CN104704121A - 含有1q25.1(RABGAP1L)位置、6P21.32(C4)位置及10q21.3位置DNA拷贝数变异检测用引物的全身性红斑狼疮发病危险度预测用组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种全身性红斑狼疮发病危险度预测用组合物。具体讲，就是涉及一种当C4区域， 1q25.1区域与10q21.3区域发生DNA拷贝数发生变异时就表现出全身性红斑狼疮发病高危险群特征的组合物。本发明的组合物可以利用C4位置、1q25.1位置及10q21.3位置的拷贝数变异与全身性红斑狼疮发病具有协同效应这一特征预测发病风险，同时采用大部分医院化验室普遍正在实施的PCR，由此可以减少新设备的购置或因技术局限可能产生的分析误差，是一种临床上比较受欢迎的方式。另外，本发明还具有可采用非侵袭的方式对检查对象实施检查的优点。最终，本发明将有望对早期预测全身性红斑狼疮发病可能性以预防状态恶化或延缓发病而发挥重要的作用。

Description

含有1q25.1(RABGAP1L)位置、6P21.32(C4)位置及10q21.3位置DNA拷贝数变异检测用引物的全身性红斑狼疮发病危险度预测用组合物
技术领域
本发明涉及一种全身性红斑狼疮发病危险度预测用组合物。具体讲，就是涉及一种当1q25.1(RABGAP1L)区域、6p21.32(C4)区域及10q21.3位置发生DNA拷贝数变异时就表现出全身性红斑狼疮发病高危险群特征的组合物。
背景技术
全身性红斑狼疮(SLE)作为一种会同时对多个脏器产生影响的慢性自身免疫疾病，主要发病于处于育龄阶段的年轻女性。在SLE患者中，由于非正常免疫反应导致产生病态的自身抗体，免疫复合物累积在多种脏器上而诱发炎症及脏器损伤。虽然目前还没有搞清楚SLE的发病机理，但是从单卵性双胞胎比二卵性双胞胎同时发病的风险更高以及与家族史密切相关这两点来推断，遗传因素是很重要的原因。
SLE作为一种慢性疾病，其症状好转后又恶化，病情反反复复。SLE患者的血液很容易凝固并形成血栓，即使是年轻人也可能诱发冠状动脉疾病，由此很可能导致心绞痛或心肌梗塞，如果正处于妊娠中则存在导致胎儿死产的风险。同时，还难以抵抗流行性感冒与肺炎链球菌等呼吸器官感染致病菌的侵袭。因此，重要的是，事先预测SLE的发病风险并对其进行预防或延缓发病，并在发病之后通过恰当的治疗减轻症状，以防止肾脏、肺、心脏等主要脏器受到损伤。SLE并发症可以通过针对流行性感冒与肺炎链球菌实施预防接种，调节与高血压、血糖、脂质代谢紊乱等动脉硬化相关的因素进行预防。
最近，有报告指出，通过全基因组遗传相关性研究(genome-wise associationstudies(GWAS))发现HLA，IRF5，STAT4，TNFAIP3，PTPN22，BLK，BANK1，TNFSF4，ITGAM，KIAA1542，PXK等候选基因表达的多个SNP与许多民族的SLE发病风险相关。除了SNP之外，DNA拷贝数变异(DNA copy numbervariations，CNVs)也会导致遗传混乱，并引发基因重组现象，对蛋白表达产生影响，从而干预SLE发病。通过一个实例表明，C4与FCGR3B中的CNV提高了白人中的SLE发病风险，但是，目前在其它民族中开展的与此相关的研究却几乎没有。
基于这一背景，本发明人针对能够早期诊断SLE发病风险性的新型标记开展了研究，结果表明，如果染色体的1q25.1及10q21.3座位(locus)上存在缺失突变体(deletion variant)，SLE发病风险就会显著提高，由此完成了本发明。
发明内容
技术问题
本发明就是在上述背景下研发的。本发明的目的在于，提供一种含有1q25.1位置、6p21.32(C4)位置及10q21.3位置DNA拷贝数变异检测用引物的全身性红斑狼疮发病危险度预测用组合物及试剂盒。
但是，本发明所要实现的技术课题并非仅限于以上提到的内容，关于未提到的其它课题，通过以下的阐述就会让本行业的相关人员有更加深入的了解。
技术方案
本发明提供了一种全身性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus)发病预测用组合物，其含有检体染色体上C4位置、1q25.1位置及/或10q21.3位置的DNA拷贝数变异(DNA copy number variation)检测用引物(primer)。
DNA拷贝数变异的范围既包括缺失型(deletion-type)(0或1拷贝)也包括获得型(gain-type)(>2copy)，但并非仅限定于此。
