CN104688720A - 绿原酸在制备治疗黑色素瘤的药物中的用途及治疗黑色素瘤的药物 - Google Patents

绿原酸在制备治疗黑色素瘤的药物中的用途及治疗黑色素瘤的药物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种绿原酸在制备治疗黑色素瘤的药物中的用途及治疗黑色素瘤的药物。本发明通过实验证明，绿原酸能够促进单核细胞向M1型巨噬细胞极化，抑制单核细胞向M2型巨噬细胞极化，及抑制M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化，促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化，最终达到治疗黑色素瘤的目的。

Description

绿原酸在制备治疗黑色素瘤的药物中的用途及治疗黑色素瘤的药物
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其是黑色素瘤治疗领域，具体为绿原酸在制备治疗黑色素瘤的药物中的用途及治疗黑色素瘤的药物。本发明通过绿原酸对巨噬细胞极化的调节，实现对黑色素瘤的治疗。
背景技术
绿原酸(chlorogenic acid)是一种从双子叶植物(如忍冬叶、咖啡豆、向日葵)的叶和果实分离得到的酚类，其是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。其是是广泛存在于各种植物中的重要成分，与日常生活相关的植物包括葵花籽、水果(苹果、梨、葡萄)、蔬菜(土豆)、大豆、小麦、可可豆、咖啡豆、沙棘果和传统中草药(杜仲、金银花)均不同程度地含有绿原酸。
绿原酸作为一种由咖啡酸(caffeic acid)与奎尼酸(鸡纳酸，quinic acid，即1-羟基六氢没食子酸)缩合而成的缩酚酸，异名咖啡鞣酸，化学名3-O-咖啡酰奎尼酸(3-O-caffeoylquinicacid)，分子式为C16H18O9，分子量：345.31，半水合物为针状晶体，110℃时变为无水化合物，易溶于热水、乙醇、丙酮，微溶于乙酸乙酯，常温下呈淡黄色或类白色粉末。
目前，已经报道了绿原酸有多种药理作用，其中关于绿原酸癌症的治疗用途仅限于***、肺癌、肝癌、膀胱癌的报道。其中，CN200710140602.7公开了绿原酸在制备治疗小细胞肺癌的药物中的用途；CN201210086313.4公开了绿原酸在制备治疗小鼠膀胱癌的药物中的用途。
截止目前，还未有关于绿原酸治疗黑色素瘤的相关报道。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种绿原酸的新用途，具体为绿原酸在制备治疗黑色素瘤的药物中的用途及治疗黑色素瘤的药物。本发明通过实验证明，绿原酸能够促进单核细胞向M1型巨噬细胞极化，抑制单核细胞向M2型巨噬细胞极化，及抑制M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化，促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化，最终达到治疗黑色素瘤的目的。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
绿原酸在制备治疗黑色素瘤的药物中的用途。
以绿原酸为有效成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。
该药物中，每制剂单位含有绿原酸1-1000mg。
其作用机理为：绿原酸通过对巨噬细胞极化的调节治疗黑色素瘤中的用途。
绿原酸通过促进单核细胞向M1型巨噬细胞极化，达到治疗黑色素瘤和控制黑色素瘤转移的用途。
绿原酸通过抑制单核细胞向M2型巨噬细胞极化，达到治疗黑色素瘤和控制黑色素瘤转移的用途。
绿原酸通过抑制M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化，同进促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化，达到治疗黑色素瘤和控制黑色素瘤转移的用途。
