CN101906417A

CN101906417A - 针对乙肝病毒的shRNA及携带其的重组腺相关病毒基因治疗载体

Info

Publication number: CN101906417A
Application number: CN 201010149858
Authority: CN
Inventors: 刘金毅; 徐晨; 辛娟娟; 程永庆
Original assignee: BEIJING BIO-TECH DEVELOPMENT Co Ltd; BEIJING SANYUAN GENE ENGINEERING Co Ltd
Current assignee: BEIJING TRI-PRIME GENE PHARMACEUTICAL CO., LTD.
Priority date: 2010-04-19
Filing date: 2010-04-19
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2030-04-19
Also published as: CN101906417B

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种携带对乙型肝炎病毒有抑制作用的shRNA(shorthairpin RNA，shRNA)的重组腺相关病毒，它的制备方法及在制备治疗和/或预防病毒感染性疾病药物中的用途。采用基因重组技术将对乙型肝炎病毒有抑制作用的shRNA克隆入腺相关病毒载体的骨架质粒中，与辅助质粒共转染包装细胞得到重组腺相关病毒。该重组腺相关病毒能够有效抑制乙型肝炎病毒的复制和表达，体内抑制作用显著且持续作用时间长，细胞毒性较小。

Description

针对乙肝病毒的shRNA及携带其的重组腺相关病毒基因治疗载体

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物医药技术领域，具体地说，本发明涉及针对乙型肝炎病毒的shRNA，携带其的载体及它们在制备治疗和/或预防乙肝病毒感染疾病中的应用。

背景技术

全球有超过3.5亿的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)携带者，每年大约有100万人死于由HBV感染所引起的肝脏疾病。慢性乙型肝炎病毒感染已成为严重危害人类健康的世界性疾病。慢性感染患者通常使用干扰素和核酸类似物进行治疗。在临床应用中，由于干扰素的治疗效果不理想，最高应笞率只有40％，而核酸类似物的副作用和由HBV突变所产生的耐药性等问题的出现，仍需探索新型有效的抗HBV的药物和方法。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由小分子干扰RNA片段(small interfering RNA，siRNA)诱导与其同源的mRNA的特异性降解从而导致基因沉默的自然过程，即序列特异性的转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing，PTGS)。RNAi现象是Fire等^[1]在研究线虫基因功能时发现的，其后发现这种现象几乎存在于所有的真核生物细胞中。RNAi中发挥主要效应的是一段长约21-23bp的siRNA。siRNA是由特异性核酸内切酶切割体内通过各种方式产生的双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)形成的，siRNA解链变成单链，其中反义链siRNA和相应的蛋白结合形成诱导沉默复合物(RNA induced silencing complex，RISC)。RISC通过与外源性基因转录的mRNA的同源区进行特异性结合，并在结合部位切割诱导同源基因降解。

RNAi高效专一地抑制基因表达的特性使其在基因功能研究方面得到了广泛的应用。更重要的是，RNAi技术不仅在功能基因组研究中显示出无法替代的优越性，而且也为某些难以治疗的疾病提供一种新的治疗手段成为可能。病毒性疾病，尤其是由HIV、HBV和HCV反转录病毒感染导致的疾病严重影响着人们的健康，而且目前的治疗手段无法根治。RNAi技术的应用，可能会提供更好的治疗和预防的手段。乙型肝炎病毒属于嗜肝DNA病毒，其复制过程以cccDNA为模板，在宿主RNA聚合酶II的作用下，转录成几种不同长短的mRNA，其中3.5kb的mRNA含有HBV DNA序列上全部遗传信息，称为前基因组RNA。后者进入肝细胞质作为模板，在HBV逆转录酶作用下，合成负链DNA；再以负链DNA为模板，在HBV DNA聚合酶作用下，合成正链DNA，形成子代的部分双链环状DNA，最后装配成完整的HBV，释放至肝细胞外。胞质中的子代部分双链环状DNA也可进入肝细胞核内，再形成cccDNA并继续复制。可见HBV虽然是DNA病毒，但其复制机制与RNA病毒类似。利用siRNA，可以直接针对HBV的mRNA，使其发生特异性降解，从而阻断从HBV的mRNA到DNA负链的逆转录过程以及各种必须蛋白质的翻译过程，达到抗HBV的作用。较现有上市药物干扰素和核苷类似物更接近乙肝病毒的根源，更有望彻底清除乙肝病毒。

