CN104694662A - 核酸等温扩增反应检测方法及应用该方法的检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种重组酶介导的核酸等温扩增反应检测方法，包括以下步骤：步骤1：制备扩增反应体系，该扩增反应体系主要包含以下组份：a、待检测核酸样品；b、一对与核酸样品杂交的寡核苷酸引物1和引物2；c、荧光探针，该荧光探针为分子信标、荧光共振、蝎子探针和分子火炬的一种或几种，荧光探针浓度为50-900nM/L；d、重组酶；e、DNA聚合酶；f、单链DNA结合蛋白；g、扩增反应缓冲液。本发明还提供一种重组酶介导的核酸等温扩增检测试剂盒。本发明核酸等温扩增反应检测方法及应用该方法的检测试剂盒，体系复杂性降低和试剂成本降低，探针序列合成容易，探针的设计容易，方便了实际应用的使用和推广。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其是涉及核酸等温扩增反应检测方法及应用该方法的检测试剂盒。
背景技术
聚合酶链式反应（简称PCR）是1983年以来发展起来的一项革命技术，可以实现微量核酸的高效扩增，将极少量的特异性核酸序列分子扩增到仪器可检测的水平，目前已被广泛应用于现代化的农业、医学、兽医以及生物安全等领域。PCR由变性-退火（复性）-延伸三个基本反应步骤构成， 模板DNA的变性：模板DNA经加热至90-95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它和引物结合，为下轮反应做准备；模板DNA单链与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55-60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：模板DNA-引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70-75℃下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按照碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程，就可以获得更多的“半保留复制链接”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需要2-4分钟，2-3个小时就能将待扩增的目的基因放大几百万倍。随着技术的不断进步，又衍生出了实时荧光定量聚合酶链反应技术（FQ-PCR），该技术是在普通PCR反应的基础体系中，加入荧光物质并结合荧光检测仪，对反应过程中荧光信号的变化进行实时监测，最后通过标准曲线可以达到对检测物质进行定性和定量分析。反应体系中加入的荧光物质含有荧光基团，主要分为Taqman荧光探针、Taqman MGB荧光探针（在荧光探针分子3’端连接非荧光淬灭剂及MGB基团，也称MGB探针），SYBR Green荧光染料分子信标探针和荧光共振能量转移探针（也称FRET探针）等。该技术整个反应过程及结果分析均在密闭容器中实现，无需开盖操作，可以避免终点PCR检测方法开盖后扩增产物引起的污染，造成实验结果的假阳性现象。目前，实验室研究及临床检测中所使用的核酸定量检测方法主要以实时定量PCR为主，该方法灵敏度和准确度较高，但需要昂贵的检测仪器，且整个过程需要不断的升降温度，反应时间较长，约2-3个小时，阻碍了其在基层医疗机构的大规模推广使用。
常规的核酸体外扩增技术（PCR技术），由于需要使用昂贵的PCR仪器和消耗大量电力，其成本和应用范围均受到一定的限制。随着恒温体外核酸扩增的悄然兴起，传统扩增技术的局限性有所改变，在过去的10年中，使核酸体外扩增变得更加简单和方便的一些等温核酸扩增技术得到了快速的发展，如NASBA（核酸序列依赖性扩增技术）、TMA（转录介导的核酸扩增技术）、SDA（链置换核酸扩增技术）、LAMP（环介导核酸扩增技术）、HAD（解旋酶依赖等温核酸扩增技术）、RPA/RAA（重组酶聚合酶扩增技术）等均可以在等温条件下扩增DNA。这些温度只需要温度控制装置来保持一个反应温度，即37-65℃，就可以实现高效的核酸扩增，从而得以摆脱对精密控制温度变化的PCR仪的依赖，若能在更低的温度条件下，甚至在常温条件下实现核酸的扩增，将进一步使核酸扩增技术简单化，并有利于此类技术更广泛围的应用。
