CN104738256A - 茯茶及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了茯茶及其制备方法和用途。其中，该方法包括：提供冠突散囊菌孢子悬液；将所述冠突散囊菌孢子悬液接种于黒毛茶中，并进行发酵，以便获得茯茶。利用该方法能够有效地制备金花茂盛的茯茶，且方法简单、容易操作控制。

Description

茯茶及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及茯茶及其制备方法和用途，具体地，涉及制备茯茶的方法，茯茶，以及茯茶在调节动物肠道菌群中的用途。

背景技术

人体胃肠道内栖息着大约10⁴数量级的正常菌群，其总量与肝脏相仿。肠道微生物含有种类繁多的酶***，可以参与宿主能量、物质及遗传信息转运等一系列生理过程。已有许多研究证明，肠道微生物可以在肠道形成生物屏障，通过占位效应、营养竞争及其所分泌的各种代谢产物和细菌素等抑制条件致病菌的过度生长以及外来致病菌的入侵。越来越多的证据表明，结构失调的肠道菌群在肥胖、糖尿病等慢性病的发生、发展中具有十分重要的作用。

然而，目前调节动物肠道菌群方面的研究仍有待深入。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效调节动物肠道菌群的手段。

根据本发明的一个方面，本发明提出了一种制备茯茶的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：提供冠突散囊菌孢子悬液；将所述冠突散囊菌孢子悬液接种于黒毛茶中，并进行发酵，以便获得茯茶。由此，能够有效地制备金花（即冠突散囊菌，在本文中“金花”和“冠突散囊菌”可以互换使用）茂盛的茯茶，且方法简单、容易操作控制。

根据本发明的实施例，所述冠突散囊菌孢子悬液的浓度不受特别限制，本领域技术人员可以根据具体情况灵活选择。根据本发明的一个实施例，所述冠突散囊菌孢子悬液的浓度为1.0×10⁷-1×10⁸个/ml。由此，有利于黒毛茶的发酵。

根据本发明的实施例，所述冠突散囊菌孢子悬液是通过以下步骤制备的：（1）将茯砖茶块上的黄色闭囊壳并接种于察氏培养基上，于28℃培养72h；（2）将步骤（1）中培养获得的黄色闭囊壳平板划线分离2～3次，以便获得初步纯化的菌落；（3）将所述初步纯化的菌落置于无菌水中，振摇制成均匀的孢子悬液，并进行10倍递增稀释，制成10^-3～10^-5稀释度的孢子悬液；（4）将步骤（3）中获得的孢子悬液在空白查氏培养基上进行平板涂布，然后置于28℃下培养，以便获得纯培养菌落；（5）按照步骤（3）制备10^-1～10^-3稀释度的孢子悬液，并将孢子浓度调整至1.5×10⁶～2.0×10⁶个/ml；（6）将步骤（5）中得到的孢子悬液接种于液体CZG培养基中，于28℃，150r/min条件下培养96h，以便获得所述冠突散囊菌孢子悬液。由此，能够有效制备冠突散囊菌孢子悬液。

根据本发明的实施例，所述发酵是在28摄氏度，湿度70%的条件下进行的。由此，能够使得黒毛茶在最适合的温度、湿度条件下进行发酵，利于冠突散囊菌的生长。

根据本发明的实施例，所述发酵的时间为7～12天。由此，黒毛茶能够有效地发酵。

根据本发明的另一方面，本发明提出了一种茯茶。根据本发明的实施例，所述茯茶是通过前面所述的方法制备的。发明人惊奇地发现，对动物提供本发明的茯茶，能够有效调节动物的肠道菌群，进而基于肠道菌群的作用，发挥降血糖、减肥的功效。

根据本发明的再一方面，本发明还提供了前面所述的茯茶在调节动物肠道菌群中的用途。根据本发明的实施例，茯茶能显著调节动物的肠道菌群，进而通过肠道菌群的作用而发挥降血糖、减肥等功效。由此，对动物提供茯茶能够有效地调节其肠道菌群，从而预防或治疗肥胖、糖尿病等疾病。

需要说明的是，在本文中所使用的表达方式“茯茶在调节动物肠道菌群中的用途”中的术语“动物”所指的动物种类不受特别限制。根据本发明的实施例，该动物可以为任何具有肠道器官的动物，优选哺乳动物，更优选大鼠、小鼠、人，最优选人。另外，在本文中所使用的表达方式“预防或治疗”主要是指预防或治疗肥胖、糖尿病、高血压、高血脂以及肿瘤等疾病。

