CN114807196B - 一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法，通过荧光标记技术、乳糖操纵子技术和聚合酶链式反应技术结合，在植物致病菌基因组中glms基因后***调节基因（lacI）和红色荧光基因；将含有LacI阻遏蛋白结合位点的lacZ启动子区域与绿色荧光基因的多重抗性可转移质粒转入至植物致病菌，植物致病菌仅红色荧光表达。通过植物致病菌跨种属传播ARGs评估方法，供体菌株体内抗性质粒转移至受体菌株，质粒荧光表达抑制解除，通过荧光显微镜和高通量流式细胞仪可进行分选回收。这种方法能追踪区分供受体菌株，有利于评价土传植物致病菌与ARGs的互作机制，为土传病害阻控策略的制定提供理论依据。

Description

一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法，具体涉及一种土传植物致病菌茄科劳尔氏菌和一种红色与绿色荧光基因表达调控体系。
背景技术
由土传植物致病菌引起的植物土传病害严重威胁植物健康和农业可持续经济发展(朱永官,彭静静,韦中,沈其荣,张福锁,2021.土壤微生物组与土壤健康.中国科学:生命科学51,1–11.)。抗生素的发现在人类和动植物治疗上作出了巨大的贡献，但是随着抗生素的滥用的导致环境中大量抗生素抗性基因(Antibiotic Resistance Genes，ARGs)富集和传播(Van Boeckel TP,Pires J,Silvester R,et al.2019.Global trends inantimicrobial resistance in animals in low-and middle-incomecountries.Science 356:eaaw1944.)。土壤植物致病菌与ARGs的叠加和互作形成的土壤生物复合污染，导致污染更为严重，防控更为困难。ARGs可以通过水平基因转移和垂直基因转移在不同细菌个体和种属之间进行转移，一旦进入食物链传递，将严重威胁人类健康安全(Li B,Qiu Y,Song Y,et al.Dissecting horizontal and vertical gene transfer ofantibiotic resistance plasmid in bacterial community usingmicrofluidics.Environment International[J].2019,131(C))。研究表明，通过添加携带多重抗性质粒的人体条件致病菌恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)至土壤中后，其携带的抗性质粒可以转移至15个门类细菌(Xiao-Ting F,Hu L,Qing-Lin C,et al.Fate ofAntibiotic Resistant Pseudomonas putida and Broad Host Range Plasmid inNatural Soil Microcosms.Frontiers in microbiology[J].2019,10.)。当前，仅在大肠杆菌和恶臭假单胞菌中探究ARGs的传播风险，土传植物致病菌如何ARGs的传播风险尚无研究，局限于缺少合适的高通量追踪技术。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法；本发明的第二个目的是提供一种植物致病菌跨种属传播ARGs评估方法。
本发明具体技术方案如下：
一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法；通过荧光标记技术和乳糖操纵子技术，利用定点***型转座子Tn7，将融合调节基因(lacI)和第一荧光基因的序列片段***至植物致病菌基因组中；将含有操纵基因lacZ启动子和第二荧光基因的抗性质粒转入至植物致病菌，得荧光标记的植物致病菌。
通过聚合酶链反应技术和荧光显微镜技术，此时植物致病菌存在第一荧光基因和第二荧光基因，但第二荧光基因表达受抑制，菌株仅具有第一荧光。
作为本申请的优选技术方案，所述植物致病菌为茄科劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)，简称青枯菌。
发明人研究发现，青枯菌是分布最为广泛、最为严重的土壤植物致病菌，其基因组可塑性高，自然转化能力强，可促进ARGs的传播。通过荧光标记技术和乳糖操纵子技术，利用定点***型转座子Tn7，将融合调节基因(lacI)和红色荧光基因的序列片段***至青枯菌基因组中。将含有操纵基因lacZ启动子和绿色荧光基因的抗性质粒转入至青枯菌，通过聚合酶链反应技术和荧光显微镜技术，此时青枯菌存在红绿荧光基因，但绿色荧光基因表达受抑制，菌株仅具有红色荧光。通过结合转移实验，供体青枯菌可将含有绿色荧光基因抗性质粒转移至受体菌株，受体菌株中抗性质粒上绿色荧光表达抑制解除，具有绿色荧光。通过高通量细胞分选技术，可以成功获得供体菌株和受体菌株。作为本申请的优选技术方案，所述第一荧光基因为红色荧光基因mCherry。
