CN109652508A

CN109652508A - 一种简便快速检测核酸方法

Info

Publication number: CN109652508A
Application number: CN201811471771.3A
Authority: CN
Inventors: 张韧; 沈赟彬; 金帅涛
Original assignee: Zhejiang Tianhang Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Tianhang Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2019-04-19

Abstract

本发明涉及一种简便检测核酸方法，其体系包括UvsX蛋白，UvsY蛋白，GP32蛋白，Bsu蛋白，Cas12a蛋白，一对引物，向导RNA，核酸探针，缓冲液和待检的核酸样品。应用该方法可以检测DNA，加入RNA反转录酶可以检测RNA，检测结果以胶体金形式可视化呈现。本方法操作简便，反应时间短，只需15‑60分钟，无需仪器读值，在30℃‑45℃即可实现检测核酸包括DNA和/或RNA样本。

Description

一种简便快速检测核酸方法

技术领域

本发明涉及核酸检测方法，具体涉及临床样品中检测核酸的方法。

背景技术

特异性检测核酸分子极具应用价值，比如病原体，遗传病，食品，环境等检测。传统的核酸检测方法是Sourthern和Northern，但操作繁杂。目前常用的核酸检测方法是PCR或荧光定量PCR，但是操作繁杂而且要借助仪器。传统的体外DNA扩增主要是基于PCR方法，已经广泛应用于生物领域。PCR是由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成，需要温度的变化才能完成，变性需要90-95℃加热，退火需要加热至50-65℃，延伸需要提高到70-75℃。扩增反应借助PCR仪，鉴定需要凝胶电泳，共耗时1.5h以上。因此需要一种简便的检测核酸方法。

在Olaf Piepenburg et al(DNA Detection Using Recombination Proteins,PLoS Biology Vol 4,No7,p e204)中提供一种等温扩增核酸的方法(RPA)。UvsX与引物结合形成的蛋白质-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应并启动DNA合成，被替换的DNA链与GP32结合，防止进一步替换。Bsu对模板上的目标区域进行指数式扩增，UvsY辅助UvsX作用。整个过程非常快，一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。但是RPA扩增引物可能出现非特异性结合，产生非特异性目的条带。

张峰等基于Cas13a的旁路活性建立快速检测RNA的方法(Jonathan S.Gootenberget al,Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2,Science)。基本原理是向导RNA引导Cas13a蛋白特异识别目标核酸，Cas13a蛋白识别核酸后就“切割”任意核酸，体系探针核酸就会发出荧光，信号放大从而达到检测目的。但是在该方法中Cas13a识别的是RNA，由于RNA不稳定，操作难度非常大，而且多一步转录的步骤。杜娜等基于Cas12a的旁路活性建立快速检测DNA的方法,Janice S.Chen et.al CRISPR-Cas12a target bindingunleashes indiscriminate single-stranded DNase activity,Science)。该方法先利用RPA等温扩增核酸，然后利用Cas12a蛋白检测目标核酸，需要两步反应，操作不简便，而且读取最终结果需要荧光酶标仪，依赖仪器，不适合家居和野外检测。

发明内容

本发明目的是针对现有技术的不足，创新性地将RPA等温扩增和Cas检测合为一个步骤，并且以试纸条的形式呈现检测结果，操作简便、时间短，无需仪器，等温反应即可。

本发明提供一种简便检测核酸的试剂盒，其特征在于包含以下成分：UvsX蛋白，UvsY蛋白，GP32蛋白，Bsu蛋白，Cas12a，上游引物,下游引物(针对待检测的DNA或RNA设计)，向导RNA(针对待检测的DNA或RNA设计)，核酸探针，HEPES，乙酸钾，乙酸镁，DTT，PEG-20000，dNTPs，ATP，NaCl，磷酸肌酸，肌酸激酶，任选地，还包括RNA反转录酶，RNase抑制剂。

进一步地，按25μl反应体系计，各组分配制成如下：UvsX蛋白(50-200ng/μl)，UvsY蛋白(50-200ng/μl)，GP32蛋白(50-200ng/μl)，Bsu蛋白(50-200ng/μl)，Cas12a(0.1-0.5μM)，上游引物(400nM),下游引物(400nM)，向导RNA(0.25-0.5μM)，核酸探针(0.25-0.5μM)，10-40mM HEPES，25-200mM乙酸钾，10-20mM乙酸镁，1-3mM DTT，1-5％PEG-20000，100-300μMdNTPs，1-5mM ATP，20-100mM NaCl，20-100mM磷酸肌酸，20-200ng/μl肌酸激酶。如果是检测的是RNA样品，则需要进一步加入RNA反转录酶1μL。

