CN104725485B - 一种重组活性肽及其同步制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组活性肽及其同步制备方法，所述重组活性肽是由活性肽单体叠加或定向串联而成的，所述活性肽单体包括降血压肽单体和抗氧化肽单体，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1。本发明的一种编码所述的重组活性肽的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2。本发明成本低，获得的重组多肽中的活性肽能被胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶有效释放，制得的活性肽混合体具有高体内降压活性及抗氧化活性。

Description

一种重组活性肽及其同步制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种重组活性肽及其同步制备方法。

背景技术

生物活性肽一般蕴藏于母体蛋白序列内，并不具备生物活性，但通过体内或体外蛋白酶或食品加工处理被释放后即可在体内行使生理功能。目前，功能活性肽主要是通过酶法水解蛋白原料进行制备。目前已有不少酶解法制备降血压肽和抗氧化肽的专利报道。相对生物提取法、化学降解法和化学合成法，酶解法具有产品安全性高、生产条件温和，对蛋白质营养价值破坏小等优势。但是，目前国内市场上出现的相关活性肽产品基本上是以活性较低的复合肽产品形式出现，如大豆肽、玉米肽、胶原蛋白肽等，功能专一性不强，且产品活性有待进一步的提高。

目前已有大量“通过常规分离手段纯化高纯活性肽”的专利报道，尽管研究者们鉴定出的某些肽段显示出极强的生理活性，如IPP、VPP、IKW、LHP等降血压肽和YHY、PHH、YKY、YPPAK、HDHPVC等抗氧化肽，但由于蕴藏于母体蛋白序列中的有效活性肽段比例低，导致酶解后期的低产率和高分离成本，除了极少数活性肽段(IPP、VPP等)有产品问世外，大多数高活性功能肽并没有得到有效开发利用。

随着基因工程技术的发展，利用DNA重组技术，将表达活性肽的基因克隆到某些微生物或动物体内，通过生物体直接表达出所需肽类，可大大增加其产量和纯度。目前，有关“利用基因工程菌制备活性肽”的专利报道已呈逐年增多的趋势。尽管利用基因工程技术制备高活性短肽已取得了技术上的突破，但活性肽多聚体的基因设计、表达效率及下游分离工艺有待进一步的完善。

近年来，细胞生物学和分子生物学的研究表明人体内除了具有升压物质及***外，尚具有许多内源性减压物质及***，以维持血压的相对稳定。有研究证实降血压肽与抗氧化肽在体内具有不同的作用靶点、不同的干预***及不同的作用机制，但对高血压及相关心血管疾病的预防与控制具有积极效应。许多研究发现，多种功效因子联合作用比单一组分具有更好的效果，即呈现协同作用，其作用可能源于具有不同作用机制的功效因子之间存在明显的互补作用或相互修复作用。因此，如果将降血压肽和抗氧化肽联合应用于心血管疾病的预防与控制，将会起到良好的效果。已有不少研究报道了通过酶解法同步制备降血压肽与抗氧化肽的相关报道。但是，目前尚无“利用基因工程菌同步制备降血压肽和抗氧化肽”的报道。

目前，缺乏一种高体内活性、低成本的重组活性肽及其同步制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高体内活性、低成本的重组活性肽及其同步制备方法。

本发明的技术方案如下：一种重组活性肽，所述重组活性肽是由活性肽单体叠加或定向串联而成的，所述活性肽单体包括降血压肽单体和抗氧化肽单体，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1。

本发明的一种编码所述的重组活性肽的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2。

进一步地，所述的抗氧化肽单体有DTHK、YPIL、FLEPDY、YLEPFR、YLEPDY、YDEPEW、HYRPFW、Y EPDY和IWAPFY；所述降血压肽单体有MRW、WIR、IRA、AMK、MKR、RGY、VAW、DGL、IPP、IKP、IKPFR、IKPVA、AKF、IW、VAF、VSV、IQY和IVY。

进一步地，所述活性肽单体部分肽段的N末端为胃蛋白酶酶切位点；所述活性肽单体部分肽段的C末端为胃蛋白酶或胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶酶切位点；所述重组降血压肽和抗氧化肽中部分活性肽单体之间由带有胃蛋白酶或胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶酶切位点的连接片段串联而成。