绿原酸与化疗药在制备治疗黑色素瘤的联合用药中的用途。
所述化疗药为顺铂、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、阿霉素、环磷酰胺中的一种或多种。
一种用于治疗黑色素瘤的药物，活性成分为绿原酸。
以绿原酸为有效成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。
巨噬细胞参与肿瘤的发生发展，巨噬细胞的不同极化类型(M1、M2)对肿瘤产生的作用不同。M1型巨噬细胞通过多种途径杀伤肿瘤细胞；而M2型巨噬细胞却参与了肿瘤的发生、生长、侵袭和转移的过程，常常表现为促进肿瘤生长、肿瘤血管的生成以及肿瘤细胞的迁移等过程。肿瘤局部微环境使肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)向M2型巨噬细胞分化。研究认为TAMs在肿瘤的起始阶段表现为M1型，在进展阶段则表现为M2型。同样，大量研究表明，存在于肿瘤组织中的TAMs大部分表现出M2的表型，且与肿瘤的治疗和预后相关。
其中，M1型巨噬细胞极化的信号通路如下：IFN-γ通过IFNR激活巨噬细胞信号转导及转录激活因子1(Signal transducer and activator of transcription,STAT1)通路，直接促进IL-2、NOS2和MHC II基因的表达上调，这些是M1型巨噬细胞极化所必需的条件。目前发现的M1表面标志物有IL-6、IL-12、iNOS、TNF-α、MAPKO受体、CD80、CD86、TLR-2、TLR-4、FcRIII(CD16)、CD32、CD62、IL-1R1、CD127等，在平常的研究中受用得较多的是iNOS、TNF-α、IL-12等。
M2型巨噬细胞的激活途径主要由STAT6介导。M2型巨噬细胞极化的信号通路如下。首先IL-4通过与IL-4Rα和IL-12Rγ受体(I型受体)结合，或者IL-4和IL-13分别与各自的受体IL-4Rα和IL-13Rα结合，受体二聚化(Ⅱ型受体)后分别激活Janus激酶Jak1/Jak3或Jak1/Jak2/Tyk2，从而募集胰岛素受体底物家族主要成员IRS形成复合物。磷酸化的IRS激活衔接蛋白酶Grb2和PI3K，进一步募集STAT6。并使STAT6发生酪氨酸磷酸化。磷酸化的STAT6形成二聚体，进入细胞核后，启动若M2功能相关基因的转录，使巨噬细胞逐步向M2极化。M2型巨噬细胞表面标志物有精氨酸酶1(Arg1)、甘露糖受体(MRC1，CD206)、CD163、FcR2(CD23，CD209)、FIZZ1、ST2、SR-A、M60受体、CD184、TRAIL等，常用的包括Arg1、MRC1FIZZ1和一些趋化因子等。
申请人通过研究发现，绿原酸能够用于黑色素瘤的预防、治疗，控制其转移，具有明显效果。实验表明，绿原酸能够促进单核细胞向M1型巨噬细胞极化，抑制单核细胞向M2型巨噬细胞极化，同时抑制M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化，促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化，有效起到黑色素瘤预防、治疗、控制其转移的目的。
基于上述发现，绿原酸可以单独或与其他具有已知功效的药物一起，采用各种制药技术，制备成注射制剂、口服剂等剂型。
以下通过实验对绿原酸所具有的上述功效加以证实。应该理解的是，本发明的实验例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
附图说明
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
图1为实施例1对iNOS的表达检测结果图。
图2为实施例1对IL-12的表达检测结果图。
