-7)
参考实施例2化合物(If-2)的合成方法，合成得到化合物(If-7)。化合物(If-7)(0.26mmol)溶于3ml吡啶与3ml二氯甲烷的混合溶剂中，冰浴下加入甲磺酰氯(0.52mmol)。室温搅拌5小时，加入10ml水和10ml二氯甲烷，分离有机相，有机相无水硫酸钠干燥。制备分离纯化得到固体3-[(3-甲磺酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-甲硫基苯基)氨基]异烟酰胺(Ig-7)0.19mmol，收率为73％。
ESI(+)m/z：479
实施例8：(S)-3-[(3-乙酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-N-[(2，3-二羟基)丙基]异烟酰胺(Ia-8)
化合物(Ig-3)(0.38mmol)悬浮于5ml醋酸中，慢慢加入亚硝酸钠(0.5mmol)的浓硫酸溶液(0.25ml)，室温搅拌反应过夜得到化合物(Ih-8)。化合物(Ih-8)(0.09mmol)，(S)-3-氨基-1，2-丙二醇(0.18mmol)，PyBop(0.105mmol)，DIPEA(0.6mmol)在DMF(3mL)中室温反应过夜。加入10ml水，用乙酸乙酯反复萃取3次，合并有机相，饱和食盐水洗2次后无水硫酸钠干燥。制备分离纯化得到固体(S)-3-[(3-乙酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-N-[(2，3-二羟基)丙基]异烟酰胺(Ia-8)0.045mmol，收率为50％。
ESI(+)m/z：597
实施例9：(S)-3-[(3-甲磺酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-甲硫基苯基)氨基]-N-[(2，3-二羟基)丙基]异烟酰胺(Ia-9)
参考实施例4化合物(Ig-4)的合成方法，合成得到化合物(Ig-9)。化合物(Ig-9)(0.31mmol)溶于10ml乙醇中，加入氢氧化钠(0.45mmol)，回流3小时得到化合物(Ih-9)。化合物(Ih-9)(0.20mmol)，(S)-3-氨基-1，2-丙二醇(0.40mmol)，PyBop(0.26mmol)，DIPEA(1.0mmol)在DMF(5mL)中室温反应过夜，加入10ml水，用乙酸乙酯反复萃取3次，合并有机相，饱和食盐水洗2次后无水硫酸钠干燥。制备分离纯化得到固体(S)-3-[(3-甲磺酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-甲硫基苯基)氨基]-N-[(2，3-二羟基)丙基]异烟酰胺(Ia-9)0.12mmol，收率为60％。
ESI(+)m/z：553
实施例10：1-({3-[(3-乙酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]吡啶-4-基}羰基)-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-3-醇(Ia-10)
化合物(Ih-8)(0.09mmol)，中间物(a)(0.18mmol)，PyBop(0.11mmol)，DIPEA(0.92mmol)在DMF(3mL)中室温反应过夜。加入10ml水，用乙酸乙酯反复萃取3次，合并有机相，饱和食盐水洗2次后无水硫酸钠干燥。制备分离纯化得到固体1-({3-[(3-乙酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]吡啶-4-基}羰基)-3-(哌啶-2-基)吖丁啶-3-醇(Ia-10)0.035mmol，收率为38.8％。
ESI(+)m/z：662
(II).本发明化合物活性测试实施例
测试实施例1：本发明化合物对人皮肤癌细胞(A375)、人结肠癌细胞(HT-29)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)增殖抑制作用
取处于对数生长期的细胞接种在96孔板中(细胞浓度为5000个/孔；细胞悬液180μl/孔)，37℃、5％CO2培养24小时使细胞贴壁。各化合物已事先溶解在DMSO中配制成10mM的储存液，当检测时再用完全培养基在另一96孔板中稀释到目的浓度的10倍，然后在接种细胞的96孔板中加入化合物20μl/孔，即到达目的浓度。每个浓度设3个复孔，并设空白对照。继续在37℃、5％CO2中继续培养72小时。终止培养，每孔加入50μl预冷(4℃)的50％三氯乙酸即TCA(终浓度10％)，放置在4℃固定1小时，用纯化水洗涤至少5次，空气中自然干燥或60℃烘箱干燥。用含1％冰乙酸的纯化水配制4mg/ml的磺酰罗丹明B即SRB，每孔加入100μl，室温染色1小时，弃上清，用1％冰乙酸洗涤至少5次除去非特异结合，干燥待用。每孔加入150μl的10mM的Tris-HCl溶液溶解，在510nm波长处测OD值，并进行数据整理计算抑制率。结果见表1：
表1
