CN109652508A - 一种简便快速检测核酸方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种简便检测核酸方法,其体系包括UvsX蛋白,UvsY蛋白,GP32蛋白,Bsu蛋白,Cas12a蛋白,一对引物,向导RNA,核酸探针,缓冲液和待检的核酸样品。应用该方法可以检测DNA,加入RNA反转录酶可以检测RNA,检测结果以胶体金形式可视化呈现。本方法操作简便,反应时间短,只需15‑60分钟,无需仪器读值,在30℃‑45℃即可实现检测核酸包括DNA和/或RNA样本。
Description
技术领域
本发明涉及核酸检测方法,具体涉及临床样品中检测核酸的方法。
背景技术
特异性检测核酸分子极具应用价值,比如病原体,遗传病,食品,环境等检测。传统的核酸检测方法是Sourthern和Northern,但操作繁杂。目前常用的核酸检测方法是PCR或荧光定量PCR,但是操作繁杂而且要借助仪器。传统的体外DNA扩增主要是基于PCR方法,已经广泛应用于生物领域。PCR是由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成,需要温度的变化才能完成,变性需要90-95℃加热,退火需要加热至50-65℃,延伸需要提高到70-75℃。扩增反应借助PCR仪,鉴定需要凝胶电泳,共耗时1.5h以上。因此需要一种简便的检测核酸方法。
在Olaf Piepenburg et al(DNA Detection Using Recombination Proteins,PLoS Biology Vol 4,No7,p e204)中提供一种等温扩增核酸的方法(RPA)。UvsX与引物结合形成的蛋白质-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就会发生链交换反应并启动DNA合成,被替换的DNA链与GP32结合,防止进一步替换。Bsu对模板上的目标区域进行指数式扩增,UvsY辅助UvsX作用。整个过程非常快,一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。但是RPA扩增引物可能出现非特异性结合,产生非特异性目的条带。
张峰等基于Cas13a的旁路活性建立快速检测RNA的方法(Jonathan S.Gootenberget al,Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2,Science)。基本原理是向导RNA引导Cas13a蛋白特异识别目标核酸,Cas13a蛋白识别核酸后就“切割”任意核酸,体系探针核酸就会发出荧光,信号放大从而达到检测目的。但是在该方法中Cas13a识别的是RNA,由于RNA不稳定,操作难度非常大,而且多一步转录的步骤。杜娜等基于Cas12a的旁路活性建立快速检测DNA的方法,Janice S.Chen et.al CRISPR-Cas12a target bindingunleashes indiscriminate single-stranded DNase activity,Science)。该方法先利用RPA等温扩增核酸,然后利用Cas12a蛋白检测目标核酸,需要两步反应,操作不简便,而且读取最终结果需要荧光酶标仪,依赖仪器,不适合家居和野外检测。
发明内容
本发明目的是针对现有技术的不足,创新性地将RPA等温扩增和Cas检测合为一个步骤,并且以试纸条的形式呈现检测结果,操作简便、时间短,无需仪器,等温反应即可。
本发明提供一种简便检测核酸的试剂盒,其特征在于包含以下成分:UvsX蛋白,UvsY蛋白,GP32蛋白,Bsu蛋白,Cas12a,上游引物,下游引物(针对待检测的DNA或RNA设计),向导RNA(针对待检测的DNA或RNA设计),核酸探针,HEPES,乙酸钾,乙酸镁,DTT,PEG-20000,dNTPs,ATP,NaCl,磷酸肌酸,肌酸激酶,任选地,还包括RNA反转录酶,RNase抑制剂。
进一步地,按25μl反应体系计,各组分配制成如下:UvsX蛋白(50-200ng/μl),UvsY蛋白(50-200ng/μl),GP32蛋白(50-200ng/μl),Bsu蛋白(50-200ng/μl),Cas12a(0.1-0.5μM),上游引物(400nM),下游引物(400nM),向导RNA(0.25-0.5μM),核酸探针(0.25-0.5μM),10-40mM HEPES,25-200mM乙酸钾,10-20mM乙酸镁,1-3mM DTT,1-5%PEG-20000,100-300μMdNTPs,1-5mM ATP,20-100mM NaCl,20-100mM磷酸肌酸,20-200ng/μl肌酸激酶。如果是检测的是RNA样品,则需要进一步加入RNA反转录酶1μL。
优选地,UvsX蛋白、UvsY蛋白、GP32蛋白分别来自为T4噬菌体或T6噬菌体。例如,UvsX蛋白为T4噬菌体或T6噬菌体UvsX或大肠杆菌RecA蛋白或酵母的Rad51蛋白或类似的链置换蛋白;UvsY蛋白为T4噬菌体或T6噬菌体UvsY蛋白或大肠杆菌RecF、RecO、RecR蛋白或酵母的Rad52蛋白;GP32蛋白为T4噬菌体或T6噬菌体GP32或大肠杆菌SSB蛋白或酵母的RPA蛋白或类似的链置换蛋白;所述的Bsu蛋白为枯草芽胞杆菌Bsu蛋白或类似的DNA聚合酶。