作为本申请的优选技术方案，所述第二荧光基因为绿色荧光基因gfp。
具体的，一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法，包括如下具体步骤：
步骤1，植物致病菌基因组荧光标记质粒构建：将调节基因lacI和第一荧光基因进行融合；融合片段回收纯化连接至KS+质粒载体，再通过酶切、酶连将所需片段连接至Tn7转座子载体质粒，得基因组荧光标记质粒；
步骤2，植物致病菌可移动荧光标记质粒构建：将操纵基因lacZ的启动子和第二荧光基因进行扩增和融合，其中操纵基因lacZ的启动子包含lacI基因编码阻遏蛋白结合位点；融合片段回收纯化连接至KS+质粒载体上，再通过酶切、酶连将所需片段连接至RP4质粒载体，构建可移动荧光标记质粒；
步骤3，植物致病菌双色荧光标记：利用步骤1构建成功的基因组荧光标记质粒，通过含有转座酶pTNS2辅助质粒，将目的片段定点***在QL-Rs1115细菌glmS基因下游的attTn7位点，利用含有25μg/mL庆大霉素的BG培养基筛选带有融合基因lacI-第一荧光的阳性菌株；利用自然转化，将步骤2的质粒转入至前述阳性菌株中，通过含有100μg/mL卡那霉素、25μg/mL盐酸四环素、100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL氯霉素的BG培养基筛选Rs1115-lacI-第一荧光-第二荧光菌株；通过荧光显微镜观察，菌株第二荧光基因表达受抑制，仅有第一荧光。
作为本申请的优选技术方案，所述BG培养基为：琼脂20～30g、葡萄糖5g、酪蛋白氨基酸1g、蛋白胨10g、酵母粉1g、去离子水1000mL，调节pH 7.2～7.4，120℃高压灭菌20min。
本发明还保护一种植物致病菌跨种属传播ARGs评估方法，将前述荧光标记的植物致病菌作为供体植物致病菌，通过结合转移实验，供体致病菌将含有第二荧光基因抗性质粒转移至受体菌株，受体菌株中抗性质粒上第二荧光表达抑制解除，具有第二荧光，从而实现土传植物致病菌传播耐药基因的追踪。
其中，所述致病菌为茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)简称青枯菌。
作为本申请的优选技术方案，所述评估方法具体步骤如下：调整供体植物致病菌与受体菌株菌液浓度分别1×108CFU/mL，各取1mL菌液混匀，离心去除上清液，加5mL无菌去离子水涡旋混匀，过0.45μm无菌滤膜，将滤膜转移至受体培养基上，30℃培养1d；用2mL无菌水洗涤滤膜上菌体至离心管中，离心，留取200μl菌液，各100μl涂布至含有100μg/mL卡那霉素、25μg/mL盐酸四环素、100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL氯霉素的受体培养基中，30℃培养2d，再通过荧光显微镜观察荧光，即可。
有益效果
本发明通过转化和结合的方式，实现了植物病原青枯菌双色标记，有利于区分供体菌株(红色荧光)和受体菌株(绿色荧光)，能够跟踪植物青枯菌传播ARGs的过程。同时，实现青枯菌向同种、同属和跨种进行传播ARGs。
附图说明
图1为质粒pUC18-lacI-mCherry-Gm的构建；
图2为lacZ-GFP-RP4质粒的构建；
图3为青枯菌同种传播ARGs的QL-Rs1115-GFP菌株，其中，图A为荧光显微镜明场下QL-Rs1115-GFP菌株，图B为荧光显微镜绿色滤光片下观察QL-Rs1115-GFP菌株；
图4为青枯菌同属传播ARGs的NJQL-A6-GFP菌株，其中，图A为荧光显微镜明场下NJQL-A6-GFP菌株，图B为荧光显微镜绿色滤光片下观察NJQL-A6-GFP菌株；
图5为青枯菌跨属传播ARGs的NJX501-GFP菌株，其中，图A为荧光显微镜明场下NJX501-GFP菌株，图B为荧光显微镜绿色滤光片下观察NJX501-GFP菌株。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
菌株：
茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)QL-Rs1115(Zhong Wei,XingmingYang,Shixue Yin,et al.Efficacy of Bacillus-fortified organic fertiliser incontrolling bacterial wilt of tomato in the field[J].Applied Soil Ecology,2011,48(2).)
