CN104688933B - 一种普洱茶有效成分的组合物及其在制备治疗降糖的药物或保健食品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种含有普洱茶有效成分的组合物，该组合物包括0～5重量份的茶多酚组分，6～12重量份的茶褐素组分以及0～1重量份的咖啡因组分，以及该组合物在制备治疗或预防糖尿病的药物或食品中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及医药及保健食品领域，具体涉及一种含有普洱茶的有效成分配比的组合物及其在制备治疗降糖的药物或保健食品中的应用。
背景技术
普洱茶原产地主要在云南的思茅地区和西双版纳。随着大叶种的推广，四川、广东、广西也成为普洱茶生产的省份。随着经济的发展，人们保健意识的增强，普洱茶因其滋味醇厚回甘，陈香独特的优良品质和其对人体的特殊保健功效起全社会的关注和重视，产品深受消费者的青睐。
普洱茶性温和耐贮藏，适于烹用或泡饮。我国古代不少史籍有很多关于普洱茶功效的记载：赵学敏《本草纲目拾遗》记载，普黑如漆，醒酒第一，消食化痰，清胃生津，功力尤大也；《木部》中又云，普洱茶膏能治百病，如肚受寒，用姜汤发散，出汗即可愈，口破喉燥，受热疼痛，用五分嚼口过夜即愈；陈宗海撰《思茅厅采访》记载“普洱帮助消化驱散寒冷，有解毒作用。”清宋士雄《随息居饮食谱》云“普洱产者，味重善吐风痰消肉食，凡暑秽疹气腹痛，霍乱痢疾等症初起，饮之辄愈”。由此可见前人对普洱茶保健经验认为，普洱茶具有消食除毒，理气去胀，清热化痰，驱风醒酒，治痢抑菌等功效。
糖尿病是一种代谢紊乱性疾病，特征表现为高血糖症、糖尿、负氮平衡，有时会出现酮血症。糖尿病可引起一系列的并发症，如视网膜病、神经***疾病以及周围血管坏死等。2型糖尿病也称非胰岛素依赖型糖尿病，一种多因素引发的疾病，表现为胰岛素抵抗，不仅与高胰岛素症和高血糖症有关，还与动脉硬化症、高血压、血脂异常即X综合征有关。
国内外学者做了大量的前期研究工作，从临床等角度初步证明了普洱茶确实具有降血糖血脂功效。根据文献检索普洱茶中含有的多种组分，例如茶褐素组分、茶多酚组分和咖啡因组分等在降血糖方面都有相应的报道，例如文献报道中茶多酚在大剂量下能降低空服血糖和餐后血糖，茶色素(包括茶黄素、茶红素和茶褐素等水溶性色素)已经被开发成胶囊应用到糖尿病的辅助治疗当中，尤其是伴有微循环障碍的2型糖尿病患者的辅助治疗等。然而普洱茶中的这些组分在降血糖功效中都分别发挥什么作用，哪些组分贡献最大，什么样的配伍配比能够发挥最大的降糖功效，尚无结论。
为探究这三类组分各自的作用以及它们的配伍后的生物学活性，本发明进行了深入的研究，经过对茶褐素组分、茶多酚组分和咖啡因组分的提取分离，并将它们进行多种配比筛选。
发明内容
本发明提供了一种含有普洱茶有效成分的组合物，包括0～5重量份的茶多酚组分，6～12重量份的茶褐素组分以及0～1重量份的咖啡因组分，所述茶多酚组分、茶褐素组分、咖啡因组分是按照如下方法进行制备的：
茶褐素组分制备方法：
普洱茶加水升温浸提1-3次，每次0.5-1小时，提取液浓缩后加90-100％乙醇(v/v)至含醇量70-80％(v/v)，静至12小时以上，醇沉物干燥得到茶褐素粗品，茶褐素粗品用水复溶，过滤，滤液浓缩至干得到茶褐素组分；
茶多酚组分制备方法：
普洱茶加水升温浸提1-3次，每次0.5-1小时，提取液浓缩后加90-100％乙醇(v/v)至含醇量70-80％(v/v)，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到4-6，静置，离心，分离沉淀物用硫酸溶液溶解，溶液用乙酸乙酯萃取，萃取物除去溶剂得到茶多酚组分；
咖啡因组分制备方法：
普洱茶加水升温浸提1-3次，每次0.5-1小时，提取液浓缩后加90-100％乙醇(v/v)至含醇量70-80％(v/v)，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到4-6，静置，离心，得到上清液，上清液经浓缩干燥得到固体，用水复溶，过滤，过大孔吸附树脂柱，并用水洗脱得到流出液，上样流出液和水洗液浓缩，用氯仿萃取，萃取物经过分离得到咖啡因组分。
进一步的，本发明的茶多酚组分、茶褐素组分、咖啡因组分优选按照如下方法进行制备：
茶褐素组分制备方法：
普洱茶加10倍量的水80℃高温浸提三次，每次0.5-1小时，合并提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加95％乙醇醇沉至80％，静至12小时以上，醇沉物真空减压干燥得到茶褐素粗品，用水复溶过滤，滤液70℃以下减压浓缩至干，得到茶褐素组分；
茶多酚组分制备方法：
普洱茶加10倍量的水80℃高温浸提三次，每次0.5-1小时，合并提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加95％乙醇醇沉至80％，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入等质量的三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到5.4，静置，离心，沉淀用硫酸溶液转溶，用乙酸乙酯萃取，萃取物除去溶剂得到茶多酚组分；
咖啡因组分制备方法：
普洱茶加10倍量的水80℃高温浸提三次，每次0.5-1小时，合并提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加95％乙醇醇沉至80％，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入等质量的三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到5.4，静置，离心，上清液经浓缩干燥得到固体，加水复溶，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱，并用水洗脱得到流出液和水洗液，减压真空浓缩至比重1.10～1.15，用氯仿萃取三次，萃取物经过分离得到咖啡因组分。
本发明的含有普洱茶有效成分的组合物，优选包括5重量份茶多酚组分，12重量份的茶褐素组分以及0重量份的咖啡因组分。
根据本发明的另一实施方式，所述的组合物，优选包括0重量份茶多酚组分，6重量份的茶褐素组分以及0.5重量份的咖啡因组分
根据本发明的另一实施方式，所述的组合物，优选包括0重量份茶多酚组分，12重量份的茶褐素组分以及1重量份的咖啡因组分。
根据本发明的另一实施方式，所述的组合物，优选包括2.5重量份茶多酚组分，12重量份的茶褐素组分以及0重量份的咖啡因组分。
根据本发明的另一实施方式，所述的组合物，优选包括5重量份茶多酚组分，6重量份的茶褐素组分以及0重量份的咖啡因组分。
根据本发明的另一实施方式，所述的组合物，优选包括0重量份茶多酚组分，12重量份的茶褐素组分以及0重量份的咖啡因组分。
本发明还提供所述含有普洱茶有效成分的组合物，其在制备治疗或预防糖尿病的药物或食品中的应用。