进一步地,Bsu蛋白为枯草芽胞杆菌Bsu蛋白或类似的DNA聚合酶,Cas12a蛋白为具有旁路切割DNA活性的Cas蛋白。
其中,加入RNA反转录酶可以实现对RNA的检测,RNA反转录酶为M-MLV酶活或其他类似的反转录酶。
所述核酸探针是带有荧光基团经大于两个碱基连接的Biotin。例如是5’FAM-(NN)n-Biotin 3’,N代表ATGC中任意碱基,n大于2,优选为n等于5,更优选如3’FAM-TTATT-Biotin 3’。其中,FAM可以用TEX或JOE或Cy5或Cy3或HEX或TAMRA等荧光基团代替。
本发明还提供一种简便检测核酸方法,其是采用上述试剂盒,与待检核酸样品于30℃-45℃加热15-60分钟,随后即可对DNA和RNA的进行检测。优选地,加热温度为35-40℃,进一步优选为36-38℃,最优选为37℃,加热时间优选为20-60分钟,更优选为30-50分钟。
其中,检测结果以试纸条或胶体金的形式呈现可视化检测结果,进一步地,所述试纸条或胶体金的形式可以检测FAM或TEX或JOE或Cy5或Cy3或HEX或TAMRA等荧光基团。
本发明的原理在于,如果引物对能够成功针对待检测核酸获得扩增产物,则向导RNA将引导Cas蛋白识别扩增产物,识别之后Cas蛋白发生结构变化,就能切割任意核酸,加入的核酸探针如FAM-TTATT-Biotin就被切断,被切断的核酸探针就在胶体金上显示两道杠,即可判断为阳性。如果不能成功扩增获得产物,则向导RNA也就不会引导Cas蛋白,Cas蛋白结构不发生变化就不能切割任意核酸,加入的核酸探针如FAM-TTATT-Biotin保持完整,进而通过胶体金上显示一道杠,即可判断为阴性。
本发明巧妙的运用上述原理,通过相关试剂的巧妙组合,创新性地将RPA等温扩增和Cas检测合为一个步骤,反应时间短,操作简单方便。进一步地,以试纸条的形式呈现检测结果,操作简便,无需仪器,具有很强的适用范围和场所,实用性极强。
附图说明
图1牛腹泻病毒检测结果。
图2β-Actin检测结果。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步的说明,其不构成对本发明的限制。
实施例一:以牛腹泻病毒为例(RNA样本)
1.提取:从牛血清中提取RNA,作为待检核酸,提取方法按常规方法进行。
2.加样:25μl反应体系中包含UvsX蛋白(100ng/μl),UvsY蛋白(100ng/μl),GP32蛋白(100ng/μl),Bsu蛋白(100ng/μl),Cas12a(0.25μM),上游引物(400nM,序列为5’GGGGAGTCGTCAATGGTTCGACAC 3’),下游引物(400nM,序列为5’TAACTCCATGTGCCATGTACAGCAGAG 3’),向导RNA(0.25μM,序列为5’UAAUUUCUACUGUUGUAGAUCUAGCGGAAUAGCAGGUCUC 3’),核酸探针(0.25μM,5’FAM-TTATT-Biotin3’),25mM HEPES,50mM乙酸钾,10mM乙酸镁,2mM DTT,2%PEG-20000,150μM dNTPs,2mM ATP,30mM NaCl,40mM磷酸肌酸,50ng/μl肌酸激酶,RNA反转录酶1μL,Rnase抑制剂(1-2μL),待检核酸1μL。
3.将反应体系于37℃加热50分钟。
4.检测:用胶体金检测,右边除下面那一道杠外,上面还有一道杠(如箭头所指位置),为阳性;左边仅下面有一道杠,而上面无杠(如箭头所指位置),为阴性对照。
实施例二:以β-Actin为例(DNA样本)
1.提取:从血液中提取DNA,作为待检核酸,提取方法按常规方法进行。
2.加样:25μl反应体系中包含UvsX蛋白(100ng/μl),UvsY蛋白(100ng/μl),GP32蛋白(100ng/μl),Bsu蛋白(100ng/μl),Cas12a(0.25μM),上游引物(400nM,序列为5’TCCATCCTGGCCTCGCTGT 3’),下游引物(400nM,序列为5’GCTGTCACCTTCACCGTTC 3’),向导RNA(0.25-0.5μM,序列为5’UAAUUUCUACUGUUGUAGAU UUGACAAAACCUAACUUGCG3’),核酸探针(0.25μM,5’FAM-TTATT-Biotin 3’),25mM HEPES,50mM乙酸钾,10mM乙酸镁,2mM DTT,2%PEG-20000,150μMdNTPs,2mM ATP,30mM NaCl,40mM磷酸肌酸,50ng/μl肌酸激酶,Rnase抑制剂(1-2μL),待检核酸1μL。
3.将反应体系于37℃加热30分钟。
4.结果:右边除下面那一道杠外,上面还有一道杠(如箭头所指位置),为阳性;左边仅下面有一道杠,而上面无杠(如箭头所指位置),为阴性对照。
序 列 表
<110>浙江天杭生物科技股份有限公司
<120>一种简便快速检测核酸方法
<160>6
<170>PatentIn Version 2.1
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:人工合成的序列