处于1q25.1位置的RABGAP1L(RAB GTPase activating protein 1-like)基因对GTP酶激活蛋白(GPTase-activating protein)进行编码，该蛋白质带有磷酸酪氨酸(phosphotyrosine)结合域，虽然普遍认为它是在信号传递过程中发挥作用的酪氨酸激酶(tyrosine-kinase)，但是对于具体的生物学作用或是否与病因论相关却没有明确阐述。
本发明人在研究过程中发现了处于RABGAP1L基因intron 20位置的5.2Kb大小缺失型CNVR，并发现该CNVR可通过选择性剪接(alternative splicing)或翻译后修饰(posttranslational modification)对该基因的表达产生影响，查明了在10q21.3位置有8.3Kb大小的缺失型CNVR，虽然不存在对10q21.3区域编码的基因，但是在多数GWAS研究中发现非翻译部位也与多种表现型相关。另外，有报告指出CD34+细胞的核酸酶的结合位点(nuclease accessible site，NAS)与10q21.3位置相关。NAS作为转录因子结合位点发挥作用并与造血干细胞分化有关联。因此，该位置的缺失牵涉到CD34+细胞的骨髓分化与SLE发病风险。
作为在GWAS发现阶段与SLE相关的现有已揭示的CNV中，C4的CNV在本发明中也表现出有意义的相关关系。
另外，虽然本发明是以韩国女性为对象完成的，但是这种拷贝数变异的发生很可能与民族无关地发生的可能性高。例如：Yang et al.在其论文中指出，就西方人而言，如果C4的拷贝数较小则SLE发病风险就较高。相反，如果其拷贝数较大则SLE发病风险就较低。以汉族的中国人为对象进行研究也得出了相同的结论。不过，这一结论在本发明的实验中也得到了验证。具体讲，如果C4的拷贝数较高则发病风险低(OR＝0.40，95％CI＝0.16-1.03，P＝0.057)。因此，检体并非仅限定于韩国女性，任何民族都适用。
另外，检体的染色体可从源于口腔上皮、头发等的检体细胞中获得，细胞的来源并非仅限定于此。
作为本发明的一个实现例，所述1q25.1位置DNA拷贝数变异(DNA copynumber variation)检测用引物(primer)的特征在于，它是包含序列号1及2的DNA序列的基因组的定量(genomic quantitative)PCR用引物对(set)。
作为本发明的另一个实现例，所述10q21.3位置DNA拷贝数变异(DNA copynumber variation)检测用引物(primer)的特征在于，它是包含序列号3及4的DNA序列的基因组的定量PCR用引物对。
作为本发明的另一个实现例，所述1q25.1位置DNA拷贝数变异(DNA copynumber variation)检测用引物(primer)的特征在于，它是包含从由序列号5至8构成的组中选择的DNA序列的缺失型PCR用引物。
作为本发明的另一个实现例，所述10q21.3位置DNA拷贝数变异(DNA copynumber variation)检测用引物(primer)的特征在于，它是包含从由序列号9至12构成的组中选择的DNA序列的缺失型PCR用引物。
另外，本发明提供了一种全身性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus)发病危险度预测用试剂盒。所述试剂盒的特征在于，含有检体染色体上C4位置、1q25.1位置及/或10q21.3位置的DNA拷贝数变异(DNA copy number variation)检测用引物(primer)。本发明用到的术语“试剂盒”是指由生物标志物及进行各种预处理所需的物质及分析所需的物质等构成可以进行普遍使用的成套产品。
作为本发明的一个实现例，所述试剂盒的特征在于，它包括含有从由序列号1至12构成的组中选择的DNA序列的引物。
本发明提供了一种获取用于预测全身性红斑狼疮发病危险度信息的方法，包括以下几个步骤：A)将检体染色体上6p21.32(C4)位置、1q25.1位置及/或10q21.3位置的DNA拷贝数变异(DNA copy number variation)检测用引物(primer)添加到检体DNA样本中实施PCR的步骤；B)通过所述实施PCR步骤获得的结果测定检体中是否带有C4位置、1q25.1位置及/或10q21.3位置的拷贝数变异(DNA copynumber variation)的步骤。
作为本发明的一个实现例，所述A)步骤中1q25.1位置及/或10q21.3位置的DNA拷贝数变异(DNA copy number variation)检测用引物(primer)的特征在于，它是包含从由序列号1至4构成的组中选择的DNA序列的基因组的定量PCR用引物。
