CN104769437B - 可以在用于氧化的表面的涂层剂、增粘剂或粘合剂中使用的肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有肽，尤其是十二肽的涂层剂、增粘剂或粘合剂，其用于氧化的表面、多层复合物或经涂覆的基质，含有完全或部分由十二肽形成的化合物，所述化合物作为所述复合物的至少两个相邻层之间或涂层与基质之间的增粘剂，还涉及可用作用于氧化的表面的涂层剂、增粘剂或粘合剂的十二肽。

Description

可以在用于氧化的表面的涂层剂、增粘剂或粘合剂中使用 的肽
本发明涉及用于氧化的表面的涂层剂、增粘剂或粘合剂，含肽，尤其是十二肽，涉及含有完全或部分由十二肽组成的化合物的多层复合物或经涂覆的基质，所述化合物作为所述复合物的至少两个相邻层之间或涂层与基质之间的增粘剂，还涉及可以用作用于氧化的表面的涂层剂、增粘剂或粘合剂的十二肽。
在氧化的表面的涂层或着色的领域，已知的促进粘附的方法涉及双功能的有机硅烷化合物，例如，所述方法建立了涂料的聚合物基体和无机基质之间的化学键。这些增粘剂的缺点之一是仅当可以与硅烷相互作用的羟基基团存在于基质的表面上，才能确保最佳粘附。因此，许多情况下，基质的复杂预处理对于表面的硅烷化是必要的。另外，定制材料的制造是非常复杂的，此外，并不是对于所有基质，定制材料都是已知的。
自1940年以来，对自组装单层膜(SAM，也称为自组织单层膜)进行了研究和描述，但直到1983年人们才开始努力对这种组织方法的进行技术利用。
原则上，自组装单层膜有两个不同的活性基团，在它们之间存在间隔物，例如脂肪族间隔物。其一个基团与表面相互作用，而另一端的基团具有特定性质或连接到另一个官能化合物。SAM形成抵抗水的侵害的化学键，同时，所述化学键能够防止所有在夹层的电化学反应。在固体表面上的单分子层的自组织提供用于生产具有一定组成、结构以及厚度的夹层的有效方法。选择性自组织增粘剂具有的优点是，它们保证涂料层和粘合剂层以长使用寿命粘附到金属表面，这在汽车领域是必要的，例如防腐蚀的进一步改进。所述自组织增粘剂还允许均匀的涂料层的一贯良好地粘附在复合材料上，其正在越来越多地使用，并且具有不同的表面，如塑料-金属复合材料。
自组织单层用于半导体技术，例如，对于电极的表面稳定化和定制官能化。渗透性和电荷传送速率收到影响，取决于所用的烷基链的长度。应用自组织单层膜的领域非常广阔。自组织单层膜的技术尤其应用于电化学扫描隧道显微镜、细胞研究、传感器***和纳米电子学。然而，在现有技术中所描述的SAM的生产复杂且成本高。
无机基质和生物学成分耦合以修饰表面特性在仿生学中是已知的。从噬菌体文库选择的呈现短肽的噬菌体已用于，例如，沉淀和分离无机材料(WO 2003/078451)。此外，无机基质和特异性肽配体组成的混合材料被用作改变基质表面的潜在方法。然而，鉴定与基质匹配的生物配体(通常是肽)耗时且成本高，并且在此之前已排除具体应用。在现有技术中提出了用于结合两个无机成分的双功能配体概念。特别地，例如，在WO 2004/035612中描述了，通过有双功能结合性质的噬菌体，将细胞或生物分子与聚合物基质，尤其是掺杂氧化氯的聚吡咯(PPyCI)或聚(乳酸共乙醇酸)(PLGA)结合。没有进一步描述进一步结合到另一种物质，其不是所用噬菌体的生物学结合伴侣，例如涂层材料；这种结合同样将必须选择性发生以及需要配体和进一步的结合成分的完全匹配。
因此，对于提供新型化合物有很大的需求，所述化合物适合于在氧化的表面上使用，以及避免所述的现有技术的缺点。
已经令人惊奇地发现，某些十二肽用作用于氧化的表面的涂层剂、增粘剂或粘合剂具有优势。
因此，本发明的主题涉及一种定量方法，用于确定粘附的肽，尤其是十二肽在氧化的表面上的粘附性质，其特征在于：
a)将含肽溶液施加到有氧化的表面的运载体，并使其干燥，
