CN104606394B - 一种祛黄褐斑的保健酒及其包含的中药组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及保健品领域，尤其涉及一种祛黄褐斑的保健酒及其包含的中药组合物。该去黄褐斑保健酒由中药组合物和白酒制得，其中中药组合物包括丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根和葡萄籽提取物。本发明还提供了该中药组合物及其制备方法。本发明通过比较不同拆方组的结果发现缺缺丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根、葡萄籽提取物对于抑制小鼠B‑16黑素瘤细胞活性、酪氨酸酶活性以及黑色素生成的作用依次减弱，且丹参、当归的添加与否对于结果具有显著影响。说明本发明提供的中药组合物和祛斑保健酒具有合理的配方，其中各组分缺一不可。饮用本发明提供的祛斑保健酒不仅不会加重黄褐斑，并且还会起到治疗和预防黄褐斑的作用。
Description
技术领域
本发明涉及保健品领域，尤其涉及一种祛黄褐斑的保健酒及其包含的中药组合物。
背景技术
黄褐斑俗称“蝴蝶斑”，“肝斑”或者“妊娠斑”，一种获得性色素沉着皮肤病，表现为色素对称性沉着，主要发生在面部，以颧部、颊部、鼻、前额、颏部为主，轻者为淡黄色或浅褐色；重者呈深褐色或浅黑色。多发于中青年女性，是临床上常见而又难以治愈的皮肤病之一。流行病学显示黄褐斑多发生于女性，而且随年龄增长，病情加重。并且大多数患者伴有不同程度的***、失眠、心烦易怒等内分泌及植物神经功能紊乱，给患者带来生活及精神方面诸多烦恼和痛苦。
中医学认为，黄褐斑的发生多由于肾阴不足，肾水不能上承，或肝郁气结、肝失条达，郁久化热，灼伤阴血，致使颜面气血失和而发病。临床上黄褐斑患者常出现***、腰膝酸软等肾阴不足之证，或表现出性格抑郁、情志不畅、急躁易怒等肝气不舒症状。而现代医学认为，黄褐斑主要是由于黑色素在皮肤内增多而引起，黑素细胞增多和黑色素生成增多是引起黑色素增多的两个主要因素。紫外线、内分泌、遗传、氧自由基、微生物等因素是引起黑色素增多的因素。另外，还有研究发现，黄褐斑的形成与下列因素有关：内分泌失调、妊娠***和孕激素水平、口服避孕药、子宫卵巢疾病、遗传因素、氧自由基、紫外线照射、血清铜含量、甲乙型肝炎、胆囊炎、酪氨酸功能障碍、化妆品、光毒性药物、抗癫痫药及情绪波动等。因此，从中医辨证论治的角度，大多是理气活血，疏肝解郁，调和心脾等整体辨证论治治疗本病，从现代医学治疗的角度，主要从抑制黑色素的生成酶即酪氨酸酶，调节体内雌孕激素水平，清除自由基和脂质过氧化物等方面治疗。
对黄褐斑的预防和治疗，医生建议要少饮或不饮酒，因为，酒精刺激可能会导致黄褐斑的产生或加重。然而亲朋团聚饮酒烘托气氛是中国传统酒文化的一部分。因此，如何能在健康饮酒的同时避免给黄褐斑患者带来不利影响，成为了目前的热点问题。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种祛黄褐斑的保健酒并提供了一种能够有效去除黄褐斑的中药组合物。
一种祛黄褐斑的保健酒，由中药组合物和白酒制得；
其中，中药组合物包括丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根和葡萄籽提取物。
在本发明的实施例中，丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根、葡萄籽提取物的质量比为(1～5)：(1～5)：(2～6)：(1～6)：(1～4)：(0.1～0.5)。
在一些实施例中，丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根、葡萄籽提取物的质量比为1：1：2：6：1：0.1。
在一些实施例中，丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根、葡萄籽提取物的质量比为5：5：6：6：4：0.5。
在一些实施例中，丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根、葡萄籽提取物的质量比为3：3：3：2：4：0.2。
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的根及根茎。性微寒，味苦。归心经、肝经。具有祛瘀止痛、活血痛经、清心除烦的功能。用治***、经闭痛经、癥瘕积聚、胸腹刺痛、热痹疼痛、疮疡肿毒、心烦不眠；肝脾肿大、心绞痛。
