CN104662156A - 玉米非翻译区域用于植物中转基因表达的用途 - Google Patents

玉米非翻译区域用于植物中转基因表达的用途 Download PDF

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Abstract

提供了用于提高转基因植物和植物组织中重组核酸序列表达的方法、载体和基因构建体。根据本发明，从编码泛素蛋白的基因的3’非翻译区获得和/或衍生核酸序列，并将其工程化到载体的选定编码区域的各自部分。载体构建体可以通过常规或基因打靶程序导入植物和/或植物组织，导致选定的编码区域的表达提高。在某些实施方案中，选定的编码区域是嵌合基因或基因片段，其编码一种或多种已知对转基因植物和/或植物组织赋予一定水平的杀昆虫活性的蛋白质。

Description

玉米非翻译区域用于植物中转基因表达的用途
发明领域
本发明一般地涉及基因工程领域，更具体地涉及植物中转基因表达的领域。
发明背景
重组DNA技术和基因工程已经使得将期望的DNA序列导入植物细胞以便表达感兴趣的蛋白质常规上成为可能。但是，为了获得产业上可行的转化事件，获得重要作物中稳定和可预测的表达的理想水平仍然是具有挑战性的。
在作物中以期望水平表达异源基因的方法之一包括对控制植物中的表达的调节机制进行操作。该调节可以是转录调节或转录后调节，可以包括，例如，增强、限制或防止DNA转录的机制，以及限制或增加mRNA产生后的寿命的机制。这些调节过程中涉及的DNA序列可以维护编码基因的蛋白质产生的结构DNA序列的上游、下游、或者甚至内部。
为了调节转基因植物中的转录，可以使用多种多样的启动子。启动子可以用来控制外来基因在转基因植物中的表达，其表达模式与该启动子原始来源的基因的表达模式类似。一般而言，启动子分为两类：“组成型”启动子在大多数组织中大多数时间表达，而“受调节型”启动子通常仅在特定的组织类型(组织特异性启动子)或仅在发育过程中的特定时间(时序性启动子)表达。来自组成型启动子的表达通常在整个发育过程中大致处于稳态的水平。编码具有看家功能的蛋白质的基因通常是由组成型启动子驱动的。玉米中组成型表达的基因的实例包括肌动蛋白和泛素(ubiquitin)(Ubi)。
通过将“增强子”序列置于启动子的上游(5’)可以获得转基因植物中转录的进一步提高。增强子元件是顺式作用的，可以相对独立于增强子的上游位置和朝向的方式增加其启动子对其邻近基因的转录水平。人们已经从多种来源，包括病毒、细菌和植物基因，分离了此类序列。良好表征的增强子序列的一个实例是来自根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶(ocs)，如美国专利号5,837,849,5,710,267和5,573,932所述。已经证明这种短(40bp)的序列可以在单子叶和双子叶植物，包括玉米中以显著的水平增加基因表达。已经证明这种增强子的串联重复可在玉米中增加GUS基因的表达至8倍。这些增强子序列如何发挥功能仍然不清楚。有可能的是，增强子结合激活子蛋白，从而易化RNA聚合酶II对TATA框的结合。WO95/14098描述了对ocs增强子和mas(甘露碱合酶)增强子的多种多个组合的测试，导致GUS基因在转基因烟草愈伤组织中基因表达的数百倍增加。
然而，使用特定的启动子，同时有或没有一个或多个增强子，并不一定保证植物中期望的基因表达水平。除了期望的转录水平之外，其他因素如不恰当的剪接、多聚腺苷酸化和核输出可能影响mRNA和感兴趣的蛋白质的积累。因此，通过转录后调节机制增加RNA稳定性和翻译效率的方法是本领域中需要的。
关于转录后调节，已经证明真核mRNA的特定5’和3’非翻译区(UTR)分别在翻译效率和RNA稳定性方面扮演主要角色。例如，烟草花叶病毒(TMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)衣壳蛋白mRNA的5’和3’UTR已知可增强烟草植物中的基因表达。玉米醇脱氢酶-1(adh1)基因的5’和3’UTR已知涉及低氧原生质体中的高效翻译。
对多种5’UTR前导序列的实验显示5’UTR的不同结构特征可能与翻译效率水平相关。某些5’UTR已经被发现含有这样的AUG密码子，当40S核糖体亚单位扫描起始位点的AUG密码子时，这些密码子可能与40S核糖体亚单位相互作用，从而降低翻译速度(Kozak,Mol.Cell.Biol.7:3438(1987)；Kozak,J.Cell Biol.108,209(1989))。此外，mRNA上的AUG起始位点两侧的5’UTR核苷酸序列可能对翻译效率有影响。如果两侧5’UTR的环境不是有利的，40S核糖体亚单位的一部分可能无法识别翻译起始位点，这样多肽合成的速率会减慢(Kozak,J.Biol.Chem.266,19867-19870(1991)；Pain,Eur.J.Biochem.236,747-771(1996))。5’UTR的二级结构(例如发夹形成)也可能会阻碍40S核糖体亚单位在其扫描过程中的运动，从而对翻译效率造成不利影响(Sonenberg et al.,Nature 334:320(1988)；Kozak,Cell 44:283-292,(1986))。5’UTR序列的相对GC含量已经被显示可指示潜在二级结构的稳定性，GC水平越高越不稳定。(Kozak,J.Biol.Chem.266,19867-19870(1991)。较长的5’UTR可能展现更多数量的抑制性二级结构。因此，任何给定的5’UTR的翻译效率高度依赖于它的具体结构，而且已经证明通过优化前导序列可增加基因表达，这是翻译起始效率提高的直接结果。此外，有人通过加入来自植物病毒或热激基因的前导序列显著增加了基因表达(Raju et al.,Plant Science 94:139-149(1993))。
除了5’UTR之外，mRNA的3’UTR(后随)序列也与基因表达有关。3’UTR(又称聚腺苷酸化元件或腺苷化控制元件)已知能够控制核输出、聚腺苷酸化状态、亚细胞靶向、和RNA酶对mRNA的翻译和降解的速率。尤其是，3’UTR可能含有一个或多个倒序重复(inverted repeats)，它们能够折叠成茎环结构，茎环结构不但构成对外切核酸酶的屏障，还与已知促进RNA稳定性的蛋白质(例如RNA结合蛋白)相互作用(Barkan et al.,A Look BeyondTranscription:Mechanisms Determining mRNA Stability and Translation in Plants,American Society of Plant Physiologists,Rockville,Md.,pp.162-213(1998))。然而，3’UTR中发现的某些元件可能是RNA去稳定性的。植物中出现的此类实例之一是DST元件，它可以在小生长素上升RNA(small auxin up RNAs，SAURs)中发现(Gil et al.,EMBO J.15,1678-1686(1996))。某些3’UTR中的另一种导致去稳定的特征是AUUUA五聚体的存在(Ohme-Takagi et al.,Pro.Nat.Acad.Sci.USA 90 11811-11815(1993))。