本发明所述的治疗或预防糖尿病的用途是通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性来实现的。
本发明所述的治疗或预防糖尿病的用途是通过抑制醛糖还原酶的活性来实现的。
本发明所述的治疗或预防糖尿病的用途是通过抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(protein tyrosine phosphatase 1B，PTP-1B)的活性来实现的。
本发明还包括，含有所述普洱茶有效成分的药物或食品组合物，本发明所述的食品包括保健食品，包括但不限于以下食品形式：饮料、乳制品、茶叶、糕点、糖果等。
本发明的药物组合物中的药物活性成分，其在组合物中所占重量百分比可以是0.01-99.99％，其余为药物可接受的载体。本发明的药物组合物，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋等。
本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、***剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。本发明的制剂，优选的是口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。
本发明的药物组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。
适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。
可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。
口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或***胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。
对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。
本发明的药物组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。
本发明的组合物在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服三次，每次1-20剂，如：1-20袋或粒或片。
以下为本研究的详细内容：
实验1普洱茶有效组分降糖的最佳配伍筛选实验
本发明是采用正交实验方法设计茶多酚组分、咖啡因组分和茶褐素组分的配伍配比，按正交表L9(34)设计安排9个实验组，以C57BL/6J小鼠作为对照组，KKAy小鼠随机分组，连续给药4周，以空腹血糖、糖耐量及体外靶酶抑制作用作为观察指标，筛选配伍配比的最佳组方。
1.实验材料
1.1实验动物
KKAy小鼠(SPF级)，雌性180只，5-6周龄。购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2009-0004。
1.2主要试剂和药品
①马来酸罗格列酮片，葛兰素史克(天津)有限公司，规格：4mg/片，批号：09090110。
②茶多酚组分，批号20111216，土黄色粉末。由天士力集团研究院中药所提供。存放于药理所供试品室样品柜内，避光室温下保存。
③茶褐素组分，批号20111209，深褐色小块状物。由天士力集团研究院中药所提供。存放于药理所供试品室样品柜内，避光室温下保存。
④咖啡因组分，批号20111115，灰白色粉末。由天士力集团研究院中药所提供。存放于药理所供试品室样品柜内，避光室温下保存。
⑤血糖测试试剂(BIOSEN 5030型血糖/乳酸分析仪配套试剂)。
1.3组分含量测定
需要说明的是，由于茶多酚组分、茶褐素组分以及咖啡因组分均为提取物，本身均不是单一物质，不为纯品，目前没有任何一种提取方法可以将这几种组分提纯，例如采用本发明的方法制备的茶多酚组分中，除含有茶多酚类物质外，还会混有一些茶多糖、茶褐素以及咖啡因类成分，同样的，茶褐素组分中，也会含有一些茶多糖、茶多酚以及咖啡因类成分等。因此，需要计算按照本发明制备方法制备的茶多酚组分、茶褐素组分以及咖啡因组分中，确切的茶多酚、茶褐素、咖啡因以及茶多糖的含量。各种成分的计算方法如下：
各组分中精确茶褐素的含量测定：在测定提取物形式的样品时，根据所测样品的出膏率对文献中茶褐素计算公式进行折算，折算结果见下表。
取样量＝3×出膏率％
式中：EB——茶褐素吸光度值
各组分中精确茶多酚的含量测定：茶多酚类成分精确含量测定方法同中华人民共和国国家标准“GB/T 8313-2008”-茶叶中茶多酚和儿茶素类含量测定方法。
各组分中精确咖啡因的含量测定：采用高效液相色谱法进行测定：
色谱条件
色谱柱：Kromasil C18(250mm×4.6mm，5μm)；
流动相：甲醇(B)-3％醋酸水溶液(A)进行线性梯度洗脱，如下表所示：
流速：1.0ml/min；
检测波长：280nm；
柱温：30℃；
供试品进样量：10μl；
检测：记录时间50min。
各组分中精确茶多糖的含量测定：采用硫酸蒽酮法进行测定，具体方法为：(1)供试品溶液的制备：取本品粉末约0.5-1g，置250mL烧瓶中，加80％乙醇50mL，95℃水浴回流30min，趁热滤过，用热80％乙醇洗涤3次(30mL/次)，挥干溶剂，滤纸连同滤渣一起置烧瓶中，加50mL水，加热回流1h，趁热过滤，用热水洗涤，合并滤液，定容至100mL。精密吸取5mL提取溶液，置聚酰胺层析柱(15cm×2cm)中，用热水洗脱，收集滤液，定容至100mL，作为供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备
取D-无水葡萄糖对照品适量，精密称定(精确至0.001g)，加水溶解并稀释制成每1ml中含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。
(3)标准曲线的绘制
分别精密吸取对照品溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml分别置10ml具塞试管中，分别加二纯水至1.0ml，各精密加入5％的苯酚溶液(称取2.5g重蒸酚，加水溶解并稀释至50ml，摇匀，即得。)1.0ml，振摇混匀，加5.0ml硫酸，用微型漩涡混合仪迅速振摇混匀，室温下放置30分钟，以第1管为空白，照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版一部附录VB)，在487nm波长处测定吸光度(在1小时内测定完毕)。以吸光度(Y)和质量(x)作标准曲线，回归方程为：
Y＝a·X+b
式中：
Y为对照品溶液的吸光度；
X为D-无水葡萄糖的质量(mg)；
a，b为常数。
(4)供试品溶液的测定