重组酶聚合酶扩增技术是一种方法，其中重组酶介导的寡核苷酸与DNA靶的靶向与聚合酶的DNA合成结合（Morrical SW et.al. J Biol Chem. 1991 Jul 25；266（21）：14031-8和Armes and stemple，US申请10/371641）。WO 2008/035205描述了扩增双链靶核酸分子的方法，包括以下步骤：1）将重组蛋白（Uvs X、Uvs Y和gp32）与对所述双链靶核酸分子特异的第一和第二单链核酸引物接触以形成第一和第二核蛋白引物；2）将第一核蛋白引物与所述双链核酸靶序列接触以在所述双链靶核酸分子的第一部分产生第一D环结构，将第二和蛋白引物与所述双链靶核酸序列接触以在所述双链靶核酸分子的第二部分产生第二D环结构，这样所述第一核酸引物和所述第二核酸引物的3’端在相同的双链靶核酸分子上朝向彼此并且没有将靶核酸分子完全变性；3）利用一种或更多种能够进行链置换合成的聚合酶和dNTPs延伸所述第一和第二核蛋白引物的3’端以产生第一和第二双链靶核酸分子和第一和第二置换的核酸链；和4）通过2）和3）的重复持续反应直到所需的扩增程度。反应产物也是以指数级增长，通过在1h内即能得到用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段，整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用。
英国公司TwistDx Inc依据上述原理开发出了TwistAmpTM核酸扩增产品系列， TwistAmpTM试剂盒能够在10-15分钟内检测DNA分子，较多数PCR***的一半时间都短，能在低、常温运转，不需要样本DNA的初始变性，无需依靠昂贵的热循环仪，且可以使用粗提样本。还可以与TwistaTM仪器无缝连接，也可以与多种广泛使用的检测平台，如传统分析工具（如琼脂糖胶）、分析仪、荧光读取器以及实时定量PCR仪联合使用。其荧光探针***具有封闭式检测操作、可避免扩增产物污染的功能，探针包括exo 探针、fpg 探针和LP探针三种类型，均为水解型探针，长度根据类型不同一般为32-52个碱基不等，且探针的设计受到许多参数的限制，反应过程中荧光信号的改变还需要其他试剂参与，如核酸外切酶、裂解酶等。
由此可见，现有核酸检测方法，存在着核酸扩增反应时间长，所需反应的温度较高，反应环境要求高，反应物的检测不方便，检测结果不准确，不能定量检测以及检测方法成本高的缺陷，亟待进一步改进。
发明内容
为解决上述技术问题本发明提供了一种核酸实时等温扩增检测方法，是一种将等温扩增技术与分子信标、荧光共振、蝎子探针、荧光放大或分子火炬技术等荧光检测技术相结合的同步检测方法。该方法的操作过程为：将待检测核酸样品、一对与核酸样品杂交的寡核苷酸引物1和2、重组酶、DNA聚合酶、单链DNA结合蛋白、扩增反应缓冲液及一种或组合荧光探针混合组成反应液，在恒温扩增荧光检测装置中进行反应，实现对核酸样品的定性和定量检测。
本发明提供一种重组酶介导的核酸等温扩增反应检测方法，其包括以下步骤：
步骤1：制备扩增反应体系，该扩增反应体系主要包含以下组份：
a、待检测核酸样品；
b、一对与核酸样品杂交的寡核苷酸引物1和引物2；
c、荧光探针，该荧光探针为分子信标、荧光共振、蝎子探针和分子火炬的一种或几种，荧光探针浓度为50-900nM/L；
d、 重组酶；
e、 DNA聚合酶；
f、 单链DNA结合蛋白；
g、 扩增反应缓冲液；
步骤2：等温扩增反应，将步骤1中的组份混合后，将该反应体系放置在密闭容器中，在25℃-45℃中等温扩增反应，并用荧光检测装置同时检测反应体系中荧光信号的变化，根据荧光信号变化的时间和强度对核酸样品进行定性和定量检测。
本发明中，所述步骤1中的待检测核酸样品为RNA或DNA。
本发明中，所述步骤1中的引物1与待检测核酸样品正链5’端杂交，引物2与待检测核酸样品负链3’端杂交，长度均为30-35个寡核苷酸碱基，该扩增反应体系中引物浓度为50-900nM/L。
本发明中，所述步骤1中的重组酶浓度为10-1000ng/μL，该重组酶来自原核生物、病毒或真核生物；
所述重组酶为RecA、UvsX、UvsY、RADA、RADB和Rad51蛋白中的片段或突变体，及它们之间的任意组合。
本发明中，所述步骤1中的DNA聚合酶浓度为10-1000ng/μL；
所述DNA聚合酶为RNA依赖的DNA聚合酶，其包括大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶II、大肠杆菌DNA聚合酶III、T4 gp43 DNA聚合酶、具有链置换功能的Bst DNA聚合酶、AMV和MMLV逆转录酶。
本发明中，所述步骤1中的单链DNA结合蛋白浓度为100-2000ng/μL；
