CN104666384B

CN104666384B - 一种玛咖生物活性成分的分离纯化方法

Info

Publication number: CN104666384B
Application number: CN201510057828.5A
Authority: CN
Inventors: 林楚雄; 刘英敏; 何彩霞; 杨立楷; 李国伟; 黄佩珊
Original assignee: GUANGDONG CHANGXING BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: GUANGDONG CHANGXING BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2015-02-04
Filing date: 2015-02-04
Publication date: 2017-11-17
Anticipated expiration: 2035-02-04
Also published as: CN104666384A

Abstract

本发明提供了一种分离纯化玛咖块根中生物活性成分的方法，通过优选玛咖原材料、对原材料进行多阶破壁和提取，最终实现提高原料中玛咖生物碱产率、降低原料成本目的。同时本发明的方法所获得的玛咖生物碱中，具有保健作用的成分（如玛咖酰胺）比例较高，经动物实验表明，本发明提供的产物能够明显提高动物的抗疲劳能力、促进其生长，并能调节生物体内激素的分泌。

Description

一种玛咖生物活性成分的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及植物体生物活性成分的分离纯化方法，具体一种玛咖生物活性成分的分离纯化方法。

背景技术

玛咖(Maca)又名Peruvian ginseng、maka等，是南美一年生或两年生草本植物，属十字花科(Cruciferae)独行菜属(Lepidium L)，具体的种还有争议，国际上普遍认为，Lepidium meyenii Walp和Lepidium peruvianum Chacon两个种在生长繁殖、植物化学和保健功效上几乎没有差异，因此被统称为“Maca”(音译为“玛咖”)。玛咖在南美安第斯山区已经有几千年的栽培历史，是不可缺少的作物之一。具有良好的保健作用。

玛咖中具有抗疲劳、增强代谢强度的活性成分主要是玛咖生物碱，其同时可提高动物成熟卵泡小体的数量、***的流动性和***的数量，从而可显著提高哺乳动物和鱼类的生育力。而且玛咖中的生物碱能够作用于视丘下部和脑垂体，具有调节内分泌腺如肾上腺、甲状腺、胰腺、卵巢等功能，从而平衡内分泌激素，因而可用予治疗女性更年期综合征。玛咖植株内的生物碱种类较多，目前已确定其分子结构、能够进行定性定量分析的主要为玛咖酰胺一种生物碱。

常见的生物碱提取方法有酸水直接提取法、浸渍法、渗辘法、热同流法、超声提取等。目前，仅有关于玛咖生物碱的超声提取。因此，但采用常规的植物超声波法处理玛咖，玛咖生物碱的产率较低，导致现有的玛咖生物碱成本走高而保健效果不明显。此外，现有技术提取出的玛咖生物总碱中，成分繁杂，具有活性的种类其含量不足，导致玛咖提取物总体表现出保健功能较弱的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明公开一种能够有效提取出玛咖块根的生物碱、提高玛咖生物碱性能的分离纯化方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种玛咖生物活性成分的分离纯化方法，包括以下步骤：

S1.将玛咖块根置于绝氧、35～40℃、相对湿度为60～80%的环境中静置15～30日；

S2.将玛咖块根粉碎为粒径为2～5mm的小块，浸泡在质量与玛咖块根等同的酸化液中；

S3.将玛咖块根的投入密封的容器中，将容器加压至0.8～1.1MPa并加热至162℃～171℃；

S4.在0.5～1秒内将容器的压力降低为0Pa，采用质量为玛咖块根1.3～3.4倍的纯水将容器内的物质洗脱至温度为-3～2℃、质量为玛咖块根3～7倍的冷却液中；

S5.采用超声波提取法对S4中获得的冷却液进行第一次超声波提取，过滤获得第一滤液；加入质量为滤渣2～3倍的乙醇对滤渣进行第二次超声波提取，过滤获得第二滤液；合并第一滤液和第二滤液，获得粗提液；