已经证明3’UTR在数种玉米基因的基因表达中扮演显著的角色。具体地，已经显示，一种200碱基对的3’序列负责玉米叶肉细胞中核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶基因的小m3亚单位的光诱导的抑制(Viret et al.,Proc Natl Acad SciUSA.91(18):8577-81(1994))。在植物，尤其是玉米中，这种序列不是非常好地保守的。在植物基因工程中经常使用的一种3’UTR源自胭脂碱合酶基因(3’nos)(Wyatt et al.,Plant Mol Biol 22(5):731-49(1993))。
在某些植物病毒，如苜蓿花叶病毒(AMV)和烟草花叶病毒(TMV)中，它们高度结构化的3’UTR对复制是必不可少的，可以折叠成为含有数个高亲和力衣壳蛋白结合位点的茎环结构的线性排列，或折叠成为被RNA依赖性RNA聚合酶识别的tRNA样位点(Olsthoorn et al.,EMBO J 1；18(17):4856-64(1999)；Zeyenko et al.,1994))。
然而，仍然有需要鉴定其他的5’和3’UTR是否可用于调节转基因植物中重组核酸的表达，因为并非任一种应用都有最优的UTR序列可供使用。
发明概要
提供了用于提高转基因植物和植物组织中重组核酸序列表达的方法、载体和基因构建体。根据本发明，从编码泛素蛋白的基因的3’非翻译区获得和/或衍生核酸序列，并将其工程化到载体的选定编码区域的各自部分的侧翼。载体构建体可以通过常规或基因打靶程序导入植物和/或植物组织，导致选定的编码区域的表达提高。在某些实施方案中，选定的编码区域是嵌合基因或基因片段，其编码一种或多种已知对转基因植物和/或植物组织赋予一定水平的杀昆虫活性的蛋白质。
在一个方面，提供了一种核酸构建体，其包含至少一个感兴趣的结构基因，所述基因功能连接于异源启动子和一个或多个控制序列，所述控制序列与选自SEQ ID NO:1-3、它们的互补物、或其组合的核酸序列有至少80％的同一性。
在一个实施方案中，所述至少一个感兴趣的结构基因包括赋予植物中的非天然表型的基因。在另一个实施方案中，所述至少一个感兴趣的结构基因包括赋予植物中的昆虫抗性或除草剂抗性的基因。在一个实施方案中，所述异源启动子不包括病毒启动子。在另一个实施方案中，所述异源启动子不包括植物启动子。在另一个实施方案中，所述异源启动子包括病毒启动子。在另一个实施方案中，所述异源启动子包括植物启动子。
在一个实施方案中，所述一个或多个控制序列与选自SEQ ID NO:1-3、它们的互补物、或其组合的核酸序列有至少85％,90％,95％,98％,或100％的同一性。在一个进一步的实施方案中，所述一个或多个控制序列选自SEQ IDNO:1-3、它们的互补物、或其组合的核酸序列。在另一个实施方案中，所述一个或多个控制序列是能够利用选自SEQ ID NO:4-15的寡核苷酸扩增的。
在一个实施方案中，所述核酸构建体包括用于土壤杆菌介导转化的双元载体。在另一个实施方案中，所述核酸构建体被稳定转化到转基因植物中。在一个进一步的实施方案中，所述植物是单子叶植物。在另一个进一步的实施方案中，所述植物是双子叶植物。在另一个实施方案中，所述植物不是单子叶植物。在另一个实施方案中，所述植物不是双子叶植物。在一个实施方案中，所述核酸构建体包含可选择标记。在另一个实施方案中，所述可选择标记包括芳基氧基链烷酸双加氧酶。在另一个实施方案中，所述芳基氧基链烷酸双加氧酶是AAD-1或AAD-12。
在另一方面，提供一种载体，其包含本文中提供的核酸构建体。在另一个方面，提供经本文提供的核酸构建体转化的植物或植物细胞。在一个实施方案中，所述植物或植物细胞包含与所述至少一种感兴趣的基因叠加的其他感兴趣的结构基因。
在另一方面，提供一种重组产生肽或蛋白质的方法，所述方法包括将异源启动子与一个或多个如下所述的控制序列功能连接，所述控制序列与选自SEQ ID NO:1-3、它们的互补物、或其组合的核酸序列具有至少80％同一性。在另一方面，提供一种增加植物或植物细胞中的基因表达的方法，所述方法包括将异源启动子与一个或多个如下所述的控制序列功能连接，所述控制序列与选自SEQ ID NO:1-3、它们的互补物、或其组合的核酸序列具有至少80％同一性。
在所提供的方法的一个实施方案中，所述异源启动子不包括病毒启动子。在另一个实施方案中，所述异源启动子不包括植物启动子。在另一个实施方案中，所述异源启动子包括病毒启动子。在另一个实施方案中，所述异源启动子包括植物启动子。在所提供的方法的一个实施方案中，所述一个或多个控制序列与选自SEQ ID NO:1-3、它们的互补物、或其组合的核酸序列具有85％,90％,95％,98％或100％同一性。在另一个实施方案中，所述一个或多个控制序列选自SEQ ID NO:1-3、它们的互补物、或其组合。在另一个实施方案中，所述一个或多个控制序列是能够利用选自SEQ ID NO:4-15的寡核苷酸扩增的。
在另一方面，提供了选自SEQ ID NO:1-3、它们的互补物、或其组合的至少一个控制序列用于在植物中表达转基因的用途。在另一方面，提供了能够利用选自SEQ ID NO:4-15的寡核苷酸扩增的一个或多个控制序列用于在植物中表达转基因的用途。
附图简要说明
图1A显示了本发明的一个示例性控制序列，玉米Ubi1 3’UTR(SEQ IDNO:1)。图1B显示了本发明的另一个示例性控制序列，ZMEXP9396.1(SEQ IDNO:2)。图1C显示了本发明的另一个示例性控制序列，ZMEXP9707.1(SEQ IDNO:3)。
图2A显示了pDAB112330和pDAB112323的代表性质粒图。图2B显示了pDAB112332的代表性质粒图。
图3显示了来自包括St PinII 3’UTR(pDAB112332)和玉米Ubi1 3’UTR(pDAB112330)的不同核酸构建体、以及阴性对照的示例性表达结果。
图4显示pDAB112357(ZMEXP9396.1)和pDAB112354(ZMEXP9707.1)的代表性质粒图。
图5显示了来自包括pDAB112357(ZMEXP9396.1),pDAB112354(ZMEXP9707.1)和pDAB112332(St PinII 3’UTR)的不同的核酸构建体的示例性表达结果，其中全部三个构建体均提供了可比较的良好表达水平。Cry34表达水平以ng/ml为单位显示。
图6显示pDAB108744和pDAB108746的代表性质粒图。图7显示pDAB112396和pDAB112397的代表性质粒图。
图8显示使用构建体pDAB108744和pDAB108746的与Zm Ubi1 3’UTR相关的代表性T1表达数据(V4叶)。图9显示使用构建体pDAB108744和pDAB108746的与Zm Ubi1 3’UTR相关的代表性T1表达数据(V4叶)。
图10显示使用构建体pDAB112396和pDAB112397的与Ubi1之外其他的玉米3’UTR相关的T0表达数据(V4叶)。
发明详细说明
提供了用于利用自玉米泛素基因分离或衍生的5’和/或3’UTR区遗传修饰细胞、组织或生物体的组合物和方法。本发明的5’和/或3’UTR区，当通过工程改造使它们位于感兴趣的结构基因的侧翼时，可改善该感兴趣的结构基因在转基因植物中的转录终止、mRNA稳定性、和/或增加该感兴趣的结构基因在转基因植物中的翻译效率。因此，本发明将会有助于对植物进行基因工程改造以表达有经济或研究价值的表型。
