CN107177684B - 一种恒温核酸扩增反应试剂 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种恒温核酸扩增反应试剂。其包括解旋酶、甲酰胺、亚精胺、氯化镁、冰醋酸、UvsX蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白、牛血清白蛋白、dNTPs、Tris碱和恒温DNA聚合酶。
Description
技术领域
本发明涉及一种恒温核酸扩增反应试剂。
背景技术
传统PCR在技术应用上存在几个方面的限制:第一,需要昂贵的仪器,同时仪器需要具备精细的温度控制程序和加热模板,从而实现在很高的温度下DNA模板链的变性,在较低的温度下退火利用引物延伸模板;第二,体系中需要耐受高温的聚合酶;第三,在PCR循环中,每个循环的退火时间都很短,这就要求引物必须快速找到模板上的同源匹配区段,以实现延伸,这就要求PCR有过量的PCR引物,而过量的引物会与模板错配,引发错误扩增或产生引物二聚体。
与传统的PCR技术相比,恒温扩增技术主要利用重组酶的活性,不进行核酸解链和退火即可在较低的温度下恒温扩增,因此,不需要昂贵的仪器,也避免了高温对酶的损耗。同时恒温扩增技术在体系中不需要加入过量的引物,降低引物与模板错配或生成引物二聚体的可能性。恒温扩增技术日益受到重视。
但是,现有的恒温扩增技术也存在一些缺陷,比如扩增产物得率不高,对设计的引物要求较高,不能进行多重扩增以及多重扩增效率低和差,对扩增模板核酸的纯度要求较高等问题。
发明内容
本申请提供了一种恒温核酸扩增反应试剂,其包括解旋酶、氯化镁、冰醋酸、UvsX蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白、牛血清白蛋白、dNTPs、Tris碱和恒温DNA聚合酶。
在一个具体实施方式中,所述试剂中还包括甲酰胺、亚精胺和甜菜碱中的至少一种。例如,所述试剂中还包括甲酰胺和亚精胺。
在一个具体实施方式中,所述试剂包括解旋酶、甲酰胺、亚精胺、氯化镁、冰醋酸、UvsX蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白、牛血清白蛋白、dNTPs、Tris碱和恒温DNA聚合酶。
在一个具体实施方式中,解旋酶10ng/μL-15ng/μL、甲酰胺的体积百分含量为0.1%-0.5%、亚精胺0.5ng/μL-5ng/μL、氯化镁5mM—100mM、冰醋酸的体积百分含量为1%-5%、UvsX蛋白40ng/μL-80ng/μL、UvsY蛋白35ng/μL-90ng/μL、单链结合蛋白500ng/μL-1000ng/μL、牛血清白蛋白1mg/mL-5mg/mL、dNTPs 50mM—100mM、Tris碱10mM—50mM、恒温DNA聚合酶1U/反应-2U/反应、以及甜菜碱0-5ng/μL。
在一个具体实施方式中,恒温核酸扩增反应试剂包括溶液I和溶液II,其中,所述溶液I包括解旋酶、氯化镁、冰醋酸、UvsX蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白、牛血清白蛋白、dNTPs和Tris碱;所述溶液II恒温DNA聚合酶。
在一个具体实施方式中,所述溶液I还包括甲酰胺、亚精胺和甜菜碱中的至少一种。例如所述溶液I还包括甲酰胺和亚精胺。
在一个具体实施方式中,所述溶液I包括解旋酶10ng/μL-15ng/μL、甲酰胺的体积百分含量为0.1%-0.5%、亚精胺0.5ng/μL-5ng/μL、氯化镁5mM—100mM、冰醋酸的体积百分含量为1%-5%、UvsX蛋白40ng/μL-80ng/μL、UvsY蛋白35ng/μL-90ng/μL、单链结合蛋白500ng/μL-1000ng/μL、牛血清白蛋白1mg/mL-5mg/mL、dNTPs 50mM—100mM、Tris碱10mM—50mM、以及甜菜碱0-5ng/μL。
在一个具体实施方式中,所述恒温DNA聚合酶包括BstDNA聚合酶和/或phi29DNA聚合酶。
在一个具体实施方式中,所述试剂的pH值为6.5-8.2;优选所述试剂的pH为7.2-7.6。
在一个具体实施方式中,所述试剂中还包括荧光染料。
在一个具体实施方式中,所述荧光染料选自SYBR green I、SYTO-13和SYTO-12中的至少一种。
在一个具体实施方式中,所述试剂中还包括用于扩增靶标片段的一对引物。
在一个具体实施方式中,所述试剂中还包括逆转录酶进行RNA反转录扩增反应。此时,在完整的扩增体系中还要有相关的引物和RNA模板。
本申请的蛋白和酶,可以来源于微生物中,亦可来源于动植物中。
本申请的有益效果:
I)使用本申请的恒温核酸扩增反应试剂,对于引物设计要求低,提高了扩增效率。(1)引物设计不需要考虑引物的GC含量;(2)引物设计不需要考虑引物的退火温度Tm值;(4)对于引物的各种修饰不影响本体系的扩增效率;(3)引物设计长度为20bp—40bp之间。
II)使用本申请的恒温核酸扩增反应试剂,解决了不能进行多重扩增以及多重扩增效率低和差的问题,实现了多重引物的高效扩增。
III)使用本申请的恒温核酸扩增反应试剂,具备抗扩增抑制的作用,对扩增模板核酸的纯度要求非常低。
IV)组分中同时加入亚精胺和甲酰胺,使试剂具备了抵抗抑制模板扩增物质的作用;可以降低扩增引物的设计要求;无需考虑引物本身的GC含量及退火温度Tm值;可以提高扩增产物的得率;能够减少或消除非特异扩增。
V)本申请的恒温扩增体系可实现常规高温PCR能够实现的一切扩增,如:
本申请的恒温扩增体系可用于普通核酸扩增;
本申请的恒温扩增体系可用于反转录扩增;
本申请的恒温扩增体系可用于不对称扩增;
本申请的恒温扩增体系可用于多重扩增;
本申请的恒温扩增体系根据不同的扩增条件,其扩增温度在28-48℃之间;
本申请的恒温扩增体系根据不同的扩增条件,其扩增时间在5分钟到1小时之间。
附图说明
图1显示了实施例1恒温扩增的核酸电泳结果。
图2显示了实施例2的3#和4#号管的核酸电泳结果。
图3显示了实施例2的5#和6#号管的核酸电泳结果。
图4显示了实施例3恒温扩增的核酸电泳结果。
图5显示了实施例4恒温扩增的核酸电泳结果。
图6显示了实施例5恒温扩增的检测结果。
图7显示了实施例6的30#号管恒温扩增的检测结果。
图8显示了实施例6的31#号管恒温扩增的检测结果。
图9显示了实施例7的32#号管恒温扩增的检测结果。
图10显示了实施例6的33#号管恒温扩增的检测结果。
图11显示了实施例8恒温扩增的核酸电泳结果。
图12显示了实施例9恒温扩增的核酸电泳结果。
具体实施方式
下面通过优选的实施例加以说明。
DNA纯度检测:利用美林恒通SMA6000微量分光光度计检测。
扩增核酸模板:从宫颈脱落细胞中,利用天根核酸提取试剂盒提取人***瘤病毒(HPV)16型DNA,由当地人民医院提供。DNA纯度OD260/OD280=1.8,纯度较高;标记为DNA I#。
扩增核酸模板:从宫颈脱落细胞中,利用碱处理方法粗糙提取人***瘤病毒(HPV)16型DNA。DNA纯度OD260/OD280=0.8,纯度较低;标记为DNAII#。
扩增核酸模板:采用结核分支杆菌RNA核酸提取试剂盒,分别从阳性临床样本中提取结核分枝杆菌RNA,标记为RNA I#;从阴性临床样本中提取RNA,标记为RNA II#。以上临床样本中的RNA由当地人民医院提供。
扩增核酸模板:人***瘤病毒(HPV)16型DNA、18型DNA、31型DNA、33型DNA、35型DNA、39型DNA模板、45型DNA模板、51型DNA模板、52型DNA模板、56型DNA模板、58型DNA模板、59型DNA模板、68型DNA模板、26型DNA模板、53型DNA模板、66型DNA模板、73型DNA模板、82型DNA模板,人基因组DNA,由当地人民医院提供。DNA纯度OD260/OD280均达到1.8,纯度较高。
人***瘤病毒(HPV)16型DNA正向引物F16-1(SEQ ID No.1):AATAACAAAATATTAGTTC;19bp,G+C含量15.8%,Tm值为30.4℃。
人***瘤病毒(HPV)16型DNA反向引物R16-1(SEQ ID No.2):ACTTTTCCTTTAAATTTAC;19bp,G+C含量21.1%,Tm值为35.3℃。
人***瘤病毒(HPV)16型DNA正向引物F16-2(SEQ ID No.3):CCGCAGGTGACGTCTAGTCACATCCTAGTCATCACATG;38bp,G+C含量70%,Tm值为68℃。
人***瘤病毒(HPV)16型DNA反向引物R16-2(SEQ ID No.4):CGTCGCCCATCGTCCTCCCCGTGTCGTAGGTACTCCTTAA;40bp,G+C含量71%,Tm值为70℃。
正向引物MTBF16(SEQ ID No.5):GCGGCAUGCUUAACACA。
反向引物MTBR16(SEQ ID No.6):UGAGUUUUAGCCUUGCGG。
HPV18型DNA正向引物F18(SEQ ID No.7):ATGTGCCTGTATACACGGG。
HPV18型DNA反向引物R18(SEQ ID No.8):TCAACATGTCTGCTATACTGC。
HPV31型DNA正向引物F31(SEQ ID No.9):ATTTTTTTACAGATGTCTCTGTGGCGG。
