CN104672332A - 用于检测游离棉酚的抗体、elisa方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

一种用于检测游离棉酚的抗体、ELISA方法及试剂盒，涉及棉粕及饲料中毒害物质分析技术领域。棉酚通过交联臂与牛血清白蛋白偶联得到免疫原，免疫原免疫小鼠得到抗体；ELISA方法首先优化确定ELISA检测方法各种试剂的最佳浓度和检测条件，建立棉酚ELISA检测方法；确定待测样品前处理条件，用建立的ELISA方法进行检测；试剂盒包括包被有包被原的酶标板、不同浓度的棉酚双加成物的标准溶液、抗体工作液。本发明提高了抗体识别棉酚衍生物的特异性和亲和力，提高了ELISA方法和试剂盒的检测灵敏度。

Description

用于检测游离棉酚的抗体、ELISA方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及棉粕及饲料中毒害物质分析技术领域，具体涉及一种用于检测游离棉酚的抗体、酶联免疫吸附分析(ELISA)方法及试剂盒。

背景技术

棉粕常用作饲料或饲料原料，是畜禽、鱼类重要的蛋白原料，但是，棉粕中含有游离棉酚，棉酚具有很强的毒性，棉酚吸收进入动物体内后，主要分布于心、肝、脾、肺、肾和血液中。棉酚不仅可以在畜禽可食性组织中蓄积，也可以发生转移，比如，奶牛体内的棉酚可以转移至奶中，蛋鸡体内的棉酚可以转移至鸡蛋中，因此，棉酚对人类食品安全构成了严重威胁。美国、欧盟和中国等国家和地区制定了饲料、饲料原料和人类食品中棉酚含量限量标准。

现有检测棉粕及饲料中游离棉酚的方法主要包括分光光度法(苯胺法)、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、高效液相质谱联用法、免疫化学分析法等。其中，分光光度法是国内检测游离棉酚普遍使用的方法，但该方法存在灵敏度低、毒性大、操作费时等缺点。高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、高效液相质谱联用法等运用仪器的方法虽然灵敏度较高、操作简单，但对仪器设备要求高、检测费用高，很难推广使用。免疫化学分析法，特别是酶联免疫吸附分析(ELISA)检测方法因灵敏度较高、操作简单，成为检测游离面棉酚研究的重点。已经有学者通过将游离棉酚的醛基直接与载体蛋白上的游离氨基结合得到免疫原，以该免疫原制备多克隆抗体和单克隆抗体，并用这些抗体分别建立检测游离棉酚的竞争ELISA方法和间接竞争ELISA方法(以下简称为ELISA方法)，但是依旧存在问题：抗体效价偏低，其中多克隆抗体的使用浓度为1:1000，单克隆抗体的使用浓度为1:10；抗体对棉酚或棉酚的衍生物的亲和力不高，以该抗体建立的免疫化学分析方法的灵敏度较低，表现为得到的标准曲线线性范围宽，曲线斜率低。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于检测游离棉酚的抗体、ELISA方法及试剂盒，提高抗体识别棉酚衍生物的特异性和亲和力，提高ELISA方法和试剂盒的检测灵敏度。

为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种用于检测游离棉酚的抗体，棉酚通过交联臂与牛血清白蛋白偶联得到免疫原，免疫原免疫小鼠得到所述抗体，所述交联臂为O-羧甲基羟胺、对肼基苯甲酸、己二酰二肼和6-氨基己酸中的一种。

在上述技术方案的基础上，棉酚通过所述交联臂与卵清蛋白偶联得到包被原。

一种用于检测游离棉酚的ELISA方法，包括如下步骤：

步骤1.将棉酚通过交联臂与牛血清白蛋白偶联得到免疫原，免疫原免疫小鼠得到抗体；将棉酚通过交联臂与卵清蛋白偶联得到包被原，利用包被原制备包被有包被原的酶标板，所述交联臂为O-羧甲基羟胺、对肼基苯甲酸、己二酰二肼和6-氨基己酸中的一种；

步骤2.将待测样品加入体积比为70％的丙酮水溶液，过滤后的滤液用稀释液稀释得到待测样品溶液；

步骤3.确定ELISA方法的检测条件，利用上述抗体、酶标板建立ELISA检测方法，利用该ELISA检测方法检测待测样品溶液中游离棉酚的含量。

在上述技术方案的基础上，所述稀释剂为包括8.0g NaCl、0.2gKH₂PO₄、2.9g Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g KCl、0.1g硫柳汞，加双蒸水至1000mL形成的溶液。