精密吸取1ml供试品溶液，按照标准曲线的绘制项下，自“精密加入5％的苯酚溶液1.0ml”起，同法操作，在487nm处分别测定吸光度。
(5)数据处理
按下式计算含量：
式中：
C为样品中的茶多糖百分含量；
A为样品的吸光度；
W为称样量(g)；
V为定容体积(mL)；
f为稀释倍数；
b为常数。
按照上述各种成分含量的精确计算方法，可得按照本发明方法制备的茶多酚组分、茶褐素组分以及咖啡因组分三种组分中，各成分的精确含量为：
1.4实验仪器
BIOSEN 5030型血糖/乳酸分析仪，德国EKF制造；
PL303电子天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
T2000电子天平：美国双杰兄弟(集团)有限公司。
2.实验方法
2.1正交实验法筛选最佳配比
2.1.1因素水平的确定
茶多酚组分、茶褐素组分、咖啡因组分，每种组分拟定3个剂量水平。选择一个三因素三水平的L9(34)正交表安排实验，具体因素水平安排，见表1。
表1因素水平表(g/kg)
2.1.2正交实验安排
按L9(34)正交表提供的配方，组成9个不同的组方进行试验。具体方法是选择KKAy小鼠(SPF级)，随机分为9组。各组分别按L9(34)正交表所设计的实验组别表(见表2)进行实验，以空腹血糖值、糖耐量为观察指标。最后以两个指标的综合评分为疗效指标，并分析组方中3种组分的最佳用药配比及其在组方中的主次关系。
表2 L9(34)正交实验安排表
2.1.3正交实验组分制备
按L9(34)正交表设计的9个实验组方，临用前各组方中的实验样品分别按其剂量水平比例混合，粉碎机粉碎混匀。
3.1.4正交实验各组分中多种成分实际给药剂量
根据1.3节组分含量测定，计算各组分中成分含量，见表3。
表3各组分中多种成分实际给药剂量计算
2.2分组及给药：
动物高脂饲料喂养四周后按照空腹血糖测定方法测定空腹血糖，按实测空腹血糖值分层随机分组。
180只KKAy中选取空腹血糖＞18.1mmol/L的入组，随机分为10组：阳性药组(1.33mg·kg-1·d-1，n＝15)；组分1～9组(n＝15)。正常C57BL/6J小鼠(n＝11)做对照组。
对照组：灌胃蒸馏水(10ml/kg BW)；
阳性药组：用蒸馏水配制阳性药溶液，灌胃(10ml/kg BW)，给药剂量1.33mg/kg/日；
各组分组按照正交表剂量用蒸馏水配制溶液，灌胃(10ml/kg BW)。
2.3观察指标：
2.3.1日常观察指标
实验期间观察动物精神、活动、毛色、及尿量粪便变化情况；每周定量测定进食量及体重。
2.3.2空腹血糖测定
分组前及给药后7d、14d、21d、28d分别尾静脉取血测空腹血糖值。所有动物均禁食(自由饮水)5h后取血，于取血前1h各组动物灌胃给药，取血时断尾取末梢血10μl，用BIOSEN5030型血糖/乳酸分析仪测定空腹血糖。
2.3.3糖耐量实验观察指标及检测方法
给药28d动物禁食5h(自由饮水)，灌胃组于取血前1h给药，禁食结束时经口给予葡萄糖2.0g·kg-1，测定给葡萄糖后0h、0.5h、1h、2h的血糖值，观察各组给予葡萄糖后各时间点血糖值的变化，并计算血糖曲线下面积。
血糖曲线下面积(AUC)＝1/2×(0h血糖值+0.5h血糖值)×0.5+1/2×(0.5h血糖值+1h血糖值)×0.5+1/2×(1h血糖值+2h血糖值)×1。
2.3.4对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用
以蔗糖为底物，受试样品与大鼠小肠上段提取的α-葡萄糖苷酶反应，依据葡萄糖的释放量来判定样品对α-葡萄糖糖苷酶活性的抑制作用。
小肠的处理：将禁食7小时的大鼠断头处死并解剖，取小肠中段约10cm长作为实验对象，然后用0.9％氯化钠水溶液轻轻冲洗除去肠壁上的内容物，并用手术剪剖开小肠，再用锡纸包好立即放入液氮中速冻，而后取出放入-20℃冰箱冷冻储存备用。
酶待测液制备：刀片刮下小肠内囊，并用浓度为0.05mol/L、pH7.4的PBS溶解至一定浓度，匀浆机搅匀，分装于小离心管中(每管约1.5ml)，冷冻备用。
α-葡萄糖苷酶的抑制活性的测定采用如下方法：测吸光度(A)400nm和半抑制浓度(IC50)值。IC50定义为抑制酶活性50％时所需的抑制剂浓度。
α-淀粉酶抑制作用的测定，将10μlα-淀粉酶溶于4ml含有50mmol/L NaCl、5mmol/LCaCl2、0.5/L TritonX-100的pH6.9，25mmol/L Piperazine-N，N’-bis2-ethanesulfonicacid缓冲液中作为酶保存液，测定时用缓冲液稀释40倍使用。碘法测定A700nm和IC50值。
2.3.5对醛糖还原酶活性的抑制作用
利用大鼠晶状体醛糖还原酶，以DL-甘油醛为底物，NADPH(在340nm有一个吸收峰)为辅酶，通过检测反应前后OD340nm的变化测定对醛糖还原酶的抑制活性。
2.3.6对蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的抑制作用
利用含有磷酸的多肽pNPP被PTP1B酶解掉1个磷酸后的产物pNP在波长405nm处有吸收峰的原理，以PTP1B作用后生成pNP的量表示化合物对酶活性的抑制情况。
将相同质量的抑制剂溶解在相同体积的溶液中，作为抑制组分加入酶活性测定体系中。加样顺序为：抑制剂200μl，25mM pH 5.0NaOAc-HAc，1.4mM EDTA，1.4mM DTT，10nMAPTP1B，最后在反应体系中加入终浓度为20mM的p-NPP。在37℃反应30min，测定OD405的变化值，与未加入抑制剂的空白对照比较。
2.3.7数据处理及结果判定
计量资料以均数±标准差
表示。应用Minitab统计软件分析，多样本均数的两两比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。
3.实验结果
3.1一般日常观察
实验期间正常对照组C57BL/6J小鼠精神状态良好，反应灵敏，动作自如，皮毛有光泽，进食量、饮水量稳定，体重持续增加。各组糖尿病动物呈现明显的“三多一少”症状，发生多饮、多食、多尿、血糖增高等情况，各给药组小鼠毛色正常，活动正常。动物体重及进食量变化不大。
3.2整体动物正交设计的实验结果
3.2.1配伍各组分对KKAy小鼠的空腹血糖值4周的影响结果
在给予配伍组分的4周内，阳性药组在给药第1-4周空腹血糖均明显低于模型组(p＜0.001)；组分2组第2、4周时空腹血糖值明显低于模型组(p＜0.001)；组分3组第2、3、4周时空腹血糖值低于模型组(p＜0.05，p＜0.001)；组分6组第2、3、4周时的空腹血糖值低于模型组(p＜0.05，p＜0.001)；组分8组第4周时的空腹血糖值低于模型组(p＜0.01)。实验结果及5周空腹血糖变化情况见表4。组分5组、组分7组在给药第1周空腹血糖值高于模型组(p＜0.001)；组分9组在给药第1、3周空腹血糖值高于模型组(p＜0.001)。