作为本发明的另一个实现例，所述A)步骤中1q25.1位置及/或10q21.3位置的DNA拷贝数变异(DNA copy number variation)检测、大小测定及边界测量用引物(primer)的特征在于，它是包含从由序列号5至12构成的组中选择的DNA序列的缺失型PCR用引物。
作为本发明的另一个实现例，上述方法的特征在于，其所诊断全身性红斑狼疮发病风险依次按照，1q25.1(RABGAP1L)、6p21.32(C4)及10q21.3三个位置的个体全都存在缺失(OR＝5.52)；三个位置中有两个位置存在缺失(OR＝1.78)；三个位置中有一个位置存在缺失(OR＝1.43)；三个位置全都不存在缺失(OR＝1)的顺序发病风险由高到低。根据缺失的数量不同OR呈现出浓度依赖性增加的趋势(r2＝0.965)。
有益效果
本发明的组合物可以利用C4位置、1q25.1位置及10q21.3位置的拷贝数变异与全身性红斑狼疮发病具有协同效应这一特征预测发病风险，同时采用大部分医院化验室普遍正在实施的PCR，由此可以减少新设备的购置或因技术局限可能产生的分析误差，是一种临床上比较受欢迎的方式。另外，本发明还具有可采用非侵袭的方式对检查对象实施检查的优点。最终，本发明将有望对早期预测全身性红斑狼疮发病可能性以预防状态恶化或延缓发病而发挥重要的作用。
附图说明
图1是显示全基因组CNV发现(genome-wide CNV discovery)实现独立拷贝分析过程的示意图。
图2是显示含有极少数量CNV的区域不通过CNVR诊断的模式图。
图3是显示1q25.1位置RABGAP1L CNV的等位基因强度与qPCR确认结果的示意图。
图4是将与1q25.2(RABGAP1L)与10q21.3的SLE相关的OR按拷贝数显示的示意图。该图中的拷贝数是指通过qPCR检测出的拷贝数，通过独立拷贝实验结果显示，1q25.1及10q21.3 CNV区域的缺失与***性红斑狼疮风险相关。相反，如果拷贝数相对较多，***性红斑狼疮风险就会降低。
图5是显示确定缺失型PCR与缺失-CNVR边界策略的模式图。白色的盒子代表缺失的区域，预测会发生缺失部分侧翼区(flanking region)的蓝色箭头指的是用于检索缺失的引物对，缺失区域内的红色箭头指的是用于区别HOM与HET的引物对，附图上部是与两个CNVR相关的策略模式图，附图中间是显示分别按照各种策略实施的缺失型PCR产物电泳结果的示意图，附图下部是通过DNA碱基序列分析显示缺失断点(箭头所指部分)的模式图。
图6是显示通过qPCR查明的与全部C4、C4A及C4B基因相关的拷贝数分布情况示意图，黑色条代表患者组，灰色条代表对照组。
图7是显示与SLE敏感性相关的OR浓度依赖性倾向示意图。本发明人预测，缺失的程度越大SLE发病危险度与标准相比就更高。
具体实施方式
本发明人试图通过利用SNP阵列(array)对400名韩国人SLE患者和200名健康韩国人的全基因组CNV谱(profile)进行分析以查明与SLE相关的CNV。为此，第第1步骤就是通过全基因组CNV分析寻找了18，266个CNV，在此基础上定义了2544个CNVR，然后以其中频率达到5％以上的144个CNVR为对象实施了完整连贯的统计分析，所获得的GWAS分析结果显示，在144个普通CNVR中，1q25.1、8q23.3、10q21.3与SLE联系最为密切(具体情况为：OR＝2.28，P＝4.4x 10-3；OR＝0.37，P＝5.2x 10-4，OR＝1.62，P＝0.039)。
为这3个候选CNVR区域设计特殊的引物，然后针对比第1步骤的实验组-对照组配对规模更大的独立实验组-对照组配对实施特定目标(target-specific)qPCR，对第1步骤的结果进行拷贝。最终，成功拷贝了1q25.1的CNV及10q21.3的缺失(具体情况为：OR＝1.30，P＝0.038；OR＝1.90，P＝3.6x 10-5)。
除了3个候选CNVR区域之外，在GWAS发掘步骤，还掌握到C4基因区域的CNVR也与SLE具有很高的关联性，因此通过qPCR方式对C4实施独立验证。结果显示，SLE发病危险度明显升高(OR＝1.88，P＝0.01)。所以，C4 CNVR也包含在SLE发病危险度预测模式内。其结果表明，三个部位全都存在缺失的情况与三个位置全都不存在缺失的情况相比SLE发病风险显著升高(OR＝5.52，P＝3.9x10-4)。