目前国内外数个研究小组已经报道成功地应用RNA干扰技术在体外和动物实验中高效地抑制了乙型肝炎病毒的感染复制。对小鼠血清中乙肝表面抗原含量的抑制率可高达90％以上。小鼠肝脏中的病毒DNA和RNA转录也能被有效抑制。这些数据表明RNA干扰技术是非常有前景的乙肝治疗的新方法，这些实验大多采用不同形式和成分的递送***。发表在2008年36卷12期的Nucleic Acids Research杂志上的Mechanisms and strategies for effective delivery ofantisense and siRNA oligonucleotides中报道了多种适用于RNA递送***，但是由于这些递送***转染效率低、成本较高和细胞毒性等问题的存在限制了其在临床的应用。寻找一种更经济、更高转染效率和更好安全性的siRNA递送***是RNAi在临床应用中急需解决的问题。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种特异性针对乙型肝炎病毒的shRNA，以解决目前临床应用的抗HBV药物，尤其是其它RNAi类药物治疗效果不够理想的问题。所述的shRNA具有如下的序列：

5′-GCAGUUUACUAGUGCCAUUUGUUUCAAGAGAACAAAUGGCACUAGUAAACUGUU-3′

用于转录该shRNA的DNA序列为：

正义链：

5′-CACCGCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTTCAAGAGAACAAATGGCACTAGTAAACTGTTTTTTG-3′；

反义链：

5′-GATCCAAAAAACAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCTCTTGAAACAAATGGCACTAGTAAACTGC-3′

该shRNA识别的靶序列是针对我国及亚洲HBV主要基因型B、C基因型，也考虑了在细胞实验中(D型)进行评价的可操作性，选择了B、C、D三种亚型序列中的共同部分。

本发明的第二个目的是提供用于携带前述shRNA的重组腺相关病毒基因治疗载体，以提高转染效率，使能够转录出shRNA的DNA在转染后能更有效的与人基因组整合。该重组腺相关病毒载体具有如下特征：

1)所述的重组腺相关病毒的载体携带有在体内能够转录出shRNA的启动子和终止子。

2)所述的重组腺相关病毒的载体包括各种血清型，特别是1型、2型、8型及嵌合型。

本发明的第三个目的是提供携带有前述shRNA的重组腺相关病毒载体的制备方法，包括如下步骤：

1)合成通过具有HBV抑制活性的siRNA转换的DNA序列。

2)将合成的DNA克隆入能够在体内转录出siRNA的腺相关病毒骨架质粒中获得重组腺相关病毒骨架质粒，所述的腺相关病毒骨架质粒包括但不限于pAAV-MCS。

3)将重组腺相关病毒骨架质粒和腺相关病毒的辅助质粒共转染入能够包装出腺相关病毒的包装细胞中获得重组腺相关病毒，所述的腺相关病毒的辅助质粒包括但不限于pAAV-RC和pHelper，所述的腺相关病毒包装细胞包括但不限于人胚肾293T细胞。

本发明的最后一个目的是提供前述shRNA及其前述重组腺相关病毒载体在制备治疗和/或预防病毒感染性疾病药物中的用途。

作为本发明重组腺相关病毒载体的优选实施方式，本发明的优点在于：

1)选择了针对HBV B、C、D基因型S基因的shRNA，将shRNA通过重组腺相关病毒转染HepG2.2.15细胞后，不仅可有效抑制细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达，还可有效抑制细胞中HBV DNA的复制和HBV mRNA的表达，且与目前***的上市药物干扰素和拉米夫定相比，抑制作用更为明显，抑制作用稳定，持续时间较长。

2)选择了腺相关病毒载体作为shRNA的递送载体，腺相关病毒载体最大的特点是：不致病，十分安全。将携带有shRNA的腺相关病毒载体转染HepG2.2.15细胞后，转染效率较高，同时细胞毒性非常小。