b)通过洗涤，从所述运载体上去除未结合的肽，并使运载体干燥，
c)用染色溶液对粘附于运载体的肽进行染色，将剩余的染色溶液洗掉，并使所述运载体干燥，
d)用提取溶液将粘附于运载体的染色的肽从运载体上去除，含有染色的肽的上清经过分光光度计测量。
优选地，根据的发生通过所述肽的简单非特异性的染色，例如使用考马斯染色溶液的染色，或者通过导致特异性结合的化学反应，与例如茚三酮的化学反应，进行本发明的方法的步骤c)中的染色。
尤其有利地，本发明的定量方法的步骤a)到d)如下实施：
在步骤a)中，将2份10μL的肽溶液，浓度为2mg/mL，溶于1×PBS，pH 7.4来自Gibco，施加到直径为2.3cm的圆形HGD钢板，其中第一个10μL干燥大约15分钟，第二个10μL随后滴到相同的位置，干燥30分钟，接着在来自UVP Laboratory Products的HB-1000杂交炉里，在30℃，存在200毫升水的情况下干燥。
在步骤b)中，将板置于直径19cm的含有1升pH 7.4的PBS的用于洗涤的结晶皿中，并以60rpm在来自B.Braun的Certomat U水平摇床中在室温轻微摇动10分钟，并随后在30℃下干燥。
在步骤c)中，将所述板转移到6孔皿中，并将150μL的考马斯蓝染色溶液用移液管吸取到所述板上，所述溶液配方为含有2g考马斯亮蓝R-250、0.5g考马斯亮蓝G-250、50mL甲醇、425mL乙醇、100mL冰醋酸，加入蒸馏水到1000毫升，30秒后，将6mL 1×PBS，pH 7.4小心地加在皿的边缘以冲洗掉染色溶液，并两次将所述板移入6mL 1×PBS，pH 7.4中以去除剩余的染色溶液，之后将所述板在30℃短暂干燥。
在步骤d)中，将20μL体积比9：1的DMSO/CH3COOH提取溶液用移液管吸取到染色斑点上，允许所述提取溶液在室温作用5分钟，随后通过用移液管吹打直到斑点完全从所述板上去除，将液体取出，将上清液转移到一个反应容器中，之后2μL的上清液在来自PeqLab的Nanodrop 1000分光光度计中测量，选择602nm的UV VIS程序，以确定与氧化的表面上的肽的粘附强度相关的颜色强度。
根据本发明的适合的氧化的表面的实例是钢、玻璃、石英、金属氧化物(例如B2O3、Al2O3、SiO2、FexOy)、陶瓷、磷酸盐化的铁、岩石、砖和混凝土，尤其优选钢。角蛋白纤维和氧化的聚合物或适当功能化的聚合物也可以形成根据本发明的适合的氧化的表面。
有利地，根据本方明的定量方法允许客观测定氧化的表面上的肽的粘附强度，尤其是钢表面上的十二肽。
本发明进一步的主题涉及肽，尤其是十二肽，其在根据本发明的定量方法步骤d)中的测量中，吸收范围为0.25-1，优选为0.4-1，更优选为0.5-1，特别优选为0.6-1，以及非常特别优选为0.7-1。
借助于根据本发明的定量方法，已经鉴定了其氨基酸序列对应于表1中所示的序列模式的十二肽，其中“X”代表任何氨基酸；这些十二肽代表了本发明的进一步的主题。
根据本发明，优选的十二肽是那些在十二个位置的至少八个对应于表1中所示的序列模式的十二肽。特别优选的十二肽是那些在十二个位置的至少十个符合表1中所示的序列模式的十二肽。
根据本发明非常特别优选的十二肽是表1中所列的肽8和9，以及表2中所列的肽6和7。
本发明的进一步主题涉及表2中所列的肽10、13、15和17尤其是肽13和15。
本发明的进一步主题涉及编码本发明的肽的核酸，特别是表3中所列的核酸序列。
在本专利申请的意义上说，肽是指由天然氨基酸组成的聚合物，具有大的线型结构，且比天然蛋白质小。在本专利申请中，19个蛋白原的，天然存在的L-氨基酸由国际通用的单字母和三字母代码表示。
根据本发明的肽，尤其是十二肽，可用已知的肽合成方法化学生产，例如通过根据Merrifield的固相合成。