本发明同步制备所述的重组活性肽的方法，包括如下步骤：

(1)人工合成序列表SEQ ID NO：2所示的基因；

(2)构建能高效表达与纯化重组降血压肽和抗氧化肽的表达载体；

(3)用所述表达载体转化宿主菌构建基因工程菌；

(4)利用所述工程菌表达重组活性肽；

(5)利用标签纯化及标签去除技术获取重组活性肽；

(6)采用胃蛋白酶和/或胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶酶解制得降血压肽和抗氧化肽。

进一步地，在步骤(2)中，所述表达载体为pET28a，宿主菌为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

进一步地，在步骤(2)中，采用DNA重组技术，将序列表SEQ ID NO：2所示的基因***pET28a的HindIII和XhoI位点中，并分别在基因的上游的NcoI和BamHI位点以及BamHI和HindIII位点克隆入类弹性蛋白纯化标签ELPs基因和SUMO融合标签基因，获得重组表达载体pET28a-ESA3。

更进一步地，在步骤(3)中，并转化E.coli BL21(DE3)，获得工程菌；

在步骤(4)中，利用IPTG诱导工程菌表达ELPs-SUMO-A3，收集菌体，超声破碎细胞，收集超声上清或包涵体沉淀；

在步骤(5)中，对于可溶表达的如序列表SEQ ID NO：1所示的目标蛋白直接进行标签技术纯化，而对包涵体表达的目标蛋白先进行变性与复性再进行标签技术纯化；通过ELPs标签纯化技术纯化融合蛋白以及采用SUMO蛋白酶裂解及加盐离心去除二联体融合标签ELPs-SUMO，获得重组活性肽；

在步骤(6)中，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解重组活性肽，超滤得小肽混合体，再脱盐去杂，冷冻干燥样品，质检制得活性肽。

本发明所述的重组活性肽在制备治疗高血压药中的应用。

有益效果：本发明成本低，获得的重组多肽中的活性小肽能被胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶有效释放，制得的活性肽混合体具有高体内降压活性及抗氧化活性。本发明终产品小肽混合物协同降压的同时能改善血管内皮细胞功能，多角度预防与维护心血管健康；本发明重组菌可以通过微生物发酵进行工业放大，具有广阔的应用前景。本发明具有如下优点：

(1)重组活性小肽混合物是指采用基因工程技术和生化分离技术研发生产的小肽、长度为2个到10多个氨基酸，所述小肽混合物具有强效的体内降血压功能和抗氧化功能，对心血管疾病具有积极的预防与控制效果。

(2)本发明提供了一种同步生产降血压肽和抗氧化肽的新方法以及由此所产生的由高活性降血压肽和抗氧化肽所组成的小肽混合物。应用DNA重组技术，通过基因工程菌发酵法来制备。提供了可供酶解释放的高活性降血压肽和抗氧化肽串联的方法，同时提供了所设计活性肽前体多肽及能稳定表达的优化基因。还提供克隆有编码重组多肽的寡核苷酸序列的表达载体pET28a-ESA3及其转化的重组大肠杆菌。

(3)本发明方法能同步有效富集高活性降血压肽和抗氧化肽，提高活性肽产率，提高活性肽单位摩尔作用强度；本发明重组降血压肽和抗氧化肽的酶解液无需纯化或经简单的膜过滤处理后即可直接应用；本发明中的活性肽多聚体中的活性肽单体可以根据需要进行删减，活性肽单体的顺序也可以根据需要进行调整。

(4)本发明中应用了降压活性或抗氧化活性较高的肽段作为连接片段，例如本发明中N末端为芳香族氨基酸(F/Y)、C末端为芳香族氨基酸以及C端倒数第三位氨基酸为Pro的六肽，如FLEPDY、YLEPDY、YDEPEW，其C末端和N末端均易于被胃蛋白酶切割释放；例如本发明中N末端为脂肪族氨基酸以及C末端为碱性氨基酸的IER、VEK、IEK、IQER，所述肽的C末端易于胰蛋白酶的释放，同时将下游紧邻活性肽的N末端游离出来。

(5)本发明重组降血压肽和抗氧化肽中的部分或全部活性肽单体能被胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰酶中的一种或多种酶酶切释放。本发明制得的终产品小肽混合物中含有多肽氨基酸序列所能用胃肠消化酶酶解产生的任何肽段，优先含有根据权利要求3中所述活性肽单体以及具有显著降压活性和/或抗氧化活性的肽段。本发明的重要步骤涉及活性肽多聚体及其相应基因的设计与优化，重组降血压肽和抗氧化肽表达载体及工程菌的构建，重组降血压肽和抗氧化肽的表达及纯化，以及重组降血压肽和抗氧化肽中活性降血压肽和抗氧化肽的酶解释放。