通过基因工程改造使得利用自玉米泛素基因分离或衍生的5’和/或3’UTR区/控制序列位于感兴趣的结构基因的侧翼，感兴趣的结构基因编码在植物、植物细胞或植物组织中重组表达的蛋白质。所描述的玉米Ubi1 3’UTR特别令人感兴趣的一点是其可用于使转基因构建体包含单个或多个基因。
转基因产品的开发要求转基因的长期稳定表达。为了转基因得到适宜的表达，需要合适组合和配置的调节元件，如启动子和终止子。每个转基因的转录需要专用的启动子。此外，3’非翻译区(3’UTR)或终止子是转录终止和聚腺苷酸化所需要的。mRNA的适宜转录终止和聚腺苷酸化对于转基因的稳定表达是重要的。转录终止对于多基因叠加而言变得更加重要，用来避免转录通读到下一个转基因。类似地，非腺苷酸化异常RNA(aRNA)是植物RNA依赖性RNA聚合酶(RdRPs)的底物，后者将aRNA转变为双链RNA(dsRNA)，导致生成小RNA和转基因沉默。因此，强的转录终止子对于单基因和多基因叠加都是非常有用的。提供了玉米Ubi1(泛素1)3’UTR及其用于制造转基因构建体的用途。
植物启动子和3’UTR是构建有功能的转基因表达或植物转录单元所需要的两种基本表达元件。需要启动子来驱动转录，而3’UTR是转录终止和转录物的聚腺苷酸化所需要的。mRNA 3’UTR是在基因表达中的RNA转录物终止和聚腺苷酸化是需要的。3’UTR还在mRNA加工、定位、稳定性和翻译中起关键作用。
提供了玉米Ubi1 5’和3’UTR作为用于植物中的转基因表达的控制序列的鉴定和表征。本文中提供的Ubi1 3’UTR可以与其他植物或病毒启动子一起用于构建载体，不限于玉米Ubi1启动子。
如本文所使用的，短语“载体”是指一段DNA，通常是双链的，其中可***一段外来DNA。载体可以是例如质粒或病毒来源的，其通常编码可选择的或可筛选的标记或转基因。载体用于将外来或异源DNA转运到合适的宿主细胞中。一旦在宿主细胞内，载体便可以独立复制或者与宿主染色体DNA同时复制。或者，载体能够导向外来或异源DNA***到宿主染色体中。
如本文所使用的，短语“转基因载体”是指含有DNA***区段，即在宿主细胞内被转录成mRNA或作为RNA复制的“转基因”，的载体。短语“转基因”不仅指所***DNA的被转换成RNA的部分，还指载体中为RNA转录和复制所必需的部分。转基因通常包括感兴趣的基因，但不必一定包含含有能够产生蛋白质的开放阅读框的多核苷酸序列。
如本文所使用的，短语“转化的”或“转化”是指将DNA引入到细胞内。短语“转化体”或“转基因的”是指被转化的或经历了转化程序的植物细胞、植物等。所引入的DNA的形式通常是含有所***DNA片段的载体。
如本文所使用的，短语“可选择标记”或“可选择标记基因”是指这样的基因，其在植物转化中任选地使用，用来例如保护植物细胞免于选择试剂的伤害或提供对选择剂的抗性/耐受性。只有接受了功能性可选择标记的细胞或植物才能够在具有选择试剂的条件下***或生长。选择剂的实例可包括，例如，抗生素，包括大观霉素、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素、庆大霉素，和潮霉素。这些可选择标记包括新霉素磷酸转移酶基因(npt II)，其表达一种赋予对抗生素卡那霉素抗性的酶，和相关抗生素新霉素、巴龙霉素、庆大霉素和G418的基因，或潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)，其表达一种赋予对潮霉素抗性的酶。其他的可选择标记基因可包括编码除草剂抗性的基因，包括Bar(抗(草铵膦)或膦丝菌素(PPT))，乙酰乳酸合成酶(ALS，抗抑制剂如磺酰脲(SUs)、咪唑啉酮(IMIs)、***并嘧啶(triazolopyrimidines(TPs))、嘧啶氧代苯甲酸(pyrimidinyl oxybenzoates(POBs))、和磺酰氨基羰基***啉酮，其阻止支链氨基酸合成的第一步)，草甘膦，2,4-D，和金属抗性或敏感性。短语“标记阳性”是指已经过转化从而包含可选择标记基因的植物。
在所选表达载体中可以组入各种可选择或可检测标记，以允许鉴定和选择被转化的植物或转化体。许多方法可供用于验证选择标记在被转化植物内的表达，包括例如DNA测序和PCR(聚合酶链式反应)、Southern印迹、RNA印迹、用于检测从载体表达的蛋白的免疫学方法，例如介导草铵膦抗性的沉淀的蛋白或者其他蛋白，例如报告基因β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、荧光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶等(见Sambrook等Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ThirdEdition,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,2001，本文引用其全部内容作为参考)。
使用可选择标记选择被转化的细胞或组织。可选择标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予对除草剂化合物抗性的基因。除草剂抗性基因一般编码对除草剂不敏感的被修饰的靶蛋白，或者编码可以在除草剂在植物体内发挥作用之前将其降解或脱毒的酶。见DeBlock et al.(1987)EMBO J.,6:2513-2518；DeBlock et al.(1989)Plant Physiol.,91:691-704；Fromm et al.(1990)8:833-839；Gordon-Kamm et al.(1990)2:603-618)。例如，已经使用编码突变体靶酶，5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)和乙酰乳酸合酶(ALS)，获得了对草甘膦或磺酰脲除草剂的抗性。对草铵膦、溴苯腈和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性可以通过使用编码膦丝菌素乙酰转移酶、腈水解酶或2,4-二氯苯氧乙酸单氧化酶(它们分别对这些除草剂脱毒)的细菌基因来获得。2,4-D抗性的酶/基因先前已经在US 2009/0093366和WO 2007/053482中被公开，本文引用其全部内容作为参考。
其他除草剂能够抑制生长点或分生组织，包括咪唑啉酮或磺酰脲。这个类别中的示例基因编码突变的ALS和AHAS酶，如分别由例如Lee等，EMBOJ.7:1241(1988)和Miki等,Theon.Appl.Genet.80:449(1990)所描述的。