然而，优先使用重组方法生产本发明的肽，尤其是十二肽。根据本发明，这是指基于将感兴趣的肽的基因导入适于生产的宿主生物体以及所述宿主生物体转录和翻译所述基因的所有基因技术或微生物学方法。感兴趣的基因通过载体，尤其是表达载体，适当地导入，但也可以通过使得宿主生物体中的感兴趣的基因***到已有的遗传元件如染色体中的载体，或其他载体。根据本发明，由基因和启动子，以及可能地，其它遗传元件组成的功能单元称为“表达盒”。然而，就此目的而言，表达盒并不一定也必须作为物理单位而存在。
特别优选地，根据本发明的肽，尤其是十二肽，以多聚体产生，随后裂解成功能性肽。非常特别优选的多聚体有2-10个十二肽，其在各种情况中，由长度为0-4个氨基酸的间隔物彼此分开。这些间隔物由例如氨基酸Gly、Ala和Ser组成。
使用目前通常已知的方法，例如化学合成或者是聚合酶链式反应(PCR),与分子生物学和/或蛋白质化学标准方法结合，对于本领域技术人员而言，基于已知的DNA和/或氨基酸序列，生产出相应的核苷酸，甚至完整的基因是可能的。这些方法已知来自，例如Lexikonder Biochemie,[Lexicon of Biochemistry],Spektrum Akademischer Verlag,Berlin,1999,Volume 1,pp.267-271和Volume 2,pp.227-229。
本发明还包括根据本发明的肽尤其是十二肽的衍生物。在本专利申请的意义上说，衍生物是指纯氨基酸链已被化学修饰的肽。例如，此类衍生物在生物学上可生物学地产生，所述产生与宿主生物体的生物合成一起进行。分子生物学方法可用于该目的。然而，该衍生化也可通过化学方法进行，例如，通过氨基酸侧链的化学转变，或通过另一个化合物与肽的共价结合。例如，这种化合物也可能是别的肽或蛋白质，其与本发明的肽通过双功能化合物结合。衍生化同样可理解为共价结合到大分子运载体。
就本发明的意义上，载体是指由核苷酸组成的元件，且含有作为表征性核苷酸范围的感兴趣的基因。载体允许在物种或细胞系中经历多代或多次细胞***，将这种基因建立为稳定的遗传元件，独立于基因组的其余部分而自我复制。载体是专用的质粒，即环状遗传元件，尤其是在细菌中使用。在基因技术中，载体之间存在区别，一方面是用于储存的载体，因此，某种意义上说，也用于遗传工作，所谓的克隆载体；另一方面是满足实现感兴趣的基因在宿主细胞中的功能的载体，即使得感兴趣的肽表达，这些载体也被称为表达载体。
将编码本发明的肽，尤其是十二肽或是这样的肽的多聚体的核酸适当地克隆进载体。因此，本发明的分子生物学维度在于具有相应肽的基因的载体。这些可能包括，例如，衍生自细菌质粒、病毒或噬菌体，或有各种起始元件的主要合成的载体或质粒的载体。用在每种情况中都存在的进一步的遗传元件，载体能跨越若干代成为感兴趣的宿主细胞中的稳定单位。就本发明的意义，载体是作为染色体外的独立单位，还是整合进染色体，并不重要。选择现有技术已知的众多***的哪个取决于单独的个案。例如，可达到的拷贝数，可利用的选择***，最主要的是抗生素的抗性，或能够接受载体的宿主细胞的可培养性等可作为决定因素。
所述载体形成适合于感兴趣的基因或相关肽的分子生物学和生物化学研究，适合于根据本发明的开发，以及最后，适合于扩增和生产本发明的肽的起点。所述载体代表了本发明的进一步的实施方式。
克隆载体是本发明优选的实施方式。除了储存，其还适合于生物学扩增或选择感兴趣基因的，适合于表征感兴趣的基因，所述表征通过例如创建限制性图谱或测序进行。因此，克隆载体也是本发明优选的实施方式，因为它们代表了所要求保护的DNA的可运输且可储存形式。它们也是不与细胞相关的分子生物学技术，例如聚合酶链式反应的优选的起点。