附图说明

图1为本发明所构建重组质粒示意图；

图2为本发明的重组质粒PCR鉴定示意图；

图3为本发明的重组质粒的双酶切鉴定示意图；

图4为SDS-PAGE鉴定重组蛋白包涵体表达示意图；

图5为SDS-PAGE鉴定重组蛋白纯化示意图；

图6为SDS-PAGE鉴定重组多肽A3纯化示意图；

图7为SDS-PAGE鉴定重组蛋白可溶性表达示意图。

具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。

实施例1

如图1至图7所示，图1为本发明所构建重组质粒示意图；图2为本发明的重组质粒PCR鉴定示意图，泳道M为DL10000DNA标样，泳道1、2、3均为同一PCR产物(以重组质粒pET28a-ESA3为模板，引物5’-TTCCTGGAACCGGA-3’和5’-CCAAGCCACACGA AAC-3’为上下游引物)；图3为本发明的重组质粒的双酶切鉴定示意图，M为DNA Marker，泳道1-5分别为Nco I/Bam HI、Bam HI/Hind III、Hind III/Xho I、Bam HI/Xho I、Nco I/Xho I双酶切产物，泳道6为重组质粒；图4为SDS-PAGE鉴定重组蛋白包涵体表达示意图，泳道M为蛋白标样，泳道1、2和3分别为诱导后重组菌超声破碎原液、超声上清和超声沉淀；图5为SDS-PAGE鉴定重组蛋白纯化示意图，M蛋白质Marker，0透析后的融合蛋白，泳道1、2、3分别为终浓度1.0、1.5、2.0mol/L氯化钠纯化后的融合蛋白；图6为SDS-PAGE鉴定重组多肽纯化示意图，泳道M为蛋白标样，泳道1为融合蛋白Elps-SUMO-A3经SUMO蛋白酶酶解后的产物，泳道2和3分别为在上述酶解产物中加入终浓度1.0mol/L氯化钠盐析后的离心上清和沉淀；图7为SDS-PAGE鉴定重组蛋白可溶性表达示意图；泳道M为蛋白标样，泳道1、2和3分别为诱导后重组菌超声破碎原液、超声上清和超声沉淀；

本发明的一种重组活性肽，所述重组活性肽是由活性肽单体叠加或定向串联而成的，所述活性肽单体包括降血压肽单体和抗氧化肽单体，其氨基酸序列如序列表SEQ IDNO：1。

本发明的一种编码所述的重组活性肽的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2。

所述的抗氧化肽单体有DTHK、YPIL、FLEPDY、YLEPFR、YLEPDY、YDEPEW、HYRPFW、YEPDY和IWAPFY；所述降血压肽单体有MRW、WIR、IRA、AMK、MKR、RGY、VAW、DGL、IPP、IKP、IKPFR、IKPVA、AKF、IW、VAF、VSV、IQY和IVY。

所述活性肽单体部分肽段的N末端为胃蛋白酶酶切位点；所述活性肽单体部分肽段的C末端为胃蛋白酶或胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶酶切位点；所述重组降血压肽和抗氧化肽中部分活性肽单体之间由带有胃蛋白酶或胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶酶切位点的连接片段串联而成。

本发明同步制备所述的重组活性肽的方法，包括如下步骤：

(1)重组降血压肽和抗氧化肽及其编码基因的设计与优化；

本发明的人工合成序列表SEQ ID NO：2所示的基因；本发明中的活性肽单体均从所构建活性肽数据库中筛选，其中部分活性肽根据复合功能肽前体的设计需要进行人为改造。所筛选活性肽的总特点为：抗胃肠酶消化；易于胃肠酶的完整释放；具有高体内生物活性。经初步筛选，选定ACE抑制肽单体为：MRW、WIR、IRA、AMK、MKR、RGY、VAW、DGL、IPP、IKP、IKPFR、IKPVA、AKF、IW、VAF、VSV、IQY、IVY等；选定抗氧化肽单体为：DTHK、YPIL、FLEPDY、YLEPFR、YLEPDY、YDEPEW、HYRPFW、Y EPDY、IWAPFY等。