在本发明中：所述的shRNA通过重组腺相关病毒载体介导的针对HBV基因的RNAi可用于制备预防或***及乙肝病毒感染相关的任何疾病的药物或制剂。

附图说明

图1、干扰质粒pGPU6-GFP-shRNA结构示意图。

图2、干扰质粒pGPU6-GFP-shRNA中能够转录出shRNA的DNA的测序图谱。

图3、重组腺相关病毒骨架质粒结构示意图。

图4、重组腺相关病毒转染效率对比图：a为重组腺相关病毒感染组，b为空病毒感染组

图5、不同处理对乙肝病毒S抗原表达的作用。图示为不同药物及携带有抑制HBV的siRNA重组腺相关病毒作用于HepG2.2.15细胞不同时间后对其细胞上清中HBsAg水平的影响。1号为对照组，是指细胞在等同条件下用PBS作处理；2号为干扰素处理；3号为拉米夫定处理；4号为重组腺相关病毒转染处理。纵坐标表示不同处理组的抗原水平占对照组的百分率。图中每一个数据表示三个重复实验的平均值±SD。

图6、不同处理对乙肝病毒e抗原表达的作用。图示为不同药物及携带有抑制HBV的siRNA重组腺相关病毒作用于HepG2.2.15细胞不同时间后对其细胞上清中HBeAg水平的影响。1号为对照组，是指细胞在等同条件下用PBS作处理；2号为干扰素处理；3号为拉米夫定处理；4号为重组腺相关病毒转染处理。纵坐标表示不同处理组的抗原水平占对照组的百分率。图中每一个数据表示三个重复实验的平均值±SD。

图7、不同处理对细胞内乙肝病毒DNA水平的作用。图示为不同药物及携带有抑制HBV的siRNA重组腺相关病毒作用于HepG2.2.15细胞8天后细胞内乙肝病毒DNA水平的影响。1号为对照组，是指细胞在等同条件下用PBS作处理；2号为空病毒；3号为重组腺相关病毒转染处理。纵坐标表示不同处理组的乙肝病毒DNA拷贝数。图中每一个数据表示三个重复实验的平均值±SD。

图8、不同处理对细胞内乙肝病毒mRNA水平的作用。图示为不同药物及携带有抑制HBV的siRNA重组腺相关病毒作用于HepG2.2.15细胞8天后细胞内乙肝病毒mRNA水平的影响。1号为对照组，是指细胞在等同条件下用PBS作处理；2号为空病毒；3号为重组腺相关病毒转染处理。纵坐标表示不同处理组的乙肝病毒mRNA水平占对照组的百分率。图中每一个数据表示三个重复实验的平均值±SD。

图9、不同处理对细胞毒性的影响。图示为不同药物及携带有抑制HBV的siRNA重组腺相关病毒作用于HepG2.2.15细胞不同时间后对其细胞毒性的影响。1号为对照组，是指细胞在等同条件下用PBS作处理；2号为干扰素处理；3号为拉米夫定处理；4号为重组腺相关病毒转染处理。纵坐标表示细胞的吸光值。图中每一个数据表示三个重复实验的平均值±SD。

图10、不同处理对乙肝病毒S抗原表达抑制作用持续时间比较。图示为不同药物及携带有抑制HBV的siRNA重组腺相关病毒作用于HepG2.2.15细胞不同时间后对其细胞上清中HBsAg和HBeAg水平的影响。1号为对照组，是指细胞在等同条件下用PBS作处理；2号为干扰素处理；3号为拉米夫定处理；4号为重组腺相关病毒转染处理。纵坐标表示不同处理组的抗原水平占对照组的百分率。图中每一个数据表示三个重复实验的平均值±SD。

图11、不同处理对乙肝病毒e抗原表达抑制作用持续时间比较。图示为不同药物及携带有抑制HBV的siRNA重组腺相关病毒作用于HepG2.2.15细胞不同时间后对其细胞上清中HBsAg和HBeAg水平的影响。1号为对照组，是指细胞在等同条件下用PBS作处理；2号为干扰素处理；3号为拉米夫定处理；4号为重组腺相关病毒转染处理。纵坐标表示不同处理组的抗原水平占对照组的百分率。图中每一个数据表示三个重复实验的平均值±SD。