所述单链DNA结合蛋白包括大肠杆菌SSB、病毒噬菌体T2及T4和复制蛋白A的真核单链DNA结合蛋白。
本发明中，所述步骤1中的扩增反应缓冲液包括以下成分：20-1000mM Tricine pH8.0、20-100mM 醋酸钾、5-20mM 醋酸镁、2.0-20mM的二硫苏糖醇、0.1%-10%（V/V）聚乙烯醇20000、1-10mM ATP、1-5mM dNTPs、1.0-5.0ug/U的肌酸激酶。
本发明中，所述步骤2中的荧光检测装置为ABI 7300、ABI7500、ABI 7700、ABI7900系列、Bio-Rad CFX 96、LC 480系列、Slan-96P、DA7600。
此外，本发明还提供一种重组酶介导的核酸等温扩增检测试剂盒，其包括以下反应组分：
a、待检测核酸样品；
a、一对与核酸样品杂交的寡核苷酸引物1和引物2；
b、荧光探针，该荧光探针为分子信标、荧光共振、蝎子探针和分子火炬的一种或几种；
c、重组酶；
d、DNA聚合酶；
e、单链DNA结合蛋白；
f、扩增反应缓冲液，其包括20-1000mM Tricine pH8.0、20-100mM 醋酸钾、5-20mM 醋酸镁、2.0-20mM的二硫苏糖醇、0.1%-10%（V/V）聚乙烯醇20000、1-10mM ATP、1-5mM dNTPs、1.0-5.0ug/U的肌酸激酶。
本发明中，所述反应组份在密闭容器中混合后，在25℃-45℃等温扩增反应，并用荧光检测装置同时检测反应体系中荧光信号的变化，根据荧光信号变化的时间和强度对核酸样品进行定性和定量检测。
本发明在恒定温度下，重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时使模板DNA链解链，在单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，在引物形成聚合体的同时，荧光探针（分子信标）和重组酶也形成聚合体，并与互补序列的模板DNA链结合而产生荧光，随着互补DNA链的增多荧光探针产生的荧光信号也随之增加，最后检测实时荧光强度的变化从而实现核酸样品的定性和定量检测。如此循环后，反应产物以指数级增长，且整个反应过程只需要10分钟-1h，因而具有简单快速、设备简单、直观明了、低污染和恒温不需要高温循环等诸多优点。
本发明核酸等温扩增反应检测方法及应用该方法的检测试剂盒，体系复杂性降低和试剂成本降低，探针序列合成容易，探针的设计容易，方便了实际应用的使用和推广。
附图说明
图1为不含不含鲍曼不动杆菌DNA检测反应时间与荧光信号强度关系的曲线图；
图2为鲍曼不动杆菌DNA浓度约10copies/uL时，检测反应时间与荧光信号强度关系的曲线图；
图3为鲍曼不动杆菌DNA浓度约102copies/uL时，检测反应时间与荧光信号强度关系的曲线图；
图4为鲍曼不动杆菌DNA浓度约103copies/uL时，检测反应时间与荧光信号强度关系的曲线图；
图5为鲍曼不动杆菌DNA浓度约104copies/uL时，检测反应时间与荧光信号强度关系的曲线图；
图6为不含丙肝病毒RNA，检测检测反应时间与荧光信号强度的曲线图；
图7为丙型病毒RNA浓度约10copies/uL时，检测检测反应时间与荧光信号强度的曲线图；
图8为丙型病毒RNA浓度约104copies/uL时，检测检测反应时间与荧光信号强度的曲线图；
图9为1×103、1×104、1×105、1×106浓度pUC19质粒的反应时间与荧光强度之间关系的扩增曲线图；
图10为1×103、1×104、1×105、1×106浓度pUC19质粒制备的标准曲线图；
图11为未知浓度的pUC19质粒样品1反应时间与荧光强度之间关系的扩增曲线图；
图12为未知浓度的pUC19质粒样品2反应时间与荧光强度之间关系的扩增曲线图。
具体实施方式
下列实施例中，所用试剂和方法如无特别说明均为常规试剂盒方法。
实施例1 、分子信标的设计
为了成功地检测核酸样品，分子信标必须与靶DNA结合，而未结合的探针则保持闭合的无荧光状态。loop环(即探针区)应具有靶特异性，两侧可以形成发夹结构的互补序列。设计信标时，通常应遵循以下原则：
1、探针区应为15~33bp长，且环序列必须与靶序列互补；
2、探针区的Tm值应该比反应时结合温度高7~10℃(参照GC含量预测规则)，而且要在附加茎结构序列之前单独估测探针序列；
3、为了保证信标优先与靶序列杂交，探针必须与靶序列二级结构较少的区域互补。靶DNA的二级结构用序列分析软件分析，如mfold：http://mfold.bioinfo.rpi.edu/；
4、分子信标应该结合于或靠近复制子的中间，上游引物3′端和分子信标探针5’端〔茎)之间应大子6bp；