实验结果显示，随给药周期的延长，具有降低空腹血糖功效的组分，功效逐渐显现并趋于稳定。个别组分没有降低空腹血糖的作用。配伍各组分对KKAy小鼠的空腹血糖值4周的影响变化结果见表4。
3.2.2正交设计的空腹血糖值方差分析结果
根据血糖变化情况选用第四周空腹血糖测定结果进行正交设计的方差分析。本实验中各因素对空腹血糖影响顺序为茶褐素组分＞咖啡因组分＞茶多酚组分。根据方差分析的结果，最佳配比为：茶多酚组分∶茶褐素组分∶咖啡因组分为0g/kg∶1.2g/kg∶0g/kg，按每种组分中实际成分含量进行计算即咖啡因1.5％∶茶褐素18.3％∶茶多糖23.4％∶茶多酚9.7％的配比对KKAy小鼠的空腹血糖降低最多。
3.2.3配伍各组分对KKAy小鼠糖耐量实验的影响结果
各配伍组分中，组分2、组分3、组分6在灌胃外源性葡萄糖后0.5h、1h血糖升高程度明显较模型组低，AUC与模型组比较有明显统计学意义(p＜0.001)。结果见表5。
表5各组分对KKAy小鼠的糖耐量影响(mmol/L)
注：与模型组比较＊＊＊p＜0.001；
3.2.4正交设计的糖耐量AUC方差分析结果
用糖耐量AUC测定结果进行正交设计的方差分析。本实验中各因素对糖耐量影响顺序为茶多酚组分＞茶褐素组分＞咖啡因组分。根据方差分析的结果，最佳配比为：茶多酚组分∶茶褐素组分∶咖啡因组分为0g/kg∶1.2g/kg∶0g/kg，按每种组分中实际成分含量进行计算即咖啡因1.5％∶茶褐素18.3％∶茶多糖23.4％∶茶多酚9.7％。
3.3体外糖尿病靶酶正交设计的实验结果
3.3.1配伍各组分对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用结果
实验结果显示配伍各组分在100μg/ml浓度下对淀粉酶均无抑制作用。配伍各组分多个浓度下对蔗糖酶及麦芽糖酶活性的测定，计算得到各样品的抑制IC50，结果见表6。各配伍组分中组分2、组分3对蔗糖酶和麦芽糖酶均未检测到抑制IC50，因此不能用Minitab统计软件统计分析，抑制IC50数据提示组分4、组分7、组分8对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用较强。
表6配伍各组分对蔗糖酶和麦芽糖酶活性的抑制作用
3.3.2配伍各组分对醛糖还原酶活性的抑制作用结果
实验结果显示各配伍组分中组分4醛糖还原酶活性抑制较强，抑制IC50为4.87μg/ml。结果见表7。
表7配伍各组分对醛糖还原酶活性的抑制作用
3.3.3正交设计的醛糖还原酶抑制率的方差分析结果
用醛糖还原酶活性抑制率测定结果进行正交设计的方差分析。本实验中各因素对醛糖还原酶活性抑制率影响顺序为茶多酚组分＞茶褐素组分＞咖啡因组分。根据方差分析的结果，最佳配比为：茶多酚组分∶茶褐素组分∶咖啡因组分为0.5g/kg∶0g/kg∶0.05g/kg，按每种组分中实际成分含量进行计算即咖啡因18.7％∶茶褐素0.82％∶茶多糖0.53％∶茶多酚64.1％的配比对醛糖还原酶活性抑制率最大。
3.3.4配伍各组分对蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的抑制作用结果
实验结果显示各配伍组分中，除组分4、组分7外，对蛋白质酪氨酸磷酸酶活性均有较强抑制作用。结果见表8。
表8配伍各组分对蛋白质酪氨酸磷酸酶活性的抑制作用
3.3.5正交设计的蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制率的方差分析结果
用蛋白质酪氨酸磷酸酶活性抑制率测定结果进行正交设计的方差分析。本实验中各因素对蛋白质酪氨酸磷酸酶活性抑制率影响顺序为茶褐素组分＞茶多酚组分＞咖啡因组分。根据方差分析的结果，最佳配比为：茶多酚组分∶茶褐素组分∶咖啡因组分为0g/kg∶1.2g/kg∶0g/kg，按每种组分中实际成分含量进行计算即咖啡因1.5％∶茶褐素18.3％∶茶多糖23.4％∶茶多酚9.7％的配比对蛋白质酪氨酸磷酸酶活性抑制率最大。
4.结论
正交设计法试验是从全面试验设计的整体观念出发，从整体试验中挑选部分代表性强的试验点进行试验，利用正交表均衡分散、整齐可比特性，不是直接比较试验结果的好坏，而是通过水平试验值的大小，对各因子主次和水平的好坏作出分析。正交设计可克服药物种类固定，剂量单一等缺点，用正交表可安排多因素试验，水平可任选，最后根据试验结果找出最佳方案(最佳配方)。本实验根据正交设计表设计不同的配伍共9组。作为3种组分互相配伍，虽不能全面反映所有的配伍组合，但在一定的层面上能够反映效应条件下3味组分之间的配伍关系的强弱。
从实验结果来看，整体动物模型上茶褐色组分对空腹血糖值及糖耐量AUC影响最大且影响显著，增大茶褐素组分的含量可以有效改善糖尿病动物的症状。咖啡因组分在正交试验中显示对空腹血糖值及糖耐量AUC影响不显著，茶多酚组分在正交试验中对空腹血糖值及糖耐量AUC影响也不显著。
体外靶酶抑制作用试验中，茶多酚组分对蔗糖酶及麦芽糖酶活性有较强的抑制作用，体外对醛糖还原酶活性的抑制作用实验中，茶多酚组分对醛糖还原酶的抑制作用最大也最显著，茶褐素组分和咖啡因组分对醛糖还原酶无显著影响。正交试验中茶褐素组分对PTP-1B的抑制作用最大也最显著，茶多酚组分和咖啡因组分无显著影响。
综合本次研究表明，普洱茶提取物降糖的物质基础为茶褐素组分、茶多酚组分。最佳配伍配比组合：茶多酚组分∶茶褐素组分∶咖啡因组分为0.5∶1.2∶0，按每种组分中实际成分含量进行计算即咖啡因4.5％∶茶褐素13.2％∶茶多糖18.2％∶茶多酚27.6％的配比
实验2普洱茶有效组分配伍组分对STZ糖尿病大鼠降糖作用研究
选择普洱茶有效组分的几种配伍组分采用药理学评价降糖药物药效最为经常使用的经典方法和新药申报推荐的动物模型STZ致糖尿病大鼠模型，观察普洱茶珍对STZ致糖尿病模型大鼠的空腹血糖、糖耐量及胰岛素抵抗的影响，确认普洱茶有效组分降糖的最佳配伍配比。
1.实验材料
1.1实验动物
Sprague-Dawley大鼠85只，雄性，SPF级，体重220-250g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证：SCXK(京)2012-0001。
1.2主要试剂和药品
(1)马来酸罗格列酮片，批号：09090110，葛兰素史克(天津)有限公司，规格：4mg/片。
(2)茶多酚组分，批号20111216，土黄色粉末。由天士力集团研究院中药所提供。存放于药理所供试品室样品柜内，避光室温下保存。
(3)茶褐素组分，批号20111209，深褐色小块状物。由天士力集团研究院中药所提供。存放于药理所供试品室样品柜内，避光室温下保存。
(4)咖啡因组分，批号20111115，灰白色粉末。由天士力集团研究院中药所提供。存放于药理所供试品室样品柜内，避光室温下保存。
(5)链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)，批号：S0130-1G，美国sigma公司，用前新鲜配制。
(6)Rat/mouse Insulin ELISA Kit，批号：ST2347EN00，购于美国MILLIPORE公司。