当归为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根。味甘、辛，性温。归肝、心、脾经。具有补血活血，调经止痛，润肠通便的作用。用于血虚萎黄，眩晕心悸，***，经闭痛经，虚寒腹痛，肠燥便秘，风湿痹痛，跌扑损伤，痈疽疮疡。酒当归活血通经。用于经闭痛经，风湿痹痛，跌打损伤。
玫瑰花为蔷薇科植物玫瑰Rosa rugosa Thunb.的干燥花蕾。味甘、微苦，性温。归肝、脾经。具有行气解郁，和血，止痛的作用。用于肝胃气痛，食少呕恶，***，跌扑伤痛。
枸杞子是茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的成熟果实。性平，味甘。归肝经、肾经。具有滋补肝肾、益精明目的作用。用治虚劳精亏、腰膝酸痛、眩晕耳鸣、内热消渴、血虚萎黄、目昏不明。
葛根是豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi的根。性凉，味甘、辛。归脾经、胃经。具有解肌退热、生津、透疹、升阳止泻的作用，用于伤寒、温热头痛项强、烦热消渴、泄泻、痢疾、癍疹不透、高血压、心绞痛、耳聋等。
葡萄籽是葡萄科植物葡萄Vitis vinifera L.的种子。葡萄籽提取物是从葡萄籽中提取活性物质，具有抗氧化、抗过敏、抗疲劳增强体质、改善亚健康状态延缓衰老、改善烦躁易怒、头昏乏力、记忆力减退的作用。
本发明采用的葡萄籽提取物可为自行制备，也可由市场购得，其实施皆在本发明的保护范围之内。
在本发明的实施例中，葡萄籽提取物的制备方法为：将葡萄籽粉碎，以乙醇回流提取后，经浓缩、干燥，得到葡萄籽提取物。
作为优选，葡萄籽的含水量不大于5％。
作为优选，乙醇的质量为葡萄籽的10倍。
作为优选，回流提取的温度为90℃～100℃，提取2次，每次2h。
作为优选，浓缩采用真空浓缩，浓缩至密度为1.2g/cm3～1.5g/cm3。
作为优选，干燥采用喷雾干燥，温度为170℃～180℃。
本发明实施例中采用的葡萄籽提取物中原花青素含量≥95％，水分含量≤5％，pH值为2.5～4.5，灰分≤0.5％，砷≤10mg/kg，铁≤3mg/kg。
本发明提供的保健酒以白酒浸泡中药组合物得到，在本发明的实施例中，白酒的质量为中药组合物质量的10倍～30倍。
在一些实施例中，白酒的质量为中药组合物质量的20倍。
在一些实施例中，白酒的酒精度不低于50％vol。
在另一些实施例中，白酒的酒精度为60％vol。
本发明提供的去黄褐斑保健酒的制备方法为以白酒浸泡丹参、当归、玫瑰花、枸杞子和葛根，然后加入葡萄籽提取物，制得去黄褐斑的保健酒；浸泡的温度为15℃～25℃，时间为7d～30d。
在一些实施例中，浸泡的温度为20℃，时间为15d。
本发明采用合理配伍的中药组合物，经白酒浸泡制得具有去除黄褐斑效果的保健酒。
该中药组合物包括：包括丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根和葡萄籽提取物。
在本发明的实施例中，丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根、葡萄籽提取物的质量比为(1～5)：(1～5)：(2～6)：(1～6)：(1～4)：(0.11～0.5)。
在一些实施例中，丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根、葡萄籽提取物的质量比为1：1：2：6：1：0.1。
在一些实施例中，丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根、葡萄籽提取物的质量比为5：5：6：6：4：0.5。
在一些实施例中，丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根、葡萄籽提取物的质量比为3：3：3：2：4：0.2。
本发明实施例中采用的葡萄籽提取物中原花青素含量≥95％。
本发明提供的中药组合物的制备方法，包括：将丹参、当归、玫瑰花、枸杞子和葛根以水回流提取，提取液经浓缩、干燥后与葡萄籽提取物混合，制得中药组合物。
在一些实施例中，水的质量为丹参、当归、玫瑰花、枸杞子和葛根质量之和的8倍～15倍。
作为优选，水的质量为丹参、当归、玫瑰花、枸杞子和葛根质量之和的10倍。
在一些实施例中，回流提取的温度为90℃～100℃，提取2次，每次2h。
在一些实施例中，浓缩采用真空浓缩，浓缩的温度为60℃。
在一些实施例中，浓缩至密度为1.2g/mL～1.5g/mL。
在一些实施例中，干燥采用喷雾干燥，温度为150℃～200℃。