以活性肽单体理论上易于胃肠消化酶有效释放为前提，采用直接首尾连接，或采用合适的连接短肽(2-3氨基酸残基，具有生物活性)，或将含有部分相同氨基酸残基的不同活性肽进行叠加，将筛选到的目标活性肽定向串联组装成复合功能肽前体重组活性肽，并利用蛋白质结构预测软件和基因优化软件指导重组活性肽及其基因的设计，旨在使得重组活性肽基因理论上能在工程菌细胞中实现稳定高效表达。

基于以上策略，本发明所设计重组降血压肽和抗氧化肽的氨基酸序列如下：

编码重组降血压肽和抗氧化肽的核苷酸序列如下：

(2)重组表达载体及重组菌的构建；

如图1所示，重组质粒pET28a-ESA3的构建。采用分子克隆技术，将步骤(1)所设计并优化的重组活性肽基因克隆入pET28a的HindIII和XhoI位点，并分别在重组活性肽上游的NcoI和BamHI位点以及BamHI和HindIII位点克隆入类弹性蛋白纯化标签ELPs基因和SUMO融合标签基因，构建重组表达载体pET28a-ESA3，并转化E.coli BL21(DE3)，获得工程菌。

如图2所示，以重组质粒pET28a-ESA3为模板，引物5’-TTCCTGGAACCGGA-3’和5’-CCAAGCCACACGAAAC-3’为上下游引物进行PCR，获得了约340bp的PCR产物，与预期目的片段重组活性肽的大小相近。

重组质粒经进一步的双酶切及测序鉴定，结果证实重组质粒构建成功。构建能高效表达与纯化重组降血压肽和抗氧化肽的表达载体；所述表达载体为pET28a，宿主菌为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。采用DNA重组技术，将序列表SEQ ID NO：2所示的基因***pET28a的HindIII和XhoI位点中，并分别在基因的上游的NcoI和BamHI位点以及BamHI和HindIII位点克隆入类弹性蛋白纯化标签ELPs基因和SUMO融合标签基因，获得重组表达载体pET28a-ESA3。

(3)用所述表达载体转化宿主菌构建基因工程菌；并转化E.coli BL21(DE3)，获得工程菌；重组蛋白Elps-SUMO-A3在E.coli BL21(DE3)中的诱导表达

挑含重组质粒pET28a-ESA3的E.coli BL21(DE3)单菌落于20ml含50μg/ml的Kana的LB培养基(1％Tryptone、0.5％Yeast extract、1％NaCl、pH 7.0)中，37℃，200rpm摇床培养过夜，后将过夜培养液按2％的接种量转接入含50μg/ml的Kana的TB培养液(1.2％Tryptone、2.4％Yeast extract、0.4％glycerol、0.2％KH2PO4、1.6％K2HPO4)中，37℃，200rpm，摇瓶培养至菌体OD值达到0.6-0.8，添加IPTG至终浓度为0.2mM，37℃，诱导培养5h后，取样SDS-PAGE分析，如图2得知，工程菌在诱导培养5h后，相对诱导前样，有一分子量约45kDa的蛋白条带出现，以上表明重组蛋白Elps-SUMO-A3在E.coli BL21(DE3)成功获得融合表达。经灰度扫描分析，重组蛋白的表达量占细胞总蛋白的65％以上。

(4)利用所述工程菌表达重组活性肽；Elps-SUMO-A3包涵体制备及复性

将培养所得菌液分装，4000rpm离心5min获得菌体沉淀，向沉淀中分别加入20mlpH 8.0PBS缓冲液重悬，重悬后的菌液于300W、工作2s、间隔8s，冰浴条件下超声破碎50min。破碎液于4℃、8000rpm离心10min，所获包涵体沉淀用等体积6mol/l尿素重悬，冰浴10h。4℃、8000rpm离心10min，保留上清。取包涵体复溶后的上清分别于透析液1、透析液2、透析液3中冰浴梯度透析6h(透析液含10mmol/l Tris-HCl pH 8.0，1mmol/l EDTA，150mmol/lNaCl，10％甘油)。透析液1尿素浓度为4mol/l，透析液2尿素浓度为2mol/l，透析液3尿素浓度为1mol/l。透析结束，将样品于4℃、8000rpm条件下离心10min，保留上清，即复性得到可溶性的融合蛋白Elps-SUMO-A3。