图3为实施例1对Arg的表达检测结果图。
图4为实施例1对TNF-α的表达检测结果图。
图5为实施例2对M1型巨噬细胞标志物iNOS的表达检测结果图。
图6为实施例2对M2型巨噬细胞标志Arg的表达检测结果图。
图7为实施例3对iNOS的表达检测结果图。
图8为实施例3对IL10的表达检测结果图。
图9为实施例3对Arg的表达检测结果图。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。即，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
实施例1绿原酸促进单核细胞向M1型巨噬细胞极化
(1)动物模型的建立
小鼠黑色素瘤B16模型，选用C57BL/6小鼠，雄性，18-22g。实验时，取生长良好的肿瘤组织，剪碎，研磨，过滤，用无菌生理盐水按1：3比例稀释后，制成肿瘤细胞悬液，每只小鼠腋背部接种0.2ml肿瘤细胞悬液。接种后次日动物随机分组，称重，并开始给药。绿原酸注射液给药体积为每10g小鼠腹腔注射0.2ml，每日1次，连续给药13天。
实验动物共分4组，阴性对照组、绿原酸5mg/kg、绿原酸10mg/kg、绿原酸20mg/kg三个剂量组。每组15只动物。绿原酸停药后次日处死动物，称体重，剥瘤并称瘤重。根据肿瘤重量计算肿瘤抑制率(％)。体重及瘤重用均值±标准差(x±SD)表示。
(2)样本收集
成功麻醉小鼠后，摘除其双侧眼球放血致死，确定小鼠无自主心跳后，手提鼠尾将小鼠整只置于75％酒精中浸泡5-10秒，取出后将其四肢固定在小鼠手术台上，小鼠呈仰卧位腹面朝上。用5ml无菌注射器预先抽取37℃预热无血清DMEM培养基5ml，用镊子提起小鼠中下腹部皮肤，向腹腔中注入5ml预先抽取的37℃预热无血清培养基(注意针尖朝上，避开肠管和脂肪)，然后轻轻揉压双侧腹膜壁约20-30秒，使腹腔内液体充分流动。收集腹腔液时，先用手术剪在小鼠下腹部皮肤剪开一小口，向两侧撕开皮肤，完全暴露腹膜，用75％酒精棉球擦拭腹膜消毒。再用眼科剪在小鼠腹膜剪开一小口约0.5-lcin，用5ml无菌注射器回抽腹腔液(尽量不要吸到肠管和脂肪，否则容易引起成纤维细胞污染)，转移至15.0ml离心管。1200rpm/min离心5分钟，去掉上清液。用无菌生理盐水重悬至1200^1，转移至1.5ml离心管，待用。
在剪碎的肿瘤组织中，根据组织块沉淀体积，加入相当于肿瘤组织10倍体积的酶工作液(IX，含IV型胶原酶(1mg/ml)、透明质酸酶(1％)、DNA酶1(0.25％))，将离心管置于37t：水浴消化2小时左右，直至肿瘤组织充分消化，酶消化期间每隔10-15分钟振荡离心管1次。当离心管内液体变浑独，肿瘤组织块已分散，且失去块状的形态，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可认为肿瘤组织块已充分消化。酶消化时间可以根据肿瘤组织消化程度适当缩短或延长。充分混匀液体，吸取肿瘤组织消化液，经7(Hun不绣钢滤网过滤到新的15.0ml离心管中，去除未消化的较大组织块。1200rpm/min离心5分钟，去掉上清液。用无菌生理盐水重悬细胞至1200^11，移至1.5ml离心管待用。
(3)采用流式细胞仪对细胞表型进行检测，同时实时荧光定量PCR对样品的相应标志物进行检测。其结果如图1-3所示，其中，图1、2、3分别为实施例1对iNOS、IL-12、Arg的表达检测结果图。图4为实施例1对TNF-α的表达检测结果图。
图1、图2表明，绿原酸能够明显的促进M1型巨噬细胞的标志物iNOS和IL-12的表达，并且呈现出剂量依赖的关系，在用药量为20mg/kg时，促进效果最为强烈；图3明显表明，绿原酸能够明显抑制M2型巨噬细胞标志Arg的表达，并且呈现出剂量依赖的关系，在用药量为20mg/kg时，抑制效果最为强烈；图4明显表明，绿原酸能够促进M1型巨噬细胞标志物TNF-α的表达。结果表明，在黑色素瘤动物模型中，绿原酸能够促进机体内的单核细胞向M1型巨噬细胞极化，从而起到明显的抗肿瘤作用。