皮氏罗尔斯通氏菌(Ralstonia pickettii)NJQL-A6，2012年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，菌种保藏号为CGMCC No.6628。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NJX501，2015年12月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路，菌种保藏号为CGMCC No.11823。
培养基：
B液体培养基：酪蛋白氨基酸1g、蛋白胨10g、酵母粉1g、去离子水1000mL，调节pH7.2～7.4，120℃高压灭菌20min。
BG固体培养基为B液体培养基加2～3％(w/w)琼脂和5g/L葡萄糖。
TSB液体培养基：蛋白胨15g、大豆蛋白胨5g、氯化钠5g、去离子水1000mL，20℃高压灭菌20min。
TSA固体培养基为TSB液体培养基加2～3％(w/w)琼脂。
实施例1青枯菌传播耐药基因的荧光标记
(1)青枯菌基因组荧光标记质粒构建：通过聚合酶链反应技术对调节基因(lacI)和红色荧光基因mCherry进行融合。融合片段lacI-mCherry回收纯化连接至KS+质粒载体上，通过HindII和BamHI双酶切、酶连将所需片段连接至pUC18-mini-Tn7T-Gm质粒载体，构建质粒pUC18-lacI-Mcherry-Gm质粒。
(2)青枯菌可移动荧光标记质粒构建：通过聚合酶链反应技术对操纵基因(lacZ)的启动子和绿色荧光基因gfp进行扩增和融合，其中操纵基因(lacZ)的启动子包含了lacI基因编码阻遏蛋白结合位点。融合片段lacZ-GFP回收纯化连接至KS+质粒载体上，通过HindII和KpnI双酶切、酶连将所需片段连接至RP4质粒载体，构建lacZ-GFP-RP4质粒。
(3)青枯菌双色荧光标记：利用构建成功pUC18-Tn7-lacI-mCherry-Gm质粒，通过含有转座酶pTNS2辅助质粒，利用电激法，将目的片段lacI-mCherry定点***在菌株QL-Rs1115的glmS基因下游的attTn7位点，利用含有25μg/mL庆大霉素的BG培养基筛选Rs1115-lacI-Mcherry菌株。利用自然转化，将质粒转入至青枯菌Rs1115-lacI-mCherry中，通过含有100μg/mL卡那霉素、25μg/mL盐酸四环素、100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL氯霉素的BG培养基筛选Rs1115-lacI-Mcherry-GFP菌株。通过荧光显微镜观察，菌株绿色荧光基因表达受抑制，仅有红色荧光。
实施例2青枯菌同种传播ARGs
材料：菌株Rs1115-lacI-mCherry-GFP和QL-Rs1115，分类命名为茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。
将甘油保存的Rs1115-lacI-mCherry-GFP和QL-Rs1115在分别在含有100μg/mL卡那霉素、25μg/mL盐酸四环素、100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL氯霉素和25μg/mL庆大霉素和未含有抗生素的BG固体培养基上划线，30℃培养2d；挑取平板上的单菌落转接到B液体培养基，30℃、170rpm培养过夜。取新鲜菌液，4500rpm常温离心2min，收集菌体，用无菌水洗涤菌体1次，除去培养基，用无菌水调到浓度为1×108CFU/mL，各取1mL菌液混匀，4500rpm常温离心2min，去除上清液，加5mL无菌去离子水涡旋混匀，过0.45μm滤膜，将滤膜转移至BG培养基上，30℃培养1d。用2mL无菌水洗涤滤膜上菌体至2mL离心管中，4500rpm常温离心2min，留取200μl菌液，各100μl涂布至含有100μg/mL卡那霉素、25μg/mL盐酸四环素、100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL氯霉素的BG培养基中，30℃培养2d，荧光显微镜观察荧光，获得QL-Rs1115-GFP菌株，见图3。结果表明，青枯菌能够在同种之间转移ARGs