表达载体化学上和克隆载体类似，但是在部分序列上不同，所述部分序列使表达载体能够在对于肽生产优化的宿主生物体中复制，以及表达所载基因。表达载体本身具有表达所必需的遗传元件，是优选的实施方式。所述表达受，例如，调节基因转录的启动子影响。因此，所述表达可能因为本来定位于基因前的天然启动子而发生，也可能发生在遗传融合后，通过表达载体上所提供的宿主细胞的启动子，或通过修饰的或另一种生物体的完全不同的启动子而发生。
通过改变培养条件，例如细胞密度或特定因子，或者通过加入某些化合物可调节的表达载体是优选的实施方式。
本发明的实施方式还可以是无细胞表达***，其中肽的生物合成可以体外跟踪。这样的表达***也同样建立在现有技术中。
根据本发明的肽的体内合成，即通过活细胞合成，需要将相关基因转移到宿主细胞中，即所谓的转化。原则上，所有的生物体，即真核、原核或蓝藻都适合作为宿主细胞。优选的是可容易进行遗传控制的宿主细胞，例如，其涉及，例如，用表达载体转化及其在如单细胞真菌或细菌的稳定建立。另外，优选的宿主细胞的特征在于良好的微生物学和生物技术的可管理性。这涉及，如易于培养、高生长率、对发酵培养基低要求，以及外源肽的良好的生产和分泌速率。经常有必要通过实验为单独的个案，从现有技术中大量的可用的不同***中确定最佳的表达***。每一种本发明的肽可以以这种发式从各种宿主生物体获得。
优选的实施方式是这样的宿主细胞，由于遗传调节元件，其活性是可调节的，所述元件在，例如，所述表达载体上提供，但也可能一开始就存在于这些细胞中。这些宿主细胞可被诱导而表达，所述诱导通过，例如，控制性添加用作激活剂的化合物，改变培养条件，或当达到一定的细胞密度而进行。这允许非常划算地生产感兴趣的肽。
原核或细菌细胞是优选的宿主细胞。细菌与真核生物相比，通常的特征是更短的世代时间以及对培养条件较低要求。因此可能建立获取根据本发明的肽的廉价方法。在革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌的情况下，大量肽被分泌进周质空间，即围绕细胞的两层膜之间的区隔。这在特定应用上有优势。相反，革兰氏阳性菌，如芽孢杆菌属、放线菌属或是放线菌目的其它代表，没有外膜，以致分泌的肽被立即传递到细胞周围的培养基中，根据另一个优选的实施方式，所表达的本发明的肽可从所述培养基直接纯化。
该检测原理的变体可以是这样的表达***，其含有额外的基因，例如那些由其它载体提供的影响根据本发明的肽的生产的基因。这可能是修饰的基因产物，或是能和本发明肽一起纯化的基因产物。
考虑到例如分子生物学方法的丰富经验和大肠型细菌可培养性，这些代表了本发明优选的实施方式。适合生物技术生产的菌株，特别优选大肠杆菌(Escherichia coli)的菌株，特别是非致病细菌。
这些物种的适当代表是大肠杆菌的K12衍生物和B菌株。根据本身已知的遗传和/或微生物学的方法衍生自其的菌株，可被认为是其衍生物，对遗传学和微生物学研究具有最大的重要性，优选地用于开发本发明的方法。这样的衍生物可以考虑其对于培养条件的要求，通过例如缺失和***诱变进行改变，所述衍生物可以有不同或额外的选择标记，或者可表达不同或额外的肽。尤其是那些除了可产生本发明的肽，还可以表达其它具有经济价值的肽的衍生菌株。
此外，优选特征在于，用上述载体之一转化后获得的微生物。这可能是，例如，为了储存和/或修饰，导入任意细菌菌株的克隆载体。这样的步骤在感兴趣的遗传元件的储存和开发中相当普遍。由于感兴趣的遗传元件可直接从这些微生物转入适合表达的革兰氏阴性菌，上述转化产物是本发明的适用的主题的实现方式。
真核细胞也可能适合生产本发明的肽。这样的例子是真菌，例如放线菌或酵母，如酵母属或克鲁维酵母属。这例如在肽的合成需要进行与此类***相适合的特异性修饰的情况下尤其有优势。这包括，例如低分子化合物如膜锚或寡糖的结合。