草甘膦抗性基因包括：突变体5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因(通过导入重组核酸和/或天然EPSP基因的各种体内诱变的形式)、aroA基因和草甘膦乙酰转移酶(GAT)基因。对其他膦酰基化合物的抗性基因包括草胺膦(来自链霉菌属物种(Streptomyces species),包括吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)和绿色产色链霉菌(Streptomyces viridichromogenes)的草胺膦乙酰基转移酶(PAT)基因)、和吡啶氧或苯氧基丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)，见例如授予Shah等的美国专利4,940,835和授予Barry等的美国专利6,248,876，它们公开了可以对植物赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变体aroA基因的DNA分子可以以ATCC保藏号39256获得，并且该突变体基因的核苷酸序列在授予Comai的美国专利No.4,769,061中公开。授予Kumada等的欧洲专利申请No.0 333 033和授予Goodman等的美国专利No.4,975,374公开了对除草剂诸如L-膦丝菌素赋予抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。PAT基因的核苷酸序列可以参见授予Leemans等的欧洲申请No.0 242 246。另外，DeGreef等，Bio/Technology 7:61(1989)描述了生成表达编码PAT活性的嵌合bar基因的转基因植物。赋予对苯氧基丙酸和环己酮，包括稀禾定(sethoxydim)和吡氟氯禾灵(haloxyfop)的抗性的基因的例子包括Marshall et al,Theon.Appl.Genet.83:435(1992)描述的Accl-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因。能够赋予草甘膦抗性的GAT基因记载于授予Castle等的WO 2005012515。赋予对2,4-D、苯氧基丙酸和吡啶基氧基生长素除草剂的抗性的基因在WO 2005107437和美国专利申请系列No.11/587,893中有描述。
其他除草剂能够抑制光合作用，包括三嗪(psbA和ls+基因)或苯基氰(腈水解酶基因)。Przibila等，Plant Cell 3:169(1991)描述了用编码突变体psbA基因的质粒转化衣滴虫(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列在授予Stalker的美国专利No.4,810,648中被公开，含有这些基因的DNA分子可以以ATCC保藏号53435、67441、和67442获得。Hayes等，Biochem.J.285:173(1992)描述了编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达。
为本发明的目的，可选择标记基因包括，但不仅限于，编码如下的基因：新霉素磷酸转移酶II(Fraley et al.(1986)CRC Critical Reviews in Plant Science,4:1-25)；氰胺水合酶(cyanamide hydratase)(Maier-Greiner et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:4250-4264)；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合酶(Perlet al.(1993)Bio/Technology,11:715-718)；色氨酸脱羧酶(Goddijn et al.(1993)Plant Mol.Bio.,22:907-912)；二氢吡啶二羧酸合酶和脱敏的天冬氨酸激酶(Perlet al.(1993)Bio/Technology,11:715-718)；bar基因(Toki et al.(1992)PlantPhysiol.,100:1503-1507和Meagher et al.(1996)and Crop Sci.,36:1367)；色氨酸脱羧酶(Goddijn et al.(1993)Plant Mol.Biol.,22:907-912)；新霉素磷酸转移酶(NEO)(Southern et al.(1982)J.Mol.Appl.Gen.,1:327；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG)(Shimizu et al.(1986)Mol.Cell Biol.,6:1074)；二氢叶酸还原酶(DHFR)(Kwok et al.(1986)PNAS USA 4552)；膦丝菌素乙酰转移酶(DeBlocket al.(1987)EMBO J.,6:2513)；2,2-二氯丙酸脱卤素酶(Buchanan-Wollatron etal.(1989)J.Cell.Biochem.13D:330)；乙酰羟酸合酶(Anderson et al,美国专利4,761,373；Haughn et al.(1988)Mol.Gen.Genet.221:266)；5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-磷酸合酶(aroA)(Comai et al.(1985)Nature 317:741)；卤代芳基腈水解酶(haloarylnitrilase)(Stalker et al,已公开的PCT申请WO87/04181)；乙酰辅酶A羧化酶(Parker et al.(1990)Plant Physiol.92:1220)；二氢蝶酸合酶(sul I)(Guerineau et al.(1990)Plant Mol.Biol.15:127)；和32kD光***II多肽(psbA)(Hirschberg et al.(1983)Science,222:1346)。
还包括编码对下述者的抗性的基因：氯霉素(Herrera-Estrella et al.(1983)EMBO J.,2:987-992)；甲氨蝶呤(Herrera-Estrella et al.(1983)Nature,303:209-213；Meijer et al.(1991)Plant Mol Bio.,16:807-820(1991)；潮霉素(Waldron et al.(1985)Plant Mol.Biol.,5:103-108；Zhijian et al.(1995)PlantScience,108:219-227和Meijer et al.(1991)Plant Mol.Bio.16:807-820)；链霉素(Jones et al.(1987)Mol.Gen.Genet.,210:86-91)；大观霉素(Bretagne-Sagnard etal.(1996)Transgenic Res.,5:131-137)；博来霉素(Hille et al.(1986)Plant Mol.Biol.,7:171-176)；磺胺(Guerineau et al.(1990)Plant Mol.Bio.,15:127-136)；溴苯腈(Stalker et al.(1988)Science,242:419-423)；2,4-D(Streber et al.(1989)Bio/Technology,7:811-816)；草甘膦(Shaw et al.(1986)Science,233:478-481)；和膦丝菌素(DeBlock et al.(1987)EMBO J.,6:2513-2518)。除非另外指出，否则本文引用所有这些参考文献的全部内容作为参考。