注：AZD6244制备方法参照WO2003/077914实施例10；GDC0973制备方法参照WO2007/044515实施例22
测试结果表明：本发明化合物对人皮肤癌细胞(A375)、人结肠癌细胞(HT-29)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)具有良好的增殖抑制作用。其中化合物Ig-3对人皮肤癌细胞(A375)、人结肠癌细胞(HT-29)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)增殖抑制作用明显优于AZD-6244和GDC-0973。
按同样方法，在B-RafV600突变结肠癌细胞Colon205、K-Ras突变人肺癌细胞A549、结肠癌细胞HCT116、胰腺癌细胞MIA-Paca2和非小细胞肺癌H2122中测试Ig-3化合物对肿瘤细胞生长抑制IC50值，结果见表2。
表2
注：*：K-Ras mutation；#：B-Raf V600E mutation
测试结果表明：本发明化合物Ig-3对B-RafV600突变结肠癌细胞Colon205、K-Ras突变人肺癌细胞A549、结肠癌细胞HCT116、胰腺癌细胞MIA-Paca2和非小细胞肺癌H2122具有良好的增殖抑制作用，且优于AZD6244。
测试实施例2：化合物If-2和化合物Ig-3对Raf-MEK-ERK信号传导抑制作用
取处于对数生长期的人结肠癌细胞(HT-29)接种在6孔板中(细胞浓度为1×106个/孔；细胞悬液2ml完全培养基/孔)，37℃、5％CO2培养24小时使细胞贴壁。阳性化合物AZD6244，GSK1120212，测试化合物If-2和Ig-3分别事先溶解在DMSO中配制成10mM的储存液，当检测时再用完全培养基在另一6孔板中稀释到目的浓度的1000倍，然后在接种细胞的6孔板中分别加入化合物，达到目的浓度：
AZD624410nM， 50nM，250nM；
GSK1120212 10nM，50nM；
If-2 2nM，10nM，50nM；
Ig-3 2nM，10nM，50nM
加药时间定为2小时。细胞给药刺激2小时后，吸干培养基，每孔加入100μl的1*SDS细胞裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，95℃，5min，离心机10000g离心5分钟，进行电泳分析，恒压100V转2-3小时，将蛋白转至PVDF(polyvinylidinedifluoride)膜上。取出PVDF膜，在纯化水中漂洗1-2min，放入封闭液中室温封闭1H。(封闭液为用TBST配制的5％脱脂奶粉。)将5％BSA(TBST配制)作为一抗稀释液预先杂交袋中，加入一抗(p-ERK抗体、ERK抗体、P-MEK，MEK抗体)稀释比例为1∶1000(Actin为1∶10000)，再将封闭后的PVDF膜按目的条带进行裁剪，放入相应杂交袋中，封口，4℃孵育过夜。回收一抗，杂交膜放入TBST中，洗膜6×5min。将5％脱脂奶粉(TBST配制)作为二抗稀释液，加入一抗稀释比例为1∶200-1∶500，再将杂交膜放入相应二抗(偶联HRP-山羊抗鼠/兔单克隆抗体)中，室温孵育1H。回收一抗，杂交膜放入TBST中，洗膜6×5min。用ECL发光试剂盒显影，并压片。试验结果见附图1。
测试结果表明：本发明化合物对Raf-MEK-ERK信号传导具有良好的抑制作用，对MEK和ERK的磷酸化都有不同程度的抑制作用。其中Ig-3化合物在2nM浓度下即对ERK蛋白磷酸化有抑制，与AZD6244在250nM浓度下抑制效果相当，同时对MEK磷酸化也有一定抑制，而AZD6244无此抑制作用。化合物Ig-3与GSK1120212对MEK和ERK的磷酸化具有同等程度的抑制作用。
测试实施例3：对人结肠癌HT-29裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用
评价测试药物Ig-3治疗人结肠癌HT-29细胞株异种移植动物模型的抗肿瘤作用和安全性研究。
方法：HT-29细胞在加有10％的Mcloy's5A培养基中培养，放在37℃含有5％CO2的恒温培养箱中培养。收取指数生长期的细胞并计数，用生理盐水重悬，接种于Balb/c-nu小鼠右背部肩胛部位，建立人结肠癌异种移植原位模型。每只鼠右侧背部接种6×106数目的HT-29细胞。待肿瘤平均体积128mm3时，根据肿瘤大小随机分组。实验分为测试药Ig-3的25mg/kgBID(一天两次)组，阳性对照组AZD624450mg/kg BID和GSK11202123mg/kg QD组，每组6只，口服灌胃给药14day。根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价，根据相对肿瘤增值率(T/C％)和肿瘤延迟时间进行疗效评价。肿瘤接种后，常规监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低(体重每周测量2次)情况，眼睛、被毛及其它异常情况。