本发明方法的宿主细胞以自身已知的方式培养和发酵，例如在分批或连续***中。在第一种情况中，用重组细菌菌株接种适合的培养基，通过实验确定的一段时间后从培养基收获产物。连续发酵的特征在于实现稳定状态，其中经过相当长的时间周期，部分细胞死亡，但也通过生长而补充，并且同时可以从培养基中取出产物。
发酵方法本身是现有的技术中众所周知的，代表了实际大规模生产步骤，接着进行合适的纯化方法。
所有的基于以上所述用于生产重组肽的方法之一的发酵方法代表本发明主题的相应的优选的实施方式。
在这方面，每种情况下对于所使用的生产方法、宿主细胞和/或被生产的肽而言的最优条件必须根据本领域技术人员的知识，基于之前特定菌株的优化的培养条件通过实验确定，所述培养条件例如关于发酵体积、培养基组成、供氧或搅拌器速度。
特征在于通过流入策略进行发酵的发酵方法同样合适。在这方面，由连续培养所消耗的培养基成分通过进料补充，也被称为进料策略。细胞密度和干生物量和/或主要是感兴趣的肽活性的显著增加也可通过此方法达到。
类似地，发酵也可以设计成这样的方式，在每种情况中按照需要，将不希望得到的代谢产物滤出，或通过添加缓冲液或平衡离子中和。
所生产的肽可以随后从发酵培养基中收获。这种发酵方法优于从干物质制备产品，但需要提供合适的分泌标记和运输***。
在不存在分泌的情况下，除了别的之外，从细胞物质中纯化肽是必要的；已知用于此目的的各种方法，如硫酸铵或乙醇沉淀法，或者如果必要的话，例如，进行色谱纯化以达到同质性。然而，大多数所述技术方法应该具有丰富而稳定的制备才令人满意。
所有上述描述的要素可以结合成生产本发明肽的方法。大量可能的方法步骤的组合可为本发明的每种肽想象出来。最优的方法必须针对每个特定单独个案通过实验确定。
本发明进一步的主题涉及编码本发明肽，尤其是十二肽的核苷酸，以及含有编码本发明肽，尤其是十二肽的核酸的克隆载体和表达载体。
本发明的主题进一步涉及用编码本发明肽，尤其是十二肽的核苷酸转化的原核或真核细胞。
有利地，本发明的肽，尤其是十二肽可以在用于氧化的表面的涂层剂、涂料、表面涂层和增粘剂或粘合剂中使用。因此本发明的主题进一步涉及用于氧化的表面的涂层剂、涂料、表面涂层和增粘剂或粘合剂，其含有本发明的肽，尤其是十二肽，或由其组成。
此外，本发明的进一步主题涉及含有完全或部分由肽，尤其是十二肽组成的化合物的多层复合物或经涂覆的基质，所述化合物作为所述复合物的至少两个相邻层或涂层与基质之间的增粘剂。
多层复合物被用于各种目的，例如作为包装材料(尤其是复合薄膜)或自粘物品(至少由一个运载体和一层粘合剂层组成的多层复合物)。根据本发明的多层复合物含有至少2层，优选2-5层，其中单层的厚度可为，例如，0.01-5mm。
所述单层具有氧化的表面，优选含有金属或金属氧化物。特别地，所述层是金属箔或金属化的聚合物薄膜。
上述肽用作所述多层复合物的至少两个相邻层之间的增粘剂。优选地，所述相邻层的至少一个是金属化的天然或合成的聚合物。特别地，适合作为聚合物的是缩聚物如聚酯，加聚物如聚氨酯、聚酰胺、聚碳酸酯或聚苯醚或聚苯硫醚，或可通过自由基或离子的烯类不饱和化合物聚合而得的聚合物(简称为自由基聚合物)。这些类型的自由基聚合物由按重量计算优选至少60％，特别优选按重量计算至少80％，的所谓主要单体组成，所述主要单体选自C1-C20的丙烯酸烷基(甲)酯、含有最多20个C原子的羧酸的乙烯基酯、含有最多20个C原子的乙烯基芳烃、烯基不饱和腈、乙烯基卤化物、含有1-10C的醇的乙烯基醚以及含有2-8个C原子和1或2个双键的脂肪族烃，特别是乙烯和丙烯。
为促进粘附所必需的肽量一般是0.01-1000毫克每平方米(mg/m2)，尤其是0.01-100mg/m2，特别优选的是0.1-10mg/m2。本发明的肽，尤其是十二肽，可以施加到相邻的层之一；或者，所述肽可施加到两层。