HPV31型DNA反向引物R31(SEQ ID No.10):GGTCAATCCAAAATTCCAATCTTCC。
HPV33型DNA正向引物F33(SEQ ID No.11):GTGCTGACTTTGTTTTACATCC。
HPV33型DNA反向引物R33(SEQ ID No.12):GCAGTTAAGGTAACTTTGCA。
HPV35型DNA正向引物F35(SEQ ID No.13):ATGTCTCTGTGGCGGTCT。
HPV35型DNA反向引物R35(SEQ ID No.14):CTCTAAAATGGACGGGTTC。
HPV39型DNA正向引物F39(SEQ ID No.15):ATGGCTATGTGGCGGT。
HPV39型DNA反向引物R39(SEQ ID No.16):GGAGGAGCTACAGCAAAAT。
HPV45型DNA正向引物F45(SEQ ID No.17):CCCTATTTTTTTGCAGATGGCT。
HPV45型DNA反向引物R45(SEQ ID No.18):GGAGGGACACCAAAATTCCAATTT。
HPV51型DNA正向引物F51(SEQ ID No.19):GTGGGGATTACTATTTGTGG。
HPV51型DNA反向引物R51(SEQ ID No.20):GCCATTACCTCTGTAGTTAAAG。
HPV52型DNA正向引物F52(SEQ ID No.21):CATCCTAGTTATTTTTTACTACGTCGCAGG。
HPV52型DNA反向引物R52(SEQ ID No.22):GCCAAATTGCCAGTCCTCTAAAATA。
HPV56型DNA正向引物F56(SEQ ID No.23):TACCCATGATGTATATATACAGGGATCCTCC。
HPV56型DNA反向引物R56(SEQ ID No.24):GCCATAACCTCTGCAGACAAAGTAATT。
HPV58型DNA正向引物F58(SEQ ID No.25):ATGGTGCTGATTTTCTGTTG。
HPV58型DNA反向引物R58(SEQ ID No.26):CCAGTCCTCCAAAATATTTG。
HPV59型DNA正向引物F59(SEQ ID No.27):TACCACGCAGGCAGTTC。
HPV59型DNA反向引物R59(SEQ ID No.28):CAGTAGGAGGTGGTGTAACAC。
HPV68型DNA正向引物F68(SEQ ID No.29):ATGGCATTGTGGCGA。
HPV68型DNA反向引物R68(SEQ ID No.30):GGCAACACCAAAATTCCA。
HPV26型DNA正向引物F26(SEQ ID No.31):ATGGCTTTGTGGCGTAC。
HPV26型DNA反向引物R26(SEQ ID No.32):TCCAATATGGAGGCATTC。
HPV53型DNA正向引物F53(SEQ ID No.33):TGGCGGCCTAGTGACAGCAA。
HPV53型DNA反向引物R53(SEQ ID No.34):TAGTGGCAACAGGAGGCGA。
HPV66型DNA正向引物F66(SEQ ID No.35):TATATACAGGGAGCTACATTTGCAC。
HPV66型DNA反向引物R66(SEQ ID No.36):GCAAATATGCCATAACTTCTGCAGT。
HPV73型DNA正向引物F73(SEQ ID No.37):ATGTGGCGACCTACTGATG。
HPV73型DNA反向引物R73(SEQ ID No.38):GGTAAGACCAAAATTCCACTC。
HPV82型DNA正向引物F82(SEQ ID No.39):ATGGCTTTGTGGCGTAC。
HPV82型DNA反向引物R82(SEQ ID No.40):GGTGTGCAGGTAAGCCATA。
实施例1
亚精胺和甲酰胺在反应体系中的加入与不加入对比
反应体系一(总体积50μL)(含BstDNA聚合酶、亚精胺、甲酰胺):冰醋酸的体积百分含量为2%;氯化镁30mM;解旋酶12ng/μL;甲酰胺的体积百分含量为0.2%;亚精胺1ng/μL;甜菜碱1ng/μL;UvsX蛋白45ng/μL;UvsY蛋白45ng/μL;单链结合蛋白700ng/μL;牛血清白蛋白1.5mg/mL;dNTPs 75mM;Tris碱15mM;pH值7.5。
反应体系二(总体积50μL)(含BstDNA聚合酶,不含亚精胺、甲酰胺):冰醋酸的体积百分含量为2%;氯化镁30mM;解旋酶12ng/μL;甜菜碱1ng/μL;UvsX蛋白45ng/μL;UvsY蛋白45ng/μL;单链结合蛋白700ng/μL;牛血清白蛋白1.5mg/mL;dNTPs 75mM;Tris碱15mM;pH值7.5。