这一关系通过缺失型PCR再次得到了确认。针对通过基因组的qPCR方式成功对拷贝进行确认的两个相关CNVR区域设计可以直接确认缺失存在与否、大小、边界的特殊引物，并利用该引物执行缺失型PCR，查明了缺失区域的准确大小(1q25.1的值为5.2Kb，10q24.3的值为8.3Kb)与缺失断点(deletion breakpoint)。在利用缺失型PCR实施的拷贝实验中也按照与qPCR相同的方式成功对1q25.1及10q21.3的缺失与SLE危险度间的关联性进行了拷贝(具体情况为：OR＝1.38，P＝0.009，OR＝1.40，P＝0.011)。
下面，为了有助于加深对本发明的理解，将列举理想的实施例。但是，下述实施例仅是为了能够更加容易地加深对本发明的理解，本发明的内容并非仅局限于下述实施例。
[实施例]
实施例1.研究对象及统计分析方法
1-1.研究对象
所有研究对象均由韩国人民族构成。
为了进行CNV-GWAS分析，从汉阳大学附属医院(位于大韩民国首尔市)的风湿性疾病科室的BAE***性红斑狼疮人群中招募了400名SLE患者(全部为女性，平均年龄31±10.0岁)。这些患者均是通过1997美国风湿病学会分类标准(American College of Rheumatology classification criteria)确诊为患SLE的患者。同时，从同一医院招募了200名非SLE患者作为对照组(全部为女性，平均年龄33±9.2岁)。
为了进行独立拷贝，从同一医院招募了患者564名与511名对照组(总共1075名)。
这一研究是在经机构伦理审查委员会(institutional review board)(CUMC11U199)批准后实施的。
1-2.统计分析
统计分析是利用Stata软件(version 10.0；Stata Corporation，College station，TX)与SPSS for Windows(version 11.5；SPSS，Chicago，IL)实施的。结果显示，当P值为0.05以上时，就表现出显著差异。
实施例2.整体基因组SNP基因型(genotype)分析
利用Illumina公司生产的Human 610s Quad-Bead Chip platform(包含620，901SNP标记)对整体基因组SNP实施了基因型(genotype)分析。就每个公知的CNV而言，探针的平均数字为37.7。每个样本大约有750ng的基因组的DNA用于基因型分析。本发明人使用的样本显示为99.89±0.16％的平均SNP判读率(call rate)。为了使板或批效果(plate or batch effect)达到最小化，所有步骤均是在相同时间内在相同环境下实施的。
实施例3.质量验证及拷贝数变异(CNV)探究
利用Illumina公司生产的GenomeStudio软件获得了包含信号强度(signalintensity)(log R ratio:LRR)与等位基因强度(allele intensity)(B等位基因频率)的实验数据。
3-1.质量验证
首先，经过了验证所述数据质量的过程。在以下几种情况下，将相关个体从实验结果排除：当成功的SNP采样率(SNP判读率)不到90％或者LRR标准偏差超过0.24时；当B合子频率浮动(drift)超过0.01时；当波形因子(wave factor)不到0.05时。
3-2.CNV采样
本发明人以信号强度(signal intensity)(log R ratio:LRR)与等位基因强度(alleleintensity)(B等位基因频率)资料为基础并用PennCNV算法作为基本设置状态对CNV进行了采样。
PennCNV算法使用HMM，虽然连续存在的CNV(consecutive CNV)的最小数不存在临界值(threshold)，但是在这一过程中查明的所有SNP包含3个以上连续存在的SNP(发现了达到3-1988个这一数字的SNP，每个CNV平均探针的个数为13.42，中间值为7)，各个CNV的边界是由第一个SNP探针的线性位置到最后一个探针(hg18)的长度决定的，CNV的一般特征如表1所示。
【表1】
各个CNV的边界(boundaries)是由第一个SNP探针到最后一个SNP探针(hg18)的直线距离决定的。
根据第一四分位数(first quartile)-1.5*IQR<N<第三四分位数(thirdquartile)+1.5*IQR的公式进行计算，实验结果不包括含有过少或过多的CNV的样本。在这里，N是指从各个样本中检出的CNV数字，IQR是指通过从600名研究对象中检出的CNV样本组计算的四分位数范围(inter-quartile range)。最后，分析对象包含总共573个样本(382名患者及191名对照组)。
实施例4.CNV区域(region)探究及统计分析