具体实施方式

实施例1：能够转录出shRNA的DNA的合成和序列鉴定。

根据HBV基因型B、C、D三种亚型序列中的共同部分，通过生物信息学方法选择HBV的相应靶序列，针对靶序列设计能够在体内转录出shRNA的DNA序列，DNA的序列如下：

正义链：

5′-CACCGCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTTCAAGAGAACAAATGGCACTAGTAAACTGTTTT

TTG-3′

反义链：

5′-GATCCAAAAAACAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCTCTTGAAACAAATGGCACTAGTAAAC

TGC-3′，合成干扰质粒pGPU6-GFP-shRNA，由上海吉玛制药技术有限公司合成并测序鉴定DNA序列，如图1和2。

实施例2：重组腺相关病毒骨架质粒的构建

以pGPU6-GFP-shRNA载体为模板，5′-GAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3′和5′-AAGCTTAAGGTCGGGCAGGAAGAGGG-3′为上下游引物，扩增质粒pGPU6-GFP-shRNA的GFP-shRNA-U6片段，并引入限制性内切酶EcoR I和HindIII的位点。扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30sec，65℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃反应5min。PCR产物回收后***pGEM-T载体，测序鉴定正确后，以EcoR I和HindIII双酶切定向克隆入pAAV-MCS质粒(Stratagene公司)双酶切和测序(上海生工)鉴定阳性重组克隆后，命名为重组载体rAAV-shRNA-GFP，如图3。

实施例3：重组腺相关病毒的包装

将3×10⁶个293T细胞接种于直径为10cm的培养皿中，待汇合度达到70-80％时，分别用脂质体和磷酸钙的方法将各5-20ug的rAAV-shRNA-GFP、pAAV-RC(Stratagene公司)和pHelper(Stratagene公司)三质粒共转染293T细胞，同时以pAAV-MCS质粒为阴性对照包装pAAV空病毒，6h后换新鲜培养基，期间观察细胞的形态变化和培养基颜色的变化。再继续培养66-72h后，用细胞铲将细胞从培养皿中刮下后连同培养基转移至15ml的离心管中。将细胞混悬液进行四个来回的各10min的干冰-乙醇浴和37℃水浴，每次冻融后涡旋均匀。室温下10000转离心10min，收集上清用0.22um滤膜过滤得病毒原液，-80℃保存。对病毒进行热源检测、微生物检测，同时用PCR法检测是否有野生病毒复制(RCL)，确保无热源，无细菌、真菌、病毒等微生物污染，无野生病毒复制。

实施例4：重组腺相关病毒转染效率的检测

取重组病毒和空病毒各200μl直接感染293T细胞，培养48h后，荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白GFP的表达情况，重组病毒的转染效率高达90％，如图4a。而空病毒感染组，未观察到明显绿色荧光，如图4b。

实施例5：重组腺相关病毒体外抑制效率的检测

以Hep G2.2.15细胞为模型，以每孔500μl，5×10⁴个Hep G2.2.15细胞接种24孔板，待细胞贴壁后，分别以1×106copies/细胞加入重组AAV病毒、10KU/ml的IFN-α和药物终浓度为100ug/ml拉米夫定，同时设置空白对照组，每个实验样品设置3个复孔。转染后第2-8天每天分别取细胞培养液上清，酶联免疫法检测HBsAg和HBeAg的分泌量，第8天提取细胞的DNA和mRNA，荧光定量PCR法检测DNA和mRNA表达量，结果显示重组AAV病毒对HBV所分泌的两种抗原HBsAg和HBeAg均有较好的抑制作用，且在第6天的时候抑制效果最明显，同时对两种抗原的抑制作用程度和时程方面结果比较一致，干扰素和拉米夫定的抑制效果中等。重组病毒感染组HBV DNA的平均拷贝数从14.41×10⁶copies/ml下降到3.30×10⁶copies/ml，抑制率达到(77.10±0.84)％，对HBV mRNA的抑制率达到(96.85±1.49)％，如图5、6、7和8。