肿瘤体积计算公式为：长径×短径2/2。
相对肿瘤增殖率T/C(％)：在某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积的百分比值。T和C分别为治疗组和对照组在某一特定时间点的相对肿瘤体积(RTV)。计算公式为：T/C％=TRTV/CRTV×100％。(TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV)。评价标准为：T/C(％)>40％为无效；T/C(％)≤40％，并经统计学处理P<0.05为有效。
结果：测试药物Ig-3(25mg/kg BID)治疗组在给药最后一天，均表现出肿瘤抑制作用，T/C(％)分别是13.2％，相较阴性对照组统计学上有显著性差异P<0.001；阳性对照药AZD624450mg/kg BID组和GSK1120212mg/kg QD给药最后一天T/C(％)分别是29.5％和8.9％，P值<0.001，阳性对照有效可靠。四个实验组肿瘤生长曲线见附图2，
测试结果表明：本发明化合物对人结肠癌HT-29裸小鼠皮下移植瘤的生长具有良好抑制作用，并且显示较好的安全性。测试药物Ig-3在25mg/kg BID下即表现良好的药效作用，并且毒性也在可接受范围。
测试实施例4：对人结肠癌HCT116裸小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用
评价测试药物Ig-3治疗KRas突变型人结肠癌HCT116细胞株异种移植动物模型的抗肿瘤作用和安全性研究。
方法：HCT116细胞在加有10％的Mcloy's5A培养基中培养，放在37℃含有5％CO2的恒温培养箱中培养。收取指数生长期的细胞并计数，用生理盐水重悬，接种于Balb/c-nu小鼠右背部肩胛部位，建立人结肠癌异种移植原位模型。每只鼠右侧背部接种2.5×106数目的HCT-116细胞。待肿瘤平均体积200mm3时，根据肿瘤大小随机分组。实验分为测试药Ig-3的25mg/kg BID(一天两次)和阳性对照药GSK11202123mg/kg QD(一天一次)组和溶媒对照组，每组6只，口服灌胃给药14day。根据动物体重变化和死亡情况进行安全性评价，根据相对肿瘤增值率(T/C％)和肿瘤延迟时间进行疗效评价。肿瘤接种后，常规监测包括了肿瘤生长及治疗对动物正常行为的影响，具体内容有实验动物的活动性，摄食和饮水情况，体重增加或降低(体重每周测量2次)情况，眼睛、被毛及其它异常情况。
肿瘤体积计算公式为：长径×短径2/2。
相对肿瘤增殖率T/C(％)：在某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积的百分比值。T和C分别为治疗组和对照组在某一特定时间点的相对肿瘤体积(RTV)。计算公式为：T/C％=TRTV/CRTV×100％。(TRTV：治疗组RTV；CRTV：阴性对照组RTV)。评价标准为：T/C(％)>40％为无效；T/C(％)≤４0％，并经统计学处理P<0.05为有效。
结果：测试药物Ig-3(25mg/kg BID)治疗组在给药最后一天，表现出明显肿瘤抑制作用，T/C(％)是12.6％，相较阴性对照组统计学上有显著性差异P<0.001；阳性对照药GSK11202123mg/kg QD组给药最后一天T/C(％)是7.8％，P值<0.001，阳性对照有效可靠。三个实验组肿瘤生长曲线见附图3。
测试结果表明：本发明化合物对人结肠癌HCT116裸小鼠皮下移植瘤的生长具有良好抑制作用，并且显示较好的安全性。测试药物Ig-3在25mg/kg BID下即表现良好的药效作用，并且毒性也在可接受范围。
在本文中提及的所有文献均通过引用被并入本申请中。此外还应指明的是，在阅读了本申请的上述公开内容之后，本领域技术人员可以无需背离本发明的精神和范围，对本发明作出各种修饰、改动或修改，但这些变化形式同样都应落于本申请所附权利要求书所记载的范围。
Claims (6)
1.一种下式(I)化合物，或其药学上可接受的盐：
式中，R1和R2各自独立地选自氢；
R3选自卤素；
A为带有1个选自B组基团的取代基的苯基，其中，B组基团为-NR4R5；
R4为-COR6；
R5为氢；
R6选自-C1-C4烷基。
2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述的化合物为3-[(3-乙酰氨基)苯硫基]-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]异烟酰胺。
3.一种药物组合物，包括权利要求1或2所述式(I)化合物或其药学上可接受的盐以及药物可接受载体、赋形剂或稀释剂。
4.权利要求1或2所述的化合物在制备治疗哺乳动物过度增殖性疾病的药物方面的应用。
5.如权利要求4所述的应用，所述哺乳动物是人类。
6.权利要求1或2所述的化合物在制备***的药物方面的应用。
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