上面列举的可选择标记和报告基因没有限制意义。本发明可以包含任何报告或可选择标记基因。如果有必要，这些基因可以通过本领域已知的方法进行测序。
报告基因和可选择标记基因以在植物体内表达最优的方式合成。也就是说，基因的编码序列经过修饰从而提高在植物体内的表达。设计合成的标记基因使其以更高水平在植物体内表达，导致更高的转化效率。合成最优化基因的方法可以技术上获得。实际上，已经有多个基因被最优化，从而增加基因产物在植物内的表达。
标记基因可以为了在特定植物物种中的表达最优化，或者，可以为了在植物家族中的最优表达而被修饰。植物的优选密码子可以根据特定的感兴趣植物物种中最大量表达的蛋白质的频率最高的密码子加以确定。参见，例如，EPA 0359472；EPA 0385962；WO 91/16432；Perlak et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:3324-3328；和Murray et al.(1989)Nucleic Acids Research,17:477-498；美国专利5,380,831；和美国专利No.5,436,391，本文引用其内容作为参考。通过这种方式，可以为了在任何植物体内表达而核苷酸序列进行最优化。可以认识到，全部基因序列或其任何部分均可是经优化或合成的。也就是说，可以使用完全最优化的或部分最优化的序列。
此外，已经开发出了多种使用土壤杆菌介导的转化***的转化策略。例如，二元载体策略是基于二质粒***，其中T-DNA位于和其余Ti质粒不同的质粒中。在共整合策略中，T-DNA的一小部分位于和外来基因相同的载体上，该载体随后与Ti质粒重组。
如本文中使用的，短语“外植体”指来自受试者的一个或多个组织或器官的活组织或器官的移出的部分。
如本文中所使用的，词语“植物”包括双子叶植物和单子叶植物。双子叶植物的实例包括烟草、拟南芥、大豆、番茄、木瓜、加拿大油菜、向日葵、棉花、苜蓿、马铃薯、葡萄(grapevine)、木豆(pigeon pea)、豌豆、芸苔属(Brassica)、鹰嘴豆、甜菜、油菜、西瓜、甜瓜、辣椒、花生、南瓜、萝卜、菠菜、倭瓜(squash)、西兰花、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、大白菜、黄瓜、茄子和莴苣。单子叶植物的例子包括玉米、水稻、小麦、甘蔗、大麦、黑麦、高粱、兰花、竹子、香蕉、香蒲、百合、燕麦、洋葱、黍和黑小麦(triticale)。
如本文中使用的，短语“嵌合基因构建体”是指包含来自多于一个生物体的基因或其部分的重组核酸。
如本文中使用的，短语“缺失”或“删除”是指氨基酸或核苷酸序列中的改变，其中分别有一个或多个氨基酸或核苷酸残基缺如。
本发明的5’和/或3’Ubi1 UTR可以与感兴趣的结构核酸序列“功能连接”，如果这些元件彼此所处的位置关系使得所述5’和/或3’Ubi1 UTR能够影响所述感兴趣的结构核酸序列的mRNA稳定性、翻译效率或转录产物的话。
如本文中使用的，短语“异源基因”是指编码蛋白质、多肽、RNA或前述任何者的部分的基因，其确切的氨基酸序列通常不见于宿主细胞中，而是通过标准基因转移技术导入的。
如本文中使用的，短语“同一性”或“相似性”是指两个多肽序列或两个多核苷酸序列之间的关系，如通过比较这些序列确定的。在本领域中，同一性也意指通过匹配两条多肽序列或两条多核苷酸序列的序列段而确定的这两条序列之间的序列相关程度。同一性和相似性均可容易地计算(ComputationalMolecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press.New York(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,New York(1993)；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey(1994)；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press(1987)；andSequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York(1991))。常用于确定两个序列之间的同一性或相似性的方法包括，但不限于Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)中公开的方法。已知的用于确定同一性的方法旨在给出所测试的两个序列的最大匹配。用于确定同一性和相似性的方法被编码成计算机程序。用于确定两条序列之间的同一性和相似性的典型方法包括：GCG program package(Devereux,J.,et al.,Nucleic Acids Research 12(1):387(1984)),BLASTP、BLASTN、FASTA和TFASTA(Atschul,S.F.et al.,J.Mol.Biol.215:403(1990))。
如本文中使用的，短语“***”或“添加”是指氨基酸或核苷酸序列中的改变导致与天然存在的分子相比分别加入一个或多个氨基酸或核苷酸残基。
如本文中使用的，短语“修饰的(或改变的)表达”是指如下所述的转基因植物中的表达，该转基因植物经过基因工程改造使得感兴趣的异源结构基因的相应区域的侧翼有本发明的5’和/或3’Ubi1 UTR之一或二者，其中该感兴趣的结构基因的mRNA水平、蛋白质水平或酶比活性相对于下述1)或2)已经改变：1)该植物的天然型，或2)携带该感兴趣的结构基因但不包含所述5’和3’Ubi1 UTR之一或二者作为其侧翼区域的转基因植物。
如本文中使用的，短语“非天然表型”是指因植物中重组DNA表达而出现或被重组DNA表达所影响的性状。
如本文中使用的，短语“重组核酸”只是已经从任何来源分离或衍生而来的核酸，其可以随后被化学改变，然后导入转基因植物。“衍生”自某来源的重组核酸的一个例子是这样的DNA或RNA序列，其作为给定生物体中的有用的片段被鉴定，然后以实质上纯的形式被化学合成。此类从某一来源“分离”的DNA的一个例子是通过化学手段，例如通过使用限制性内切核酸酶将有用的DNA序列切出或移出，以便能够通过基因工程方法学对它进一步操作(例如扩增)，以供用于本发明。
如本文中使用的，短语“感兴趣的结构核酸序列”指编码蛋白质的DNA、RNA或合成核苷酸的序列。术语“感兴趣的结构核酸”与短语“感兴趣的结构基因”在本文中可以互换使用。
如本文中使用的，短语“转基因植物”是指含有外源核苷酸序列的植物，该序列***植物的细胞核基因组或细胞器基因组中。