实施例2绿原酸维持M1型巨噬细胞，抑制M1型向M2型极化
小鼠黑色素瘤B16模型，选用C57BL/6小鼠，雄性，18-22g。实验时，取生长良好的肿瘤组织，剪碎，研磨，过滤，用无菌生理盐水按1：3比例稀释后，制成肿瘤细胞悬液，每只小鼠腋背部接种0.2ml肿瘤细胞悬液。接种后次日动物随机分组，称重，并开始给药。绿原酸注射液给药体积为每10g小鼠腹腔注射0.2ml，每日1次，连续给药13天。
实验动物共分4组，分别为：(1)对照组(LPS+INFγ)，(2)LPS和INFγ与绿原酸5mg/kg联合用药组，(3)LPS和INFγ与绿原酸10mg/kg联合用药组，(4)LPS和INFγ与绿原酸20mg/kg联合用药组。每组15只动物。
(2)样本收集
成功麻醉小鼠后，摘除其双侧眼球放血致死，确定小鼠无自主心跳后，手提鼠尾将小鼠整只置于75％酒精中浸泡5-10秒，取出后将其四肢固定在小鼠手术台上，小鼠呈仰卧位腹面朝上。用5ml无菌注射器预先抽取37℃预热无血清DMEM培养基5ml，用镊子提起小鼠中下腹部皮肤，向腹腔中注入5ml预先抽取的37℃预热无血清培养基(注意针尖朝上，避开肠管和脂肪)，然后轻轻揉压双侧腹膜壁约20-30秒，使腹腔内液体充分流动。收集腹腔液时，先用手术剪在小鼠下腹部皮肤剪开一小口，向两侧撕开皮肤，完全暴露腹膜，用75％酒精棉球擦拭腹膜消毒。再用眼科剪在小鼠腹膜剪开一小口约0.5-lcin，用5ml无菌注射器回抽腹腔液(尽量不要吸到肠管和脂肪，否则容易引起成纤维细胞污染)，转移至15.0ml离心管。1200rpm/min离心5分钟，去掉上清液。用无菌生理盐水重悬至1200^1,转移至1.5ml离心管，待用。
在剪碎的肿瘤组织中，根据组织块沉淀体积，加入相当于肿瘤组织10倍体积的酶工作液(IX，含IV型胶原酶(1mg/ml)、透明质酸酶(1％)、DNA酶1(0.25％))，将离心管置于37t：水浴消化2小时左右，直至肿瘤组织充分消化，酶消化期间每隔10-15分钟振荡离心管1次。当离心管内液体变浑独，肿瘤组织块已分散，且失去块状的形态，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可认为肿瘤组织块已充分消化。酶消化时间可以根据肿瘤组织消化程度适当缩短或延长。充分混匀液体，吸取肿瘤组织消化液，经7(Hun不绣钢滤网过滤到新的15.0ml离心管中，去除未消化的较大组织块。1200rpm/min离心5分钟，去掉上清液。用无菌生理盐水重悬细胞至1200^11，移至1.5ml离心管待用。
(3)采用流式细胞仪对细胞表型进行检测，同时实时荧光定量PCR对同一个样品的相应标志物进行检测。测定结果如图5-6所示，其中图5、图6分别为实施例2对M1型巨噬细胞标志物iNOS、M2型巨噬细胞标志Arg的表达检测结果图。
图5表明，绿原酸能够维持M1型巨噬细胞的标志物处于一个高的表达状态，并且呈现出剂量依赖关系，在20mg/kg绿原酸的剂量下，M1型巨噬细胞维持在最高状态。图6表明，绿原酸能够维持M2型巨噬细胞标志物Arg在相对较低的状态，并且呈现剂量依赖关系。说明在绿原酸的作用下，M1型巨噬细胞并没有向M2型巨噬细胞转化。在黑色素瘤动物模型中，绿原酸能够维持M1巨噬细胞的量，并抑制M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化，起到抑制黑色素细胞的生长，从而达到抗肿瘤的作用。
实施例3绿原酸促使M2型巨噬细胞极化为M1型巨噬细胞
(1)动物模型的建立
小鼠黑色素瘤B16模型，选用C57BL/6小鼠，雄性，18-22g。实验时，取生长良好的肿瘤组织，剪碎，研磨，过滤，用无菌生理盐水按1：3比例稀释后，制成肿瘤细胞悬液，每只小鼠腋背部接种0.2ml肿瘤细胞悬液。接种后次日动物随机分组，称重，并开始给药。绿原酸注射液给药体积为每10g小鼠腹腔注射0.2ml，每日1次，连续给药13天。
实验动物共分5组，分别为：(1)阴性对照组，(2)对照组(IL-4)，(3)IL-4与绿原酸5mg/kg联合用药组，(3)IL-4与绿原酸10mg/kg联合用药组，(3)IL-4与绿原酸20mg/kg联合用药组。每组15只动物。
