CN103073634B - 一种抗除草剂莎稗磷的特异性抗体 - Google Patents
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Abstract
除草剂莎稗磷的半抗原、人工抗原和抗体的制备涉及具有除草剂莎稗磷基本结构的半抗原、人工抗原和抗体的制备。本发明以简便的方法制备了特异性良好的除草剂莎稗磷的抗体。该抗体是以N-氯乙酰基-N-异丙基-4-氯苯胺与巯基乙酸合成半抗原，然后分别与牛血清白蛋白(BSA)和辣根过氧化酶(HRP)连接合成人工抗原和酶标抗原。人工抗原再经动物免疫，取血，分出抗血清，纯化制得抗体。该抗体稳定，具有良好的特异性和灵敏度，且合成方法简单，可用于环境、农产品和食品中除草剂莎稗磷残留的快速免疫检测，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及选择一种具有-COOH的、又最大可能包含莎稗磷原有结构的化合物作为莎稗磷半抗原，并将半抗原制成抗原、进而产生抗体；以及此类半抗原、抗原的合成与抗体制备方法。本发明属于生物技术领域。
背景技术
除草剂是近20年来逐渐发展起来的一种农药类型，随着化学工业的发展，除草剂的品种也逐渐增多。在我国研制和投产的除草剂也已达数十种。有些除草剂具有致畸作用，除草剂的安全性已经引起人们的关注，应注意除草剂对环境的污染和人畜毒性作用问题。使用除草剂能在粮食等中残留，通过食物链而使人畜发生慢性危害作用。日本肯定列表制度《食品中农业化学品残留限量食品卷/药品卷》中莎稗磷在大米(糙米)中的检测限为0.05mg/kg；《食品中农用化学品残留检测方法增补本1》中莎稗磷的气质测定低限为0.025mg/kg；《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》(2008-09-04发布2009-03-16实施)中运用气相色谱-质谱法对大米、糙米、大麦、小麦和玉米5中食品中110种农药残留进行测定其中莎稗磷的测定低限为0.01mg/kg。
然而，莎稗磷由于其分子量为367.84，小于1000dolton(道尔顿)，一般传统上采用气相色谱(GC)、液相色谱(HPLC)或气相色谱质谱法联用等物化方法对其残留进行检测。虽然这些传统的理化分析方法灵敏度较高，而且较为准确，但由于它们普遍操作繁琐复杂、成本较高、分析速度慢，所以难于满足实际分析的需要，因此迫切需要发展一种简单、快速、灵敏的分析技术。
而免疫分析技术正是一种快速、灵敏、操作简单、费用低的检测技术。其基本原理认为：抗原抗体的免疫反应涉及分子间的立体结构，电荷、氢键及范德华引力作用等诸多因素，具有极高特异性和灵敏性，遵循质量作用定律，不仅可体内进行，也可体外进行，这些特点使其能被利用建立免疫分析方法，可达到传统理化分析技术无法达到的选择性和灵敏度。所以，免疫分析为莎稗磷残留研究提供了一条新的分析检测途径。
发明内容
本发明设计合成了小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白质偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备对小分子分析物特异性抗体，利用抗原抗体的特异性免疫学反应，从而定性定量的检测样本中超微量小分子目标物，可用于样本测定。该技术研究的关键是半抗原的分子设计、合成和全抗原及抗体的制备。
本发明为达到以上目的所设计的技术方案是合成分子结构式如下图所示的莎稗磷半抗原，然后将半抗原与载体蛋白联接合成人工抗原，免疫动物，获得抗体。
(1)N-氯乙酰基-N-异丙基-4-氯苯胺(简称CCPA)的合成
原料N-异丙基对氯苯胺与三乙胺、氯乙酰氯按照投料比是1∶1∶1在无水甲苯中反应，保持温度在110℃回流5-6h。反应完毕后，过滤，用苯洗涤生成的三乙胺盐酸盐至滤液水洗至中性，无水硫酸钠干燥。产物过硅胶柱纯化(洗脱剂乙酸乙酯∶正己烷＝1∶10，每10ml正己烷加200μl冰乙酸)，TLC跟踪硅胶柱纯化，收集目标组分并旋蒸掉其中的大部分有机溶剂，室温冷却，有白色结晶析出。正己烷洗涤析出目标物。
(2)半抗原的合成
巯基乙酸与CCAP按照摩尔比1∶1投料比在氢氧化钠溶液中反应，回流2h，用浓盐酸酸化，过滤，水洗，得到目标产物。
(3)半抗原于DMSO中超声2h溶解。再按照摩尔比半抗原∶N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)∶N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)为1∶5∶2搅拌反应24h，离心出去沉淀，得到活化酯液。
(4)人工抗原的合成：将上述活化酯液逐滴缓慢地加入到牛血清白蛋白(BSA)溶液中，4℃搅拌反应过夜。反应产物于4℃、pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中透析三天，得到免疫原。