(7)血糖测试试剂(BIOSEN 5030型血糖/乳酸分析仪配套试剂)。
(8)柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)：天津化学试剂一厂，批号：1108192。
(9)无水柠檬酸(C6H8O7·H2O)：天津化学试剂一厂，批号：1108241。
(10)CHOL检测试剂，R1批号DK334，R2批号DK335，日本和光纯药工业株式会社。
(11)TG检测试剂，R1批号EE607，R2批号DL018，日本和光纯药工业株式会社。
(12)HDL-C检测试剂，R1批号DG373，R2批号DG374，日本和光纯药工业株式会社。
(13)LDL-C检测试剂，R1批号DH017，R2批号DH018，日本和光纯药工业株式会社。
(14)GLU检测试剂，R1批号DH004，R2批号DH005，日本和光纯药工业株式会社。
(15)FRUC检测试剂，批号11102406，上海华氏亚太生物制药有限公司。
1.3实验仪器
BIOSEN 5030型血糖/乳酸分析仪，德国EKF公司制造。
Infinite200多功能酶标仪，瑞典TECAN公司。
日立7020型全自动生化仪：日本日立株式会社。
PL303电子天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。
T2000电子天平：美国双杰兄弟(集团)有限公司。
2.实验方法
2.1 STZ糖尿病模型的建立
SD雄性大鼠85只适应性喂养1w后，随机分成正常对照组与糖尿病造模组。正常对照组10只，糖尿病造模组75只。造模组75只大鼠禁食16h，经腹腔一次注射STZ 55mg.kg-1(0.1mmol.L-1、Ph 4.4柠檬酸缓冲溶液配制成2％溶液)，正常对照组动物注射等剂量的柠檬酸缓冲液作为对照。注射3d后，动物禁食5h后尾静脉针刺采血测血糖，血糖值大于10mmol.L-1者确定为糖尿病大鼠。
2.2分组及给药：
参照前期研究结果，共选择三个配比组作为降糖功效考察的对象。包括以整体动物模型正交筛选的最佳配伍配比组合；结合实际生产工艺咖啡因组分难以完全去除，且普洱茶提取物中茶多酚含量不高的情况，尽量减少咖啡因组分用量，增大茶褐色组分的配比组合；以正交筛选综合分析的最佳配伍配比作为最后一个考察配比组。组分配伍情况及各组分中各成分实际含量见表9、表10。
表9三个配比组的组分配伍情况
表10各组分中各成分实际含量
成模的糖尿病大鼠随机分成模型组、阳性药组、组分配比1、组分配比2、组分配比3，共5组动物，每组12只。正常对照组1组，10只动物。每日灌胃，连续灌胃4周。
正常对照组：灌胃蒸馏水(10ml/kg BW)；
模型对照组：灌胃蒸馏水(10ml/kg BW)；
阳性药组：用蒸馏水配制阳性药溶液，灌胃(10ml/kg BW)，给药剂量1.33mg/kg/日；
组分配比各组按照表1剂量用蒸馏水配制溶液，灌胃(10ml/kg BW)。
2.3观察指标：
2.3.1日常观察指标
实验期间观察动物精神、活动、毛色、及尿量粪便变化情况；每周定量测定进食量及体重。
2.3.2空腹血糖测定
分组前及给药后7d、14d、21d、28d分别尾静脉取血测空腹血糖值。所有动物均禁食(自由饮水)5h后取血，于取血前1h各组动物灌胃给药，取血时尾静脉针刺采血，取末梢血10μl，用BIOSEN 5030型血糖/乳酸分析仪测定空腹血糖。
2.3.3糖耐量实验观察指标及检测方法
给药28d动物禁食5h(自由饮水)，灌胃组于取血前1h给药，禁食结束时经口给予葡萄糖2.0g·kg-1，测定给葡萄糖后0h、0.5h、1h、2h的血糖值，观察各组给予葡萄糖后各时间点血糖值的变化，并计算血糖曲线下面积。
血糖曲线下面积(AUC)＝1/2×(0h血糖值+0.5h血糖值)×0.5+1/2×(0.5h血糖值+1h血糖值)×0.5+1/2×(1h血糖值+2h血糖值)×1。
2.3.4空腹血清胰岛素测定
给药30d后禁食不禁水12h，腹腔注射水合氯醛麻醉(0.04ml·10g-1)，眶静脉取血，常温静置30min，2500g×10min 4℃离心，分离血清，采用用双抗夹心酶免ELISA法，按照试剂盒说明书步骤测定。
2.3.5血液生化检测
给药30d后禁食不禁水12h，腹腔注射水合氯醛麻醉(0.04ml·10g-1)，眶静脉取血，3000转/分离心，分离血清，用全自动生化仪检测GLU、CHO1、TG、HDL-C、LDL-C、FRUC含量。
2.3.6数据处理及结果判定
计量资料以均数±标准差
表示。应用SPSS11.0统计软件分析，多样本均数的两两比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。
3.实验结果
3.1一般日常观察及体重变化
实验期间各组糖尿病动物呈现明显的“三多一少”症状，发生多饮、多食、多尿、血糖增高、尿糖阳性、拒食、呆滞、皮毛松散等情况。糖尿病各组动物体重增长较正常组缓慢。
3.2对空腹血糖的影响
模型组血糖值比阴性对照组显著升高，证明动物模型成功。阳性药组在给药后第2-4周，空腹血糖值均明显低于模型组(p＜0.05，p＜0.01)。组分1组第2、3、4周时空腹血糖值低于模型组(p＜0.01，p＜0.001)；组分2组第2周时空腹血糖值明显低于模型组(p＜0.01)；组分3组第2、3、4周时空腹血糖值明显低于模型组(p＜0.01)；各组分对糖尿病大鼠的空腹血糖值4周的影响变化结果见表11。
表11各配伍组分对糖尿病大鼠的空腹血糖影响(mmol/L)
注：与模型组比较＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001；
3.3对糖耐量的影响
组分1组在灌胃外源性葡萄糖后0.5h、2h血糖均值明显较模型组低(p＜0.05、p＜0.01)，AUC与模型组比较有明显统计学差异(p＜0.01)。组分2组灌胃外源性葡萄糖后1h血糖均值与模型组比较差异显著(p＜0.05)，同时AUC与模型组比较亦有统计学差异(p＜0.05)。组分3组在灌胃外源性葡萄糖后0.5h、1h、2h血糖均值明显较模型组低(p＜0.01、p＜0.001)，同时AUC与模型组比较有明显统计学差异(p＜0.001)。结果见表12。
表12各配伍组分对糖尿病大鼠的糖耐量的影响(mmol/L)
注：与模型组比较＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.001；
3.4对动物空腹血清胰岛素的影响
从表13可见，模型组血清胰岛素显著增高，而与对照组比较差异有高度显著性(P＜0.001)，阳性药组、组分1组、组分2组、组分3组均能显著降低大鼠血清胰岛素，与模型组比较有显著性差异(P＜0.05，P＜0.001)。
表13各配伍组分对动物空腹血清胰岛素的影响
3.5血液生化检测结果
从表14、表15可见，血清GLU检测结果与空腹血糖测定一致，组分1组、组分2组与模型组比较显著差异(P＜0.05)。FRUC、TC、TG、HDL-C、LDL-C指标各组间均无差异。