实施例3青枯菌同属ARGs转移
材料：Rs1115-lacI-mCherry-GFP和NJQL-A6，分别属于罗尔斯顿菌属的茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)和皮氏罗尔斯顿菌(Ralstonia pickettii)。
Rs1115-lacI-Mcherry-GFP在含有100μg/mL卡那霉素、25μg/mL盐酸四环素、100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL氯霉素和25μg/mL庆大霉素的BG固体培养基上划线，30℃培养2d；挑取平板上的单菌落转接到B液体培养基，30℃、170rpm培养过夜。取新鲜菌液，4500rpm常温离心2min，收集菌体，用无菌水洗涤菌体1次，除去培养基，用无菌水调到浓度为1×108CFU/mL，备用。
将甘油保存的NJQL-A6在的TSA固体培养基上划线，30℃培养1d；挑取平板上的单菌落转接到TSA液体培养基，30℃、170rpm培养过夜。取新鲜菌液，4500rpm常温离心2min，收集菌体，用无菌水洗涤菌体1次，除去培养基，用无菌水调到浓度为1×108CFU/mL，备用。
取1mL Rs1115-lacI-Mcherry-GFP菌液和1mL NJQL-A6菌液，4500rpm常温离心2min，去除上清液，加5mL无菌去离子水涡旋混匀，过0.45um滤膜，将滤膜转移至TSA培养基上，30℃培养1d。用2mL无菌水洗涤滤膜上菌体至2mL离心管中，4500rpm常温离心2min，留取200ul菌液，各100μL涂布至含有100μg/mL卡那霉素、25μg/mL盐酸四环素、100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL氯霉素的TSA培养基中，30℃培养2d，荧光显微镜观察荧光，获得NJQL-A6-GFP菌株，见图4。结果表明，青枯菌能够在同属之间转移ARGs。
实施例4青枯菌跨门传播ARGs
材料：Rs1115-lacI-mCherry-GFP和NJX501，分别属于变形菌门(Proteobacteria)和后壁菌门(Firmicutes)。
Rs1115-lacI-mCherry-GFP在含有100μg/mL卡那霉素、25μg/mL盐酸四环素、100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL氯霉素和25μg/mL庆大霉素的BG固体培养基上划线，30℃培养2d；挑取平板上的单菌落转接到B液体培养基，30℃、170rpm培养过夜。取新鲜菌液，4500rpm常温离心2min，收集菌体，用无菌水洗涤菌体1次，除去培养基，用无菌水调到浓度为1×108CFU/mL，备用。
将甘油保存的NJX501在的TSA固体培养基上划线，30℃培养1d；挑取平板上的单菌落转接到TSA液体培养基，30℃、170rpm培养过夜。取新鲜菌液，4500rpm常温离心2min，收集菌体，用无菌水洗涤菌体1次，除去培养基，用无菌水调到浓度为1×108CFU/mL，备用。
取1mL Rs1115-lacI-Mcherry-GFP菌液和1mL NJX501菌液，4500rpm常温离心2min，去除上清液，加5mL无菌去离子水涡旋混匀，过0.45um滤膜，将滤膜转移至TSA培养基上，30℃培养1d。用2mL无菌水洗涤滤膜上菌体至2mL离心管中，4500rpm常温离心2min，留取200ul菌液，各100μl涂布至含有100μg/mL卡那霉素、25μg/mL盐酸四环素、100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL氯霉素的TSA培养基中，30℃培养2d，荧光显微镜观察荧光，获得NJX501-GFP菌株，见图5。结果表明，青枯菌能够跨门转移ARGs。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (7)