(5)包被原的制备
按照摩尔比半抗原∶N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)∶N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)为1∶5∶2搅拌反应24h，离心出去沉淀，得到活化酯液。
将活化酯液逐滴缓慢地加入到卵清蛋白(OVA)溶液中，4℃搅拌反应过夜。反应产物于4℃、pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中透析三天，制得包被原。
(6)莎稗磷酶标抗原的制备方法
称取1.02784mg半抗原于一棕色小瓶中，加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，超声2h，半抗原溶解，再分别称取1.96mgN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1.4045mgN，N-二环己基碳二亚胺(DCC)加入上述半抗原的DMSO溶液中，搅拌反应24h，离心出去沉淀，得到活化酯液；然后准确称取5mg的辣根过氧化物酶(HRP)溶解于2ml的NaHCO3溶液中，将上述的活化酯溶液于冰浴中缓慢加入到HRP溶液中，4℃条件下搅拌过夜。后用pH7.4磷酸盐缓冲液透析3天，加入硫柳汞，4℃冰箱保存；
(7)抗体的制备及纯化：
免疫动物选择雄性新西兰大耳白兔2只，月龄3个月，体重1.5公斤左右，分别编号为1号、2号。免疫采取皮下和肌肉注射法共同进行。
免疫程序：初次免疫：为提高抗原的免疫性，采用由弗氏完全佐剂乳化的免疫原，初次免疫每只兔子用1mg人工抗原，用1mL 0.9％的NaCl溶液稀释至1g L-1，与弗氏完全佐剂等体积乳化后免疫。加强免疫：初次免疫后第14天和28天进行加强免疫，剂量为0.5mg，溶于1mL 0.9％的NaCl稀释至1gL-1，再与等量的弗氏不完全佐剂混合进行乳化。以后每隔14天加强免疫一次，共免疫6次。从第2次加强免疫开始，每次免疫8-10天后对动物试采血进行血清效价测定和亲和力测定。末次免疫后采用股动脉采血法对动物采全血，经离心处理后收集全部血清，采取免疫亲合层析法进行抗体纯化，所得抗体添加0.1％(W/V)的叠氮钠后于4℃储存备用。
本发明的优点和积极效果
1.本发明最大程度地保留了莎稗磷的化学结构，为国内外首创的新化合物，用此半抗原制备的免疫抗原去免疫动物最大可能保留了原来莎稗磷的分子结构，这为获得对莎稗磷有高度特异性的抗体提供了保证。
2.在合成莎稗磷半抗原的基础上，合成其活化酯能大大提高半抗原与大分子蛋白的联结率。
3.本发明，具有特异、灵敏、准确、快速、廉价等特点，所设计、合成的半抗原为制备特异性良好的抗体奠定了基础。
4.经试验验证，上述半抗原，其合成方法较简单，且所用主要原料价格低廉、容易获得，在一般化学试剂公司均可购得。
5.本发明经试验验证上述半抗原，其合成方法简便，合成效率高，反应步骤少，提高了反应的可控性；另外，合成产物的提取、纯化方法简便，易于推广普及。
具体实施方式
下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
实施例1：
1.N-氯乙酰基-N-异丙基-4-氯苯胺(简称CCPA)的合成
本发明选择CCAP为半抗原合成的中间产物，其分子结构式为：
具体制备方法是：称取5.859g(0.035mol)N-异丙基对氯苯胺、28ml无水甲苯、3.57g(0.035mol)三乙胺置于圆底烧瓶中，在室温搅拌下，利用恒压滴液漏斗向其中逐滴滴加3.92g(0.035mol)氯乙酰氯(控制滴加的速度使温度保持在65℃以下)。滴加完毕后，保持温度在110℃回流5-6h。冷却，过滤，用苯洗涤生成的三乙胺盐酸盐，滤液水洗至中性，无水硫酸钠干燥，过滤，得到一深色溶液，进行质谱鉴定。产物过硅胶柱纯化(洗脱剂乙酸乙酯∶正己烷＝1∶10，每10ml正己烷加200μl冰乙酸)，TLC跟踪硅胶柱纯化，收集目标组分并旋蒸掉其中的大部分有机溶剂，室温冷却，有白色结晶析出。正己烷洗涤析出的白色晶体。产物进行质谱鉴定其分子量为245。
2.半抗原的合成
具体制备方法是：称取2.25g氢氧化钠溶解于18ml水中，向其中加入132.65mg(0.00144mol)巯基乙酸，搅拌15min后，向其中投入354.24mg(0.00144mol)的CCPA，回流2h，冷却，用浓盐酸酸化至pH＝1.过滤，水洗，得到白色固体。产物进行质谱鉴定其分子量为301。
3.半抗原活化酯的合成
具体制备方法是：称取4.568mg(0.01515mmol)半抗原于一棕色小瓶中，加入350μl DMSO，超声2h，半抗原溶解。再分别称取8.711mg(0.07575mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、6.242mg(0.0303mmol)N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)加入上述半抗原的DMSO溶液中，搅拌反应24h，离心出去沉淀，得到活化酯液。