黑色素是一种生物多聚体，广泛存在于人和动物的皮肤、毛发和眼睛中。黑色素的生成与酪氨酸酶密切相关，其主要发生在黑色素细胞中。黑色素的的形成过程大致如下：体内酪氨酸在酪氨酸酶催化下形成3,4-二羟基苯丙氨酸(即多巴)、多巴进一步氧化形成多巴醌、多巴醌经多聚合反应与氧化反应生成多巴色素、多巴色素又经一系列羟化反应、脱羧反应、氧化反应形成5，6-吲哚醌，再与其他中间产物结合形成黑色素。因此，黄褐斑的形成与黑色素细胞活性以及体内存在的酪氨酸酶活性密切相关，鉴于此，本发明在相关的药效实验过程中选择了检测小鼠B-16黑素瘤细胞活性、酪氨酸酶活性以及黑色素生成量来探讨本专利发明组合物对于黄褐斑的祛除效果。
本发明通过比较不同拆方组的结果发现缺丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根、葡萄籽提取物对于抑制小鼠B-16黑素瘤细胞活性、酪氨酸酶活性以及黑色素生成的作用依次减弱，且丹参、当归的添加与否对于结果具有显著影响。说明，本发明提供的中药组合物具有合理的配方，其中各组分缺一不可。
本发明提供的中药组合物在制备祛除黄褐斑的产品中的应用。
实验结果表明：1)本发明提供的去黄褐斑保健酒在极低浓度时，可刺激B16细胞的增殖；但当其浓度介于75μg/ml-300μg/ml时，随浓度增高，抑制作用增强；当其浓度大于350μg/ml时，对B-16黑色素瘤细胞增殖的抑制作用趋于平衡，不再增强；(2)本发明提供中药组合物在极低浓度时，对酪氨酸酶活性有一定促进作用，但当其浓度介于100μg/ml-350μg/ml时，随浓度增高，抑制作用增强；当本发明组合物浓度大于350μg/ml时，对酪氨酸酶活性抑制作用趋于平衡，不再增强；(3)本发明提供中药组合物在极低浓度时，对黑色素生成有一定促进作用，但当其浓度介于50μg/ml-100μg/ml时，随浓度增高，抑制作用增强；当本发明组合物浓度大于100μg/ml时，对黑色素生成抑制作用趋于平衡，不再增强。
在本发明的实施例中，祛黄褐斑的产品为口服产品。
作为优选，口服产品的剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、饮液或颗粒剂。
本发明还提供了一种祛除黄褐斑的产品，包括本发明提供的中药组合物。
作为优选，祛黄褐斑的产品为保健品、食品或药物。
作为优选，祛除黄褐斑的药物包括本发明提供的中药组合物及药学上可接受的辅料。
优选的，药学上可接受的辅料为：稀释剂、吸收剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、包衣材料或胶囊材料中任一种或两者以上的组合。
作为优选，祛除黄褐斑的保健品包括本发明提供的中药组合物及保健品中可接受的辅料。
优选的，保健品中可接受的辅料为：微晶纤维素、二氧化硅、预胶化淀粉、硬脂酸镁、交联羧甲基纤维素钠、甲基硅油、乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、甜菊糖苷、玉米淀粉、小麦淀粉、稻米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、聚乙烯吡咯烷酮或磷酸钙中任一种或两者以上的组合。
作为优选，祛除黄褐斑的食品包括本发明提供的中药组合物及食品中可接受的原料和辅料。
优选的，辅料为柠檬酸、苹果酸、山梨酸钾、马铃薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、微晶纤维素、乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇、甜菊糖甙、羟丙纤维素、羧甲基纤维素钠、明胶、大豆油、黄芪胶、氯化钠、氯化钾或磷酸钙。
优选的，原料为白酒、葡萄酒、蜂蜜、蜂王浆或蜂胶。
本发明提供了一种由中药组合物和白酒制得的祛黄褐斑的保健酒，其中中药组合物包括丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根和葡萄籽提取物。本发明还提供了该中药组合物及其制备方法。本发明通过比较不同拆方组的结果发现缺缺丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根、葡萄籽提取物对于抑制小鼠B-16黑素瘤细胞活性、酪氨酸酶活性以及黑色素生成的作用依次减弱，且丹参、当归的添加与否对于结果具有显著影响。说明本发明提供的中药组合物和祛斑保健酒具有合理的配方，其中各组分缺一不可。饮用本发明提供的祛斑保健酒不仅不会加重黄褐斑，并且还会起到治疗和预防黄褐斑的作用。
具体实施方式
本发明提供了一种祛黄褐斑的保健酒并提供了一种能够有效祛除黄褐斑的中药组合物，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的原料皆为普通市售品，皆可由市场购得。
其中，小鼠B-16黑素瘤细胞株，由华神集团提供；