<400>1
GGGGAGTCGT CAATGGTTCG ACAC 24
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:人工合成的序列
<400>2
TAACTCCATG TGCCATGTAC AGCAGAG 27
<210>3
<211>40
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:人工合成的序列
<400>3
UAAUUUCUA CUGUUGUAGA UCUAGCGGAA UAGCAGGUCUC 40
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:人工合成的序列
<400>4
TCCATCCTGG CCTCGCTGT 19
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:人工合成的序列
<400>5
GCTGTCACCT TCACCGTTC 19
<210>6
<211>40
<212>RNA
<213>人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述:人工合成的序列
<400>6
UAAUUUCUAC UGUUGUAGAU UUGACAAAAC CUAACUUGCG 40
Claims (10)
1.一种简便检测核酸的试剂盒,其特征在于包含以下成分:UvsX蛋白,UvsY蛋白,GP32蛋白,Bsu蛋白,Cas12a,针对待检测核酸的上游引物和下游引物,针对待检测核酸的向导RNA,核酸探针,HEPES,乙酸钾,乙酸镁,DTT,PEG-20000,dNTPs,ATP,NaCl,磷酸肌酸,肌酸激酶,任选地,还包括RNA反转录酶,RNase抑制剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,按25μl反应体系计,各组成分组配如下:UvsX蛋白(50-200ng/μl),UvsY蛋白(50-200ng/μl),GP32蛋白(50-200ng/μl),Bsu蛋白(50-200ng/μl),Cas12a(0.1-0.5μM),上游引物(300-500nM),下游引物(300-500nM),向导RNA(0.25-0.5μM),核酸探针(0.25-0.5μM),10-40mM HEPES,25-200mM乙酸钾,10-20mM乙酸镁,1-3mM DTT,1-5%PEG-20000,100-300μM dNTPs,1-5mM ATP,20-100mM NaCl,20-100mM磷酸肌酸,20-200ng/μl肌酸激酶;任选地,还包括RNA反转录酶0.5-2μL,RNase抑制剂1-2μL。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于UvsX蛋白为T4噬菌体或T6噬菌体UvsX或大肠杆菌RecA蛋白或酵母的Rad51蛋白或类似的链置换蛋白。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于UvsY蛋白为T4噬菌体或T6噬菌体UvsY蛋白或大肠杆菌RecF、RecO、RecR蛋白或酵母的Rad52蛋白。
5.根据权利要求1所述的的试剂盒,其特征在于GP32蛋白为T4噬菌体或T6噬菌体GP32或大肠杆菌SSB蛋白或酵母的RPA蛋白或类似的链置换蛋白;所述的Bsu蛋白为枯草芽胞杆菌Bsu蛋白或类似的DNA聚合酶。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于Cas12a蛋白为具有旁路切割DNA活性的Cas蛋白。
7.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于RNA反转录酶为M-MLV酶活或其他类似的反转录酶。
8.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于:所述核酸探针是带有荧光基团并经大于两个碱基连接的Biotin,例如是5’FAM-(NN)n-Biotin 3’,N代表ATGC中任意碱基,n大于2,优选为n等于5,更优选如3’FAM-TTATT-Biotin 3’。其中,FAM可以用TEX或JOE或Cy5或Cy3或HEX或TAMRA等荧光基团代替。
9.采用根据权利要求1至9任一项所述的试剂盒检测核酸的方法,其特征在于:将所述试剂盒各组成与待检测样品于30℃-45℃加热15-60分钟,随后进行结果检测,优选地加热温度为35-40℃,优选地加热时间为20-60分钟,更优选为30-50分钟。
10.根据权利要求9所述的检测核酸的方法,其特征在于检测结果以试纸条或胶体金的形式呈现可视化检测结果,进一步地,所述试纸条或胶体金的形式可以检测FAM或TEX或JOE或Cy5或Cy3或HEX或TAMRA等荧光基团。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20190419 |
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