优选地，UvsX蛋白、UvsY蛋白、GP32蛋白分别来自为T4噬菌体或T6噬菌体。例如，UvsX蛋白为T4噬菌体或T6噬菌体UvsX或大肠杆菌RecA蛋白或酵母的Rad51蛋白或类似的链置换蛋白；UvsY蛋白为T4噬菌体或T6噬菌体UvsY蛋白或大肠杆菌RecF、RecO、RecR蛋白或酵母的Rad52蛋白；GP32蛋白为T4噬菌体或T6噬菌体GP32或大肠杆菌SSB蛋白或酵母的RPA蛋白或类似的链置换蛋白；所述的Bsu蛋白为枯草芽胞杆菌Bsu蛋白或类似的DNA聚合酶。

进一步地，Bsu蛋白为枯草芽胞杆菌Bsu蛋白或类似的DNA聚合酶，Cas12a蛋白为具有旁路切割DNA活性的Cas蛋白。

其中，加入RNA反转录酶可以实现对RNA的检测，RNA反转录酶为M-MLV酶活或其他类似的反转录酶。

所述核酸探针是带有荧光基团经大于两个碱基连接的Biotin。例如是5’FAM-(NN)n-Biotin 3’，N代表ATGC中任意碱基，n大于2，优选为n等于5，更优选如3’FAM-TTATT-Biotin 3’。其中，FAM可以用TEX或JOE或Cy5或Cy3或HEX或TAMRA等荧光基团代替。

本发明还提供一种简便检测核酸方法，其是采用上述试剂盒，与待检核酸样品于30℃-45℃加热15-60分钟，随后即可对DNA和RNA的进行检测。优选地，加热温度为35-40℃，进一步优选为36－38℃，最优选为37℃，加热时间优选为20-60分钟，更优选为30-50分钟。

其中，检测结果以试纸条或胶体金的形式呈现可视化检测结果，进一步地，所述试纸条或胶体金的形式可以检测FAM或TEX或JOE或Cy5或Cy3或HEX或TAMRA等荧光基团。

本发明的原理在于，如果引物对能够成功针对待检测核酸获得扩增产物，则向导RNA将引导Cas蛋白识别扩增产物，识别之后Cas蛋白发生结构变化，就能切割任意核酸，加入的核酸探针如FAM-TTATT-Biotin就被切断，被切断的核酸探针就在胶体金上显示两道杠，即可判断为阳性。如果不能成功扩增获得产物，则向导RNA也就不会引导Cas蛋白，Cas蛋白结构不发生变化就不能切割任意核酸，加入的核酸探针如FAM-TTATT-Biotin保持完整，进而通过胶体金上显示一道杠，即可判断为阴性。

本发明巧妙的运用上述原理，通过相关试剂的巧妙组合，创新性地将RPA等温扩增和Cas检测合为一个步骤，反应时间短，操作简单方便。进一步地，以试纸条的形式呈现检测结果，操作简便，无需仪器，具有很强的适用范围和场所，实用性极强。

附图说明

图1牛腹泻病毒检测结果。

图2β-Actin检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明，其不构成对本发明的限制。

实施例一：以牛腹泻病毒为例(RNA样本)

1.提取：从牛血清中提取RNA，作为待检核酸，提取方法按常规方法进行。

2.加样：25μl反应体系中包含UvsX蛋白(100ng/μl)，UvsY蛋白(100ng/μl)，GP32蛋白(100ng/μl)，Bsu蛋白(100ng/μl)，Cas12a(0.25μM)，上游引物(400nM，序列为5’GGGGAGTCGTCAATGGTTCGACAC 3’)，下游引物(400nM，序列为5’TAACTCCATGTGCCATGTACAGCAGAG 3’)，向导RNA(0.25μM，序列为5’UAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUAGCGGAAUAGCAGGUCUC 3’)，核酸探针(0.25μM，5’FAM-TTATT-Biotin3’)，25mM HEPES，50mM乙酸钾，10mM乙酸镁，2mM DTT，2％PEG-20000，150μM dNTPs，2mM ATP，30mM NaCl，40mM磷酸肌酸，50ng/μl肌酸激酶，RNA反转录酶1μL，Rnase抑制剂(1-2μL)，待检核酸1μL。

3.将反应体系于37℃加热50分钟。

4.检测：用胶体金检测，右边除下面那一道杠外，上面还有一道杠(如箭头所指位置)，为阳性；左边仅下面有一道杠，而上面无杠(如箭头所指位置)，为阴性对照。

实施例二：以β-Actin为例(DNA样本)