取出1个预装了25μL反应体系一试剂管1#;和1个预装了25μL反应体系二的试剂管2#,分别向1#和2#管中各加入2μL的F16-1(20μM)和R16-1(20μM);并分别在1#和2#号管中各加入5μL HPV16DNA模板DNA I#和1U的BstDNA聚合酶,然后再分别补灭菌水至50μL体积到1#和2#号管中。
将1#和2#号管分别混匀,放入到37℃的金属浴或水浴锅中,反应15分钟。然后取出,分别加入50μL的1:1酚氯仿试剂,震荡混匀,12000离心30秒,取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳,可见1#号管的电泳结果中有一条单一且亮度明显的条带;而2#号管的扩增条带中有杂带,且亮度不是太明显。结果见附图1。
实施例2
引物本身设计对扩增的影响
取出2个预装了25μL反应体系一(实施例1)试剂管分别标记为3#和4#,向3#号管中加入2μL的F16-1(20μM)和R16-1(20μM),向4#号管中加入2μL的F16-2(20μM)和R16-2(20μM);并分别在3#和4#号管中各加入5μL HPV16DNA模板DNA I#和1U的BstDNA聚合酶,然后再分别补灭菌水13.5μL到3#和4#号管中。
将3#和4#号管分别混匀,放入到37℃的金属浴或水浴锅中,反应15分钟。然后取出,分别加入50μL的1:1酚氯仿试剂,震荡混匀,12000离心30秒,取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳,可见3#和4#号管的电泳结果中各有一条单一且亮度相当的条带。结果见附图2。
取出2个预装了25μL反应体系二(实施例1)试剂管分别标记为5#和6#,向5#号管中加入2μL的F16-1(20μM)和R16-1(20μM),向6#号管中加入2μL的F16-2(20μM)和R16-2(20μM);并分别在5#和6#号管中各加入5μL HPV16DNA模板DNA I#和1U的BstDNA聚合酶,然后再分别补灭菌水13.5μL到5#和6#号管中。
将5#和6#号管分别混匀,放入到37℃的金属浴或水浴锅中,反应15分钟。然后取出,分别加入50μL的1:1酚氯仿试剂,震荡混匀,12000离心30秒,取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳,可见5#和6#号管的电泳结果中条带不单一,有杂带出现,目的条带亮度较低。结果见附图3。
实施例3
亚精胺和甲酰胺对核酸模板纯度的要求
取出1个预装了25μL反应体系一(实施例1)试剂管7#;和1个预装了25μL反应体系二(实施例1)的试剂管8#,分别向7#和8#管中各加入2μL的F16-1(20μM)和R16-1(20μM);并分别在7#和8#号管中各加入5μLHPV16DNA模板DNA II#和1U的BstDNA聚合酶,然后再分别补灭菌水13.5μL到7#和8#号管中。
将7#和8#号管分别混匀,放入到37℃的金属浴或水浴锅中,反应15分钟。然后取出,分别加入50μL的1:1酚氯仿试剂,震荡混匀,12000离心30秒,取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳,可见7#号管的电泳结果中有一条单一的条带;而8#号管的扩增结果弥散,未见条带。结果见附图4。
实施例4
反转录扩增
取出1个预装了25μL反应体系一(实施例1)试剂管9#;和1个预装了25μL反应体系一(实施例1)的试剂管10#,分别向9#和10#管中各加入2μL的MTBF16(20μM)和MTBR16(20μM);并在9#号管中加入5μL RNA模板RNA I#、1U的BstDNA聚合酶和和1U的AMV反转录酶;在10#号管中加入5μL RNA模板RNA II#、1U的BstDNA聚合酶和1U的AMV反转录酶,作为阴性对照;然后再分别补无RNA酶水13.5μL到9#和10#号管中。
将9#和10#号管分别混匀,放入到37℃的金属浴或水浴锅中,反应15分钟。然后取出,分别加入50μL的1:1酚氯仿试剂,震荡混匀,12000离心30秒,取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳,可见9#号管的电泳结果中有一条单一的条带;而10#号管则没有条带出现。结果见附图5。
实施例5
多重不对称扩增
正向引物混合物:F16-1、F18、F31、F33、F35、F39、F45、F51、F52、F56、F58、F59、F68、F26、F53、F66、F73和F82各40μM。