优选地，所述肽作为水溶液存在；优选地，溶液的肽含量为以重量计0.01-5份的肽，以重量计100份的水。对于根据本发明的在用于氧化的表面的涂层剂、增粘剂或粘合剂中的用途，优选地，所述溶液进一步稀释到含量1-10000μg/mL水的浓度，特别是10-1000μg/mL水。
因此，施加后，可首先进行干燥以去除水。两个相邻层可以随后通过常规的方法接合，如层压。
为各种目的给基质涂层。特别是称为装饰性涂层或保护性涂层(包含涂料)或还有粘合剂涂层，其中该粘合剂本身可以施加到基质或以，例如，自粘合物品的形式(标签或胶带)粘附固定。所述基质或基质表面可由任何材料制成。同样，所述涂层或涂层的基质侧的表面可由任何材料制成。优选地，所述基质表面或所述涂层，即涂层的基质侧的表面，是由金属，尤其是钢，或金属化的天然或合成的聚合物制成的。
特别地，适合作为聚合物的是缩聚物如聚酯纤维，加聚物如聚氨酯、聚酰胺、聚碳酸酯或聚苯醚或聚苯硫醚，或可通过自由基或离子的烯类不饱和化合物聚合而得的聚合物(简称为自由基聚合物)。上文的陈述适用于自由基聚合物的结构和他们主要单体的含量。
为促进粘附所必需的肽的量对应上述的量。该肽可施加到基质表面、涂层基质侧的表面，或施加到两者。优选地，所述肽作为水溶液存在；溶液中的肽含量如上所述。因此，施加后，可首先进行干燥以去除水。
涂层可以根据常规方法施加到基质上，例如，薄膜或多层复合物可以层压。尤其是，涂层可以通过将聚合物分散体、聚合物溶液或无溶剂聚合物施加到由增粘剂提供的基质侧的表面，接着进行薄膜形成和/或热或光化学固化来产生。为了这个目的，特别地，所述聚合物以水分散体或水溶液形式存在，特别优选乳液聚合物的水分散体，优选如上所述的自由基聚合物之一。施加聚合物施加后，任选地，进行干燥。
本发明的多层复合物和经涂覆的基质具有大大提高的强度。因为使用所述肽作为增粘剂，涂层更牢固地粘附于基质，所述多层复合物的单层彼此粘附更好。
在本发明的一个非常特别优选的实施方式中，所述基质是金属。原则上，可以是任何金属。实例包括铁、钢、锌、锡、铝、铜或这些金属彼此之间以及与其他金属的合金。特别地，所述金属是钢，涂有锌、锌合金、铝或铝合金的钢，或者可以是铝或铝合金。特别优选，例如，锌、锌合金以及如镀锌的钢的基质。
锌或铝合金是本领域技术人员已知的。本领域技术人员会依据想要的应用，选择合金成分的类型和量。特别地，锌合金的典型成分含有Al、Pb、Si、Mg、Sn、Cu或Cd。特别地，铝合金的典型成分含有Mg、Mn、Si、Zn、Cr、Zr、Cu或Ti。这些也可以是Al/Zn合金，其中Al和Zn以大致相等的量存在。涂有这种类型合金的钢市面上有售。
所述金属可以任何形式存在，但优选是金属箔、金属条或金属片。所述金属也可以是有金属表面的复合材料。例如，所述复合材料可是由聚合物薄膜和金属组成的复合物。
所述氧化的表面，优选含金属的氧化的表面涂有本发明肽作为增粘剂。这可用所述肽的水溶液进行。上文已提及了所述涂覆的详情。
特别地，所述涂层可以是典型的涂料或用于涂覆金属表面的涂料***。这些涂料或涂料***可以是热、光化学或通过别的机制固化的涂料。
典型的涂覆金属表面的涂料包括至少一种粘合剂和可交联成分。所述颗交联成分可以是除了粘合剂之外使用的交联剂，或是与所述粘合剂相连的可交联基团。当然，所述粘合剂也可以有可交联基团，并且也可另外使用交联剂。可想出各种各样可能的组合。例如，粘合剂和交联剂可以分开使用。那么，粘合剂包括反应性官能团，其能够与交联剂中互补的反应性官能团反应。或者，粘合剂可以是自交联粘合剂，其包括反应性官能团，所述官能团能够参与与他们类型的基团(即自身)或同一聚合物上的互补的反应性官能团的交联反应。也有可能是仅交联剂相互反应。