4.人工抗原的合成：
采用半抗原活化酯法连接到牛血清白蛋白(BSA)上，合成人工抗原，其分子结构式是：
具体制备方法是：将上述制备得到的活化酯液逐滴缓慢地加入到牛血清白蛋白(BSA)溶液(20mg BSA，溶解于4ml pH＝7.4的PBS缓冲液中)中，4℃反应过夜。反应产物于4℃、pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中透析三天，然后精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度，分装，-20℃保存。
人工抗原的鉴定：
按合成莎稗磷免疫抗原反应所用载体蛋白与偶联产物的比例，进行紫外(200nm～400nm)扫描测定。偶联物半抗原-BSA在274nm处出现最大吸收峰，而BSA的最大吸收峰分别为280，两者存在较明显的变化，表明人工抗原的合成成功。
5.包被原的制备
具体合成过程是：称取6.80mg(0.0226mmol)半抗原于一棕色小瓶中，加入400μl DMSO，超声2h，半抗原溶解。再分别称取12.98mg(0.1128mmol)N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、9.3mg(0.045mmol)N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)加入上述半抗原的DMSO溶液中，搅拌反应24h，离心出去沉淀，得到活化酯液。
将上述活化酯液逐滴缓慢地加入到卵清蛋白(OVA)溶液(20mg OVA，溶解于4ml pH＝7.4的PBS缓冲液中)中，4℃反应过夜。反应产物于4℃、pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中透析三天，然后精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度，分装，-20℃保存。
6.抗体的制备及纯化：
免疫动物选择新西兰大耳白兔2只，月龄3个月，体重1.5公斤左右，饲养于标准试验动物房中，连续观察7天，确定身体状况正常后进行免疫。免疫采取皮下和肌肉注射法共同进行。
免疫程序：初次免疫：为提高抗原的免疫性，采用由弗氏完全佐剂乳化的免疫原，初次免疫每只兔子用1mg人工抗原，用1mL 0.9％的NaCl溶液稀释至1g L-1，与弗氏完全佐剂等体积乳化后免疫。加强免疫：初次免疫后第14天和28天进行加强免疫，剂量为0.5mg，溶于1mL 0.9％的NaCl稀释至1gL-1，再与等量的弗氏不完全佐剂混合进行乳化。以后每隔14天加强免疫一次，共免疫6次。从第2次加强免疫开始，每次免疫8-10天后对动物试采血进行血清效价测定和亲和力测定。末次免疫后采用股动脉采血法对动物采全血，经离心处理后收集全部血清，采取免疫亲合层析法进行抗体纯化，所得抗体添加0.1％(W/V)的叠氮钠后于4℃储存备用。
Claims (1)
1.一种除草剂莎稗磷的人工抗原的制备方法，其特征在于，使用分子式为
的半抗原与牛血清白蛋白连接合成人工抗原，具体制备由下述步骤组成：
(1)N-氯乙酰基-N-异丙基-4-氯苯胺的合成
称取5.859g N-异丙基对氯苯胺、28ml无水甲苯、3.57g三乙胺置于圆底烧瓶中，在室温搅拌下，利用恒压滴液漏斗向其中逐滴滴加3.92g氯乙酰氯，控制滴加的速度使温度保持在65℃以下，滴加完毕后，保持温度在110℃回流5-6h，冷却，过滤，用苯洗涤生成的三乙胺盐酸盐，滤液水洗至中性，无水硫酸钠干燥，过滤，得到一深色溶液，将深色溶液过硅胶柱纯化，收集目标组分并旋蒸掉其中的大部分有机溶剂，室温冷却，析出的白色结晶即为N-氯乙酰基-N-异丙基-4-氯苯胺；
(2)半抗原的合成
称取2.25g氢氧化钠溶解于18ml水中，向其中加入132.65mg巯基乙酸，搅拌15min后，向其中投入354.24mg的CCPA，回流2h，冷却，用浓盐酸酸化至pH＝1.过滤，水洗，得到白色固体；
(3)称取4.568mg半抗原于一棕色小瓶中，加入350μl DMSO，超声2h，半抗原溶解。再分别称取8.711mgN-羟基琥珀酰亚胺、6.242mgN,N-二环已基碳二亚胺加入上述半抗原的DMSO溶液中，搅拌反应24h，离心出去沉淀，得到活化酯液；
(4)人工抗原的合成：
将上述活化酯液逐滴缓慢地加入到由20mg牛血清白蛋白溶解于4mlpH＝7.4的PBS缓冲液中所配置的溶液中，4℃反应过夜，反应产物于4℃、pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析三天，然后精确量取蛋白质偶联物溶液的体积，测定浓度，分装，-20℃保存。
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