5、分子信标的茎区长度应为5~7bp,GC含量控制在70%-80%，茎部太长会使探针与靶序列结合速度减缓；
6、茎区的长度、序列和GC含量应慎重选择，保证其解链温度比引物的退火温度高7~10℃；
7、茎区解链温度一般用mfold发夹折叠公式计算，该公式用来估测形成茎区双链分子的自由能，进而预测其解链温度。假如GC含量是100%，5bp长的茎的解链温度介于55~60℃,6bp长的茎的解链温度介于60~65℃，7bp长的茎的解链温度介于65~70℃；
8、一个序列的自由能越负，越优先形成发夹结构，而且越稳定。用mfold得到的发夹结构的自由能应介于-3~0. 5kcal/mol( 1cal= 4.1840J)之间；
9、由于G碱基可以淬灭荧光，因此要避免G碱基与荧光染料(一般在茎区5′端)直接毗邻，茎状5′端为C较好；
10、设计好的探针要检测是否存在其他二级结构,而不是预先设计好的发夹结构，因为这样会改变荧光染料与淬灭剂之间的相对距离，导致背景信号增强；
11、要避免探针与引物之间互补，否则会导致引物与探针杂交，使背景增加；
12、复制子应相对较短，一般小于150bp。分子信标是一种内在探针，必须与靶序列的互补链竞争。较短的复制子更容易完成DNA合成，以保证把序列完全合成，结果更为可靠。
实施例2 、细菌DNA检测
下面以鲍曼不动杆菌DNA的检测为例，采用本发明重组酶介导的核酸等温扩增反应检测方法对细菌DNA进行定性检测，具体过程如下：
步骤1：鲍曼不动杆菌 DNA提取
接种鲍曼不动杆菌标准菌株（购买于 ATCC，菌株编号为ATCC19606）并培养过夜，使用天根TIANamp Bactercia DNA Kit 细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）进行DNA提取。
步骤2：引物1、引物2及分子信标设计
根据鲍曼不动杆菌固有特异性基因OXA51核酸片段进行检测引物1、引物2和特异性分子信标的设计，并委托北京三博远志生物技术有限责任公司合成，具体序列参见序列1：>gi|597441578|gb|KF048919.1| Acinetobacter baumannii strain SR181 beta-lactamase OXA-51-like protein gene, complete cds
引物1：5' GCACACACTACGGGTGTTTTAGTTATCCAT 3'
引物2：5' AAATACTTCTGTGGTGGTTGCCTTATGGTG 3'
分子信标：5' FAM-ccgccac ATGGTAATGATCTTGCTCGTGCTgtggcgg- Dabcyl4 3'
5’端标记的荧光基团为（FAM：6-羧基荧光素，3’端标记的淬灭基团为Dabcyl4（4-甲基氨基苯基偶氮）-苯甲酸（非荧光基团）
步骤3：反应体系组成及反应参数
反应体系组分及浓度为：20mM Tricine pH8.0、30mM 醋酸钾、10mM 醋酸镁、5.0mM二硫苏糖醇、
0.1%（V/V）聚乙烯醇20000、5mM ATP、2mM dNTPs、3.0ug/U的肌酸激酶，100ng/μL RecA重组酶；100ng/μL Bst DNA聚合酶；200ng/μL单链DNA结合蛋白，100 nM引物1，100 nM引物2，50nM分子信标。
配制上述反应体系一定体积并混合均匀后，分装至八联排管中，每管28μL，加入已提取的鲍曼不动杆菌基因组DNA 2μL作为模板，在DA7600荧光PCR仪中42℃条件下保温40分钟，并同步进行FAM通道荧光检测，每隔1分钟收集一次荧光信号。
步骤4：反应结果分析及判定
荧光信号的检测结果，请配合参阅图1至图5所示（横坐标为反应时间，纵坐标为相对荧光吸收值），不同浓度的鲍曼不动杆菌DNA在不同时间产生高于背景的荧光信号，稀释度越高（浓度越低），则产生高于背景的荧光信号所需时间越长，及待测样本的浓度与反应时间成反比。未加入鲍曼不动杆菌DNA的样本在结束时，没有产生高于背景的荧光信号，只有背景荧光信号。
实施例3、病毒RNA检测
下面以丙型肝炎病毒RNA的检测为例，采用本发明重组酶介导的核酸等温扩增反应检测方法对病毒RNA进行定性检测，具体过程如下：
步骤1：样本丙型肝炎病毒RNA提取
收集丙型肝炎病毒呈阳性的临床血清，使用天根TIANamp Virus RNA Kit 病毒RNA提取试剂盒（离心柱型）进行RNA提取，操作过程中随时注意个人安全防护。
步骤2、引物1、引物2及分子信标设计