反向引物混合物:R16-1、R18、R31、R33、R35、R39、R45、R51、R52、R56、R58、R59、R68、R26、R53、R66、R73和R82各20μM。
分别取出19个预装了25μL实施例1中的反应体系一的试剂管11#、12#、13#、14#、15#、16#、17#、18#、19#、20#、21#、22#、23#、24#、25#、26#、27#、28#、29#,分别向各管中各加入10μL的正向引物混合物和2μL反向引物混合物。
并分别依次用HPV16型DNA、18型DNA、31型DNA、33型DNA、35型DNA、39型DNA、45型DNA、51型DNA、52型DNA、56型DNA、58型DNA、59型DNA、68型DNA、26型DNA、53型DNA、66型DNA、73型DNA、82型DNA和人基因组DNA(作为阴性对照)作为扩增模板。即依次在11#、12#、13#、14#、15#、16#、17#、18#、19#、20#、21#、22#、23#、24#、25#、26#、27#、28#、29#号管中分别加入5μL的16型DNA、18型DNA、31型DNA、33型DNA、35型DNA、39型DNA、45型DNA、51型DNA、52型DNA、56型DNA、58型DNA、59型DNA、68型DNA、26型DNA、53型DNA、66型DNA、73型DNA、82型DNA和人基因组DNA模板,然后分别1U的BstDNA聚合酶并补灭菌水5.5μL到各管中。
分别将各管混匀,放入到37℃的金属浴或水浴锅中,反应15分钟,然后取出扩增产物无需热变性,用膜芯片进行杂交检测,可见肉眼可判定的显色点出现在相对应的探针位置上。结果见附图6,说明多重引物混合后,针对每一个型别的DNA模板都能成功扩增出对应型别的产物,并且扩增特异,没有非特异性扩增,实现了多重扩增效果;还能说明扩增产物是单链,扩增产物不用进行热变性,可以直接进行杂交,实现了不对称扩增效果;其中,HC和PC是两个质控点,阴性和阳性都会出现。
实施例6
荧光染料扩增
取出2个预装了25μL反应体系一(实施例1)试剂管30#和31#,分别向30#和31#管中各加入2μL的F16-1(20μM)和R16-1(20μM);并在30#号管中加入5μL DNA模板DNA I#;在31#号管中加入5μL DNA模板人基因组DNA,作为阴性对照;然后再分别加入1U的BstDNA聚合酶并补无菌水13.5μL到30#和31#号管中。
将30#和31#号管分别混匀,放入到37℃的金属浴或水浴锅中,反应15分钟。然后用荧光扫描仪进行结果判读,从产物熔解曲线图可见单一峰。结果见附图7和图8,其中,实验组(图7)为单一峰,说明可以扩增出特异性产物;而阴性对照组(图8)没有峰出现,即没有产物扩增出来。
实施例7
荧光探针扩增
取出2个预装了25μL反应体系一(实施例1)试剂管32#和33#,分别向32#和33#管中各加入2μL的F16-1(20μM)和R16-1(20μM);并在32#号管中加入5μL DNA模板DNA I#;在33#号管中加入5μL DNA模板人基因组DNA,作为阴性对照;然后再分别加入4μL浓度为20μM)的荧光探针(SEQID No.41CCATATCTACTTCAGAAACTA,5端HEX+,3端BHQ修饰)、1U的BstDNA聚合酶并补无菌水至体积50μL到32#和33#号管中。
将32#和33#号管分别混匀,放入到37℃的金属浴或水浴锅中,反应15分钟。然后用荧光扫描仪进行结果判读,从产物扩增曲线图可见32#号管有产物扩增。结果见附图9和图10,实验组(图9)有扩增曲线,说明扩增出产物;对照组(图10)无扩增曲线出现,说明没有产物扩增。
实施例8
体系三:解旋酶10ng/μL、甲酰胺的体积百分含量为0.1%、亚精胺0.5ng/μL、氯化镁5mM、冰醋酸的体积百分含量为1%、UvsX蛋白40ng/μL、UvsY蛋白35ng/μL、单链结合蛋白500ng/μL、牛血清白蛋白1mg/mL、dNTPs50mM、Tris碱10mM;pH6.5。
取出1个预装了25μL反应体系三试剂管34#,向34#管中加入2μL的F16-1(20μM)和R16-1(20μM),5μL HPV16DNA模板DNA I#和1U的BstDNA聚合酶,然后再分别补灭菌水至50μL到34#号管中。
将34#号管混匀,放入到37℃的金属浴或水浴锅中,反应15分钟。然后取出,加入50μL的1:1酚氯仿试剂,震荡混匀,12000离心30秒,取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳,可见34#号管的电泳结果中有一条单一的条带。结果见附图11。