表14各配伍组分对生化指标的影响I
注：与模型组比较＊p＜0.05，＊＊p＜0.01；
表15各配伍组分对生化指标的影响II
4实验结论及讨论
本实验选择评价降糖药物药效的经典方法，即新药申报推荐的动物模型STZ致糖尿病大鼠模型，观察三个普洱茶有效组分配伍对STZ致糖尿病模型大鼠的空腹血糖、糖耐量、胰岛素及生化指标的影响，确认普洱茶有效组分降糖的最佳配伍配比。
实验选择的三个配比组分别是以整体动物模型正交筛选结果选择的最佳配伍配比组分1；结合生产工艺确定的配比组分2；以体内体外正交筛选综合分析选择的最佳配伍配比组分3。
空腹血糖实验结果显示三个配伍组分对糖尿病动物空腹血糖都有比较明显的降低作用，其中组分1和组分3的作用稳定。糖耐量实验与空腹血糖结果相似，其中组分3改善糖耐量的作用最明显，各组分间没有差异。结合三种配伍组分的含量测定结果分析可以得出配伍组分中茶褐素组分、茶多酚组分的含量较高时，降糖和改善糖耐量的效果较好，当咖啡因组分含量过高时会对降糖效果产生负面影响。
胰岛素抵抗(或组织的胰岛素敏感性)是糖尿病重要的发病原因，是研究糖代谢紊乱病因及其与并发症联系的重要指标。模型组的空腹血清胰岛素明显高于阴性对照组，证明该实验动物为胰岛素抵抗的典型模型。组分1组、组分2组、组分3组均能显著降低大鼠血清胰岛素，表明三个配伍组分都能很好的改善胰岛素抵抗，增强实验动物对胰岛素的敏感性。
通过本次功效验证试验可以确定三种组分配伍均能达到比较理想的降糖效果，综合多项观测指标其中茶多酚组分0.5g/kg，茶褐色组分1.2g/kg这样的配比组合能达到最好的降糖效果。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明
实施例1
茶褐素组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提三次，每次0.5-1小时，合并提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加95％乙醇醇沉至80％，静至12小时以上，醇沉物真空减压干燥得到茶褐素粗品，用水复溶过滤，滤液70℃以下减压浓缩至干得到茶褐素组分；
茶多酚组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提三次，每次0.5-1小时，合并提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加95％乙醇醇沉至80％，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入等质量的三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到5.4，静置，离心，分离沉淀物用硫酸溶液转溶，用乙酸乙酯萃取，萃取物除去溶剂得到茶多酚组分；
咖啡因组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提三次，每次0.5-1小时，合并提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加95％乙醇醇沉至80％，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入等质量的三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到5.4，静置，离心，上清液经浓缩干燥得到固体，用水复溶，过滤，过大孔吸附树脂柱，并用水洗脱得到流出液，上样流出液和水洗液减压真空浓缩至比重1.10～1.15，用氯仿萃取三次，萃取物经过分离得到咖啡因组分。
将上述步骤得到的茶多酚组分、茶褐素组分以及咖啡因组分按照5重量份茶多酚组分、12重量份的茶褐素组分以及0重量份的咖啡因组分进行称取、混合，即得本发明的普洱茶有效成分的组合物。按每种组分中实际成分含量进行计算即咖啡因4.47％，茶褐素13.18％，茶多糖18.16％，茶多酚27.55％。
实施例2
茶褐素组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提1次，时间0.5小时，提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加90％乙醇醇沉至含醇量70％，静至12小时以上，醇沉物真空减压干燥得到茶褐素粗品，用水复溶过滤，滤液70℃以下减压浓缩至干得到茶褐素组分；
茶多酚组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提1次，时间0.5小时，提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加90％乙醇醇沉至含醇量70％，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入等质量的三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到4，静置，离心，分离沉淀物用硫酸溶液转溶，溶液用乙酸乙酯萃取，萃取物除去溶剂得到茶多酚组分；
咖啡因组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提1次，时间0.5小时，提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加90％乙醇醇沉至含醇量70％，静至12小时以上，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入等质量的三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到4，静置，离心，得到上清液，上清液经浓缩干燥得到固体，用水复溶，过滤，过大孔吸附树脂柱，并用水洗脱得到流出液，上样流出液和水洗液减压真空浓缩至比重1.10～1.15，用氯仿萃取三次，萃取物经过分离得到咖啡因组分。
将上述步骤得到的茶褐素组分、茶多酚组分以及咖啡因组分按照0重量份茶多酚组分、6重量份的茶褐素组分以及0.5重量份的咖啡因组分进行称取、混合，即得本发明的普洱茶有效成分的组合物。按每种组分中实际成分含量进行计算即咖啡因8.29％、茶褐素16.89％、茶多糖21.75％、茶多酚9.03％。
实施例3
茶褐素组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提2次，每次1小时，提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加100％乙醇至含醇量80％，静至12小时以上，醇沉物真空减压干燥得到茶褐素粗品，用水复溶过滤，滤液70℃以下减压浓缩至干得到茶褐素组分；