酶标仪：Bio-Rad，Model 550；
离心机：LDZ5-2，北京医用离心机厂；
倒置显微镜：Nikon DEAPHOT Fx-35DX；
二氧化碳细胞培养箱：BNA-311，ESPEC；
精密电子天平(精密度0.01g)：EB-3200D，日本岛津；
电子天平(精密度0.001g)：JA1003A，上海精天电子仪器有限公司；
离心沉淀器：80-2，上海手术器械厂；
连续定量可调移动移液枪：10ul-100ul、20ul-200ul、100-1000ul、1-5ml，芬兰雷勃Finnpipette；
石英紫外线杀菌灯：扬州通达卫生器械有限公司；
智能立式不锈钢灭菌器：LDZM-40KCS，上海申安医疗器械有限公司；
SOD试剂：南京建成生物工程研究所提供，批号20031225；
MDA试剂：南京建成生物工程研究所提供，批号20031226；
硫化钠：500g/瓶，化学纯，成者化学试剂厂，批号980923；
生理盐水：0.9％氯化钠注射液，500ml：4.5g。国药准字H51021158，四川科伦大药厂有限责任公司，批号20030921-18；
RPMI-1640：GIBCO公司；
胎牛血清、胎牛血清：HyClone公司；
L多巴：美国Slpa公司产品，批号D9628；
胰蛋白酶：上海华美生物公司产品，批号2186；
MTT，SDS，ConA，琼脂：Sigma公司；
另有谷氨酰胺，青霉素，庆大霉素，Tris Base及其它国产分析纯试剂。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1祛黄褐斑保健酒的制备
将丹参10g、当归10g、玫瑰花20g、枸杞子60g、葛根10g清洗后，以1.1L酒精度为60％vol的白酒浸泡，温度为20℃，浸泡15天后，加入葡萄籽提取物1g。
实施例2祛黄褐斑保健酒的制备
将丹参50g、当归50g、玫瑰花60g、枸杞子60g、葛根40g清洗后，以5.2L酒精度为55％vol的白酒浸泡，温度为25℃，浸泡7天后，加入葡萄籽提取物5g。
实施例3祛黄褐斑保健酒的制备
将丹参30g、当归30g、玫瑰花30g、枸杞子20g、葛根40g清洗后，以3.6L酒精度为50％vol的白酒浸泡，温度为15℃，浸泡30天后，加入葡萄籽提取物2g。
对比例1拆方保健酒的制备
将当归30g、玫瑰花30g、枸杞子20g、葛根40g清洗后，以2.4L酒精度为60％vol的白酒浸泡，温度为20℃，浸泡15天后，加入葡萄籽提取物2g。
对比例2拆方保健酒的制备
将丹参30g、玫瑰花30g、枸杞子20g、葛根40g清洗后，以2.4L酒精度为60％vol的白酒浸泡，温度为20℃，浸泡15天后，加入葡萄籽提取物2g。
对比例3拆方保健酒的制备
将丹参30g、当归30g、枸杞子20g、葛根40g清洗后，以2.4L酒精度为60％vol的白酒浸泡，温度为20℃，浸泡15天后，加入葡萄籽提取物2g。
对比例4拆方保健酒的制备
将丹参30g、当归30g、玫瑰花30g、葛根40g清洗后，以2.8L酒精度为60％vol的白酒浸泡，温度为20℃，浸泡15天后，加入葡萄籽提取物2g。
对比例5拆方保健酒的制备
将丹参30g、当归30g、玫瑰花30g、枸杞子20g、葛根40g清洗后，以2.2L酒精度为60％vol的白酒浸泡，温度为20℃，浸泡15天后，加入葡萄籽提取物2g。
对比例6拆方保健酒的制备
将丹参30g、当归30g、玫瑰花30g、枸杞子20g、葛根40g清洗后，以2.4L酒精度为60％vol的白酒浸泡，温度为20℃，浸泡15天。
对比例7拆方保健酒的制备
将玫瑰花30g、枸杞子20g、葛根40g清洗后，以1.8L酒精度为60％vol的白酒浸泡，温度为20℃，浸泡15天后，加入葡萄籽提取物2g。
对比例8拆方保健酒的制备
将丹参30g、当归30g清洗后，以0.6L酒精度为60％vol的白酒浸泡，温度为20℃，浸泡15天后，加入葡萄籽提取物2g。
实施例4祛黄褐斑的中药组合物制备
将丹参10g、当归10g、玫瑰花20g、枸杞子10g、葛根10g清洗后，以600g饮用水，90℃回流提取2次，每次2h，然后60℃真空浓缩至密度为1.2gmL，150℃喷雾干燥后，加入葡萄籽提取物2g。
实施例5祛黄褐斑的中药组合物制备
将丹参50g、当归50g、玫瑰花60g、枸杞子60g、葛根40g清洗后，以2600g饮用水，100℃回流提取2次，每次2h，然后60℃真空浓缩至密度为1.3g/mL，200℃喷雾干燥后，加入葡萄籽提取物5g。
实施例6祛黄褐斑的中药组合物制备
将丹参20g、当归20g、玫瑰花30g、枸杞子30g、葛根20g清洗后，以1200g饮用水，95℃回流提取2次，每次2h，然后60℃真空浓缩至密度为1.3g mL，180℃喷雾干燥后，加入葡萄籽提取物1g。