本文中所使用的表达方式“对动物提供茯茶”中的术语“提供”是指所述动物饮用茯茶，饮用的方式可以是动物主动饮用，也可以是人工灌胃。

上述茯茶能够用于调节动物肠道菌群，进而通过肠道菌群的作用能够发挥降血糖、减肥等功效。因而，根据本发明的实施例，所述茯茶用于预防或治疗肥胖、糖尿病。

根据本发明的实施例，饮用茯茶没有任何副作用，因而茯茶的饮用剂量不受特别限制，只要能够提高受试动物肠道内乳酸菌属、丁酸弧菌属、罗斯拜瑞氏菌属、罗斯氏菌属等益生菌的数量以及有效调节动物的肠道菌群即可。根据本发明的一些具体示例，将所述茯茶以150mg/kg的剂量提供给所述动物，其中，冠突散囊菌的活菌数不低于4.0×10⁴CFU。由此，受试动物肠道内益生菌的数量增加明显，即茯茶调节动物肠道菌群的效果显著。

根据本发明的又一方面，本发明还提出了一种调节动物肠道菌群的方法。根据本发明的实施例，该方法是对所述动物提供茯茶。根据本发明的实施例，利用本发明的方法能够显著提高受试动物肠道内乳酸菌属、丁酸弧菌属、罗斯拜瑞氏菌属、罗斯氏菌属等益生菌的数量，有效调节动物的肠道菌群，进而通过肠道菌群的作用有效预防或治疗肥胖、糖尿病等疾病。

还需要说明的是，本发明的茯茶及其制备方法和其在调节动物肠道菌群中的用途，正是本发明的发明人经过艰苦的创造性劳动和大量的实验工作才意外发现的。

本发明的有益效果在于：

1、本发明的茯茶，所有原料取于自然、源于天然，且不含任何化学制剂，无毒副作用、安全可靠；原料来源广泛易得，且制备工艺简单，贮运和应用安全，生产成本低廉，易被消费者接受。

2、本发明的茯茶经过动物功能试验和人群饮用试验都证明无任何毒副作用，有显著的降血糖、减肥、调节动物肠道菌群等作用。本发明的茯茶能非常显著的降低血糖，可使病人空腹血糖显著下降。该茯茶适于高血糖、肥胖人群以及老年人群等，通过日常饮用，从治本的角度出发，通过改善脂质代谢、改善血流、提高人体免疫力等，最终达到保护健康的目的。

3、本发明实现了便捷的、显著的降血糖等保健功效，效果明显、安全性好，质量稳定，产品可长期保存，为人们日常保健提供了新的选择。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。

在本发明的一个方面，本发明提出了一种制备茯茶的方法。根据本发明的实施例，该方法包括一下步骤：

制备冠突散囊菌孢子悬液：

（1）将茯砖茶块上的黄色闭囊壳并接种于察氏培养基上，于28℃培养72h；（2）将步骤（1）中培养获得的黄色闭囊壳平板划线分离2～3次，以便获得初步纯化的菌落；（3）将所述初步纯化的菌落置于无菌水中，振摇制成均匀的孢子悬液，并进行10倍递增稀释，制成10^-3～10^-5稀释度的孢子悬液；（4）将步骤（3）中获得的孢子悬液在空白查氏培养基上进行平板涂布，然后置于28℃下培养，以便获得纯培养菌落；（5）按照步骤（3）制备10^-1～10^-3稀释度的孢子悬液，并将孢子浓度调整至1.5×10⁶～2.0×10⁶个/ml；（6）将步骤（5）中得到的孢子悬液接种于液体CZG培养基中，于28℃，150r/min条件下培养96h，以便获得所述冠突散囊菌孢子悬液。由此，能够有效制备冠突散囊菌孢子悬液。

根据本发明的实施例，所述冠突散囊菌孢子悬液的浓度不受特别限制，本领域技术人员可以根据具体情况灵活选择。根据本发明的一个实施例，所述冠突散囊菌孢子悬液的浓度为1.0×10⁷-1×10⁸个/ml。由此，有利于后续黒毛茶的发酵。

接种发酵：

将所述冠突散囊菌孢子悬液接种于黒毛茶中，并进行发酵，以便获得茯茶。由此，能够有效地制备金花（即冠突散囊菌，在本文中“金花”和“冠突散囊菌”可以互换使用）茂盛的茯茶，且方法简单、容易操作控制。