本发明人制作各探针的CNV数据后基于由正常(2X)、缺失(同配接合缺失＝0X；半接合缺失＝1X)，获得(≥3X)构成的拷贝数状态(status)对CNV进行了区分。通过573名个体确认CNV后再按照Redon等中记载的方法使用将CNVRuler软件CNV间重叠的部分合并，从而查明了CNV的一般区域(CNV region，CNVR)。这种方法虽然具有能够直接查明CNVR的优点，但是在CNVR包含的CNV中存在大小特别大的CNV时，具有如下缺点，即CNVR的大小与实际情况相比其计算结果可能更大。另外，即使在包含全部CNV采样的情况下，如果CNVR的频率为单例(singleton)或者只包含极少CNV，则CNVR的大小与实际情况相比其计算结果也可能更大(参照图2)。为了将这种可能性降到最低，含有极少数量CNV(全部CNV的10％以下)的区域不视为CNVR。
在573个样本中总共查明了18，266 CNV。结果显示，个人CNV数的中间值为30(1～285的范围内)，CNV的中间大小为21.0kb(14bp～18Mbp的范围内)，拷贝数-缺失CNV与拷贝数-获得CNV相比频率高出1.4倍。
通过18，266个CNV查明了2，544个CNVR。其中，144个CNVR出现在5％以上的个体中。
表2中记载了从5％以上的个体中发现的144个CNVR。
【表2】
利用这144个CNVR进行了逻辑回归分析。通过此举防止了因不同年龄段及实验组的差异而导致出现不同的实验结果。为了解决T多重比较问题，采用了错误发现率(false discovery rate(FDR))方法。分析表明，P<0.05，FDR<0.1的CNVR具有显著性。最终，在与SLE发病风险关联性最高的1q25.1，8q23.3，10q21中发现了3个CNVR，其结果如表3所示。
【表3】
*hg18；
1主成分分析以调整群体分层
2用qPCR复制；
3用缺失型PCR复制；
年龄调整；ND，未确定
以CNVR的OR是2n的个体为基准进行了相关计算，同时在通过缺失型PCR进行拷贝的过程中以OR≥2n为基准进行了计算。为了确保不同年龄段人口分布的效果而实施了主成分分析(principal componet analysis，PCA)分析。为了进行回归分析，PCA分析，将导出的2个高位主成分即PC1与PC2用作相关变量(covariate)，SNP-阵列批(array batch)信息也被用作进行回归分析的相关变量，利用144 CNVR的p-值计算出了FDR。
分析表明，除了上述3种CNVR之外，在已查明与SLE存在关系的CNVR位置中，C4(6p21.32)的拷贝数缺失在SLE患者组中显示出更高频率，获得型CNVR反而具有阻止SLE发病的效果。但是，这一结果还没有达到具有统计学上显著性的程度(OR＝2.35，95％CI＝0.64-8.57，P＝0.197用于缺失；OR＝0.40，95％CI＝0.16-1.03，P＝0.057用于获得)。
实施例5.利用基因组的qPCR验证(validation)与SLE相关的CNVR
本发明人为基因组的定量PCR(qPCR)设计了特殊的增幅用引物对，并试图利用该引物对拷贝在GWAS发现步骤中与SLE关联性较高的CNVR后进行确认。
实验表明，本研究中使用的所有引物均适合拷贝数定量，其相关信息如表4所示。
【表4】
利用Viia 7***(Life Technologies，Carlsbad，CA)执行了基因组的qPCR。
就1q25.1及10q21.3的qPCR而言，使用了含有20ng的基因组的DNA的反应混合物20μl，SYBR Premix Ex Taq TM II(TaKaRaBio社)，1xROX及引物10pmol，在95℃的环境下执行30秒的1循环后，再分别在95℃的环境下执行了5秒、在55℃的环境下执行了10秒、在72℃的环境下执行了30秒的45循环。
对于C4基因来说(C4A及C4B)，拷贝数是在利用针对C4A及C4B而特别设计的2种Taqman assay(Hs07226349_cn及Hs07226350_cn(Life Technologies))实施基因组的qPCR后而确定的，使用了包含10ng的基因组的DNA，TaqMan universalPCR master mix Ⅱ(Life Technologies)，C4A或C4B TaqMan探针及RNasePTaqMan探针的总共10μl的反应混合物。PCR条件是在95℃的环境下执行10分钟1循环并在95℃的环境下反应15秒钟后再在60℃的环境下反应1分钟完成40循环。