茶多酚组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提2次，每次1小时，提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加100％乙醇至含醇量80％，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入等质量的三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到6，静置，离心，分离沉淀物用硫酸溶液转溶，溶液用乙酸乙酯萃取，萃取物除去溶剂得到茶多酚组分；
咖啡因组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提2次，每次1小时，提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加100％乙醇至含醇量80％，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入等质量的三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到6，静置，离心，得到上清液，上清液经浓缩干燥得到固体，用水复溶，过滤，过大孔吸附树脂柱，并用水洗脱得到流出液，上样流出液和水洗液减压真空浓缩至比重1.10～1.15，用氯仿萃取三次，萃取物经过分离得到咖啡因组分。
将上述步骤得到的茶褐素组分、茶多酚组分以及咖啡因组分按照0重量份茶多酚组分、12重量份的茶褐素组分以及1重量份的咖啡因组分进行称取、混合，即得本发明的普洱茶有效成分的组合物。按每种组分中实际成分含量进行计算即咖啡因8.29％、茶褐素16.89％、茶多糖21.75％、茶多酚9.03％。
实施例4
茶褐素组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提2次，每次0.5小时，提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加95％乙醇至含醇量80％，静至12小时以上，醇沉物真空减压干燥得到茶褐素粗品，用水复溶过滤，滤液70℃以下减压浓缩至干得到茶褐素组分；
茶多酚组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提2次，每次0.5小时，提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加95％乙醇至含醇量80％，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入等质量的三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到5，静置，离心，分离沉淀物用硫酸溶液转溶，溶液用乙酸乙酯萃取，萃取物除去溶剂得到茶多酚组分；
咖啡因组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提2次，每次0.5小时，提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加95％乙醇至含醇量80％，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入等质量的三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到5，静置，离心，得到上清液，上清液经浓缩干燥得到固体，用水复溶，过滤，过大孔吸附树脂柱，并用水洗脱得到流出液，上样流出液和水洗液减压真空浓缩至比重1.10～1.15，用氯仿萃取三次，萃取物经过分离得到咖啡因组分。
将上述步骤得到的茶褐素组分、茶多酚组分以及咖啡因组分按照2.5重量份茶多酚组分、12重量份的茶褐素组分以及0重量份的咖啡因组分进行称取、混合，即得本发明的普洱茶有效成分的组合物。按每种组分中实际成分含量进行计算即咖啡因3.24％、茶褐素15.3％、茶多糖20.33％、茶多酚20.17％。
实施例5
茶褐素组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提3次，每次1小时，提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加80％乙醇至含醇量70％，静至12小时以上，醇沉物真空减压干燥得到茶褐素粗品，用水复溶过滤，滤液70℃以下减压浓缩至干得到茶褐素组分；
茶多酚组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提3次，每次1小时，提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加80％乙醇至含醇量70％，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入等质量的三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到6，静置，离心，分离沉淀物用硫酸溶液转溶，溶液用乙酸乙酯萃取，萃取物除去溶剂得到茶多酚组分；
咖啡因组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提3次，每次1小时，提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加80％乙醇至含醇量70％，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入等质量的三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到6，静置，离心，得到上清液，上清液经浓缩干燥得到固体，用水复溶，过滤，过大孔吸附树脂柱，并用水洗脱得到流出液，上样流出液和水洗液减压真空浓缩至比重1.10～1.15，用氯仿萃取三次，萃取物经过分离得到咖啡因组分。
将上述步骤得到的茶褐素组分、茶多酚组分以及咖啡因组分按照5重量份茶多酚组分、6重量份的茶褐素组分以及0重量份的咖啡因组分进行称取、混合，即得本发明的普洱茶有效成分的组合物。按每种组分中实际成分含量进行计算即咖啡因6.09％、茶褐素10.39％、茶多糖15.31％、茶多酚37.29％。
实施例6
茶褐素组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提3次，每次0.5小时，提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加95％乙醇至含醇量85％，静至12小时以上，醇沉物真空减压干燥得到茶褐素粗品，用水复溶过滤，滤液70℃以下减压浓缩至干得到茶褐素组分；