根据本发明的实施例，所述发酵是在28摄氏度，湿度70%的条件下进行的。由此，能够使得黒毛茶在最适合的温度、湿度条件下进行发酵，利于冠突散囊菌的生长。

根据本发明的实施例，所述发酵的时间为7～12天。由此，黒毛茶能够有效地发酵。

在本发明的另一方面，本发明提出了一种茯茶。根据本发明的实施例，所述茯茶是通过前面所述的方法制备的。发明人惊奇地发现，对动物提供本发明的茯茶，能够有效调节动物的肠道菌群，进而基于肠道菌群的作用，发挥降血糖、减肥的功效。

在本发明的再一方面，本发明还提出了前面所述的茯茶在调节动物肠道菌群中的用途。根据本发明的实施例，茯茶能显著调节动物的肠道菌群，进而通过肠道菌群的作用而发挥降血糖、减肥等功效。由此，对动物提供茯茶能够有效地调节其肠道菌群，从而预防或治疗肥胖、糖尿病等疾病。

需要说明的是，在本文中所使用的表达方式“茯茶在调节动物肠道菌群中的用途”中的术语“动物”所指的动物种类不受特别限制。根据本发明的实施例，该动物可以为任何具有肠道器官的动物，优选哺乳动物，更优选大鼠、小鼠、人，最优选人。另外，在本文中所使用的表达方式“预防或治疗”主要是指预防或治疗肥胖、糖尿病、高血压、高血脂以及肿瘤等疾病。

本文中所使用的表达方式“对动物提供茯茶”中的术语“提供”是指所述动物饮用茯茶，饮用的方式可以是动物主动饮用，也可以是人工灌胃。

上述茯茶能够用于调节动物肠道菌群，进而通过肠道菌群的作用能够发挥降血糖、减肥等功效。因而，根据本发明的实施例，所述茯茶用于预防或治疗肥胖、糖尿病。

根据本发明的实施例，饮用茯茶没有任何副作用，因而茯茶的饮用剂量不受特别限制，只要能够提高受试动物肠道内乳酸菌属、丁酸弧菌属、罗斯拜瑞氏菌属、罗斯氏菌属等益生菌的数量以及有效调节动物的肠道菌群即可。根据本发明的一些具体示例，将所述茯茶以150mg/kg的剂量提供给所述动物，其中，冠突散囊菌的活菌数不低于4.0*10⁴CFU。由此，受试动物肠道内益生菌的数量增加明显，即茯茶调节动物肠道菌群的效果显著。

在本发明的又一方面，本发明还提出了一种调节动物肠道菌群的方法。根据本发明的实施例，该方法是对所述动物提供茯茶。根据本发明的实施例，利用本发明的方法能够显著提高受试动物肠道内乳酸菌属、丁酸弧菌属、罗斯拜瑞氏菌属、罗斯氏菌属等益生菌的数量，有效调节动物的肠道菌群，进而通过肠道菌群的作用有效预防或治疗肥胖、糖尿病等疾病。

实施例1：茯茶的制备

1、冠突散囊菌孢子悬液的制备

用无菌接种针挑取茯砖茶块上的黄色闭囊壳并接种于察氏培养基上，于28℃进行培养。待培养72h时，挑取少量黄色闭囊壳作平板划线分离，经2～3次平板划线后该菌已得到初步纯化。待初步纯化的菌落生长处于旺盛期时，用接种环刮取黄色闭囊壳放入盛有10ml无菌水的无菌小瓶内，振摇20min，制成均匀的孢子悬液并进行10倍递增稀释，制成10^-3～10^-5稀释度的孢子悬液。

用无菌吸管分别吸取0.1ml各稀释度的孢子悬液在空白查氏培养基上进行平板涂布，然后置于28℃下培养。选取仅长有1～2个单菌落的平板，该平板上的单菌落就是该菌的纯培养，观察其菌落特征，并结合显微镜检测个体形态特征。

按照上述方法制备10^-1～10^-3稀释度的孢子悬液，然后对孢子悬液进行血球计数板计数，将孢子浓度调整至1.5×10⁶～2.0×10⁶个/ml，用移液器吸取1ml孢子悬液接种于已经制备好的装有99ml液体CZG培养基的250ml三角瓶中，于28℃，150r/min条件下进行培养96h，将菌液上样于血球计数板在光学显微镜下进行孢子计数，调整孢子的浓度为1.0×10⁷-1×10⁸个/ml，由此获得冠突散囊菌孢子悬液。

察氏培养基：硝酸钠2g/L，磷酸氢二钾1g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸镁0.5g/L，硫酸铁0.01g/L，蔗糖30g/L，琼脂15～20g/L。