对比例9拆方中药组合物的制备
将当归30g、玫瑰花30g、枸杞子20g、葛根40g清洗后，以1200g饮用水，95℃回流提取2次，每次2h，然后60℃真空浓缩至密度为1.3g/mL，180℃喷雾干燥后，加入葡萄籽提取物1g。
对比例10拆方中药组合物的制备
将丹参30g、玫瑰花30g、枸杞子20g、葛根40g清洗后，以1200g饮用水，95℃回流提取2次，每次2h，然后60℃真空浓缩至密度为1.3g/mL，180℃喷雾干燥后，加入葡萄籽提取物1g。
对比例11拆方中药组合物的制备
将丹参30g、当归30g、枸杞子20g、葛根40g清洗后，以1200g饮用水，95℃回流提取2次，每次2h，然后60℃真空浓缩至密度为1.3g/mL，180℃喷雾干燥后，加入葡萄籽提取物1g。
对比例12拆方中药组合物的制备
将丹参30g、当归30g、玫瑰花30g、葛根40g清洗后，以1300g饮用水，95℃回流提取2次，每次2h，然后60℃真空浓缩至密度为1.3g/mL，180℃喷雾干燥后，加入葡萄籽提取物1g。
对比例13拆方中药组合物的制备
将丹参30g、当归30g、玫瑰花30g、枸杞子20g、葛根40g清洗后，以1500g饮用水，95℃回流提取2次，每次2h，然后60℃真空浓缩至密度为1.3g/mL 180℃喷雾干燥后，加入葡萄籽提取物1g。
对比例14拆方中药组合物的制备
将丹参30g、当归30g、玫瑰花30g、枸杞子20g、葛根40g清洗后，1200g饮用水，95℃回流提取2次，每次2h，然后60℃真空浓缩至密度为1.3g/mL，180℃喷雾干燥。
对比例15拆方中药组合物的制备
将玫瑰花30g、枸杞子20g、葛根40g清洗后，以900g饮用水，95℃回流提取2次，每次2h，然后60℃真空浓缩至密度为1.3g/mL，180℃喷雾干燥后，加入葡萄籽提取物1g。
对比例16拆方中药组合物的制备
将丹参30g、当归30g清洗后，以600g饮用水，95℃回流提取2次，每次2h，然后60℃真空浓缩至密度为1.3g/mL，180℃喷雾干燥后，加入葡萄籽提取物1g。
实施例7祛黄褐斑保健品的制备
取实施例4～6任一项制备的中药组合物，与辅料混合，制粒，获得祛黄褐斑的保健品。
实施例8祛黄褐斑药物的制备
取实施例4～6任一项制备的中药组合物，与微晶纤维素混合，制粒，获得祛黄褐斑的药物。
实施例9祛黄褐斑食品的制备
取实施例4～6任一项制备的中药组合物，与蜂蜜混合，获得祛黄褐斑的食品。
实施例10对B16细胞增殖抑制作用
取本发明实施例1～6和对比例1～8制得产品检测对B16细胞增殖的抑制作用，实验设不添加中药组合物的空白对照。实验方法为：
1.1培养液配制
(1)RPMI-1640培养液(1000ml)：将RPMI-1640干粉溶于300ml三蒸水中，用水洗包装袋2次，倒入合并、搅拌，加三蒸水至近1000ml处：加NaHCO32g，补充谷氨酰胺至终浓度为3mmol/L，加入酚红(终浓度为5.3mg/L)；加入抗生素a青霉素(100U/ml)、b庆大霉素(50U/ml)；定容至1000ml；以NaOH或HCl调节PH至7.2。过滤除菌，4℃保存。吸取配制好的RPMI-1640培养液2ml入25ml的玻璃细胞培养瓶中，在37℃、5％CO2和完全湿度条件下培养过夜，倒置显微镜下观察有否染菌。未染菌的培养液方可进行实验。
(2)10％小牛血清的RMPI-1640培养液(100ml)：取配好的RPMI-1640培养液90ml，加入10ml小牛血清，以NaOH或HCl调节PH至7.2。过滤除菌，4℃保存。吸取配制好的含10％小牛血清的RPMI-1640培养液2ml入25ml的玻璃细胞培养瓶中，在37℃、5％CO2和完全湿度条件下培养过夜，倒置显微镜下观察有否染菌。未染菌的培养液方可进行实验。
(3)10％胎牛血清的RMPI-1640培养液(100ml)：取配好的RPMI-1640培养液80ml，加入10ml胎牛血清和10mlHeper’s(终浓度为5mmol/L)；加入2-巯基乙醇(2-Me)至终浓度为50μmol/L以NaOH或HCI调节PH至7.2。过滤除菌，4℃保存。吸取配制好的含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液2ml入25ml的玻璃细胞培养瓶中，在37℃、5％CO2和完全湿度条件下培养过夜，倒置显微镜下观察是否染菌。未染菌的培养液方可进行实验。
1.2消化液配制
(1)母液配制：用无钙镁Hanks液配制0.25％的胰蛋白酶溶液。过滤除菌，4℃保存。用PBS配制0.04％的EDTA，高压灭菌，4℃保存。
(2)应用液配制：取0.4ml 0.04％的EDTA，0.4ml 0.25％胰蛋白酶，加入无菌PBS到2ml，4℃保存。