根据丙型肝炎病毒5’UTR基因核酸片段进行检测引物1、引物2和特异性分子信标的设计，并委托北京三博远志生物技术有限责任公司合成，具体序列如序列2：>gi|221612:1-341 Hepatitis C virus (HCV) complete genome。
引物1：5' TCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCT 3'
引物2：5' CGCAAGCACCCTATCAGGCAGTACCACAAG 3'
分子信标：5' FAM-ccgccac CTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCgtggcgg -Dabcyl4 3'
5’端标记的荧光基团为（FAM：6-羧基荧光素，3’端标记的淬灭基团为Dabcyl4（4-甲基氨基苯基偶氮）-苯甲酸（非荧光基团）
步骤3：反应体系组成及反应参数
反应体系组分及浓度为：20mM Tricine pH8.0、30mM 醋酸钾、10mM 醋酸镁、5.0mM二硫苏糖醇、0.1%（V/V）聚乙烯醇20000、10mM ATP、5mM dNTPs、3.0ug/U的肌酸激酶，100ng/μL RecA重组酶；100ng/μL MMLV聚合酶，200ng/μL单链DNA结合蛋白，100 nM引物1，100 nM引物2，50nM分子信标。
配制上述反应体系一定体积并混合均匀后，分装至八联排管中，每管28μL，加入已提取的丙型肝炎病毒RNA 2μL作为模板，在DA7600荧光PCR仪中42℃条件下保温40分钟，并同步进行FAM通道荧光检测，每隔1分钟收集一次荧光信号。
步骤4：反应结果分析及判定
荧光信号的检测结果请配合参阅图6至图8所示（横坐标为反应时间，纵坐标为相对荧光吸收值），不同丙型肝炎病毒RNA在不同时间产生高于背景的荧光信号，稀释度越高（浓度越低），则产生高于背景的荧光信号所需时间越长，及待测样本的浓度与反应时间成反比。未加入丙型肝炎病毒RNA的样本在结束时，没有产生高于背景的荧光信号，只有背景荧光信号。
实施例4、DNA定量检测
下面以PUC19载体质粒的检测为例，采用本发明对DNA进行定量检测，具体过程如下：
步骤1：鲍曼不动杆菌 DNA提取
接种含有PUC19载体质粒的大肠杆菌并37℃培养过夜，使用MEGA质粒小量提取试剂盒（离心柱型）进行质粒DNA提取，使用核酸定量仪测定质粒浓度后换算成拷贝数，并用TE溶液将质粒10倍梯度稀释1×102、1×103、1×104、1×105、1×106。
步骤2：引物1、引物2及分子信标设计
根据PUC19载体质粒的序列进行检测引物1、引物2和分子信标的设计，并委托北京三博远志生物技术有限责任公司合成，具体序列如序列3所示。
引物1：5' CACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGC 3'
引物2：5' GTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGAC 3'
分子信标：5' FAM-ccgccac AGAGGATCCCCGGGTACCGAGC gtggcgg -Dabcyl4 3'
5’端标记的荧光基团为（FAM：6-羧基荧光素，3’端标记的淬灭基团为Dabcyl4（4-甲基氨基苯基偶氮）-苯甲酸（非荧光基团）
步骤3：反应体系组成及反应参数
反应体系组分及浓度为：10mM Tricine pH8.0、20mM 醋酸钾、10mM 醋酸镁、4.0mM二硫苏糖醇、0.5%（V/V）聚乙烯醇20000、5mM ATP、5mM dNTPs、5.0ug/U的肌酸激酶，1000ng/μL重组酶；100ng/μL DNA聚合酶；200ng/μL单链DNA结合蛋白，100 nM引物1，100 nM引物2，50nM分子信标。
配制上述反应体系一定体积并混合均匀后，分装至八联排管中，每管28μL，加入上述稀释的PUC19载体质粒DNA 2μL作为模板，其中1×103、1×104、1×105、1×106用于标准曲线的制定，其余为未知浓度的PUC19载体质粒用于定量检测，在DA7600荧光PCR仪中42℃条件下保温40分钟，并同步进行FAM通道荧光检测，每隔1分钟收集一次荧光信号。
步骤4：反应结果分析及判定
荧光信号的检测结果，请配合参阅图9至图12所示（横坐标为反应时间，纵坐标为相对荧光吸收值），不同浓度的鲍曼不动杆菌DNA在不同时间产生高于背景的荧光信号，稀释度越高（浓度越低），则产生高于背景的荧光信号所需时间越长，及待测样本的浓度与反应时间成反比。未加入鲍曼不动杆菌DNA的样本在结束时，没有产生高于背景的荧光信号，只有背景荧光信号。