在上述技术方案的基础上，确定ELISA方法的检测条件包括以下步骤：

步骤301.配置ELISA方法所需试剂；

步骤302.采用ELISA方法，测定不同浓度抗体稀释液和包被原稀释液作用后酶标板的OD值，根据酶标板相邻孔OD值差值最大的抗体稀释液的浓度，确定为抗体工作浓度；相邻孔OD值的差值最大的包被原稀释液的浓度，确定为包被原浓度；

步骤303.采用ELISA方法，绘制标准曲线，求出半抑制浓度；

步骤304.采用ELISA方法，利用所述试剂对棉酚标准品进行测定。

一种用于检测游离棉酚的ELISA试剂盒，包括辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、底物液A、底物液B和终止液，本试剂盒还包括：包被有包被原的酶标板、抗体工作液和不同浓度的棉酚双加成物的标准溶液，其中，包被原为棉酚通过交联臂与卵清蛋白偶联反应得到的偶联物；抗体为棉酚通过交联臂与牛血清白蛋白偶联得到免疫原，免疫原免疫小鼠得到的抗体；棉酚双加成物为棉酚与交联臂双加成反应得到的加成物，所述交联臂为O-羧甲基羟胺、对肼基苯甲酸、己二酰二肼和6-氨基己酸中的一种。

在上述技术方案的基础上，所述包被原为棉酚通过6-氨基己酸与卵清蛋白偶联反应得到的偶联物棉酚-6-氨基己酸-卵清蛋白；免疫原为棉酚通过6-氨基己酸与牛血清白蛋白反应得到的偶联物棉酚-6-氨基己酸-牛血清白蛋白；棉酚双加成物为棉酚与6-氨基己酸双加成反应得到的加成物棉酚-6-氨基己酸双加成物。

在上述技术方案的基础上，包被有包被原的酶标板制作的具体过程为：用包被液将所述包被原稀释成0.5mg/L的溶液，在酶标板的每孔加入100μL上述溶液，4℃过夜，倾倒去除包被液；在每孔加入210μL洗涤液，洗涤3次，拍干；在每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1h，倾去孔内液体；洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存，制得包被有包被原的酶标板。

在上述技术方案的基础上，所述抗体工作液为将上述抗体用磷酸盐缓冲液按照1:16000稀释得到的溶液。

在上述技术方案的基础上，棉酚双加成物的标准溶液的浓度分别为0μg/L、5μg/L、15μg/L、45μg/L、135μg/L、405μg/L。

本发明的有益效果在于：

1、因为棉酚分子化学结构是对称的，分子中含有的两个醛基具有相同的化学反应活性，本发明的抗原是在棉酚分子中的两个醛基均加上交联臂获得双加成物，然后再偶联到载体蛋白上，得到抗体识别棉酚与交联臂的双加成衍生物，交联臂的引入增加了棉酚衍生物化学结构和空间结构的复杂性，大大改善小分子棉酚人工抗原的免疫原性，提高抗体的特异性、亲和力，从而提高ELISA方法及试剂盒的检测灵敏度。

2、本发明ELISA方法对仪器设备要求低，操作简单，本试剂盒中包括ELISA方法用到的所有试剂和酶标板，便于携带和推广使用。

附图说明

图1为本发明实施例中制备抗原的反应原理方程式；

图2为本发明实施例中抗体与棉酚-6-氨基己酸双加成物的间接竞争酶联免疫反应的标准曲线；

图3为本发明ELISA方法与高效液相色谱法对不同棉粕中游离棉酚含量测定值的相互关系示意图。

具体实施方式

以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。

一种用于检测游离棉酚的抗体，棉酚通过交联臂与牛血清白蛋白偶联得到免疫原，免疫原免疫小鼠得到所述抗体，棉酚通过所述交联臂与卵清蛋白偶联得到包被原，所述交联臂为O-羧甲基羟胺、对肼基苯甲酸、己二酰二肼和6-氨基己酸中的一种。

一种用于检测游离棉酚的ELISA方法，包括如下步骤：

步骤1.将棉酚通过交联臂O-羧甲基羟胺、对肼基苯甲酸、己二酰二肼或6-氨基己酸与牛血清白蛋白偶联得到免疫原，免疫原免疫小鼠得到识别棉酚衍生物的抗体。

将棉酚通过交联臂O-羧甲基羟胺、对肼基苯甲酸、己二酰二肼或6-氨基己酸与卵清蛋白偶联得到包被原，包被原为棉酚-O-羧甲基羟胺-卵清蛋白偶联物、棉酚-对肼基苯甲酸-卵清蛋白偶联物、棉酚-6-氨基己酸-卵清蛋白偶联物或棉酚-己二酰二肼-卵清蛋白偶联物；利用包被原制备包被有包被原的酶标板。