1.3无机盐缓冲液配制
(1)PBS溶液(1000ml)：8g NaCl(137mmol/L)，0.2g KCl(2.7mmol/L)，1.15gNa2HPO4·7H2O(4.3mmol/L)，0.2g KH2PO4(1.4mmol/L)溶于1L双蒸水中，调节PH到7.2。高压灭菌，4℃保存。
(2)0.83％Tris-NH4Cl溶液(500ml)：3.0275g Tris(0.05mol/L)溶于250ml双蒸水中；4.15g NH4Cl(0.83％)溶于250ml双蒸水中。两种溶液混合，加双蒸水中定容至500ml。高压灭菌，4℃保存。
1.4观察中药组合物对B16细胞增殖抑制作用
取对数生长期的B16细胞，0.25％胰蛋白酶消化，RMPI-1640培养液收集消化后细胞，1000rpm离心3-5min。弃去上层清液。以10％小牛血清的RMPI-1640培养液吹散细胞，将其稀释为5×104个/ml。取0.1ml细胞悬液加入96孔细胞培养板，放在37℃、5％CO2二氧化碳培养箱中培养。
将实施例1～3和对比例1～8提供的祛黄褐斑保健酒，121℃灭菌20min，用10％小牛血清的RMPI-1640培养液稀释为终浓度：0、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、800、1200、1600μg/ml(共14个梯度，加入贴壁生长4h的细胞培养体系中，每孔终体积为200μL，每个浓度设4个复孔，取平均值。实验设空白对照，空白对照组不添加保健酒。
在37℃、5％CO2二氧化碳培养箱中培养72小时。于细胞培养结束前5小时每孔弃去培养上清100μl，加入浓度为5mg/ml的MTT10μl(用生理盐水配制，过滤除菌)。培养结束后，每孔加10％SDS(用0.01M的HCl配置)100μl振荡混匀，37℃下4小时，用酶标仪在570nm处读取0D值。统计软件采用DPS 7.05版，处理间比较采用单因素分析，多重比较采用LSD法。
其中，实施例1提供的祛斑保健酒对B16细胞增殖的抑制作用如表1所示：
表1实施例1药物组合物(不同含量组)体外抑制B-16增殖的影响(n-4，x±S)
| 浓度(μg/ml) | OD值 | 浓度(μg/ml) | OD值 |
| 0 | 0.576±0.010a | 250 | 0.571±0.005a |
| 25 | 0.581±0.013a | 300 | 0.502±0.012c |
| 50 | 0.588±0.018a | 350 | 0.504±0.011c |
| 75 | 0.595±0.008b | 400 | 0.506±0.017c |
| 100 | 0.587±0.011a | 800 | 0.506±0.009c |
| 150 | 0.579±0.015a | 1200 | 0.504±0.011c |
| 200 | 0.575±0.009a | 1600 | 0.504±0.020c |
注：a、b、c表示同一列中不同组别之间存在显著性差异(P<0.05)
由表1可见，用MTT法测定本发明保健酒对B-16黑色素瘤细胞增殖的影响，与空白对照相比有明显的抑制作用。在极低浓渡时，本发明保健酒可刺激B16细胞的增殖；但当其浓度大于75μg/ml时，随浓度增高，则呈现出抑制作用，最佳抑制浓度为300μg/ml，当本发明保健酒浓度大于300μg/ml时，对B-16黑色素瘤细胞增殖的抑制作用不会再随着浓度增大而增加，其抑制效果达到最大。本发明实施例2～3制得祛斑保健酒及实施例4～6制得的中药组合物的检测结果与此相似。
其中，固定浓度为300μg/ml，比较实施例1提供的中药组合物和对比例1～8提供的中药组合物对B16细胞增殖的抑制作用如表2所示：
表2实施例1及对比例1～8抑制B-16增殖的影响(n-4，x±S)
注：a、b、c表示同一行中不同组别之间存在显著性差异(P<0.05)
由表2可见，用MTT法测定本发明药物组合物(不同拆方组)对B-16黑色素瘤细胞增殖的影响，与空白组相比，其他组别均有一定的抑制作用，而与对照组相比，所有的拆方组抑制作用均明显降低，另外，比较不同拆方组的结果发现缺丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根、葡萄籽提取物对于结果的影响依次减弱，且丹参、当归对于结果具有显著影响。
本发明提供中药组合物和祛斑保健酒在极低浓度时，可刺激B16细胞的增殖；但当其浓度介于75μg/ml～300μg/ml时，随浓度增高，抑制作用增强；当本发明组合物浓度大于350μg/ml时，对B-16黑色素瘤细胞增殖的抑制作用趋于平衡，不再增强。
实施例11对酪氨酸酶活性的影响