全部引物的PCR效率(PCR efficiency，Ct value)是通过标准曲线系列1:5稀释(standard curve over serial 1:5 dilution)决定的，Ct值是由使参照基因(referencegene)达到标准曲线的阈值所要求的PCR循环次数决定的，各个对象的拷贝数变异被定义为在这里，ΔCt是指需要确认的样本中通过参照基因(RNase P)与calibrator DNA(个人/calibrator)获得数值的循环阈值差异，比例数据取最接近的整数。简单说，本发明人将511个正常人对照组样本分为二倍体(diploid)，然后将所有测定的1q25.1与10q21.3 qPCR比例数值调整到与2个复制物匹配，并将调整后的比例数值四舍五入到最接近的整数。这3个CNVR的频率分布如下表(表5)所示，左侧栏是CNVR GWAS发掘结果的频率分布，中间栏是qPCR验证结果，右侧栏是缺失型PCR验证结果。
【表5】
通过SNP-阵列强度信号(array intensity signal)可以确认，在阵列中出现的CNV的92.8％在基因组的qPCR中也被检出。1q25.1位置处RABGAP1L CNV的等位基因强度与qPCR确认结果如图3所示。
图3左侧部分是利用Illumina公司生产的GenomeStudio软件获得的rs4480415标记(173066744位置，hg18)的genoplot图像。这一位置的信号强度分别为2X(A/A，A/B/B/B)，1X(A/-，B/-)，0X(-/-)，形成了6个显明的分区(cluster)。由此可以掌握拷贝数状态。附图中间部分是显示1q25.1区域周边的信号强度比例的示意图。图3右侧部分是通过基因组的qPCR确认1q25.1区域推定拷贝数的示意图，X轴显示通过PennCNV获得的拷贝数状态，Y轴是通过qPCR获得的推定DNA拷贝数。
利用基因组的qPCR获得的独立队列验证结果1q25.1位置处跨越RABGAP1L的CNVR与10q21.3CNVR的关联性被成功从独立验证队列群中拷贝(表3)。但是，8q23.3位置的CNVR未被拷贝。本发明人将带有2n的个体作为SLE发病危险度预测的标准(OR＝1.30，95％CI 1.02-1.67，P＝0.038)，拷贝数越增加OR越呈现出减少的趋势(r2＝0.939)(图4左侧)。10q21.3位置存在缺失型CNVR的个体在拷贝时也比2n的个体SLE发病风险高(OR＝1.90，95％CI 1.40-2.58，P＝3.6x 10-5)。但是，关于拷贝数，OR中未表现出任何连贯的倾向(r2＝0.528)(图4右侧)。
在GWAS发现步骤中证明C4基因中的CNVR也与SLE发病危险度存在关联。因此，也对所述CNVR单独进行了拷贝(308名患者组及307名对照组)。为了测定C4的拷贝数，将带有该基因二倍体拷贝数的HeLa细胞的DNA设定为二倍体对照组，并据此进行了调整。如果将带有2n的个体设定为标准，就可以看出存在C4A拷贝数缺失的个体SLE发病危险度显著升高(OR＝1.83，95％CI 0.19-0.49，P＝3.6x 10-6)，存在C4A拷贝数获得的个体SLE发病危险度显著降低(OR＝0.30，95％CI 1.15-3.06，P＝1.87x 10-6)。但是，C4B的CNVR与SLE发病危险度没有太大的关系。所有存在C4(C4A+C4B)拷贝数缺失的个体与带有4n的个体相比其SLE发病危险度也显著升高(OR＝1.88，95％CI 1.15-3.06，P＝0.01)。
跨越C4的CNVR即6p21.32的频率分布如表6所示。表6中上半部分是CNVGWAS发掘结果，下半部分是qPCR验证实验结果。
【表6】
实施例6.利用缺失型PCR确认CNV的大小与边界
6-1.确认CNV的大小及边界
为了通过实施例5的结果确认与SLE有显著关联的两个区域(1q25.1及10q21.3)的CNV准确大小与边界，本发明人实施了缺失型PCR，利用PCR-直接测序(directsequencing)对缺失等位基因的扩增子(amplicon)进行了测序。就C4区域而言，由于对于缺失型PCR不能执行设计，因此未对其进行测序。
为了准确掌握1q251.和10q21.3的大小与边界，本发明人制订了缺失型PCR策略。在预计缺失部位周边的旁侧序列(flanking sequence)与缺失区域内设计了引物对。与其相关的具体信息如表7所示，PCR是按下述条件执行的。准备了20μl含有20ng的基因组的DNA、0.4单位的FX DNA聚合酶(TOYOBO，Osaka，Japan)、2％DNSO、6pmol的引物的反应混合物，将PCR在94℃的环境下执行2分钟1循环并在98℃的环境下反应10秒钟后再在69℃的环境下反应1分/Kb完成了32循环。PCR反应后，将10μl的PCR产物在0.5％琼脂糖凝胶中电泳，通过PCR-直接测序方法对缺失的等位基因进行了测序。