(2)样本收集
成功麻醉小鼠后，摘除其双侧眼球放血致死，确定小鼠无自主心跳后，手提鼠尾将小鼠整只置于75％酒精中浸泡5-10秒，取出后将其四肢固定在小鼠手术台上，小鼠呈仰卧位腹面朝上。用5ml无菌注射器预先抽取37℃预热无血清DMEM培养基5ml，用镊子提起小鼠中下腹部皮肤，向腹腔中注入5ml培养基(注意针尖朝上，避开肠管和脂肪)，然后轻轻揉压双侧腹膜壁约20-30秒，使腹腔内液体充分流动。收集腹腔液时，先用手术剪在小鼠下腹部皮肤剪开一小口，向两侧撕开皮肤，完全暴露腹膜，用75％酒精棉球擦拭腹膜消毒。再用眼科剪在小鼠腹膜剪开一小口约0.5-lcin，用5ml无菌注射器回抽腹腔液(尽量不要吸到肠管和脂肪，否则容易引起成纤维细胞污染)，转移至15.0ml离心管。1200rpm/min离心5分钟，去掉上清液。用无菌生理盐水重悬至1200^1，转移至1.5ml离心管，待用。
在剪碎的肿瘤组织中，根据组织块沉淀体积，加入相当于肿瘤组织10倍体积的酶工作液(IX，含IV型胶原酶(1mg/ml)、透明质酸酶(1％)、DNA酶1(0.25％))，将离心管置于37t：水浴消化2小时左右，直至肿瘤组织充分消化，酶消化期间每隔10-15分钟振荡离心管1次。当离心管内液体变浑独，肿瘤组织块已分散，且失去块状的形态，一经摇动即成细胞团或单个细胞，可认为肿瘤组织块已充分消化。酶消化时间可以根据肿瘤组织消化程度适当缩短或延长。充分混匀液体，吸取肿瘤组织消化液，经7(Hun不绣钢滤网过滤到新的15.0ml离心管中，去除未消化的较大组织块。1200rpm/min离心5分钟，去掉上清液。用无菌生理盐水重悬细胞至1200^11，移至1.5ml离心管待用。
(3)采用流式细胞仪对细胞表型进行检测，同时实时荧光定量PCR对同一个样品的相应标志物进行检测。检测结果如图7-9所示，其中，图7、8、9分别为实施例3对iNOS、IL-10、Arg的表达检测结果图。
图7表明，在同一样品中，绿原酸与M1型巨噬细胞的增长呈现出与剂量正相关的关系；图8表明，绿原酸与M2型巨噬细胞的增长呈现出与剂量负相关的关系。在黑色素瘤动物模型中，绿原酸能够促使M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化。
实施例4绿原酸对黑色素瘤动物模型的抑瘤率
(1)实验方法
小鼠黑色素瘤B16模型，选用C57BL/6小鼠，雄性，18-22g。实验时，取生长良好的肿瘤组织，剪碎，研磨，过滤，用无菌生理盐水按1：3比例稀释后，制成肿瘤细胞悬液，每只小鼠腋背部接种0.2ml肿瘤细胞悬液。接种后次日动物随机分组，称重，并开始给药。环磷酰胺注射液给药体积为每10g小鼠腹腔注射0.2ml。于接种次日注射环磷酰胺1次。绿原酸注射液给药体积为每10g小鼠腹腔注射0.2ml，每日1次，连续给药13天。
实验动物共分5组，分别为：(1)阴性对照组，(2)环磷酰胺60mg/kg给药组，(3)绿原酸5mg/kg给药组，(4)绿原酸10mg/kg给药组，(5)绿原酸20mg/kg给药组。每组15只动物。绿原酸停药后次日处死动物，称体重，剥瘤并称瘤重。根据肿瘤重量计算肿瘤抑制率(％)。体重及瘤重用均值±标准差表示，并进行各给药组与阴性对照组之间。
(2)实验结果
腹腔注射给予荷瘤小鼠绿原酸对小鼠黑色素瘤B16的生长有明显的抑制作用，且呈一定的剂量效应关系，绿原酸20mg/kg抑瘤率与环磷酰胺抑瘤率相近。在所用剂量下，绿原酸对动物体重无明显影响，如下表1所示。
表1.绿原酸对小鼠黑色素瘤B16的抗肿瘤作用
注：***P<0.001，与阴性对照组比较。
实施例5.绿原酸与环磷酰胺联合用药
(1)实验方法
小鼠黑色素瘤B16模型，选用C57BL/6小鼠，雄性，18-22g。实验时，取生长良好的肿瘤组织，剪碎，研磨，过滤，用无菌生理盐水按1：3比例稀释后，制成肿瘤细胞悬液，每只小鼠腋背部接种0.2ml肿瘤细胞悬液。接种后次日动物随机分组，称重，并开始给药。环磷酰胺注射液给药体积为每10g小鼠腹腔注射0.2ml。于接种次日注射环磷酰胺1次。绿原酸及环磷酰胺联合用药组先于左侧腹腔注射环磷酰胺，再于右侧腹腔注射绿原酸。绿原酸注射液给药体积为每10g小鼠腹腔注射0.2ml，每日1次，连续给药13天。