S6.在40～50℃、-100～-50KPa的条件下将粗提液浓缩为其原体积的20%～30%，获得玛咖生物活性成分成品。

本发明的玛咖块根可以优选为产自南美安第斯山区的玛咖块根（含水量70wt%）。现有的玛咖块根中玛咖生物总碱产率低，原因主要在于玛咖块根的细胞其细胞壁强度较高而大分子有机物的通过性较差。因此本发明选用多个步骤、多阶段地对玛咖块根的细胞进行破壁处理。本发明首先将玛咖的块根置于高温、高压、绝氧的环境中进行预处理。上述条件下，玛咖块根内受刺激将继续代谢大量积累玛咖生物碱，而细胞内的含水量上升、细胞壁刚性增加，最终使细胞壁处于不稳定的状态。酸化液则进一步降低细胞壁的热稳定性，使之容易在后续处理中更容易破裂。对块根高压下加热，使细胞内压提高后释放容器内的压力，因外界压力突然下降，细胞因内压过大而膨胀、最终将细胞壁胀裂，完成第一次破壁。但出于块根小块内部的细胞，由于细胞的膨胀受周围细胞的阻碍，细胞壁并不能完全胀裂。因此本发明特别设计采用冷却液，对体积膨胀的细胞进行快速冷却。细胞及其细胞壁在低温下体积收缩而破裂为碎片，完成第二次破壁。此外，低温处理有助于降低细胞膜的流动性，使之韧性下降而容易在超声波提取中消散、进而使细胞内容物流出细胞。破碎的细胞残骸、原料中的纤维均会阻碍玛咖生物碱溶于溶剂。尤其是经本发明处理的原料，其细胞粉碎程度高，表面活性强而具有较强的吸附性能。单次的超声波提取将损失大量的玛咖生物碱。二阶超声波提取则能够最大程度地提取出玛咖原料中的生物活性成分，提高产率而降低生产成本。本发明中的超声波提取可选用现有技术和现有的超声波提取设备实现。在低温和低压的条件下浓缩粗提液，可以增加具有生物活性的玛咖生物碱在产物中的浓度，增强产品的保健性能。

进一步的，所述第一次超声波提取是指将冷却液加热至50～55℃后采用90KHz的超声波提取30～50min；

所述第二次超声波提取是指将乙醇加热至45～55℃后，用1000KHz的超声波提取50～90min。

进一步的，所述酸化液按重量计包括60～80份水、1.2～3.5份磷酸二氢钾、0.2～1.1份琥珀酸亚铁、0.03～0.10份十二烷基苯磺酸钠、2～7份羧甲基纤维素钠。

磷酸二氢钾、琥珀酸亚铁均为现有技术，用于形成弱酸、无毒而稳定的酸化液体系；十二烷基苯磺酸钠是常用的无毒、可食用表面活性剂，有助于酸化液与细胞、细胞壁的接触。本发明在酸化液中添加羧甲基纤维素钠，其能够借助十二烷基苯磺酸钠的作用渗入原料中、吸附在细胞壁表面。被羧甲基纤维素钠吸附后，细胞壁的稳定性进一步下降，最终使细胞胀裂的过程更加剧烈，细胞内容物被大量地喷洒出细胞。羧甲基纤维素钠通常用于制作食品增稠剂，为现有技术。经测试，采用质量分数为5%的乙酸溶液作为酸化液，采用质量分数为0.02%的氯化钠溶液作为冷却液，也有一定的效果。

优选的，所述冷却液按重量计包括60～80份水、2～9份氯化钾、0.001～0.005份赤血盐、10～14份碳酸氢铵。

氯化钾和碳酸氢铵可以降低水的凝固点，使水同时兼具低温和高流动性。赤血盐和碳酸氢铵还能够共同使主要成分为果胶和纤维素的细胞壁涨缩性增强，最终细胞壁在低温下发生剧烈收缩而破碎。所述赤血盐是一种无机化合物，化学式为K₃[Fe(CN)₆]，俗称赤血盐、赤血盐钾、六氰合铁酸钾。在低温下无毒。碳酸氢铵可以中和残留的酸化液，使溶液整体呈现弱碱性。

更进一步的，所述酸化液的制备方法为将水加热至90℃后，加入所述羧甲基纤维素钠、磷酸二氢钾和十二烷基苯磺酸钠，保持10～20Min,降温至50℃，加入所述琥珀酸亚铁获得所述酸化液；所述将玛咖块根浸泡在酸化液中是指将玛咖块根浸泡在于40～50℃的酸化液中，置于玻璃容器中，每升酸化液中投放40～60粒粒径为2～8mm的玻璃珠，在旋转式摇床中以300转/min的转速振荡3～9min。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1

本实施例提供一种玛咖生物活性成分的分离纯化方法，包括以下步骤：

S1.将玛咖块根置于绝氧、38℃、相对湿度为69%的环境中静置20日；

S3.将玛咖块根投入密封的容器中，将容器加压至0.8MPa并加热至165℃；

S4.在0.5～1秒内将容器的压力降低为0Pa，采用质量为玛咖块根3倍的纯水将容器内的物质洗脱至温度为2℃、质量为玛咖块根4倍的冷却液中；

S5.采用超声波提取法对S4中获得的冷却液进行第一次超声波提取，过滤获得第一滤液；加入质量为滤渣3倍的乙醇对滤渣进行第二次超声波提取，过滤获得第二滤液；合并第一滤液和第二滤液，获得粗提液；