CZG培养基：蔗糖40g/L，磷酸氢二钾1g/L，硝酸氨3g/L，氯化钠50g/L，硫酸镁0.5g/L，琼脂15～20g/L。

2、黑毛茶接种发酵

准确称取200g黑毛茶，接种10ml冠突散囊菌孢子悬液，于28℃，湿度70%的条件下，发酵7-12天，然后按照GB8302-87《茶取样》的规定取样，计数，以茯砖茶国家标准为合格标准。

3、包装

将发酵好的黑毛茶称重，压成茶砖或者直接装袋。

实施例2：茯茶调节人肠道菌群功能实验

依据***《保健饮品检验与评价技术规范（2003年）》的调节肠道菌群功能人体试饮实验评价办法对实施例1制备获得的茯茶进行评价，具体如下：

1.试饮实验分组

表1试饮实验分组表

2.人体试饮实验方法

将受试者随机分成2个组，每组20人，在受试者试饮之前，均无菌采取受试者粪便，16S rDNA测序检验肠道菌群，作为本底水平的参照。

按表1的分组情况，组1服用对照组、组2服用实验组，4周后，采取受试者粪便，16SrDNA测序检验肠道菌群，与本底水平对比，对比其相对丰度增加的倍数。

3.肠道菌群检测方法

粪便样本首先进行DNA提取，PCR扩增16S rDNA的V3～V5区域，然后用454平台测序，测序方向V5->V3。每个样品原始数据平均7795条tag，读长400bp左右。最终用于分析的tag数平均为3235，读长265bp左右。

16S分析主要采用mothur软件（http://www.mothur.org/wiki/Mothur_manual），包括质控，OTU聚类，注释等分析，并在完成数据物种分类的基础上，分析各个物种的相对丰度。

4.实验结果

具体结果见表2：

表2人肠道菌群各菌属测序数据丰度对比（与试饮前本底水平相比提高倍数）

由表2可知，服用了茯茶的实验组相对于对照组，乳酸菌属、丁酸弧菌属、罗斯拜瑞氏菌属、罗斯氏菌属等益生菌数均有明显的增加，表明本发明的茯茶能够有效调节肠道菌群。

实施例3：茯茶在降血糖方面的动物实验

将实施例1制备获得的茯茶按照***《保健饮品检验与评价技术规范（2003年）》的降血糖功能动物实验评价办法进行评价，具体如下：

1、试验方法：取雄性SD大鼠30只，按照标准方法制备小剂量链佐菌素致糖尿病大鼠模型，三日后根据大鼠血糖值随机分为3组，每组10只。各组连续灌胃给药8天，每日1次，空白组给予等量蒸馏水，最后一次给药后两小时取血，测定血糖值。

2、试验对象：

空白组：给予蒸馏水；

对照1组：给予二甲双胍300mg/kg；

实验组：给予茯茶150mg/kg，活菌数不低于1.0*10⁸CFU/g。

3、实验结果

不同实验组降血糖的结果如表3所示。

表3不同实验组降血糖效果比较

注：（1）与空白组比较*P<0.01；（2）与空白组比较^ΔP<0.05

从表3的动物试验结果表明，对照1组以及本发明实验组对小鼠实验性糖尿病的高血糖均具有下降作用，本发明的茯茶以及二甲双胍对小鼠实验性糖尿病的高血糖具有极其显著的下降作用，结合表1的实验结果，说明本发明的茯茶显著增加了益生菌菌群数，而益生菌菌群的增加导致了血糖的降低，显示该茯茶具有降血糖的功能，本发明的茯茶具有显著的治疗作用。

实施例4：茯茶降血糖人体试饮实验

依据***《保健饮品检验与评价技术规范（2003年）》，对实施例1制备获得的茯茶进行降血糖人体试饮实验，具体如下：

1、样品：

本试验的样品由深圳华大基因科技有限公司提供，按本发明的实施例1制备得到的茯茶。

2、人体试饮及试验方法：

按自愿原则选择60例Ⅱ型糖尿病人，其中男性42人，女性18人，年龄范围43-75岁，无严重心肝肾等并发症，采取试饮前中后对比设计。受试者原用治疗药物种类、饮食控制及活动不变，每日饮用茯砖茶3次，每次150mg/kg的剂量冲泡，于早、午、晚饭前服用，连续服用30天。监测病人血压、大小便、体重的变化，并测定空腹和餐后2小时的血糖（用葡萄糖氧化酶法）。