步骤2.将待测样品加入用体积比为70％的丙酮水溶液，过滤后的滤液用稀释液稀释得到待测样品溶液，稀释剂为包括8.0g NaCl、0.2gKH₂PO₄、2.9g Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g KCl，0.1g硫柳汞，加双蒸水至1000mL形成的溶液。

步骤3.确定ELISA方法的检测条件，利用上述抗体、酶标板建立ELISA检测方法，利用该ELISA检测方法检测待测样品溶液中游离棉酚的含量。

所述步骤1中，棉酚抗原(包括免疫原和包被原)和抗体的制备，可以通过如下几种实施例制得。

实施例一：

步骤1.1棉酚-O-羧甲基羟胺双加成物(AOAA-FG-AOAA)的制备。称取O-羧甲基羟胺半盐酸盐(AOAA)255.0mg(2mmol)加入到2mL蒸馏水中，待溶解，得到A液；称取醋酸棉酚(FG)289.0mg(0.5mmol)加入到20mL无水乙醇中，40℃加热溶解，形成B液；将A液和B液混合后，室温避光磁力搅拌反应过夜，过滤取沉淀，用无水乙醇50mL洗涤沉淀，收集沉淀，常温避光晾干，得到棉酚双加成物AOAA-FG-AOAA。

步骤1.2棉酚-O-羧甲基羟胺-牛血清白蛋白/卵清蛋白偶联物(FG-AOAA-BSA/OVA)的制备。称取AOAA-FG-AOAA 33.2mg(0.05mmol)加入到2mL甲醇中，然后加入三正丁胺35.5μL，4℃搅拌10min，再加入4℃预冷的氯甲酸异丁酯18μL，室温反应1h，为A液；称取牛血清白蛋白(BSA)75mg溶于25mL 0.01M碳酸盐缓冲溶液中，为B液；将A液逐滴加入到B液中，边加入边搅拌，置冰水浴中磁力搅拌反应10h。离心后取上清，4℃生理盐水中透析3d，每天更换透析液2次，即得棉酚-O-羧甲基羟胺-牛血清白蛋白偶联物(FG-AOAA-BSA)；离心后取上清液冷冻干燥，置-20℃保存，用作免疫原。另外，将牛血清白蛋白(BSA)换成等摩尔量的卵清蛋白(OVA)，具体方式不变，即得棉酚-O-羧甲基羟胺-卵清蛋白偶联物(FG-AOAA-OVA)，用作包被原。

步骤1.3抗棉酚-O-羧甲基羟胺-BSA偶联物抗体的制备。利用FG-AOAA-BSA免疫Balb/C小鼠(购自湖北省医学科学院实验动物中心)。免疫程序是：取含FG-AOAA-BSA50～100μg的蛋白溶液与等体积的弗氏完全佐剂(购自sigma公司)乳化后，于小鼠背部皮下多点注射；换用弗氏不完全佐剂(购自sigma公司)乳化，每间隔2周加强一次；经过3～5次免疫后，眼眶采血，分离血清，即为抗棉酚-O-羧甲基羟胺抗体；加入等量甘油，混匀后分装，置-20℃保存。

实施例二：

步骤2.1棉酚-对肼基苯甲酸双加成物(HBA-FG-HBA)的制备。称取对肼基苯甲酸(HBA)302.0mg(2mmol)加入到2.5mL N,N-二甲基甲酰胺中，待溶解，得到A液；称取醋酸棉酚(FG)289.0mg(0.5mmol)加入到20mL无水乙醇中，40℃水浴磁力搅拌加热至完全溶解，形成B液；将A液和B液混合后，40℃避光磁力搅拌反应过夜，过滤取沉淀，用无水乙醇50mL洗涤沉淀，收集沉淀，常温避光晾干，得到棉酚双加成物(HBA-FG-HBA)。