实验动物共分4组，分别为：(1)阴性对照组，(2)环磷酰胺60mg/kg给药组，(3)环磷酰胺60mg/kg+绿原酸10mg/kg给药组，(4)环磷酰胺60mg/kg+绿原酸20mg/kg给药组。每组15只动物。绿原酸停药后次日处死动物，称体重，剥瘤并称瘤重。根据肿瘤重量计算肿瘤抑制率(％)。体重及瘤重用均值±标准差表示，并进行各给药组与阴性对照组之间。
(2)实验结果
腹腔注射给予荷瘤小鼠绿原酸对小鼠黑色素瘤B16的生长有明显的抑制作用，且呈一定的剂量效应关系，绿原酸20mg/kg抑瘤率与环磷酰胺抑瘤率相近。20mg/kg的绿原酸与环磷酰胺联合用药时，可显著提高环磷酰胺抗肿作用。在所用剂量下，绿原酸对动物体重无明显影响，如下表2所示。
表2.绿原酸与环磷酰胺联合用药对小鼠黑色素瘤B16的抗肿瘤作用
注：***P<0.001，与阴性对照组比较。###P<0.001，与环磷酰胺组比较。
实施例6.绿原酸与顺铂联合用药
(1)实验方法
小鼠黑色素瘤B16模型，选用C57BL/6小鼠，雄性，18-22g。实验时，取生长良好的肿瘤组织，剪碎，研磨，过滤，用无菌生理盐水按1：3比例稀释后，制成肿瘤细胞悬液，每只小鼠腋背部接种0.2ml肿瘤细胞悬液。接种后次日动物随机分组，称重，并开始给药。阿霉素注射液给药体积为每10g小鼠腹腔注射0.2ml。阿霉素单用及联合用药均为隔日给药，共给药6次。顺铂注射液给药体积为每10g小鼠腹腔注射0.2ml。顺铂单用及联合用药均为每隔3天给药1次，共给药3次。绿原酸注射液给药体积为每10g小鼠腹腔注射0.2ml，每日1次，连续给药11天。联合用药组先于左侧腹腔注射绿原酸，再于右侧腹腔注射阿霉素或顺铂。
实验动物共分7组，分别为：(1)阴性对照组，(2)阿霉素3mg/kg单用给药组，(3)顺铂3mg/kg单用给药组，(4)阿霉素3mg/kg与绿原酸10mg/kg联合用药组，(5)阿霉素3mg/kg与绿原酸20mg/kg联合用药组，(6)顺铂3mg/kg与绿原酸10mg/kg联合用药组，(7)顺铂3mg/kg与绿原酸20mg/kg联合用药组。每组15只动物。最后一次给药后次日处死动物，称体重，剥瘤并称瘤重。根据肿瘤重量计算肿瘤抑制率(％)。体重及瘤重用均值±标准差(x±SD)表示，并进行各给药组与阴性对照组之间，绿原酸与阿霉素联合用药组与阿霉素单用组，绿原酸与顺铂联合用药组与顺铂单用组之间的t检验。
(2)实验结果
腹腔注射给予注射用绿原酸对小鼠黑色素瘤B16的生长呈明显的剂量效应依赖性的抑制作用，20mg/kg绿原酸可显著增强阿霉素和顺铂抗肿瘤作用。由小鼠体重可以看出，绿原酸在所用剂量下没有明显的变化，如下表3所示。
表3.绿原酸与阿霉素或顺铂联合用药对小鼠黑色素瘤B16的抗肿瘤作用
注：***P＜0.001，与阴性对照组比较。
##P＜0.01，与阿霉素单用组比较。
P＜0.05，与顺铂单用组比较。
实施例7.绿原酸与5-氟尿嘧啶联合用药
(1)实验方法
小鼠黑色素瘤B16模型，选用BALB/c小鼠，雌性，18-22g。实验时，取生长良好的肿瘤组织，剪碎，研磨，过滤，用无菌生理盐水按1:3比例稀释后制成肿瘤细胞悬液，每只小鼠腋背部接种0.2ml肿瘤细胞悬液。接种后次日动物随机分组，称重，并开始给药。阴性对照组按每10g小鼠腹腔注射0.2ml生理盐水，每日1次。5-氟尿嘧啶注射液给药体积为每10g小鼠腹腔注射0.2ml。5-氟尿嘧啶单用及联合用药均于接种次日注射，每隔3天给药1次。绿原酸注射液给药体积为每10g小鼠腹腔注射0.2ml，每日1次，连续给药14天。绿原酸及5-氟尿嘧啶联合用药组先于左侧腹腔注射绿原酸，再于右侧腹腔注射5-氟尿嘧啶。