1.一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法，其特征在于，通过荧光标记技术和乳糖操纵子技术，利用定点***型转座子Tn7，将融合调节基因lacI和第一荧光基因的序列片段***至植物致病菌基因组中；将含有操纵基因lacZ启动子和第二荧光基因的抗性质粒转入至植物致病菌，得荧光标记的植物致病菌；其中，所述植物致病菌为茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）。
2.根据权利要求1所述的一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法，其特征在于，所述第一荧光基因为红色荧光基因mCherry。
3.根据权利要求1-2任一所述的一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法，其特征在于，所述第二荧光基因为绿色荧光基因gfp。
4.根据权利要求1所述的一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
步骤1，植物致病菌基因组荧光标记质粒构建：将调节基因lacI和第一荧光基因进行融合；融合片段回收纯化连接至KS+质粒载体，再通过酶切、酶连将所需片段连接至Tn7转座子载体质粒，得基因组荧光标记质粒；
步骤2，植物致病菌可移动荧光标记质粒构建：将操纵基因lacZ的启动子和第二荧光基因进行扩增和融合，其中操纵基因lacZ的启动子包含lacI基因编码阻遏蛋白结合位点；融合片段回收纯化连接至KS+质粒载体上，再通过酶切、酶连将所需片段连接至RP4质粒载体，构建可移动荧光标记质粒；
步骤3，植物致病菌双色荧光标记：利用步骤1构建成功的基因组荧光标记质粒，通过含有转座酶pTNS2辅助质粒，将目的片段定点***在QL-Rs1115细菌glmS基因下游的attTn7位点，利用含有25µg/mL庆大霉素的BG培养基筛选带有融合基因lacI-第一荧光的阳性菌株；利用自然转化，将步骤2的质粒转入至前述阳性菌株中，通过含有100 µg/mL卡那霉素、25µg/mL盐酸四环素、100µg/mL氨苄青霉素、50µg/mL氯霉素的BG培养基筛选RS1115-lacI-第一荧光-第二荧光菌株；通过荧光显微镜观察，菌株第二荧光基因表达受抑制，仅有第一荧光。
5.根据权利要求4所述的一种追踪土传植物致病菌传播耐药基因的荧光标记方法，其特征在于，所述BG培养基为：琼脂20~30g、葡萄糖5g、酪蛋白氨基酸 1g、蛋白胨 10 g、酵母粉 1g、去离子水1000 mL，调节 pH 7.2～7.4，120℃高压灭菌20min。
6.一种植物致病菌跨种属传播ARGs评估方法，其特征在于，将权利要求1荧光标记的植物致病菌作为供体植物致病菌，通过结合转移实验，供体致病菌将含有第二荧光基因抗性质粒转移至受体菌株，受体菌株中抗性质粒上第二荧光表达抑制解除，具有第二荧光，从而实现土传植物致病菌传播耐药基因的追踪；其中，所述致病菌为茄科劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）。
7.根据权利要求6所述的一种植物致病菌跨种属传播ARGs评估方法，其特征在于，调整供体植物致病菌与受体菌株菌液浓度分别1×108 CFU/mL，各取1 mL菌液混匀，离心去除上清液，加5 mL无菌去离子水涡旋混匀，过0.45 µm无菌滤膜，将滤膜转移至受体培养基上，30℃培养1 d；用2 mL无菌水洗涤滤膜上菌体至离心管中，离心，留取200 µl菌液，各100 µl涂布至含有100 µg/mL卡那霉素、25 µg/mL盐酸四环素、100 µg/mL氨苄青霉素、50 µg/mL氯霉素的受体培养基中，30℃培养2 d，再通过荧光显微镜观察荧光，即可。
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