为了根据本发明的教导修饰主题的5’和/或3’UTR序列，示例性的技术包括那些用于多核苷酸介导的、定点诱变的技术，以及使用限制酶、PCR扩增和连接酶以修饰和/或联接现存的核酸分子的公知技术(参见，例如Zoller etal.,DNA,3:479-488(1984)；Higuchi et al.,Nucl.Acids Res.,16:7351-7367(1988)；Ho et al.,Gene,77:51-59(1989)；Horton et al.,Gene,77:61(1989)；PCRTechnology:Principles and Applications for DNA Amplification,(ed.)Erlich(1989)；以及Metz等人的美国专利6,271,360，Single-strandedoligodeoxynucleotide mutational vectors(2001.8.7授权))。在本发明的一个优选的实施方案中，添加一个或多个茎环结构以提供进一步的对mRNA降解的保护。在该实施方案的一个方面，额外的茎环结构是通过PCR扩增获得的。在在另一方面，本发明的一个进一步的实施方案中，删除一个或多个现存的茎环结构，例如通过使用本领域技术人员已知的位点特异性限制酶。
在某些实施方案中，就位于一个或多个感兴趣的结构基因的适宜区域的侧翼而言，本发明的5’和/或3’Ubi1 UTR是彼此联合使用的。然而，本发明不限于此方式。因此，例如，本发明的5’或3’Ubi1 UTR之一或二者可以与下述者联合使用：感兴趣的结构基因的天然UTR、对感兴趣的结构基因和Ubi1基因异源的UTR、或此类天然或异源UTR之外附加的UTR。
用于本发明的5’和/或3’Ubi1 UTR可以使用本领域已知的核酸杂交技术(例如使用本申请公开的核苷酸序列或其部分作为杂交探针)加以分离。此类探针可以由整个Ubi1基因或其部分，包括本申请鉴定的5’和3’UTR组成。主题的5’和/或3’Ubi1 UTR也可以是合成的，使用上述的序列和本领域中已知的核酸合成技术获得。
通过已知的克隆技术将感兴趣的结构核酸序列与分离自或衍生自Ubi1基因的5’和/或3’Ubi1 UTR控制序列可操作地连接。感兴趣的结构核酸序列相对于受体植物、植物细胞、或植物组织中天然存在的基因而言可以是异源的或者是同源的。在任一情况下，本发明的5’和/或3’Ubi1 UTR均可用于调节感兴趣的核酸序列的翻译效率以：增加被转录的mRNA的半衰期；和/或以比如果没有使用本发明的5’和/或3’Ubi1 UTR表达的丰度高的丰度在植物组织中表达感兴趣的结构核酸序列编码的蛋白质。另外特别考虑到的是在这样的基因构建体中使用本发明，该基因构建体被工程改造使得由感兴趣的结构基因序列编码的蛋白质仅在植物的特定优选的组织中，例如根、叶或茎中，而不在种子中表达。
本发明一般地可适用于在单子叶植物和双子叶植物中表达感兴趣的基因。因此，本发明适用于任何单子叶植物家族的任何成员，包括但不限于玉米、水稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦、甘蔗、菠萝、薯蓣(yams)、洋葱、香蕉、椰子、和枣(dates)。本发明的一个优选的应用是应用于转基因玉米植物的生产中。适用于本发明的双子叶植物种类包括，但不限于，烟草、西红柿、向日葵、棉花、糖用甜菜、马铃薯、莴苣、甜瓜、大豆和芥花(canola)(油菜)。
本发明的构建体中使用的感兴趣的结构基因序列可以是任何这样的核酸序列：其为产生的转基因植物的有益的特征提供条件，或者增强这样的特征。特别有用的核酸序列编码蛋白质或反义RNA转录物，以促进增加的营养价值、更高的产率、对除草剂、昆虫或疾病的耐性等等。更优选地，所述核酸序列会是这样的有用基因，它们由于自身相对较大的大小(长度至少4-5kb)，已知这样的大小会使基因更易于物理、化学或酶促降解而固有地不稳定。由于其大小而固有地不稳定的基因包括来自异短杆菌属(Xenorhabdus)(见美国专利6,048,838)的和发光短杆菌属的杀虫蛋白基因(例如毒素A)
在本发明的一个优选的实施方案中，一个或多个感兴趣的结构基因的侧翼有一个或多个本发明的Ubi1 UTR/控制序列，它们在特定的作物品种中被相互“叠加”。短语“叠加”是指多个感兴趣的结构基因，每个感兴趣的结构基因优选地赋予产业上期望的性状，已经被转基因地导入到单一作物品种中(近交种或杂种)。例如，具有叠加基因的玉米杂种可能既含有昆虫抗性的基因(例如Cry1F B.t.基因)，又含有除草剂抗性基因(例如草甘膦抗性基因)。
在一些实施方案中，一个或多个本发明的Ubi1 UTR/控制序列与来自发光短杆菌的毒素A基因功能连接，再与一个或多个杀虫剂和/或除草剂抗性基因在单一作物品种中叠加。在某些实施方案中，除草剂基因将来自苏云金芽孢杆菌或异短杆菌属的某些种(Xenorhabdus spp.)，而除草剂基因会是草胺膦、草甘膦、咪唑啉酮、或2,4-D、或磺酰脲抗性基因中的一种或多种。当然，任何“叠加”的杀虫剂或除草剂基因可以与本发明的Ubi1 UTR功能连接。
感兴趣的结构基因序列可以完全或部分来源于细菌基因组或附加体，真和基因组、线粒体或质体DNA、cDNA、病毒核酸、或化学合成的核酸。设想感兴趣的结构基因序列在可能影响表达产物的生物活性或化学结构、表达速率、或表达控制方式的编码区中可以含有一个或更多修饰。这样的修饰包括但不限于突变、***、缺失(或称删除)、重排、以及一个或多个核苷酸的取代。感兴趣的结构基因序列可以构成不间断的编码序列，或者其可以包括一个或多个内含子，内含子以合适的植物-功能剪接结点所界定。感兴趣的结构基因序列可以是来源于多个来源，包括天然或合成来源的节段的集合。感兴趣的结构基因序列还可以编码融合蛋白，只要实验操作在接合各编码序列的过程中维持功能性。
在实施本发明的过程中，利用克隆技术来获得含有侧翼于感兴趣的结构基因的5’和/或3’Ubi1 UTR的载体，用于接下来导入期望的宿主细胞。因此，可以利用本领域中标准的克隆步骤，例如J.Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(2d ed.,1989)和Ausubel,F.M.et al.(1989)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York,N.Y.(二者均通过提述并入本申请)中描述的那些，将5’和/或3’Ubi1 UTR、感兴趣的结构基因序列、以及任何期望的启动子、增强子、可选择标记等分离并克隆到载体中。
有多种多样的如下所述的克隆载体可供使用，或者可以制备：其中克隆载体包含在期望的植物物种中有功能的基因构建体。示例性的载体包括例如pBR322,pUC系列,pACYC184,Bluescript系列(Stratagene)，等等。因此，这样的载体是可商购的，或者可以容易地制备用于转化植物细胞。在一般情况下，质粒或病毒载体将包含在给定宿主中维护和表达异源DNA序列必要的核酸序列。选择适当的元件以在任何特定的物种中实现优化表达，是利用本公开的教导实施本领域的普通技术的范畴。合适的DNA成分，选择性标记基因，报道基因，增强子，内含子等在K.Weising et al.,Ann.Rev.Genetics,22,421(1988)中描述。
通常情况下，将感兴趣的结构基因序列和5'和/或3'UBI1 UTR***在适当的克隆载体的适当的限制性位点处，使得感兴趣的结构基因可操作地连接到所需的启动子，且和5'和/或3'UTR UBI1与感兴趣的结构基因序列功能连接。在制备本发明的基因构建体时，可操作各核酸片段，以便提供具有适当取向，以及视需要，处于适当的阅读框中的核酸序列。当然，可以使用衔接子或接头连接核酸片段，或可以包括其他操作以提供方便的限制性位点，移除多余DNA，移除限制性位点等等。