实施例9
体系四:解旋酶15ng/μL、甲酰胺的体积百分含量为0.5%、亚精胺5ng/μL、氯化镁100mM、冰醋酸的体积百分含量为5%、UvsX蛋白80ng/μL、UvsY蛋白90ng/μL、单链结合蛋白1000ng/μL、牛血清白蛋白5mg/mL、dNTPs 100mM、Tris碱50mM、以及甜菜碱5ng/μL;pH8.2。
取出1个预装了25μL反应体系三试剂管35#,向35#管中加入2μL的F16-1(20μM)和R16-1(20μM),5μL HPV16DNA模板DNA I#和2U的BstDNA聚合酶,然后再分别补灭菌水13.5μL到35#号管中。
将35#号管混匀,放入到37℃的金属浴或水浴锅中,反应15分钟。然后取出,加入50μL的1:1酚氯仿试剂,震荡混匀,12000离心30秒,取5μL上清液进行琼脂糖凝胶电泳,可见35#号管的电泳结果中有一条单一的条带。结果见附图12。
LHA1760134 核 苷 酸 序 列 表
<110>刘琳
<120> 一种恒温核酸扩增反应试剂
<130> LHA1760134
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<223>F16-1
<400> 1
AATAACAAAATATTAGTTC;
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<223> R16-1
<400> 2
ACTTTTCCTTTAAATTTAC;
<210>3
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F16-2
<400> 3
CCGCAGGTGACGTCTAGTCACATCCTAGTCATCACATG;
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R16-2
<400> 4
CGTCGCCCATCGTCCTCCCCGTGTCGTAGGTACTCCTTAA;
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MTBF16
<400> 5
GCGGCAUGCUUAACACA;
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<223> MTBR16
<400> 6
UGAGUUUUAGCCUUGCGG;
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<223>F18
<400> 7
ATGTGCCTGTATACACGGG;
<210>8
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<223> R18
<400> 8
TCAACATGTCTGCTATACTGC;
<210>9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F31
<400> 9
ATTTTTTTACAGATGTCTCTGTGGCGG;
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R31
<400> 10
GGTCAATCCAAAATTCCAATCTTCC;
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223>F33
<400> 11
GTGCTGACTTTGTTTTACATCC;
<210>12
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列
<223> R33
<400> 12
GCAGTTAAGGTAACTTTGCA;
<210>13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F35
<400> 13
ATGTCTCTGTGGCGGTCT;
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R35
<400> 14
CTCTAAAATGGACGGGTTC;
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<223>F39
<400> 15
ATGGCTATGTGGCGGT;
<210>16
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列
<223> R39
<400> 16