步骤2.2棉酚-对肼基苯甲酸-牛血清白蛋白/卵清蛋白偶联物(FG-HBA-BSA/OVA)的制备。称取HBA-FG-HBA 39.2mg(0.05mmol)加入到2mL N,N-二甲基甲酰胺中，然后加入三正丁胺35.5μL，4℃搅拌10min，再加入4℃预冷的氯甲酸异丁酯18μL，室温反应1h，为A液；称取牛血清白蛋白(BSA)75mg溶于25mL0.01M碳酸盐缓冲溶液中，为B液。将A液逐滴加入到B液中，边加入边搅拌，置冰水浴中磁力搅拌反应10h；离心后取上清，4℃生理盐水中透析3d，每天更换透析液2次，即得棉酚-对肼基苯甲酸-牛血清白蛋白偶联物(FG-HBA-BSA)；离心后取上清液冷冻干燥，置-20℃保存，用作免疫原。另外，将BSA换成等摩尔量的卵清蛋白(OVA)，具体方式不变，即得棉酚-对肼基苯甲酸-卵清蛋白偶联物(FG-HBA-OVA)，用作包被原。

步骤2.3抗棉酚-对肼基苯甲酸-BSA偶联物抗体的制备。利用FG-HBA-BSA免疫Balb/C小鼠，免疫程序是同1.3，得到抗棉酚-对肼基苯甲酸抗体。

实施例三：

步骤3.1棉酚-6-氨基己酸双加成物(EACA-FG-EACA)的合成。称取6-氨基己酸(EACA)262.0mg(2mmol)加入到2mL蒸馏水中，待溶解，得到A液；称取醋酸棉酚(FG)289.0mg(0.5mmol)加入到15mL无水乙醇中，40℃水浴磁力搅拌加热至完全溶解，形成B液；将A液逐滴加入到B液中，避光磁力搅拌反应3h，过滤取沉淀，用无水乙醇50mL洗涤沉淀，收集沉淀，常温避光晾干，得到棉酚双加成物(EACA-FG-EACA)。

步骤3.2棉酚-6-氨基己酸-牛血清白蛋白/卵清蛋白偶联物(FG-EACA-BSA/OVA)的制备。制备过程中，将步骤2.2中的HBA-FG-HBA换成等摩尔量的EACA-FG-EACA(即37.2mg)，其他步骤与步骤2.2所述一致，即可获得免疫原棉酚-6-氨基己酸-牛血清白蛋白偶联物(FG-EACA-BSA)和包被原棉酚-6-氨基己酸-卵清蛋白偶联物(FG-EACA-OVA)，反应原理方程式如图1所示。

步骤3.3抗棉酚-6-氨基己酸-BSA偶联物抗体的制备。利用FG-EACA-BSA免疫Balb/C小鼠，免疫程序是同步骤1.3，得到抗棉酚-6-氨基己酸抗体。

实施例四：

步骤4.1棉酚-己二酰二肼-牛血清白蛋白/卵清蛋白偶联物(FG-ADH-BSA/OVA)的制备。称取己二酰二肼(ADH)334mg、牛血清白蛋白(BSA)80mg和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)80mg溶解于16mLMES缓冲液[0.1mol/L的2-(N-***啉)乙磺酸]中，室温磁力搅拌反应1.5h。2000rpm离心后取上清，4℃生理盐水中透析3d，每天更换透析液2次。透析后2000rpm离心，取上清，即为A液；称取ADH-FG-ADH 8.3mg加入到DMF 2mL，待溶解，形成B液；将B液逐滴加入到A液中，边加边搅拌，置冰水浴中磁力搅拌反应12h。反应完毕后，用4℃生理盐水透析3d，每天更换透析液2次，即得棉酚-己二酰二肼-牛血清白蛋白偶联物(FG-ADH-BSA)；离心后取上清冷冻干燥，置-20℃保存，用作免疫原。另外，将BSA换成等摩尔量的OVA，具体方式不变，即得棉酚-己二酰二肼-卵清蛋白偶联物(FG-ADH-OVA)，用作包被原。

步骤4.2抗棉酚-己二酰二肼-BSA偶联物抗体的制备。利用FG-ADH-BSA免疫Balb/C小鼠，免疫程序是同1.3，得到抗棉酚-己二酰二肼抗体。

所述步骤3中，确定ELISA方法的检测条件的过程为：

步骤301.配置ELISA方法所需试剂。

磷酸盐缓冲液：称取NaCl 8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl 0.2g，加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4，形成溶液；

包被液：称取1.5g Na₂CO₃、2.9g NaHCO₃，加三蒸水至1000mL，调节pH值至9.6后，形成溶液；

洗涤液：称取8.0g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.9g Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g KCl，0.1g硫柳汞，量取0.5mL吐温-20，加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4后，形成溶液；