1.提取：从血液中提取DNA，作为待检核酸，提取方法按常规方法进行。

2.加样：25μl反应体系中包含UvsX蛋白(100ng/μl)，UvsY蛋白(100ng/μl)，GP32蛋白(100ng/μl)，Bsu蛋白(100ng/μl)，Cas12a(0.25μM)，上游引物(400nM，序列为5’TCCATCCTGGCCTCGCTGT 3’)，下游引物(400nM，序列为5’GCTGTCACCTTCACCGTTC 3’)，向导RNA(0.25-0.5μM，序列为5’UAAUUUCUACUGUUGUAGAU UUGACAAAACCUAACUUGCG3’)，核酸探针(0.25μM，5’FAM-TTATT-Biotin 3’)，25mM HEPES，50mM乙酸钾，10mM乙酸镁，2mM DTT，2％PEG-20000，150μMdNTPs，2mM ATP，30mM NaCl，40mM磷酸肌酸，50ng/μl肌酸激酶，Rnase抑制剂(1-2μL)，待检核酸1μL。

3.将反应体系于37℃加热30分钟。

4.结果：右边除下面那一道杠外，上面还有一道杠(如箭头所指位置)，为阳性；左边仅下面有一道杠，而上面无杠(如箭头所指位置)，为阴性对照。

序列表

<110>浙江天杭生物科技股份有限公司

<120>一种简便快速检测核酸方法

<160>6

<170>PatentIn Version 2.1

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400>1

GGGGAGTCGT CAATGGTTCG ACAC 24

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400>2

TAACTCCATG TGCCATGTAC AGCAGAG 27

<210>3

<211>40

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400>3

UAAUUUCUA CUGUUGUAGA UCUAGCGGAA UAGCAGGUCUC 40

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400>4

TCCATCCTGG CCTCGCTGT 19

<210>5

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400>5

GCTGTCACCT TCACCGTTC 19

<210>6

<211>40

<212>RNA

<213>人工序列

<220>

<223> 人工序列的描述：人工合成的序列

<400>6

UAAUUUCUAC UGUUGUAGAU UUGACAAAAC CUAACUUGCG 40

Claims

1.一种简便检测核酸的试剂盒，其特征在于包含以下成分：UvsX蛋白，UvsY蛋白，GP32蛋白，Bsu蛋白，Cas12a，针对待检测核酸的上游引物和下游引物，针对待检测核酸的向导RNA，核酸探针，HEPES，乙酸钾，乙酸镁，DTT，PEG-20000，dNTPs，ATP，NaCl，磷酸肌酸，肌酸激酶，任选地，还包括RNA反转录酶，RNase抑制剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，按25μl反应体系计，各组成分组配如下：UvsX蛋白(50-200ng/μl)，UvsY蛋白(50-200ng/μl)，GP32蛋白(50-200ng/μl)，Bsu蛋白(50-200ng/μl)，Cas12a(0.1-0.5μM)，上游引物(300-500nM),下游引物(300-500nM)，向导RNA(0.25-0.5μM)，核酸探针(0.25-0.5μM)，10-40mM HEPES，25-200mM乙酸钾，10-20mM乙酸镁，1-3mM DTT，1-5％PEG-20000，100-300μM dNTPs，1-5mM ATP，20-100mM NaCl，20-100mM磷酸肌酸，20-200ng/μl肌酸激酶；任选地，还包括RNA反转录酶0.5-2μL，RNase抑制剂1-2μL。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于UvsX蛋白为T4噬菌体或T6噬菌体UvsX或大肠杆菌RecA蛋白或酵母的Rad51蛋白或类似的链置换蛋白。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于UvsY蛋白为T4噬菌体或T6噬菌体UvsY蛋白或大肠杆菌RecF、RecO、RecR蛋白或酵母的Rad52蛋白。

5.根据权利要求1所述的的试剂盒，其特征在于GP32蛋白为T4噬菌体或T6噬菌体GP32或大肠杆菌SSB蛋白或酵母的RPA蛋白或类似的链置换蛋白；所述的Bsu蛋白为枯草芽胞杆菌Bsu蛋白或类似的DNA聚合酶。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于Cas12a蛋白为具有旁路切割DNA活性的Cas蛋白。

7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于RNA反转录酶为M-MLV酶活或其他类似的反转录酶。

8.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸探针是带有荧光基团并经大于两个碱基连接的Biotin，例如是5’FAM-(NN)n-Biotin 3’，N代表ATGC中任意碱基，n大于2，优选为n等于5，更优选如3’FAM-TTATT-Biotin 3’。其中，FAM可以用TEX或JOE或Cy5或Cy3或HEX或TAMRA等荧光基团代替。

9.采用根据权利要求1至9任一项所述的试剂盒检测核酸的方法，其特征在于：将所述试剂盒各组成与待检测样品于30℃-45℃加热15-60分钟，随后进行结果检测，优选地加热温度为35-40℃，优选地加热时间为20-60分钟，更优选为30-50分钟。

10.根据权利要求9所述的检测核酸的方法，其特征在于检测结果以试纸条或胶体金的形式呈现可视化检测结果，进一步地，所述试纸条或胶体金的形式可以检测FAM或TEX或JOE或Cy5或Cy3或HEX或TAMRA等荧光基团。