【表7】
下面，对图5的实验策略进行简要说明，其原理就是：如果对包括预计缺失区域的对象实施PCR，则在不存在缺失的情况下会出现预计大小的PCR扩增子。相反，如果存在缺失，就会出现长度根据其大小相应减少的PCR扩增物。
本发明人设计的1q25.1区域所有等位基因扩增片段大小(amplicon size)为9.4Kb，基于SNP的开始-结束位置(start-end position)的1q25.1处缺失区域预测大小为3.8Kb。因此，通过计算确定缺失等位基因的扩增片段大小为5.6Kb。但是，缺失等位基因的实际扩增片段大小低于4.2Kb，因此1q25.1位置处的实际缺失大小也不是3.8Kb，通过计算其值低于5.2Kb。所以，仅表现出9.4Kb群(Band)的人可以用2n(二倍体)解释，仅表现出4.2Kb群的人可以用同合型缺失(homozygous deletion(HOM))解释，同时表现出9.4Kb与4.2Kb群的人可以用杂合型缺失(heterozygous deletion(HET))解释。
与此相同，基于10q21.3区域内SNP的开始-结束位置(start-end position)的缺失区域预测大小为2.4Kb，设计的所有等位基因扩增片段大小为11.6Kb。虽然对9.2Kb大小缺失型PCR扩增物进行了预测，但是实际缺失等位基因扩增物的大小低于3.3Kb。因此，10q21.3区域实际缺失等位基因扩增片段大小不是2.4Kb，通过计算其值低于8.3Kb。所以，仅表现出11.6Kb群的人可以用2n(二倍体)解释，仅表现出3.3Kb群的人可以用同合型缺失(HOM)解释，同时表现出11.6Kb与3.3Kb群的人可以用杂合型缺失(HET)解释。
本发明人对缺失基因的扩增子进行了测序，并确认了缺失序列的准确大小与断点。
图5中部显示了缺失型PCR产物的电泳结果。
在图5中部左侧，1q25.1区域显示了群1(Band 1)，9.4Kb；群2，4.2Kb；群3，2.3Kb。在图5中部右侧，10q21.3区域显示了群1，11.6Kb；群2，3.3Kb；群3，3.2Kb。P1和P2分别是指引物对1，2。
图5下部是显示1q25.1与10q21.3缺失断点(箭头所指的部分)的DNA序列示例图。
6-2.同配接合缺失及异配接合缺失的比较
尽管通过异配接合发生缺失的样本中必须存在两种大小的扩增子(整体大小及发生缺失的大小)，但由于整体大小的扩增子在两种CNVR中都对较小的PCR存在偏好现象(preference for small-sized PCR)，因此也可能不会表现出来。所以，为了基于缺失映射(mapping)数据对同配接合缺失与异配接合缺失进行区分，本发明人在缺失序列内重新设计了引物，并试图验证是否存在代表所有等位基因的较短扩增子(图5、表7)。如果样本存在异配接合缺失，则预计所有等位基因会产生预测大小(针对1q25.1而言为2.3Kb，针对10q21.3而言为3.2Kb)的扩增子，而缺失等位基因则不会那样。如果样本存在同配接合缺失，则预计不会产生PCR扩增子。
最后，本发明人对缺失型进行如下解释。对于1q25.1来说，同合型缺失为4.2Kb群为阳性，9.4Kb群为阴性，2.3Kb群为阴性，杂合型缺失为4.2Kb群为阳性，2.3Kb群为阳性。9.4Kb群虽然为阳性但是也可能不会表现出来。如果存在2个以上拷贝数变异，则为9.4Kb群为阳性，2.3Kb群为阳性，3.2Kb群为阴性，4.2Kb群为阴性。对于10q21.3来说，同合型缺失为3.3Kb群为阳性，3.2Kb群为阴性，11.6Kb群为阴性，杂合型缺失为3.3Kb群为阳性，3.2Kb群为阳性，11.6Kb虽然为阳性但是也可能不会表现出来。如果存在2个以上的拷贝数变异，则将会是11.6Kb群为阳性，3.2Kb群为阳性，3.3Kb群为阴性(图4)。
通过实施这一策略，可以对HOM，HET，≥2n进行准确区分(图4B及4C)。通过对缺失的等位基因复制物测序，准确掌握了缺失部位的大小及缺失断点。
本发明人将设计的缺失型PCR策略应用于独立验证队列(564例和495对照)实施了缺失型PCR，验证了通过qPCR查明的95％以下缺失与缺失型PCR结果一致。基于缺失型PCR结果发现1q25.1处存在CNVR的人(HOM及HET)与≥2n的相比SLE发病概率大大升高(OR＝1.38，95％CI 1.08-1.77，P＝0.0009)，10q21.3处存在缺失的情况也相同(OR＝1.40，95％CI 1.08-1.81，P＝0.011)(表3)。1q24.1或10q21.3 HOM与≥2n相比呈现出相当高的SLE发病风险(具体情况为：OR＝1.82，95％CI 1.03-3.20，P＝0.039；OR＝1.46，95％CI 1.01-2.10，P＝0.044)。GWAS发现及缺失型PCR的Meta分析结果显示，CNVR的相关关系呈现出更加明显的差异(就1q24.1而言，OR＝1.51，95％CI 1.20-1.89，P＝4x 10-4；就10q21.3而言，OR＝1.46，95％CI 1.01-2.10，P＝8x 10-4)。