封闭液：称取0.1g卵清蛋白溶于100mL磷酸盐缓冲液中，形成溶液；

底物液A：称取200mg3，3’，5’，5-四甲基联苯二胺(TMB)，量取100mL无水乙醇，加双蒸水至1000mL后，形成溶液。

底物液B：称取14.6g Na₂HPO₄、9.3g柠檬酸，量取6.4mL 0.75％过氧化氢尿素，加双蒸水至1000mL后，形成溶液；

终止液：2mol/L的硫酸溶液。

步骤302.确定包被原浓度和抗体工作浓度：采用ELISA方法，测定不同浓度抗体稀释液和包被原稀释液作用后酶标板的OD值，根据酶标板相邻孔OD值差值最大的抗体稀释液的浓度，确定为抗体工作浓度；相邻孔OD值的差值最大的包被原稀释液的浓度，确定为包被原浓度。本实施例中，选择上述棉酚-6-氨基己酸-卵清蛋白(FG-EACA-OVA)作为包被原，用包被液稀释成8mg/L、4mg/L、2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L 6个浓度，在96孔酶标板，从第一至第六列依次加入，4℃过夜；洗涤3次，拍干，加入封闭液200μL，37℃封闭1h；洗涤3次，拍干，在酶标板的第一行至第八行依次加入100μL磷酸盐缓冲液稀释的稀释倍数为2000、4000、8000、16000、32000、64000、128000、256000的单克隆抗体，37℃孵育1h，洗涤3次，拍干；各孔加入1:5000倍磷酸盐缓冲液稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(简称二抗，购自武汉三鹰生物技术有限公司)100μL，37℃孵育1h，洗涤5次，拍干；各孔加入100μL底物混合液，避光显色15min，加入50μL终止液，用自动酶标仪在450nm波长处测定光密度值(OD值)，结果见表1。

表1包被原浓度和抗体工作浓度

由上表可以看出，以OD值为1.0左右，且相邻孔OD值的差值最大的抗体稀释溶液的浓度，定为抗体工作浓度；相邻孔OD值的差值最大的包被原稀释浓度，定为包被原浓度。因此，确定包被原FG-EACA-OVA的包被原浓度为0.5mg/L，抗体工作液浓度为稀释倍数为1:16000的稀释溶液浓度。

步骤303.采用ELISA方法，绘制标准曲线，求出半抑制浓度IC₅₀。

称取上述棉酚-6-氨基己酸双加成物(EACA-FG-EACA)10mg，用丙酮定容至100mL，配置浓度为100mg/L的标准溶液。用磷酸盐缓冲液将AOAA-FG-AOAA标准溶液稀释成0μg/L、5μg/L、15μg/L、45μg/L、135μg/L、405μg/L 6个系列浓度，每个浓度重复3孔，按照ELISA方法测定，重复测定5次。以AOAA-FG-AOAA溶液浓度的对数值为横坐标，B/B0为纵坐标绘制标准曲线，求出半抑制浓度IC50，本试剂盒的IC50值为52.0μg/L。

步骤304.采用ELISA方法，利用所述试剂对棉酚标准品进行测定。

称取棉酚标准品10mg，用丙酮定容至100mL，配制浓度为100mg/L的棉酚标准品丙酮溶液。用磷酸盐缓冲液将棉酚标准溶液稀释成10μg/L、50μg/L、250μg/L 3个浓度。另用蒸馏水配制1mmol/L的O-羧甲基羟胺溶液。取上述3个浓度的棉酚标准溶液各1mL，分别加入1mmol/L6-氨基己酸溶液7.7μL、38.6μL、192.8μL，40℃水浴振荡反应2h。反应完毕后，按照ELISA方法测定，每个浓度重复3次。根据标准曲线计算出棉酚-6-氨基己酸双交联物(AOAA-FG-AOAA)的浓度(CEACA-FG-EACA，μg/kg)，并按照公式1换算成棉酚浓度(CFG)。检测结果见表2。

公式1： $C_{\mathrm{FG}}=C_{\mathrm{EACA}-\mathrm{FG}-\mathrm{EACA}}\×\frac{518}{744}$