S6.在45℃、-70KPa的条件下将粗提液浓缩为其原体积的25%，获得玛咖生物活性成分成品。

所述第一次超声波提取是指将冷却液加热至53℃后采用90KHz的超声波提取40min；

所述第二次超声波提取是指将乙醇加热至50℃后，用1000KHz的超声波提取80min。

所述酸化液按重量计包括75份水、2份磷酸二氢钾、1份琥珀酸亚铁、0.06份十二烷基苯磺酸钠、5份羧甲基纤维素钠。

所述冷却液按重量计包括77份水、4份氯化钾、0.005份赤血盐、12份碳酸氢铵。

所述酸化液的制备方法为将水加热至90℃后，加入所述羧甲基纤维素钠、磷酸二氢钾和十二烷基苯磺酸钠，保持17Min,降温至50℃，加入所述琥珀酸亚铁获得所述酸化液；所述将玛咖块根浸泡在酸化液中是指将玛咖块根浸泡在于45℃的酸化液中，置于玻璃容器中，每升酸化液中投放55粒粒（直）径为5mm的玻璃珠，在旋转式摇床中以300转/min的转速振荡8min。

实施例2

S1.将玛咖块根置于绝氧、40℃、相对湿度为80%的环境中静置30日；

S2.将玛咖块根粉碎为粒径为2mm的小块，浸泡在质量与玛咖块根等同的酸化液中；

S3.将玛咖块根投入密封的容器中，将容器加压至1.1MPa并加热至162℃～171℃；

S4.在0.5～1秒内将容器的压力降低为0Pa，采用质量为玛咖块根1.3倍的纯水将容器内的物质洗脱至温度为2℃、质量为玛咖块根3倍冷却液中；

S6.在50℃、-100KPa的条件下将粗提液浓缩为其原体积的30%，获得玛咖生物活性成分成品。

本实施例中超声波提取法为现有技术的植物超声波提取法，如中国专利蛹虫草总生物碱的提取方法及用途（申请号200910032092.0）所公开的方法。

所述酸化液按重量计包括60份水、3.5份磷酸二氢钾、0.2份琥珀酸亚铁、0.10份十二烷基苯磺酸钠、2份羧甲基纤维素钠。

所述酸化液的制备方法为将水加热至90℃后，加入所述羧甲基纤维素钠、磷酸二氢钾和十二烷基苯磺酸钠，保持20Min,降温至50℃，加入所述琥珀酸亚铁获得所述酸化液；所述将玛咖块根浸泡在酸化液中是指将玛咖块根浸泡在于40℃的酸化液中，置于玻璃容器中，每升酸化液中投放60粒粒径为2mm的玻璃珠，在旋转式摇床中以300转/min的转速振荡9min。

实施例3

S1.将玛咖块根置于绝氧、35℃、相对湿度为80%的环境中静置15日；

S2.将玛咖块根粉碎为粒径为5mm的小块，浸泡在质量与玛咖块根等同的酸化液中；

S3.将玛咖块根投入密封的容器中，将容器加压至0.8MPa并加热至162℃；

S4.在0.5秒内将容器的压力降低为0Pa，采用质量为玛咖块根3.4倍的纯水将容器内的物质洗脱至温度为-3℃、质量为玛咖块根7倍冷却液中；

S5.采用超声波提取法对S4中获得的冷却液进行第一次超声波提取，过滤获得第一滤液；加入质量为滤渣2倍的乙醇对滤渣进行第二次超声波提取，过滤获得第二滤液；合并第一滤液和第二滤液，获得粗提液；