3、评判标准：

显效：基本症状消失，空腹或餐后2小时的血糖较治疗前下降不超过30.0%。

有效：基本症状明显改善，空腹和餐后2小时的血糖较治疗前下降不超过10.0%。

无效：基本症状无明显改善，空腹和餐后2小时的血糖较治疗前下降小于10.0%。

4、人体试饮结果：

试饮30天本发明的茯茶后与试饮前相比，病人的血压、大小便、体重均无显著性差异。关于对试饮前后的血糖的影响，试饮30天后病人空腹血糖和餐后2h血糖有明显的降低，较试饮前有极显著性差异（P<0.01），具体结果见表4。由此可见，本发明的茯茶通过改善肠道菌群结构从而降低血糖，具有明显的降血糖保健功能，并对受试人群健康无损害作用。

表4茯茶对病人血糖的影响

实施例5：茯茶对肥胖的治疗效果试验

1、试验材料及方法

本发明的茯茶，由深圳华大基因科技有限公司提供，按照本发明实施例1制备得到，饮用方式参照表1。

受试对象：经体检符合试验要求，超重度在20%以上的肥胖志愿者20名，无其它疾病，内脏功能正常。

方法：采用自身对照设计，将受试者随机分为2组，每组10人，按表1的分组情况，对照组服用生理盐水、实验组服用茯茶，每日服用3次，于饭后服用，连续服用30天。试饮期间日常饮食及运动量与试验前保持一致。各项指标于试饮试验开始及结束时各测试1次。

2、功效性观察

①测量身高(cm)、体重(kg)并计算标准体重、超重度：

成人标准体重(kg)=[身高(cm)-100]×0.9

超重度(％)=（实测体重-标准体重）/标准体重×100％

②体内脂肪总量(kg)及脂肪百分率(％)测定：用电阻抗仪测定人体脂肪含量。

③腰围、臀围(cm)测量：用皮尺测量。

3、观察结果

3.1体重、体内脂肪总量及脂肪百分率测定

关于对试饮前后的体重、体脂，服用茯茶的病人，与试饮前相比，试饮30天后病人的体重、体脂较试饮前均有明显的降低，体脂百分率较试饮前有明显的升高，具体结果见表4。

表4试饮前后体重、体脂测定结果

注：（1）*表示P<0.05；（2）**表示P<0.01

3.2腰围、臀围的测量

关于对试饮前后的腰围、臀围，服用茯茶的病人，与试饮前相比，试饮30天后病人的腰围、臀围较试饮前均有明显的降低，具体结果见表5。

表5试饮前后腰围、臀围测量结果

注：（1）*表示P<0.05；（2）**表示P<0.01

本试饮试验中，受试者连续服用茯茶30天后，体重、体内脂肪总量、体脂百分率、腰围、臀围均显著下降。由此可见，本发明的茯茶对人体具有明显的减肥作用，且服用期间未见不良反应。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种制备茯茶的方法，其特征在于，包括：

提供冠突散囊菌孢子悬液；

将所述冠突散囊菌孢子悬液接种于黒毛茶中，并进行发酵，以便获得茯茶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冠突散囊菌孢子悬液的浓度为1.0×10⁷-1×10⁸个/ml。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述冠突散囊菌孢子悬液是通过以下步骤制备的：

（1）将茯砖茶块上的黄色闭囊壳并接种于察氏培养基上，于28℃培养72h；

（2）将步骤（1）中培养获得的黄色闭囊壳平板划线分离2～3次，以便获得初步纯化的菌落；

（3）将所述初步纯化的菌落置于无菌水中，振摇制成均匀的孢子悬液，并进行10倍递增稀释，制成10^-3～10^-5稀释度的孢子悬液；

（4）将步骤（3）中获得的孢子悬液在空白查氏培养基上进行平板涂布，然后置于28℃下培养，以便获得纯培养菌落；

（5）按照步骤（3）制备10^-1～10^-3稀释度的孢子悬液，并将孢子浓度调整至1.5×10⁶～2.0×10⁶个/ml；

（6）将步骤（5）中得到的孢子悬液接种于液体CZG培养基中，于28℃，150r/min条件下培养96h，以便获得所述冠突散囊菌孢子悬液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵是在28摄氏度，湿度70%的条件下进行的。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的时间为7～12天。

6.一种茯茶，其特征在于，所述茯茶是通过权利要求1～5任一项所述的方法制备的。

7.权利要求6所述的茯茶在调节动物肠道菌群中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述茯茶用于预防或治疗糖尿病或肥胖。

9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，将所述茯茶以不低于4×10⁴CFU冠突散囊菌/(kg·d)的剂量提供给所述动物。

10.一种调节动物肠道菌群的方法，其特征在于，对所述动物提供权利要求6所述的茯茶。