(5)重组蛋白Elps-SUMO-A3的分离纯化

利用标签纯化及标签去除技术获取重组活性肽；透析后，经重新折叠后的重组蛋白溶液中还含有少量的杂蛋白，需进行纯化。上述制备的重组蛋白由于含有Elps标签，因此可用加盐离心纯化。取透析所得蛋白溶液，加入终浓度为1.5mol/l的NaCl混合均匀后于30℃条件下水浴10min，常温离心，保留沉淀。对于可溶表达的如序列表SEQ ID NO：1所示的目标蛋白直接进行标签技术纯化，而对包涵体表达的目标蛋白先进行变性与复性再进行标签技术纯化；通过ELPs标签纯化技术纯化融合蛋白以及采用SUMO蛋白酶裂解及加盐离心去除二联体融合标签ELPs-SUMO，获得重组活性肽；

(6)采用胃蛋白酶和/或胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶酶解制得活性肽

采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解重组降血压肽和抗氧化肽，超滤得小肽混合体，再脱盐去杂，冷冻干燥样品，质检制得降血压肽和抗氧化肽。向沉淀中加入等体积预冷的4℃pH 8.0PBS缓冲液重悬，冰浴6h后离心，上清液即是纯化所得蛋白溶液，经过两次离心循环即可获得纯度95％以上的目标蛋白。

本发明的一种制备活性短肽的大肠杆菌菌株，该菌株为大肠杆菌；保藏名称为大肠埃希氏菌Escherichia coli；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2014年10月24日；保藏编号：CGMCC No.9842。

本发明所述的大肠杆菌制备的大肠杆菌菌剂。

本发明所述的大肠杆菌菌剂，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：

(a)权利要求1所述的大肠杆菌的发酵培养物；

(b)权利要求1所得大肠杆菌细胞的超声裂解上清；

(c)权利要求1所得大肠杆菌细胞的超声裂解沉淀。

本发明制备所述大肠杆菌菌剂的方法，包括如下步骤：

(1)将菌株单菌落于20ml含50μg/ml的Kana的LB培养基中，温度为37℃，搅拌速率为200rpm摇床培养12-14h；所述LB培养基按质量百分比由1％Tryptone、0.5％Yeastextract、1％NaCl、pH 7.0的组分组成。

(2)将培养液按2％的接种量转接入含50μg/ml的Kana的TB培养液中，温度为37℃，搅拌速率为200rpm；所述TB培养液按质量百分比由1.2％Tryptone、2.4％Yeast extract、0.4％glycerol、0.2％KH₂PO₄和1.6％K₂HPO₄的组分组成。

(3)摇瓶将大肠杆菌菌种培养至菌体OD值达到0.6-0.8，添加IPTG至终浓度为0.02-0.2mM，温度为20-37℃诱导培养时间为5-20h后，取样SDS-PAGE分析，制得大肠杆菌菌剂。

本发明所述的大肠杆菌菌株在制备治疗高血压药中的应用。

实施例2

实施例2与实施例1的区别在于：依据实施例1中步骤(1)和步骤(2)构建工程菌pET28a-ESA3/E.coli BL21(DE3)。将工程菌单菌落于20ml含50μg/ml的Kana的LB培养基中，37℃，200rpm摇床培养过夜，后将过夜培养液按2％的接种量转接入含50μg/ml的Kana的TB培养液中，37℃，200rpm，摇瓶培养至菌体OD值达到0.6-0.8，添加IPTG至终浓度为0.02mM，20℃诱导培养20h后，取样SDS-PAGE分析。

如图4得知，工程菌在低温低诱导剂浓度条件下诱导培养20h后，相对诱导前样，有一分子量约45kDa的蛋白条带出现；超声破碎细胞后，目标蛋白的可溶性表达水平达到60％以上。取超声破碎上清，加入终浓度为1.5mol/l的NaCl混合均匀后于30℃条件下水浴10min，常温离心，保留沉淀。向沉淀中加入等体积预冷的4℃pH 8.0PBS缓冲液重悬，冰浴6h后离心，上清液即是纯化所得蛋白溶液，经过两次离心循环即可获得纯度95％以上的目标蛋白。