实验动物共分4组，分别为：(1)阴性对照组，(2)5-氟尿嘧啶500mg/kg单用给药组，(3)5-氟尿嘧啶500mg/kg与绿原酸10mg/kg联合用药组，(4)5-氟尿嘧啶500mg/kg与绿原酸20mg/kg联合用药组。每组12只动物。于停药后次日处死动物，称体重，剥瘤并称瘤重。根据肿瘤重量计算肿瘤抑制率(％)。体重及瘤重用均值±标准差(x±SD)表示，并进行各给药组与阴性对照组之间，联合用药组与5-氟尿嘧啶单用组之间的t检验。
(2)实验结果
腹腔注射给予绿原酸对小鼠黑色素瘤B16的生长呈显著的剂量依赖性的抑制作用，绿原酸20mg/kg可增强环磷酰胺抑制肿瘤生长的作用，但无统计学差异。绿原酸在所用剂量下未观察到明显变化，如下表4所示。
表4.绿原酸与5-氟尿嘧啶联合用药对小鼠黑色素瘤B16抑瘤率
注：***P<0.001，与阴性对照组比较。
巨噬细胞参与肿瘤的发生发展，巨噬细胞的不同极化类型(M1、M2)对肿瘤产生的作用不同。M1型巨噬细胞通过多种途径杀伤肿瘤细胞，而M2型巨噬细胞却参与了肿瘤的发生、生长、侵袭和转移的过程，常常表现为促进肿瘤生长、肿瘤血管的生成以及肿瘤细胞的迁移等过程。肿瘤局部微环境使肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)向M2型巨噬细胞分化。研究认为TAMs在肿瘤的起始阶段表现为M1型，在进展阶段则表现为M2型。同样，大量研究表明，存在于肿瘤组织中的TAMs大部分表现出M2的表型，且与肿瘤的治疗和预后相关。
上述实验结果表明：绿原酸通过促使单核细胞向M1型巨噬细胞的极化、维持M1型巨噬细胞，同时抑制M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化和促使M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化的途径治疗黑色素瘤和抑制黑色素瘤的转移。同时，绿原酸在小鼠黑色素瘤B16模型中的抑瘤率与化疗药环磷酰胺的抑瘤率相近，有较好的抑瘤效果。
本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

Claims (9)

1.绿原酸在制备治疗黑色素瘤的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，以绿原酸为有效成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，该药物中，每制剂单位含有绿原酸1-1000mg。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，所述的剂型为注射制剂、口服剂中的一种。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，其作用机理为：绿原酸通过对巨噬细胞极化的调节治疗黑色素瘤中的用途。
6.绿原酸与化疗药在制备治疗黑色素瘤的联合用药中的用途。
7.据权利要求1-6任一项所述的用途，其特征在于，所述化疗药为顺铂、5-氟尿嘧啶、紫杉醇、阿霉素、环磷酰胺中的一种或多种。
8.一种用于治疗黑色素瘤的药物，其特征在于，活性成分为绿原酸。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，以绿原酸为有效成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016127847A1 (zh) * 2015-02-13 2016-08-18 四川九章生物科技有限公司 绿原酸在制备治疗黑色素瘤的药物中的用途及治疗黑色素瘤的药物
CN106038531A (zh) * 2016-05-31 2016-10-26 湖南农业大学 绿原酸诱导HepG2细胞凋亡的用途
CN108403690A (zh) * 2018-05-15 2018-08-17 泰山医学院 一种抑制黑色素瘤细胞增殖的药物及其应用
CN108721297A (zh) * 2018-05-15 2018-11-02 泰山医学院 一种减轻免疫抑制的抗肿瘤药物及其应用