本发明中采用的结构基因的表达可以通过任何数目的启动子来驱动。虽然本申请中可以使用感兴趣的结构基因的内源启动子进行基因的转录调控，但在一些实施方案中，启动子是外来调节序列。对于植物表达载体，合适的病毒启动子包括木薯叶脉花叶病毒启动子(Verdaguer et al.,Plant Mol.Biol.31(6):1129-39(1996)；花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson et al.,Nature 310:511(1984)；Odell et al.,Nature,313:810(1985)；增强的和双增强的CaMV35S启动子(Kay et al.,Science 236:1299-1302(1987)；来自玄参花叶病毒(FMV)的全长转录物启动子(Gowda et al.,J.Cell Biochem.,13D:301,1989)和来自TMV的外壳蛋白启动子(Takamatsu et al.,EMBO J.6:307,1987)。其他有用的启动子包括来自小亚基核酮糖1,5-二磷酸羧化酶加氧酶(ssRUBISCO)的光诱导型启动子(Coruzzi et al.,EMBO J.,3:1671(1984)；Broglie,et al.,Science 224:838(1984)；水稻肌动蛋白启动子(McElroy et al.,Plant Cell.2(2):163-71(1990)；和Adh1启动子(Dennis et al.,Nucleic Acids Res.12(9):3983-4000(1984))；甘露碱合酶启动子(Velten et al.,EMBO J.,3:2723,1984)；胭脂碱合酶(NOS)和章鱼碱合酶(OCS)启动子(携带在根癌土壤杆菌的肿瘤诱导质粒上)，或热休克启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurleyet al.,Mol.Cell.Biol.6:559(1986)；Severin et al.,Plant Mol.Biol.15:827,(1990))。
通常可以进行对克隆步骤的分析，分析可能涉及序列分析，限制酶切分析，电泳，等等。每次操作后，可将最终的构建体中要使用的DNA序列限制酶切出来，并且连接到下一个序列，其中各个部分构建体可以克隆到相同或不同的质粒中。
一旦克隆步骤已经完成，有多种技术可供用于导入，植株再生，稳定整合、和在植物细胞中表达包含感兴趣的异源基因的外来重组载体。一种这样的技术涉及将包被有遗传物质的微粒加速直接引入植物细胞(美国专利4,945,050，授予Cornell；美国专利5,141,131，授予DowElanco；美国专利5,538,877和5,538,880，均授予Dekalb)。该技术现在通常称为“微粒轰击”或“轰击”。还可以使用土壤杆菌技术来转化(美国专利5,177,010，授予University ofToledo,美国专利5,104,310，授予Texas A&M,欧洲专利申请0131624B1,欧洲专利申请120516,159418B1和176,112，授予Schilperoot；美国专利5,149,645,5,469,976,5,464,763和4,940,838和4,693,976，授予Schilperoot,欧洲专利申请116718,290799,320500均授予Max Planck,欧洲专利申请604662,627752和美国专利5,591,616，授予Japan Tobacco；欧洲专利申请0267159,和0292435和美国专利5,231,019，均授予Ciba-Geigy；美国专利5,463,174和4,762,785，均授予Calgene；和美国专利5,004,863和5,159,135，均授予Agracetus)。另一种转化方法设计使用延长的针状微纤维或称“晶须”(“whiskers”)来转化玉米细胞悬浮培养物(美国专利5,302,523和5,464,765，均授予Zeneca)。此外，已经利用电转化技术来转化植物细胞，从其获得了能育的植物(WO 87/06614，授予Boyce Thompson Institute；美国专利5,472,869和5,384,253，均授予Dekalb；美国专利5,679,558,5,641,664,WO9209696和WO9321335，授予PlantGenetic Systems)。
其他用于转化植物细胞的技术包括：直接DNA摄取机制(见Mandel andHiga,J.Mol.Biol.,53:159-162(1972)；Dityatkin et al.,Biochimica et BiophysicaActa,281:319-323(1972)；Wigler et al.,Cell,16:77(1979)；和Uchimiya et al.,In:Proc.5th Intl.Cong.Plant Tissue and Cell Culture,A.Fujiwara(ed.),Jap.Assoc.for Plant Tissue Culture,Tokyo,pp.507-508(1982))；融合机制(见Uchidaz et al.,收录于：Introduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells,Baserga etal.(eds.)Wistar Symposium Series,1:169-185(1980))；位点特异重组(见WO/9109957),和各种感染剂(见Fraley et al.,CRC Crit Rev.Plant Sci.,4:1-46(1986)；and Anderson,Science,226:401-409(1984))。
可根据所使用的植物细胞选择转化所选的植物细胞的适当过程。根据迄今为止的经验，似乎基因一旦***到细胞中，其表达几乎没有可归因于转化的方法本身的差别。相反，***到植物细胞中的外源基因的活性依赖于***物邻近的内源性植物DNA的影响。一般地，使用任何转化技术异源基因的***似乎都是随机的；然而，当前存在产生DNA位点特异性重组导入植物细胞的植物的技术(见WO91/09957)。
用于转化此类植物细胞的特定方法不是本发明的关键，随后视情况需要的步骤，如此类植物细胞的再生，也不是本发明的关键。任何方法或方法的组合，如果导致所希望的序列在一个或多个主题5'和/或3'UBI1UTR的调节控制下表达，就是可接受的。
一旦将结构基因引入植物组织中，可以在瞬时表达***中测定结构基因的表达，或者可以在针对植物基因组内的稳定整合进行选择后再确定结构基因的表达。