实施例3

实施例3与实施例1的区别在于：重组小肽混合物的制备及其活性鉴定。取适量制备所得的ELPs-SUMO-A3，按照3％的添加量加入SUMO蛋白酶，30℃酶解5h。酶解结束后，向酶解液中加入终浓度1.5mol/l的氯化钠，30℃水浴10min后，8000r/min离心10min，保留上清液，即为重组活性肽。体外模拟人体自然生理消化过程，将2mg/ml的重组活性肽溶液用盐酸调节pH至2.0，加入2％胃蛋白酶，37℃下水解4h，沸水浴终止反应，调pH至7.0，取部分水解液测定肽活性。在剩余的水解液中加入2％的胰酶(或胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶混合物)，37℃水解4h，沸水浴终止反应。胃蛋白酶水解液(H1)；胰酶水解液(H2)；复合酶水解液(H3)。经体外ACE抑制活性及抗氧化活性检测，结果显示多聚体重组活性肽的胃肠消化酶水解液H1、H2和H3均显示出了极强的ACE抑制活性和抗氧化活性，其中，水解液H2的ACE抑制IC₅₀在1.0μg/ml以下，SHR动物实验也证实重组活性肽的胃肠酶水解液H1、H2和H3均具有显著的降压效应。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种重组活性肽，其特征在于：所述重组活性肽是由活性肽单体叠加或定向串联而成的，所述活性肽单体包括降血压肽单体和抗氧化肽单体，其氨基酸序列如序列表 SEQ IDNO ：1。

2.一种编码权利要求 1 所述的重组活性肽的核苷酸序列如序列表 SEQ ID NO ：2。

3.根据权利要求 1 所述的重组活性肽，其特征在于：所述的抗氧化肽单体有 DTHK、YPIL、FLEPDY、YLEPFR、YLEPDY、YDEPEW、HYRPFW、YEPDY 和 IWAPFY ；所述降血压肽单体有MRW、WIR、IRA、AMK、MKR、RGY、VAW、DGL、IPP、IKP、IKPFR、IKPVA、AKF、IW、VAF、VSV、IQY 和IVY。

4.根据权利要求 1 所述的重组活性肽，其特征在于：所述活性肽单体部分肽段的 N末端为胃蛋白酶酶切位点；所述活性肽单体部分肽段的 C 末端为胃蛋白酶或胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶酶切位点；所述重组降血压肽和抗氧化肽中部分活性肽单体之间由带有胃蛋白酶或胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶酶切位点的连接片段串联而成。

5.一种重组降血压肽和抗氧化肽的制备方法，其特征在，于包括如下步骤：

（1）人工合成序列表 SEQ ID NO ：2 所示的基因；

（2）构建能高效表达与纯化重组降血压肽和抗氧化肽的表达载体；

（3）用所述表达载体转化宿主菌构建基因工程菌；

（4）利用所述工程菌表达重组活性肽；

（5）利用标签纯化及标签去除技术获取重组活性肽；

（6）采用胃蛋白酶和 / 或胰蛋白酶和 / 或胰凝乳蛋白酶酶解制得降血压肽和抗氧化肽。

6.根据权利要求 5 所述的重组降血压肽和抗氧化肽的制备方法，其特征在于：在步骤（3）中，所述表达载体为 pET28a，宿主菌为大肠杆菌 E.coli BL21(DE3)。

7.根据权利要求 6 所述的重组降血压肽和抗氧化肽的制备方法，其特征在于：在步骤(2)

中，采用DNA 重组技术，将序列表 SEQ ID NO ：2 所示的基因*** pET28a 的HindIII和XhoI 位点中，并分别在基因的上游的NcoI 和BamHI 位点以及BamHI 和HindIII 位点克隆入类弹性蛋白纯化标签 ELPs 基因和 SUMO 融合标签基因，获得重组表达载体 pET28a-ESA3。

8.根据权利要求 6 所述的重组降血压肽和抗氧化肽的制备方法，其特征在于：

在步骤 (3) 中，并转化E.coli BL21(DE3)，获得工程菌；

在步骤 (4) 中，利用 IPTG 诱导工程菌表达 ELPS-SUMO-A3，收集菌体，超声破碎细胞，收集超声上清或包涵体沉淀；

在步骤 (5) 中，对于可溶表达的如序列表 SEQ ID NO ：1 所示的目标蛋白直接进行标签技术纯化，而对包涵体表达的目标蛋白先进行变性与复性再进行标签技术纯化；通过ELPs 标签纯化技术纯化融合蛋白以及采用 SUMO 蛋白酶裂解及加盐离心去除二联体融合标签

ELPs-SUMO，获得重组活性肽；

在步骤 (6) 中，采用胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解重组活性肽，超滤得小肽混合体，再脱盐去杂，冷冻干燥样品，质检制得活性肽。

9.按照权利要求 1，3 任一项所述的重组活性肽在制备治疗高血压药中的应用。