CN109419795A (zh) * 2017-08-28 2019-03-05 四川九章生物科技有限公司 一种***坏死因子家族相关疾病的联合用药物
CN111568890A (zh) * 2020-05-28 2020-08-25 刘玉琳 绿原酸、同分异构体或药学上可接受的盐在制备肿瘤化疗增敏药物中的应用
CN116036285A (zh) * 2023-02-07 2023-05-02 河北大学附属医院 抑制stat6位点泛素化的物质在调控巨噬细胞极化中的应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108159038B (zh) * 2018-03-13 2020-06-12 四川九章生物科技有限公司 一种药物组合物及其在制备***多药耐药性的药物中的用途

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7691905B2 (en) * 2002-12-24 2010-04-06 New York University Inhibition of melanogenesis and melanoma metastasis with p-aminobenzoic acid (PABA)
CN100558353C (zh) 2006-08-09 2009-11-11 四川九章生物化工科技发展有限公司 绿原酸在制备治疗小细胞肺癌的药物中的用途
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CN102579419B (zh) 2012-03-28 2014-02-19 四川九章生物化工科技发展有限公司 绿原酸的抗癌用途
CN104688720A (zh) * 2015-02-13 2015-06-10 四川九章生物科技有限公司 绿原酸在制备治疗黑色素瘤的药物中的用途及治疗黑色素瘤的药物

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016127847A1 (zh) * 2015-02-13 2016-08-18 四川九章生物科技有限公司 绿原酸在制备治疗黑色素瘤的药物中的用途及治疗黑色素瘤的药物
CN106038531A (zh) * 2016-05-31 2016-10-26 湖南农业大学 绿原酸诱导HepG2细胞凋亡的用途
CN109419795A (zh) * 2017-08-28 2019-03-05 四川九章生物科技有限公司 一种***坏死因子家族相关疾病的联合用药物
WO2019042170A1 (zh) * 2017-08-28 2019-03-07 四川九章生物科技有限公司 一种***坏死因子家族相关疾病的联合用药物
CN109419795B (zh) * 2017-08-28 2021-02-26 四川九章生物科技有限公司 一种***坏死因子家族相关疾病的联合用药物
CN108403690A (zh) * 2018-05-15 2018-08-17 泰山医学院 一种抑制黑色素瘤细胞增殖的药物及其应用
CN108721297A (zh) * 2018-05-15 2018-11-02 泰山医学院 一种减轻免疫抑制的抗肿瘤药物及其应用
CN111568890A (zh) * 2020-05-28 2020-08-25 刘玉琳 绿原酸、同分异构体或药学上可接受的盐在制备肿瘤化疗增敏药物中的应用
CN116036285A (zh) * 2023-02-07 2023-05-02 河北大学附属医院 抑制stat6位点泛素化的物质在调控巨噬细胞极化中的应用
CN116036285B (zh) * 2023-02-07 2024-02-02 河北大学附属医院 抑制stat6位点泛素化的物质在调控巨噬细胞极化中的应用

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