合适的粘合剂实例包括(甲基)丙烯酸酯(共)聚合物，部分皂化的聚乙烯酯、聚酯、醇酸树脂、聚内酯、聚碳酸酯、聚醚、环氧树脂胺加成产物、聚脲、聚酰胺、聚酰亚胺或聚氨基甲酸乙酯。当然，也可使用各种聚合物的混合物，条件是没有混合物所致的不想要的效果。交联组分可以有热交联基团或光化学交联基团。合适的热交联剂是，例如，基于环氧化物、三聚氰胺或闭合异氰酸酯的交联剂。特别地，合适的光化学交联剂是含有多个烯类不饱和基团的化合物，特别是含有二或多功能丙烯酸酯。
有利地，本发明的肽，尤其是十二肽改进涂料和基质的粘附。此外，在腐蚀保护测试中实现了改进的对涂料层的渗透的抗性。
因此，本发明的进一步主题涉及本发明的肽，尤其是十二肽，作为涂层剂、涂料、表面涂层的成分，用于氧化的表面的以及多层复合物或经涂覆的基质的增粘剂或粘合剂的成分的用途。
下列实施例解释本发明，但不将本发明限制于此：
实施例1：(钢)表面上的肽的定量
用以下所述方法，举例说明可以如何定量粘附到(钢)表面的肽。
因此，除了视觉评估，可以产生关于粘附性质的客观可测量的结果。这方法应理解为示例；相似地，其它化学检测方法可以是合适的(例如，与茚三酮反应)。
用所述方法，表3中所列的肽可以区分为好(P6、P7)，中等(P13、P15)，差到不结合的肽(10、17)，这在图1中所示的图形中是明显的。
施加所述肽：
将2份10μL肽溶液(2mg/mL溶解于来自Gibco的1×PBS,pH 7.4)施加到HDG钢板(圆形，直径2.3cm)。第一个10μL干燥大约15'，第二个10μL随后滴到相同的位置，干燥30'，接着在来自UVP的HB-1000杂交炉里，在30℃，存在200mL水的情况下干燥。
洗涤：
将所述板置于直径19cm的用于洗涤的结晶皿中，所述结晶皿含有1升1×PBS，pH7.4，以60rpm在B.Braun的Certomat U仪器中在RT轻微摇动10'。随后所述板在30℃干燥。
染色：
将所述板转移到6孔皿中。将150μL的考马斯蓝染色溶液用移液管吸取到所述板上。30秒后，将6mL 1×PBS，pH 7.4小心地加在培养皿的边缘以冲洗掉染色溶液，并两次将所述板移入6mL 1×PBS，pH 7.4中，以去除剩余的染色溶液。将所述板在30℃下短暂干燥。(考马斯染色溶液：2g考马斯亮蓝R-250、0.5g考马斯亮蓝G-250、50mL甲醇、425mL乙醇、100毫升冰醋酸，加入蒸馏水到1000mL)
去除：
将20μL DMSO/CH3COOH溶液(v/v 9/1)用移液管吸取到染色斑点上，允许所述提取溶液在RT作用5'，随后通过用移液管吹打直到斑点完全从板上去除，将液体取出。将上清液转移到反应容器中。
测量：
颜色强度的测量在Nanodrop 1000分光光度计中进行。为此，使用2μL样品，在602nm测量。
表格和附图：
表1：
位置: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
肽K1 X K R R P G X X V E X X
肽K2 H N T I R I L T I K L X
肽K3 R H S S T L R Y R P H P
肽8 R S I V T F S L R Q N R
肽9 Q R N L I K S T C R K I
X:任何氨基酸
表2：
表3：编码本发明的肽的核苷酸序列
肽 序列
肽6 tccagggcacgactatttgtagtcacatatcacaaa
肽7 cacatgatatctacaatgaacgcggcgagccggcga
肽8 agaagcatagtaacctttagtttaagacaaaatcgc
肽9 caacgtaatttgattaaatcgacgtgccggaaaatc
肽10 cgccagctccagaggctgatgaaatcagtaaattcg
肽13 cgcaacactattcgtatacggactataaaacatccg
肽15 cgacacagtagtactctgaggtataggccacttccg