表2ELISA方法对棉酚的测定结果

另外，通过实验对ELISA方法进行确证

1、ELISA方法测定棉粕中棉酚标准品添加：

准确称取9份已知游离棉酚含量为8.53g/kg(高效液相色谱法测定)的棉粕研磨物0.5g于100mL离心管中，平均分为3组，每组分别加入醋酸棉酚2.8mg、5.6mg、11.1mg(折算成棉酚分别为：2.5mg、5mg、10mg)，混匀后，加入70％丙酮水溶液(V:V)50mL，涡旋混合均匀，超声30min，过滤。取滤液1mL，加入0.1mol/L 6-氨基己酸水溶液10μL，40℃水浴振荡反应2h。反应完毕后，将棉粕样品反应液用磷酸盐缓冲液稀释100倍，取稀释的反应液按照ELISA方法测定，每个样品重复3次。根据标准曲线计算出棉酚-6-氨基己酸双交联物(EACA-FG-EACA)的浓度，按照公式1换算成棉酚浓度，并计算添加回收率，结果见表3。

表3棉粕中棉酚添加回收率及变异系数

2、ELISA方法测定饲料中棉酚标准品添加：

准确称取9份已知游离棉酚含量为0.57g/kg(高效液相色谱法测定)的饲料研磨物0.5g于100mL离心管中，平均分为3组，每组分别加入100mg/L醋酸棉酚丙酮溶液2.8mL、5.6mL、11.1mL(折算成棉酚添加量分别为：0.25mg、0.5mg、1.0mg)，混匀后，加入70％丙酮水溶液(V:V)至总体积为50mL，涡旋混合均匀，超声30min，过滤。取滤液1mL，加入0.01mol/L 6-氨基己酸水溶液10μL，40℃水浴振荡反应2h。反应完毕后，将饲料样品反应液用磷酸盐缓冲液稀释10倍，取稀释的反应液按照ELISA方法测定，每个样品重复3次。根据标准曲线计算出棉酚-6-氨基己酸双交联物(EACA-FG-EACA)的浓度，按照公式1换算成棉酚浓度，并计算添加回收率，结果见表4。

表4饲料中棉酚添加回收率及变异系数

3、ELISA方法和HPLC法对棉粕样品中游离棉酚测定值比对：

准确称取10份不同来源的棉粕样品研磨物0.5g于100mL离心管中，加入70％丙酮水溶液(V:V)50mL，涡旋混合均匀，超声30min，过滤。取滤液1mL，加入乙腈/水溶液(80:20，V:V)9mL，混匀后，过0.2微米微孔滤膜，用高效液相色谱法(HPLC)检测。具体方法为：采用日本岛津高效液相色谱仪，色谱条件：Agilent extend-C18(250×4.6mm，5μm)，紫外检测波长235nm，柱温35℃。进样量20μL，流动相A：水/甲酸(100:0.1，v/v)；流动相B：乙腈，A:B＝20:80(V:V)，等度洗脱，流速为1mL/min。

另取滤液1mL，加入0.1mol/L 6-氨基己酸水溶液10μL，40℃水浴振荡反应2h。反应完毕后，将反应液用磷酸盐缓冲液稀释100倍，取稀释的反应液按照ELISA方法测定。根据标准曲线计算出棉酚-6-氨基己酸双交联物(EACA-FG-EACA)的浓度，并按照公式1换算成棉酚浓度。图3为本发明ELISA方法与高效液相色谱法(HPLC)对10份不同来源棉粕中游离棉酚含量测定值的相互关系，X轴为HPLC法测定值，Y轴为ELISA方法测定值。HPLC和ELISA方法的测定结果见表5，

表5HPLC法和ELISA法测定棉粕中游离棉酚含量

一种用于检测游离棉酚的试剂盒，包括辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液和包被有包被原的酶标板、抗体工作液、不同浓度的棉酚双加成物的标准溶液。其中，包被原为棉酚通过交联臂与卵清蛋白偶联反应得到的偶联物；抗体为棉酚通过交联臂与牛血清白蛋白偶联得到免疫原，免疫原免疫小鼠得到的抗体；棉酚双加成物为棉酚与交联臂双加成反应得到的加成物，所述交联臂为O-羧甲基羟胺、对肼基苯甲酸、己二酰二肼和6-氨基己酸中的一种，同一试剂盒中的包被原、棉酚双加成物的标准溶液和抗体工作液为棉酚的同一交联臂衍生物。

本实施例中，包被原为棉酚通过交联臂6-氨基己酸与卵清蛋白偶联反应得到的偶联物棉酚-6-氨基己酸-卵清蛋白；包被原的酶标板制作的具体步骤为：用包被液将所述包被原稀释成0.5mg/L的溶液，在酶标板的每孔加入100μL上述溶液，4℃过夜，倾倒去除包被液；在每孔加入210μL洗涤液，洗涤3次，拍干；在每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1h，倾去孔内液体；洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存，制得包被有包被原的酶标板。