实施例6：重组腺相关病毒细胞毒性的检测

以Hep G2.2.15细胞为模型，以每孔50ul，1×10⁴个Hep G2.2.15细胞铺在96孔板中，待细胞贴壁后，分别以1×10⁶copies/细胞加入重组AAV病毒、空病毒、10KU/ml的IFN-α和药物终浓度为100ug/ml拉米夫定，同时设置空白对照组。加样后每天使用CCK-8试剂盒()检测各样品的细胞毒性，共检测7天。具体步骤为各样品孔加入10ul的CCK-8，继续培养30min后，在450nm处测吸光值。重组AAV病毒、空病毒与空白对照的生长曲线基本一致，说明其对细胞基本没有毒性，如图9。

实施例7：重组腺相关病毒体外抑制作用时间的检测

以Hep G2.2.15细胞为模型，以每孔500μl，5×10⁴个Hep G2.2.15细胞接种24孔板，待细胞贴壁后，分别以1×10⁶opies/细胞加入重组AAV病毒、10KU/ml的IFN-α和药物终浓度为100ug/ml拉米夫定，同时设置空白对照组，每个实验样品设置3个复孔。第10、20和30天分别取细胞培养液上清，酶联免疫法检测HBsAg和HBeAg的分泌量，结果显示干扰素和拉米夫定在10天左右时基本没有抑制效果，而重组腺相关病毒得抑制作用在第30天时仍能维持一定的水平，如图10和11。

DNA SEQUENCE LISTING

<110>北京三元基因工程有限公司北京毕艾欧科技发展有限责任公司

<120>针对乙肝病毒的shRNA及携带其的重组腺相关病毒

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>stem_loop

<222>(27)..(35)

<223>人工设计合成的正义链序列

<400>1

caccgcagtt tactagtgcc atttgtttca agagaacaaa tggcactagt aaactgtttt 60

ttg 63

<210>2

<211>63

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>stem_loop

<222>(33)..(41)

<223>人工设计合成的反义链序列

<400>2

gatccaaaaa acagtttact agtgccattt gttctcttga aacaaatggc actagtaaac 60

tgc 63

RNA SEQUENCE LISTING

<120>针对乙肝病毒的shRNA及携带其的重组腺相关病毒

<130>

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>54

<212>RNA

<213>人工合成

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(54)

<400>1

gcaguuuacu agugccauuu guuucaagag aacaaauggc acuaguaaac uguu 54

Claims

1.一种针对乙型肝炎病毒的shRNA，其RNA序列为：

5′-GCAGUUUACUAGUGCCAUUUGUUUCAAGAGAACAAAUGGCACUAGUAAACUGUU-3′

2.权利要求1所述的shRNA在制备预防或***及乙肝病毒感染相关的疾病的药物中的用途。

3.一种用于转录权利要求1所述的shRNA的DNA序列，其DNA序列为：正义链：

5′-CACCGCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTTCAAGAGAACAAATGGCACTAGTAAACTGTTTTTTG-3′

反义链：

5′-GATCCAAAAAACAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCTCTTGAAACAAATGGCACTAGTAAACTGC-3′

4.一种重组腺相关病毒基因治疗载体，其特征在于，所述的重组腺相关病毒载体携带有权利要求3所述的DNA序列和适宜的启动子和终止子。

5.权利要求4所述的重组腺相关病毒基因治疗载体在制备预防或***及乙肝病毒感染相关的疾病的药物制剂中的用途。

6.权利要求4所述的重组腺相关病毒载体的制备方法，包括如下步骤：

(a)合成通过具有HBV抑制活性的shRNA转换的DNA序列，

(b)将合成的DNA克隆入能够在体内转录出shRNA的腺相关病毒骨架质粒中获得重组腺相关病毒骨架质粒，

(c)将重组腺相关病毒骨架质粒和腺相关病毒的辅助质粒共转染入能够包装出腺相关病毒的包装细胞中获得重组腺相关病毒载体。