取本发明实施例1～6和对比例1～8制得产品检测对酪氨酸酶活性的的抑制作用，实验设不添加中药组合物的空白对照。培养液、消化液、无机盐缓冲液的配制方法与实施例9相同，实验方法为：
取对数生长期的B16细胞，0.25％胰蛋白酶消化，RMPI-1640培养液收集消化后细胞，1000rpm离心3-5min。弃去上层清液。以10％小牛血清的RMPI-1640培养液吹散细胞，将其稀释为8×104个/ml。取0.1ml细胞悬液加入96孔细胞培养板。放在37℃、5％CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养。
将实施例1～6和对比例1～8提供的祛黄褐斑保健酒，121℃灭菌20min，用10％小牛血清的RMPI-1640培养液稀释为终浓度：0、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、800、1200、1600μg/ml(共14个梯度)加入贴壁生长4h的细胞培养体系中，每孔终体积为200μL，每个浓度设4个复孔。在37℃、5％CO2二氧化碳培养箱中培养48小时。弃去上层清液，用PH7.4的PBS洗涤细胞2次，每孔加入50μl、1％TritonX-100。将96孔细胞培养板迅速放入-30℃冰箱，30min后取出，室温下自然解冻从而破坏细胞。37℃预温后加入1％L-多巴溶液(10μl/孔)，37℃反应2h，用酶标仪在490nm处读取0D值。统计软件采用DPS 7.05版，处理间比较采用单因素分析，多重比较采用LSD法。
其中，实施例1提供的中药组合物对酪氨酸酶活性的抑制作用如表3所示：
表3本发明药物组合物对酪氨酸酶活性影响(n-4，x±S)
| 浓度(ug/ml) | OD值 | 浓度(ug/ml) | OD值 |
| 0 | 0.395±0.011a | 150 | 0.336±0.005c |
| 25 | 0.450±0.017b | 200 | 0.327±0.017c |
| 50 | 0.439±0.002b | 250 | 0.315±0.013c |
| 75 | 0.419±0.009b | 300 | 0.303±0.005c |
| 100 | 0.305±0.017c | 350 | 0.298±0.008c |
注：a、b、c表示同一列中不同组别之间存在显著性差异(P<0.05)
由表3所示，小鼠B-16黑色素瘤细胞在经本发明药物组合物作用48小时后，低浓度本发明药物组合物(＜100μg/ml)对酪氨酸酶活性有一定促进作用，但随浓度增高，则对酪氨酸酶活性有明显的抑制作用。本发明药物组合物浓度在100-350μg/ml的范围内，能有效抑制B-16黑色素瘤细胞株的酪氨酸酶活性。本发明实施例2～3制得的祛黄褐斑保健酒和实施例4～6制得的中药组合物的检测结果与此相似。
其中，固定浓度为350μg/ml，比较实施例1提供的中药组合物和对比例1～8提供的中药组合物对酪氨酸酶活性的抑制作用如表4所示：
表4本发明药物组合物(不同拆方组)对酪氨酸酶活性影响(n-4，x±S)
注：a、b、c表示同一行中不同组别之间存在显著性差异(P<0.05)
由表3可见，小鼠B-16黑色素瘤细胞在经本发明药物组合物作用48小时后，与空白组相比，其他组别均有一定的抑制作用，而与对照组相比，所有的拆方组抑制作用均明显降低，另外，比较不同拆方组的结果发现缺丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根、葡萄籽提取物对于结果的影响依次减弱，且丹参、当归对于结果具有显著影响。
本发明提供中药组合物和祛斑保健酒在极低浓度时，对酪氨酸酶活性有一定促进作用，但当其浓度介于100μg/ml-350μg/ml时，随浓度增高，抑制作用增强；当本发明组合物浓度大于350μg/ml时，对酪氨酸酶活性抑制作用趋于平衡，不再增强；
实施例12中药组合物对黑色素生成的影响
取本发明实施例4～6和对比例9～16制得产品检测对黑色素生成的抑制作用，实验设不添加中药组合物的空白对照。培养液、消化液、无机盐缓冲液的配制方法与实施例9相同，实验方法为：
取对数生长期的B16细胞，0.25％胰蛋白酶消化，RMPI-1640培养液收集消化后细胞，1000rpm离心3-5min。弃去上层清液。以10％小牛血清的RMPI-1640培养液吹散细胞，将其稀释为1×105个/ml。取1ml细胞悬液加入24孔细胞培养板。在37℃、5％CO2二氧化碳培养箱中培养。