抗体为棉酚通过6-氨基己酸与牛血清白蛋白偶联得到免疫原棉酚-6-氨基己酸-牛血清白蛋白，免疫原免疫小鼠得到的抗体，抗体工作液为将抗体用磷酸缓冲盐按1:16000稀释得到的溶液，

棉酚双加成物为棉酚与6-氨基己酸双加成反应得到的加成物棉酚-6-氨基己酸双加成物，棉酚双加成物的标准溶液的浓度分别为0μg/L、5μg/L、15μg/L、45μg/L、135μg/L、405μg/L。

浓缩磷酸盐缓冲液为包括浓度为80.0g/L的NaCl、浓度为2.0g/L的KH₂PO₄、浓度为29.0g/L的Na₂HPO₄.12H₂O、浓度为2.0g/L的KCl和浓度为0.1g/L的硫柳汞的水溶液。

浓缩洗涤液为包括浓度为80.0g/L的NaCl、浓度为2.0g/L的KH₂PO₄、浓度为29.0g/L的Na₂HPO₄·12H₂O、浓度为2.0g/L的KCl、浓度为0.1g/L的硫柳汞和浓度为5mL/L的吐温-20的水溶液。

底物液A为包括浓度为200mg/L的3，3’，5’，5-四甲基联苯二胺和浓度为100mL/L的无水乙醇的水溶液。

底物液B为包括浓度为14.6g/L的Na₂HPO₄、浓度为9.3g/L的柠檬酸和浓度为6.4mL/L的0.75％过氧化氢尿素的水溶液。

终止液为2mol/L的硫酸溶液。

使用本试剂盒利用ELISA方法检测游离棉酚的程序，包括如下步骤：

F1.将试剂盒中的浓缩磷酸盐缓冲液用三蒸水稀释10倍后形成稀释液待用，将浓缩洗涤液用三蒸水稀释10倍后形成洗涤液待用，将底物液A和底物液B按体积1:1混匀形成底物混合液待用，根据每次所需用量现配先用，酶标板和其他试剂无需处理直接待用。

F2.待测样品处理得到待测样品溶液，具体过程为：称取0.5g棉粕样品或饲料样品研磨物于100mL离心管中，加入50mL体积百分比为70％的丙酮水溶液，涡旋混合均匀，超声30min，过滤；取1mL样品滤液，加入10μL所述选用的交联臂水溶液，40℃水浴振荡反应2h；样品反应滤液用稀释液稀释得到待测样品溶液，其中，棉粕样品滤液加入0.1mol/L的交联臂水溶液，棉粕样品反应滤液用稀释液稀释100倍得到待测样品溶液；饲料样品滤液加入0.01mol/L交联臂水溶液，饲料样品反应滤液用稀释液10倍得到待测样品溶液。

F3.在包被有包被原的酶标板的每孔中加入50μL不同浓度的棉酚双加成物的标准溶液或待测样品溶液，然后加入50μL抗体工作液，将酶标板置于湿盒中，37℃恒温孵育1h；倾倒去除每孔中的液体，在每孔中加入210μL洗涤液，洗涤3次并拍干。

F4.在每孔中加入100μL辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液，将酶标板置于湿盒中，37℃恒温孵育1h；倾倒去除每孔中的液体，在每孔中加入210μL洗涤液，洗涤5次并拍干。

F5.在每孔中加入100μL底物混合液，将酶标板置于湿盒中，37℃恒温孵育15min，在每孔中加入50μL终止液。

F6.用酶标仪测定每孔在450nm处的光密度值(OD值)。

F7.根据光密度值计算得到待测样品溶液中游离棉酚浓度。

本实施例，采用6-氨基己酸作为交联臂制备棉酚双加成物、抗体试剂盒，计算方法为：X轴为棉酚-6-氨基己酸双加成物的标准溶液的浓度，Y轴为棉酚-6-氨基己酸双加成物的标准溶液光密度值除以空白溶液(“零”孔)光密度值(B/B0)，制作标准曲线，如图2所示，并进行线性回归，给出回归方程；待测样品溶液的OD值除以“零”孔OD值，计算样品的抑制率；待测样品溶液的抑制率代入上述标准曲线的回归方程中，并乘以稀释系数，计算出待测样品溶液中棉酚双加成物棉酚-6-氨基己酸双加成物(EACA-FG-EACA)的浓度；按照公式计算得到游离棉酚(FG)的浓度，单位为μg/kg。