以上仅为本发明的较佳实施例，当不得以此限定本发明实施的技术范围，因此凡参考本发明的说明书内容所作的简单等效变化与修饰，皆应仍属本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种重组酶介导的核酸等温扩增反应检测方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1：制备扩增反应体系，该扩增反应体系主要包含以下组份：
a、待检测核酸样品；
b、一对与核酸样品杂交的寡核苷酸引物1和引物2；
c、荧光探针，该荧光探针为分子信标、荧光共振、蝎子探针和分子火炬的一种或几种，荧光探针浓度为50-900nM/L；
d、 重组酶；
e、 DNA聚合酶；
f、 单链DNA结合蛋白；
g、 扩增反应缓冲液；
步骤2：等温扩增反应，将步骤1中的组份混合后，将该反应体系放置在密闭容器中，在25℃-45℃中等温扩增反应，并用荧光检测装置同时检测反应体系中荧光信号的变化，根据荧光信号变化的时间和强度对核酸样品进行定性和定量检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1中的待检测核酸样品为RNA或DNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1中的引物1与待检测核酸样品正链5’端杂交，引物2与待检测核酸样品负链3’端杂交，长度均为30-35个寡核苷酸碱基，该扩增反应体系中引物浓度为50-900nM/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1中的重组酶浓度为10-1000ng/μL，该重组酶来自原核生物、病毒或真核生物；
所述重组酶为RecA、UvsX、UvsY、RADA、RADB和Rad51蛋白中的片段或突变体，及它们之间的任意组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1中的DNA聚合酶浓度为10-1000ng/μL；
所述DNA聚合酶为RNA依赖的DNA聚合酶，其包括大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶II、大肠杆菌DNA聚合酶III、T4 gp43 DNA聚合酶、具有链置换功能的Bst DNA聚合酶、AMV和MMLV逆转录酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1中的单链DNA结合蛋白浓度为100-2000ng/μL；
所述单链DNA结合蛋白包括大肠杆菌SSB、病毒噬菌体T2及T4和复制蛋白A的真核单链DNA结合蛋白。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1中的扩增反应缓冲液包括以下成分：20-1000mM Tricine pH8.0、20-100mM 醋酸钾、5-20mM 醋酸镁、2.0-20mM的二硫苏糖醇、0.1%-10%（V/V）聚乙烯醇20000、1-10mM ATP、1-5mM dNTPs、1.0-5.0ug/U的肌酸激酶。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2中的荧光检测装置为ABI 7300、ABI7500、ABI 7700、ABI7900系列、Bio-Rad CFX 96、LC 480系列、Slan-96P、DA7600。
9.一种重组酶介导的核酸等温扩增检测试剂盒，其包括以下反应组分：
a、待检测核酸样品；
a、一对与核酸样品杂交的寡核苷酸引物1和引物2；
b、荧光探针，该荧光探针为分子信标、荧光共振、蝎子探针和分子火炬的一种或几种；
c、重组酶；
d、DNA聚合酶；
e、单链DNA结合蛋白；
f、扩增反应缓冲液，其包括20-1000mM Tricine pH8.0、20-100mM 醋酸钾、5-20mM 醋酸镁、2.0-20mM的二硫苏糖醇、0.1%-10%（V/V）聚乙烯醇20000、1-10mM ATP、1-5mM dNTPs、1.0-5.0ug/U的肌酸激酶。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述反应组份在密闭容器中混合后，在25℃-45℃等温扩增反应，并用荧光检测装置同时检测反应体系中荧光信号的变化，根据荧光信号变化的时间和强度对核酸样品进行定性和定量检测。
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