肽17 caacaaagtcgtcatatactgaatagaaaaaaaccg

Claims (13)

1.确定粘附于氧化的表面的肽的粘附性质的定量方法，其特征在于：
a)将含肽溶液施加到具有氧化的表面的运载体，并使其干燥，
b)通过洗涤，从所述运载体去除未结合的肽，并使所述运载体干燥，
c)用染色溶液对粘附于所述运载体的肽进行染色，洗掉剩余的染色溶液，并使所述运载体干燥，
d)用提取溶液将粘附于运载体的染色的肽从运载体去除，含有染色的肽的上清液经分光光度计测量。
2.权利要求1的定量方法，其特征在于，所述肽是十二肽。
3.权利要求1的定量方法，其特征在于，通过所述肽的简单的非特异性染色，或者通过导致特异性结合的化学反应，进行本发明的方法的步骤c)中的染色。
4.权利要求3的定量方法，其中所述非特异性染色使用考马斯染色溶液染色。
5.权利要求3的定量方法，其中所述导致特异性结合的化学反应是与茚三酮的化学反应。
6.权利要求1的定量方法，其特征在于：
·在步骤a)中，将2份10μL的肽溶液施加到直径为2.3cm的圆形HDG钢板，所述肽溶液浓度为2mg/mL，溶于1×PBS，pH 7.4，来自Gibco，其中第一个10μL干燥大约15分钟，第二个10μL随后滴到相同的位置，干燥30分钟，接着在来自UVP Laboratory Products的HB-1000杂交炉里，在30℃，存在200mL水的情况下干燥；
·在步骤b)中，将所述板置于用于洗涤的直径19cm的结晶皿中，所述结晶皿含有1升1×PBS，pH 7.4，并以60rpm在来自B.Braun的Certomat U水平摇床中在室温轻微摇动10分钟，并随后在30℃干燥；
·在步骤c)中，将所述板转移到6孔皿中，并将150μL考马斯染色溶液用移液管吸取到所述板上，所述考马斯染色溶液配方为含有2g考马斯亮蓝R-250、0.5g考马斯亮蓝G-250、50mL甲醇、425mL乙醇、100mL冰醋酸，加入蒸馏水到1000mL，30秒后，将6mL 1×PBS缓冲液，pH 7.4，小心地加在皿的边缘以冲洗掉染色溶液，并两次将所述板移入6mL 1×PBS，pH 7.4中以去除剩余的染色溶液，之后将所述板在30℃短暂干燥；
·在步骤d)中，将20μL体积比9/1的DMSO/CH3COOH提取溶液用移液管吸取到染色斑点上，允许所述提取溶液在室温作用5分钟，随后通过用移液管吹打直到斑点完全从所述板上去除，将液体取出，将上清液转移到反应容器中，之后2μL上清液在来自PeqLab的Nanodrop1000分光光度计中测量，选择602nm的UV VIS程序，以确定与氧化的表面上的肽的粘附强度相关的颜色强度。
7.肽，在权利要求1-6之一的定量方法的步骤d)的测量中，所述肽的吸收的范围为0.25-1，其特征在于，所述肽是十二肽，其氨基酸序列对应于SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15。
8.核酸，其编码权利要求7的肽，其核酸序列对应于SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7。
9.载体，其含有权利要求8的核酸，所述核酸编码肽。
10.用权利要求8的核酸转化的原核或真核细胞，所述核酸编码肽。
11.用于氧化的表面的涂层剂、涂料、表面涂层和增粘剂或粘合剂，其含有权利要求7的肽。
12.含有完全或部分由权利要求7的肽组成的化合物的多层复合物或经涂覆的基质，所述化合物作为所述复合物的至少两个相邻层之间或涂层与基质之间的增粘剂。
13.权利要求7的肽作为涂层剂、涂料、表面涂层的成分，作为用于氧化的表面的以及多层复合物或经涂覆的基质的增粘剂或粘合剂的成分的用途。
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