将实施例4～6和对比例9～16提供的中药组合物用生理盐水配置成2000μg/ml的母液，121℃灭菌20min。将2000μg/ml的中药组合物母液用10％小牛血清的RMPI-1640培养液稀释为终浓度0-400μg/ml(共6个梯度，分别为：0、50、100、200、300、400μg/ml)加入贴壁生长4小时的细胞培养体系中，每孔终体积为200μL，每个浓度设4个复孔，在37℃、5％CO2二氧化碳培养箱中培养96小时。0.25％胰蛋白酶消化细胞，每孔取1×105个细胞离心弃去上层清液，加入1ml 1mol/L的NaOH，震荡5分钟。置酶标仪测A值，波长为490nm。其中，实施例4提供的中药组合物对黑色素生成的抑制作用如表5所示：
表5本发明药物组合物对黑色素生成的影响(n-4，x±S)
| 浓度(μg/ml) | OD值 | 浓度(μg/ml) | OD值 |
| 0 | 0.275±0.012a | 200 | 0.181±0.005c |
| 50 | 0.326±0.006b | 300 | 0.214±0.007c |
| 100 | 0.208±0.008c | 400 | 0.215±0.015c |
注：a、b、c表示同一列中不同组别之间存在显著性差异(P<0.05)
由表5可见，本发明药物组合物对小鼠B-16黑色素瘤细胞作用4d后，测定黑色素含量，在50μg/ml以下，随药物浓度增加，黑色素含量不断增加；大于50μg/ml浓度时，随浓渡增高，本发明药物组合物可明显抑制黑色素的生成，当本发明药物组合物浓度为200μg/ml时，其对黑色素生成的抑制达到最大；在100-400μg/ml之间，对黑色素的抑制趋于平稳说明在较高浓度时，本发明药物组合物对黑色素合成有明显抑制作用。本发明实施例1～3制得的去黄褐斑保健酒和实施例5～6制得的中药组合物的检测结果与此相似。
其中，固定浓度为200μg/ml，比较实施例4提供的中药组合物和对比例9～16提供的中药组合物对黑色素生成的抑制作用如表6所示：
表6本发明药物组合物(不同拆方组)对黑色素生成的影响(n-4，x±S)
注：a、b、c表示同一行中不同组别之间存在显著性差异(P<0.05)
由表6可见，本发明药物组合物对小鼠B-16黑色素瘤细胞作用4d后，测定黑色素含量，与空白组相比，其他组别均有一定的抑制作用，而与对照组相比，所有的拆方组抑制作用均明显降低，另外，比较不同拆方组的结果发现缺丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根、葡萄籽提取物对于结果的影响依次减弱，且丹参、当归对于结果具有显著影响。
本发明提供中药组合物和祛斑保健酒在极低浓度时，对黑色素生成有一定促进作用，但当其浓度介于50μg/ml-200μg/ml时，随浓度增高，抑制作用增强；当本发明组合物浓度大于200μg/ml时，对黑色素生成抑制作用趋于平衡，不再增强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种祛黄褐斑的保健酒，其特征在于，由中药组合物和白酒制得；
所述中药组合物由丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根和葡萄籽提取物组成；所述丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根、葡萄籽提取物的质量比为（1~5）：（1~5）：（2~6）：（1~6）：（1~4）：（0.1~0.5）。
2.根据权利要求1所述的保健酒，其特征在于，所述白酒的质量为中药组合物质量的10倍~30倍。
3.如权利要求1~2任一项所述保健酒的制备方法，其特征在于，以白酒浸泡丹参、当归、玫瑰花、枸杞子和葛根，然后加入葡萄籽提取物，制得去黄褐斑的保健酒；所述浸泡的温度为15℃~25℃，时间为7d~30d。
4.一种祛除黄褐斑的中药组合物，其特征在于，由以下原料制得：丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根和葡萄籽提取物；所述丹参、当归、玫瑰花、枸杞子、葛根、葡萄籽提取物的质量比为（1~5）：（1~5）：（2~6）：（1~6）：（1~4）：（0.1~0.5）。
5.根据权利要求4所述的中药组合物，其特征在于，所述葡萄籽提取物中原花青素的含量不低于95%。
6.如权利要求4~5任一项所述的中药组合物的制备方法，其特征在于，将丹参、当归、玫瑰花、枸杞子和葛根以水回流提取，提取液经浓缩、干燥后与葡萄籽提取物混合，制得中药组合物。
7.如权利要求4~5任一项所述的中药组合物在制备祛除黄褐斑的产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品为口服产品。
9.一种祛除黄褐斑的产品，其特征在于，包括如权利要求1~2任一项所述的中药组合物。
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