S6.在50℃、-100KPa的条件下将粗提液浓缩为其原体积的20%，获得玛咖生物活性成分成品。

本实施例中超声波提取法为现有技术的植物超声波提取法，如中国专利一种以微波超声波复合提取玛咖生物碱的方法（申请号 201410014832.9）所公开的方法。

本实施例的酸化液为现有技术。可优选为碳酸溶液。

所述冷却液按重量计包括80份水、2份氯化钾、0.005份赤血盐、10份碳酸氢铵。

对比例1

本对比例采用华南理工大学杜广香《超声波提取玛咖生物碱的工艺研究》（广东农业科学，2011年第3期）提供的方法提取玛咖生物总碱。

对比例2

本对比例提供一种玛咖生物活性成分的分离纯化方法，包括以下步骤：

S1.将玛咖块根置于绝氧、40℃、相对湿度为60～80%的环境中静置25日；

S2.将玛咖块根粉碎为粒径为3mm的小块，浸泡在质量与玛咖块根等同的酸化液中；

S3.将玛咖块根的投入密封的容器中，将容器加压至0.9MPa并加热至166℃；

S4.在0.8秒内将容器的压力降低为0Pa，采用质量为玛咖块根2.5倍的纯水将容器内的物质洗脱至温度为-1℃、质量为玛咖块根5倍冷却液中；

S6.在45℃、-50KPa的条件下将粗提液浓缩为其原体积的20%，获得玛咖生物活性成分成品。

本对比例中超声波提取法为现有技术的植物超声波提取法，如中国专利蛹虫草总生物碱的提取方法及用途（申请号200910032092.0）所公开的方法。

所述酸化液按重量计包括75份水、3份磷酸二氢钾、0.5份琥珀酸亚铁、0.05份十二烷基苯磺酸钠。

对比例3

S1.将玛咖块根置于绝氧、40℃、相对湿度为80%的环境中静置15日；

S3.将玛咖块根的投入密封的容器中，将容器加压至0.8MPa并加热至171℃；

本对比例中超声波提取法为现有技术的植物超声波提取法。

本实施例的酸化液为现有技术。可优选为碳酸溶液。

所述冷却液按重量计包括60份水、9份氯化钾、0.001份赤血盐、14份碳酸氢铵。

对实施例1、2、3和对比例1、2、3中玛咖原料提取出的生物总碱和玛咖酰胺含量进行测定，其结果如表1所示。

表1 生物总碱和玛咖酰胺产量

将成年雄性小鼠（体重113.11±5.72g）分为7组，每组50只，每组分别灌胃喂食实施例1、实施例2、实施例3、对比例1、对比例2、对比例3以及生理盐水，喂食剂量为0.5g。喂食过程持续50日。

每组选取30只小鼠，将其投入深水中驱使其游泳，120min后测试小鼠血糖浓度。其结果如表2所示。

表2 玛咖提取物的生物活性

以上为本发明的其中具体实现方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些显而易见的替换形式均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种玛咖生物活性成分的分离纯化方法，包括以下步骤： S1. 将玛咖块根置于绝氧、35 ～ 40℃、相对湿度为 60 ～ 80% 的环境中静置 15 ～ 30 日； S2. 将玛咖块根粉碎为粒径为 2 ～ 5mm 的小块，浸泡在质量与玛咖块根等同的酸化液中； S3. 将玛咖块根投入密封的容器中，将容器加压至 0.8 ～ 1.1MPa 并加热至 162℃～ 171℃ ； S4.在 0.5 ～ 1 秒内将容器的压力降低为 0Pa，采用质量为玛咖块根 1.3 ～ 3.4 倍的纯水将容器内的物质洗脱至温度为 -3 ～ 2℃、质量为玛咖块根 3 ～ 7 倍的冷却液中；S5. 采用超声波提取法对 S4 中获得的冷却液进行第一次超声波提取，过滤获得第一滤液；加入质量为滤渣 2 ～ 3 倍的乙醇对滤渣进行第二次超声波提取，过滤获得第二滤液；合并第一滤液和第二滤液，获得粗提液； S6. 在 40 ～ 50℃、-100 ～ -50KPa 的条件下将粗提液浓缩为其原体积的 20% ～ 30%，获得玛咖生物活性成分成品；所述第一次超声波提取是指将冷却液加热至 50 ～ 55℃后采用 90KHz 的超声波提取 30 ～ 50min ；所述第二次超声波提取是指将乙醇加热至 45 ～ 55℃后，用 1000KHz 的超声波提取 50～ 90min；所述酸化液按重量计包括 60 ～ 80 份水、1.2 ～ 3.5 份磷酸二氢钾、0.2 ～1.1 份琥珀酸亚铁、0.03 ～ 0.10 份十二烷基苯磺酸钠、2 ～ 7 份羧甲基纤维素钠。

2.根据权利要求 1所述的方法，其特征在于：所述冷却液按重量计包括 60 ～ 80 份水、2 ～ 9 份氯化钾、0.001 ～ 0.005 份赤血盐、10 ～ 14 份碳酸氢铵。

3.根据权利要求 1所述的方法，其特征在于：所述酸化液的制备方法为将水加热至90℃后，加入所述羧甲基纤维素钠、磷酸二氢钾和十二烷基苯磺酸钠，保持 10 ～ 20Min,降温至 50℃，加入所述琥珀酸亚铁获得所述酸化液；所述将玛咖块根浸泡在酸化液中是指将玛咖块根浸泡在于 40 ～ 50℃的酸化液中，置于玻璃容器中，每升酸化液中投放 40～ 60 粒粒径为 2 ～ 8mm 的玻璃珠，在旋转式摇床中以 300 转 /min 的转速振荡 3～ 9min。