GGAGGAGCTACAGCAAAAT;
<210>17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F45
<400> 17
CCCTATTTTTTTGCAGATGGCT;
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R45
<400> 18
GGAGGGACACCAAAATTCCAATTT;
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223>F51
<400> 19
GTGGGGATTACTATTTGTGG;
<210>20
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列
<223> R51
<400> 20
GCCATTACCTCTGTAGTTAAAG;
<210>21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F52
<400> 21
CATCCTAGTTATTTTTTACTACGTCGCAGG;
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R52
<400> 22
GCCAAATTGCCAGTCCTCTAAAATA;
<210> 23
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<223>F56
<400> 23
TACCCATGATGTATATATACAGGGATCCTCC;
<210>24
<211> 27
<212> DNA
<213>人工序列
<223> R56
<400> 24
GCCATAACCTCTGCAGACAAAGTAATT;
<210>25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F58
<400> 25
ATGGTGCTGATTTTCTGTTG;
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R58
<400> 26
CCAGTCCTCCAAAATATTTG;
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<223>F59
<400> 27
TACCACGCAGGCAGTTC;
<210>28
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列
<223> R59
<400> 28
CAGTAGGAGGTGGTGTAACAC;
<210>29
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F68
<400> 29
ATGGCATTGTGGCGA;
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R68
<400> 30
GGCAACACCAAAATTCCA;
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<223>F26
<400> 31
ATGGCTTTGTGGCGTAC;
<210>32
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列
<223> R26
<400> 32
TCCAATATGGAGGCATTC;
<210>33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F53
<400> 33
TGGCGGCCTAGTGACAGCAA;
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R53
<400> 34
TAGTGGCAACAGGAGGCGA;
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<223>F66
<400> 35
TATATACAGGGAGCTACATTTGCAC;
<210>36
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列
<223> R66
<400> 36
GCAAATATGCCATAACTTCTGCAGT;
<210>37
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F73