茶多酚组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提3次，每次0.5小时，提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加95％乙醇至含醇量85％，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入等质量的三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到5.4，静置，离心，分离沉淀物用硫酸溶液转溶，溶液用乙酸乙酯萃取，萃取物除去溶剂得到茶多酚组分；
咖啡因组分制备方法：
普洱茶加10倍量水80℃高温浸提3次，每次0.5小时，提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加95％乙醇至含醇量85％，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入等质量的三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到5.4，静置，离心，得到上清液，上清液经浓缩干燥得到固体，用水复溶，过滤，过大孔吸附树脂柱，并用水洗脱得到流出液，上样流出液和水洗液减压真空浓缩至比重1.10～1.15，用氯仿萃取三次，萃取物经过分离得到咖啡因组分。
将上述步骤得到的茶褐素组分、茶多酚组分以及咖啡因组分按照0重量份茶多酚组分、12重量份的茶褐素组分以及0重量份的咖啡因组分进行称取、混合，即得本发明的普洱茶有效成分的组合物。按每种组分中实际成分含量进行计算即咖啡因1.5％、茶褐素18.3％、茶多糖23.4％、茶多酚9.7％。
实施例7
根据实施例1得到的普洱茶有效成分的组合物，将两种组分进行混合得到混合物，加入常规辅料，应用制剂学上的常规方法，制成片剂。
实施例8
根据实施例2得到的普洱茶有效成分的组合物，将两种组分进行混合得到混合物，加入常规辅料，应用制剂学上的常规方法，制成胶囊。
实施例9
根据实施例3得到的普洱茶有效成分的组合物，将两种组分进行混合得到混合物，加入常规辅料，应用制剂学上的常规方法，制成颗粒剂。
实施例10
根据实施例4得到的普洱茶有效成分的组合物，将两种组分进行混合得到混合物，加入常规辅料，应用制剂学上的常规方法，制成散剂。
实施例11
根据实施例5得到的普洱茶有效成分的组合物，将两种组分进行混合得到混合物，加入常规辅料，应用制剂学上的常规方法，制成滴丸剂。
实施例12
根据实施例6得到的普洱茶有效成分的组合物，将两种组分进行混合得到混合物，加入常规辅料，应用制剂学上的常规方法，制成注射剂。
实施例13
根据实施例1～6任一方法得到的普洱茶有效成分的组合物，以常规工艺按一定比例加入到茶叶制品中，制成具有降糖功能的保健茶。
实施例14
根据实施例1～6任一方法得到的普洱茶有效成分的组合物，以常规工艺按一定比例加入到乳制品中，制成具有降糖功能的保健食品。
实施例15
根据实施例1～6任一方法得到的普洱茶有效成分的组合物，以常规工艺按一定比例加入到饮料中，制成具有降糖功能的保健饮料。
实施例16
根据实施例1～6任一方法得到的普洱茶有效成分的组合物，以常规工艺按一定比例加入到糕点中，制成具有降糖功能的保健糕点。
Claims (12)
1.一种含有普洱茶有效成分的组合物的调配方法，其特征在于，包括如下步骤：取0～5重量份的茶多酚组分，6～12重量份的茶褐素组分以及0～1重量份的咖啡因组分混合均匀即可，其中，茶多酚组分和咖啡因组分的重量份不能同时为0，所述茶多酚组分、茶褐素组分、咖啡因组分的制备方法如下：
茶褐素组分制备方法：
普洱茶加10倍量的水80℃高温浸提三次，每次0.5-1小时，合并提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加95％乙醇醇沉至80％，静至12小时以上，醇沉物真空减压干燥得到茶褐素粗品，用水复溶过滤，滤液70℃以下减压浓缩至干，得到茶褐素组分；
茶多酚组分制备方法：
普洱茶加10倍量的水80℃高温浸提三次，每次0.5-1小时，合并提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加95％乙醇醇沉至80％，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入等质量的三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到5.4，静置，离心，沉淀用硫酸溶液转溶，用乙酸乙酯萃取，萃取物除去溶剂得到茶多酚组分；
咖啡因组分制备方法：
普洱茶加10倍量的水80℃高温浸提三次，每次0.5-1小时，合并提取液70℃以下减压浓缩至相对密度1.05～1.10，加95％乙醇醇沉至80％，静至12小时以上，得到上清液，经浓缩干燥得到粗品，将粗品溶于水中，加入等质量的三氯化铝，用碳酸氢钠溶液调节PH值到5.4，静置，离心，上清液经浓缩干燥得到固体，加水复溶，过滤，滤液过大孔吸附树脂柱，并用水洗脱得到流出液和水洗液，减压真空浓缩至比重1.10～1.15，用氯仿萃取三次，萃取物经过分离得到咖啡因组分。
2.根据权利要求1所述的组合物的调配方法，其特征在于，所述组合物包括5重量份茶多酚组分，12重量份的茶褐素组分以及0重量份的咖啡因组分。
3.根据权利要求1所述的组合物的调配方法，其特征在于，所述组合物包括0重量份茶多酚组分，6重量份的茶褐素组分以及0.5重量份的咖啡因组分
4.根据权利要求1所述的组合物的调配方法，其特征在于，所述组合物包括0重量份茶多酚组分，12重量份的茶褐素组分以及1重量份的咖啡因组分。
5.根据权利要求1所述的组合物的调配方法，其特征在于，所述组合物包括2.5重量份茶多酚组分，12重量份的茶褐素组分以及0重量份的咖啡因组分。
6.根据权利要求1所述的组合物的调配方法，其特征在于，所述组合物包括5重量份茶多酚组分，6重量份的茶褐素组分以及0重量份的咖啡因组分。
7.权利要求1～6任一所述的组合物的调配方法，其特征在于，所述组合物具有在制备治疗或预防糖尿病的药物或食品中的应用。
8.如权利要求7所述的组合物的调配方法，其特征在于，所述组合物具有在制备抑制α-葡萄糖苷酶的活性药物或食品中的应用。
9.如权利要求7所述的组合物的调配方法，其特征在于，所述组合物的应用是通过抑制醛糖还原酶的活性来实现的。
10.如权利要求7所述的组合物的调配方法，其特征在于，所述组合物的应用是通过抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的活性来实现的。
11.含有权利要求1～6任一所述的组合物的调配方法，所述组合物为用于医疗保健用途的药物或食品组合物。
12.根据权利要求11所述的组合物的调配方法，其中的食品形式选自：饮料、乳制品、茶叶、糕点、糖果；其中的药物形式选自：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、***剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂。
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