本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (10)

1.一种用于检测游离棉酚的抗体，其特征在于：棉酚通过交联臂与牛血清白蛋白偶联得到免疫原，免疫原免疫小鼠得到所述抗体，所述交联臂为O-羧甲基羟胺、对肼基苯甲酸、己二酰二肼和6-氨基己酸中的一种。

2.如权利要求1所述用于检测游离棉酚的抗体，其特征在于：棉酚通过所述交联臂与卵清蛋白偶联得到包被原。

3.一种用于检测游离棉酚的ELISA方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1.将棉酚通过交联臂与牛血清白蛋白偶联得到免疫原，免疫原免疫小鼠得到抗体；将棉酚通过交联臂与卵清蛋白偶联得到包被原，利用包被原制备包被有包被原的酶标板，所述交联臂为O-羧甲基羟胺、对肼基苯甲酸、己二酰二肼和6-氨基己酸中的一种；

步骤2.将待测样品加入体积比为70％的丙酮水溶液，过滤后的滤液用稀释液稀释得到待测样品溶液；

步骤3.确定ELISA方法的检测条件，利用上述抗体、酶标板建立ELISA检测方法，利用该ELISA检测方法检测待测样品溶液中游离棉酚的含量。

4.如权利要求3所述的用于检测游离棉酚的ELISA方法，其特征在于：所述稀释剂为包括8.0g NaCl、0.2g KH₂PO₄、2.9gNa₂HPO₄·12H₂O、0.2g KCl、0.1g硫柳汞，加双蒸水至1000mL形成的溶液。

5.如权利要求3所述的用于检测游离棉酚的ELISA方法，其特征在于，确定ELISA方法的检测条件包括以下步骤：

步骤301.配置ELISA方法所需试剂；

步骤302.采用ELISA方法，测定不同浓度抗体稀释液和包被原稀释液作用后酶标板的OD值，根据酶标板相邻孔OD值差值最大的抗体稀释液的浓度，确定为抗体工作浓度；相邻孔OD值的差值最大的包被原稀释液的浓度，确定为包被原浓度；

步骤303.采用ELISA方法，绘制标准曲线，求出半抑制浓度；

步骤304.采用ELISA方法，利用所述试剂对棉酚标准品进行测定。

6.一种用于检测游离棉酚的ELISA试剂盒，包括辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG抗体工作液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、底物液A、底物液B和终止液，其特征在于，本试剂盒还包括：包被有包被原的酶标板、抗体工作液和不同浓度的棉酚双加成物的标准溶液，其中，包被原为棉酚通过交联臂与卵清蛋白偶联反应得到的偶联物；抗体为棉酚通过交联臂与牛血清白蛋白偶联得到免疫原，免疫原免疫小鼠得到的抗体；棉酚双加成物为棉酚与交联臂双加成反应得到的加成物，所述交联臂为O-羧甲基羟胺、对肼基苯甲酸、己二酰二肼和6-氨基己酸中的一种。

7.如权利要求6所述的用于检测游离棉酚的ELISA试剂盒，其特征在于：所述包被原为棉酚通过6-氨基己酸与卵清蛋白偶联反应得到的偶联物棉酚-6-氨基己酸-卵清蛋白；免疫原为棉酚通过6-氨基己酸与牛血清白蛋白反应得到的偶联物棉酚-6-氨基己酸-牛血清白蛋白；棉酚双加成物为棉酚与6-氨基己酸双加成反应得到的加成物棉酚-6-氨基己酸双加成物。

8.如权利要求7所述的用于检测游离棉酚的ELISA试剂盒，其特征在于，包被有包被原的酶标板制作的具体过程为：用包被液将所述包被原稀释成0.5mg/L的溶液，在酶标板的每孔加入100μL上述溶液，4℃过夜，倾倒去除包被液；在每孔加入210μL洗涤液，洗涤3次，拍干；在每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1h，倾去孔内液体；洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存，制得包被有包被原的酶标板。

9.如权利要求7所述的用于检测游离棉酚的ELISA试剂盒，其特征在于：所述抗体工作液为将上述抗体用磷酸盐缓冲液按照1:16000稀释得到的溶液。

10.如权利要求7所述的用于检测游离棉酚的ELISA试剂盒，其特征在于：棉酚双加成物的标准溶液的浓度分别为0μg/L、5μg/L、15μg/L、45μg/L、135μg/L、405μg/L。