<400> 37
ATGTGGCGACCTACTGATG;
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R73
<400> 38
GGTAAGACCAAAATTCCACTC;
<210>39
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> F82
<400> 39
ATGGCTTTGTGGCGTAC;
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> R82
<400> 40
GGTGTGCAGGTAAGCCATA;
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<223> 荧光探针
<400> 41
CCATATCTACTTCAGAAACTA。
Claims (5)
1.一种恒温核酸扩增反应试剂,其包括甲酰胺、亚精胺、甜菜碱、解旋酶、氯化镁、冰醋酸、UvsX蛋白、UvsY蛋白、单链结合蛋白、牛血清白蛋白、dNTPs、Tris碱和恒温DNA聚合酶;
解旋酶10ng/μL-15ng/μL、甲酰胺的体积百分含量为0.1%-0.5%、亚精胺0.5ng/μL-5ng/μL、氯化镁5mM-100mM、冰醋酸的体积百分含量为1%-5%、UvsX蛋白40ng/μL-80ng/μL、UvsY蛋白35ng/μL-90ng/μL、单链结合蛋白500ng/μL-1000ng/μL、牛血清白蛋白1mg/mL-5mg/mL、dNTPs 50mM—100mM、Tris碱10mM—50mM、恒温DNA聚合酶1U/反应-2U/反应、以及甜菜碱0-5ng/μL;
所述恒温DNA聚合酶包括BstDNA聚合酶和/或phi29DNA聚合酶;
所述试剂的pH值为7.2-7.6。
2.根据权利要求1所述的试剂,其特征在于,所述试剂中还包括荧光染料。
3.根据权利要求2所述的试剂,其特征在于,所述荧光染料选自SYBR green I、SYTO-13和SYTO-12中的至少一种。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的试剂,其特征在于,所述试剂中还包括用于扩增靶标片段的一对引物。
5.根据权利要求1-3中任意一项所述的试剂,其特征在于,所述试剂中还包括逆转录酶。
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Citations (8)
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101712973A (zh) * | 2009-09-30 | 2010-05-26 | 宁波华越生物科技有限公司 | 常温核酸扩增链替换反应试剂及常温核酸扩增方法 |
CN102465120A (zh) * | 2010-11-10 | 2012-05-23 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种荧光定量pcr反应液及荧光定量pcr方法 |
CN102816756A (zh) * | 2012-09-07 | 2012-12-12 | 江苏奇天基因生物科技有限公司 | 等温核酸扩增反应试剂及等温核酸扩增方法 |
CN104694662A (zh) * | 2015-04-03 | 2015-06-10 | 杜文红 | 核酸等温扩增反应检测方法及应用该方法的检测试剂盒 |
CN105112399A (zh) * | 2015-08-17 | 2015-12-02 | 广州和实生物技术有限公司 | 一种荧光恒温扩增技术 |
CN105543402A (zh) * | 2016-03-02 | 2016-05-04 | 刘国宪 | 等温核酸扩增反应试剂及等温核酸扩增方法 |
CN106367413A (zh) * | 2016-09-05 | 2017-02-01 | 博奥生物集团有限公司 | 一种核酸的扩增方法及应用 |
CN106498060A (zh) * | 2016-11-03 | 2017-03-15 | 江苏然科生物技术有限公司 | 一种荧光定量pcr反应液及方法 |
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PCR增强剂对药材DNA分子鉴定的影响;蒋超等;《中国中药杂志》;20130831;第38卷(第16期);第2571-2576页 * |
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