另外，针对SLE发病危险度预测，本发明人试图掌握在3个重要位置同时存在缺失型CNVR情况下的效果。综合RABGAP1L及10q21.3的缺失型PCR结果与C4处的qPCR结果来看，对于三个位置都存在缺失的个体(本研究患者组的8.1％及对照组的2.3％)，在三个位置都与≥2n的个体(本研究患者组的10.7％及对照组的16.6％)相比SLE发病危险度高达5.5倍(OR＝5.52，95％CI 2.14-14.21，P＝3.9x10-4)。随着1到3缺失数的OR呈现出浓度依赖性增加的状态(r2＝0.965)(图7、表8)。
【表8】
类型 例(308) 对照(307)
3个位置都缺失 25(8.1％) 7(2.3％)
2个位置缺失 122(39.6％) 106(34.5％)
1个位置缺失 126(40.9％) 136(44.3％)
在3个位置都≥2n 33(10.7％) 51(16.6％)
ND 2(0.6％) 7(2.3％)
在上述说明中，通过实施例对本发明进行了详细介绍。通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。因此，上述实施例仅是为了从各个层面对本发明进行示例说明，它并不限定本发明的范围。
本发明的组合物可以利用C4位置、1q25.1位置及10q21.3位置的拷贝数变异与全身性红斑狼疮发病具有协同效应这一特征预测发病风险，同时采用大部分医院化验室普遍正在实施的PCR，由此可以减少新设备的购置或因技术局限可能产生的分析误差。另外，本发明还具有可采用非侵袭的方式对检查对象实施检查的优点。最终，本发明将有望对早期预测全身性红斑狼疮发病可能性以预防状态恶化或延缓发病而发挥重要的作用。

Claims (10)

1. 一种组合物，其特征在于：
作为一种全身性红斑狼疮发病危险度预测用组合物，该组合物含有检体染色体上C4，1q25.1位置及/或10q21.3位置DNA拷贝数变异检测用引物。
2. 根据权利要求项1所述的组合物，其特征在于：
所述1q25.1位置DNA拷贝数变异检测用引物是包含序列号1及2的DNA序列的基因定量PCR用引物对。
3. 根据权利要求项1所述的组合物，其特征在于：
所述10q21.3位置DNA拷贝数变异检测用引物是包含序列号3及4的DNA序列的基因定量PCR用引物对。
4. 根据权利要求项1所述的组合物，其特征在于：
所述1q25.1位置DNA拷贝数变异检测用引物是包含从由序列号5至8构成的组中选择的DNA序列的缺失型 PCR用引物。
5. 根据权利要求项1所述的组合物，其特征在于：
所述10q21.3位置DNA拷贝数变异检测用引物是包含从由序列号9至12构成的组中选择的DNA序列的缺失型 PCR用引物。
6. 一种试剂盒，其特征在于：
作为一种全身性红斑狼疮发病危险度预测用试剂盒， 该试剂盒含有检体染色体上1q25.1位置及/或10q21.3位置DNA拷贝数变异检测用引物。
7. 根据权利要求项6所述的试剂盒，其特征在于：
所述引物是包含从由序列号1至12构成的组中选择的DNA序列的引物。
8. 一种获取用于预测全身性红斑狼疮发病危险度信息的方法，其特征在于：
包括以下几个步骤：A) 将检体染色体上C4位置、1q25.1位置及/或10q21.3位置的DNA拷贝数变异检测用引物添加到检体DNA样本中实施PCR的步骤；B)通过所述实施PCR步骤获得的结果测定检体中是否带有C4位置、1q25.1位置及/或10q21.3位置的拷贝数变异的步骤。
9. 根据权利要求项8所述的方法，其特征在于：
所述A)步骤中1q25.1位置及/或10q21.3位置的DNA 拷贝数变异检测用引物是包含从由序列号1至4构成的组中选择的DNA序列的基因定量PCR用引物。
10. 根据权利要求项8所述的方法，其特征在于：
所述A)步骤中1q25.1位置及/或10q21.3位置的DNA拷贝数变异检测、大小测定及边界测量用引物是包含从由序列号5至12构成的组中选择的DNA序列的缺失型PCR用引物。
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