可以使用任何数目的选择***来回收转化的细胞系。这些包括，但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler et al.,Cell 11:223(1977))和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy et al.,Cell 22:817(1980))基因，它们分别可以在tk-或aprt-细胞中使用。此外，抗代谢物，抗生素，或除草剂抗性可以用作选择的基础；例如，DHFR，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,77:3567(1980))；pt，其赋予对氨基糖苷类的新霉素和G-418的抗性(Colbere-Garapin etal.,J.Mol.Biol.,150:1)(1981))；和ALS(美国专利5,378,824，授予Bedbrook)或PAT(Wehrmann et al.,Nat Biotechnol 14(10):1274-8(1996))，它们分别赋予对氯磺隆和膦丝菌素乙酰转移酶的抗性。其他可选择基因已有描述，例如，trpB，其允许细胞利用吲哚代替色氨酸，或者HISD，其允许细胞利用组氨醇代替组氨酸(Hartman and Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.,85:8047(1988))。最近，可视标记的使用已经得到普及，如GFP，花青素，α葡糖苷酸酶及其底物GUS，荧光素酶及其底物萤光素等标记被广泛使用，不仅用于识别转化体，而且用于定量可归因于特异性载体***的瞬时或稳定蛋白表达(Rhodes et al.,Methods Mol.Biol.,55:121(1995))。
尽管标记基因的存在/不存在表达可提示感兴趣的基因也存在，它的存在和表达可能需要确认。例如，如果编码多肽的序列***在标记基因序列内，包含编码多肽的序列的重组细胞可以根据标记基因功能的缺乏来鉴定。或者，可以放置标记基因使其与编码多肽的序列串联处于单个启动子的控制下。该标记基因响应于诱导或选择的表达通常也指示串联基因的表达。
或者，可以通过本领域技术人员已知的程序来鉴别包含编码感兴趣的多肽(例如，本发明的核酸编码的多肽)的核酸序列、且表达该多肽的宿主细胞。这些程序包括，但不限于，DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白生物测定或免疫测定技术，包括基于膜、溶液或芯片的技术用于核酸或蛋白的检测和/或定量。
编码感兴趣的多肽(例如，由本发明的核酸编码的多肽)的多核苷酸序列的存在可以通过使用编码该多肽的多核苷酸探针或部分或片段进行DNA-DNA或DNA-RNA杂交或扩增来检测。以核酸扩增为基础的测定涉及使用基于编码多肽的序列的寡核苷酸或寡聚物来检测含有编码该多肽的DNA或RNA的转化子。如本文所用的“寡核苷酸”或“寡聚物”是指至少约10个核苷酸，多达约60个核苷酸，优选约15至30个核苷酸，更优选约20-25个核苷酸，且可用于作为探针或扩增引物的核酸序列。
多种使用特异于蛋白质的多克隆或单克隆抗体用于检测和测量多肽(例如本发明的核酸编码的多肽)的表达的规程是本领域已知的。实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。双位点、基于单克隆的免疫测定是优选的，它利用对多肽的两个不干扰的表位起反应的多种单克隆抗体，但是竞争性结合测定法也可以使用。这些和其它测定描述于，例如，Hampton et al.,Serological Methods,a Laboratory Manual,APS Press,St Paul,Minn.(1990),和Maddox et al.,J.Exp.Med.,158:1211(1983)。
多种标记和缀合技术是由本领域技术人员已知的，并且可以用于各种核酸和氨基酸测定中。用于生产标记的杂交或PCR探针以检测相关的编码感兴趣的多肽序列的多核苷酸的手段包括：寡核苷酸标记，切口平移，末端标记或使用标记的核苷酸的PCR扩增。或者，所述编码多肽的序列，或其任何部分可克隆到用于产生mRNA探针的载体中。这样的载体是本领域已知的，可商购，并且通过加入适当的RNA聚合酶如T7，T3或SP6和标记的核苷酸可以用来体外合成RNA探针。这些程序可以使用来自Pharmacia&Upjohn(Kalamazoo,Mich.),Promega Corporation(Madison,Wis.)和U.S.BiochemicalCorp.(Cleveland,Ohio)的多种可商购的试剂盒来进行。可以使用的合适报告分子或标记包括放射性核素，酶，荧光，化学发光或生色剂以及底物，辅因子，抑制剂，磁性颗粒等。
用于在体外培养植物组织、并且在一些情况下再生成为整株植物的技术是已知的。可根据所用的植物物种选择适当的程序来产生成熟的转基因植物。再生因植物的种类不同而异。高效的再生将取决于培养基，基因型，以及培养的历史。一旦已获得整株植物，它们可以以这样的方式有性或无性繁殖，使得该序列的至少一个拷贝存在于子代的细胞中。可以收集来自再生植物的种子以供将来使用，并可从种子种植植物。用于将导入的基因从所述原始转化植株转移到商业上有用的栽培种的程序是本领域技术人员已知的。
实施例中进一步举例说明本发明特定实施方案。然而，本领域技术人员将容易理解，下文详述的具体实验仅用于说明本发明，本发明在后随的权利要求中有更全面的描述。
实施例
实施例1
使用对玉米Ubi1基因翻译终止密码子的直接下游的序列退火的正向引物PCR扩增Ubi1 3'UTR序列。反向引物被设计成对终止密码子的下游910bp的序列退火。该910bp序列包括3'UTR和可能为适当转录所需要的下游非转录区域。引物序列示于表1中。使用Invitrogen公司Topo试剂盒将PCR产物克隆到TOPO载体中。使用玉米B73作为参照基因组对3'UTR***物进行了测序确认。
将3’UTR进一步PCR扩增以在末端添加～15nt的突出端(overhang)，获得适合于无缝克隆(seamless cloning)(Invitrogen,目录号A13288)的序列。使用无缝克隆反应来生成载体pDAB112330(ZmUbi1启动子v8/Cry34Ab1v2/maizeUbi1 3'UTR v1,图2A)。还构建了另一个含有玉米(Zm)泛素(Ubi)启动子v8/Cry34Ab1v2/St PinII 3'UTR v2的载体(pDAB112332,图2B)用来比较Ubi1 3’UTR与马铃薯PinII 3’UTR的表达。
瞬时表达测试：利用对授粉后10-12天收集的未成熟玉米(B104)胚的颗粒轰击来测试瞬时表达。每个处理使用20个胚，使用三个重复。颗粒轰击后将胚过夜温育，然后进行ELISA。图3显示从包含与马铃薯PinII或玉米Ubi13’UTR的组合的核酸构建体都获得了良好的蛋白表达水平，其中玉米Ubi13’UTR提供了更好的表达。Neg是非轰击的对照。
实施例2
在控制序列ZMEXP9396.1、ZMEXP9707.1和St PinII 3’UTR之间进行了与实施例1相似的表达比较。
图4显示了pDAB112357(ZMEXP9396.1)和pDAB112354(ZMEXP9707.1)的代表性质粒图。利用Cry34Ab1基因来测试转基因的表达。Cry34Ab1的表达水平可以通过本领域已知的方法来测量。
图5显示了来自不同的核酸构建体，包括pDAB112357(ZMEXP9396.1)，pDAB112354(ZMEXP9707.1)和pDAB112332(St PinII 3’UTR)的典型的表达结果。所有这三个构建体均提供了可比的良好的Cry34Ab1表达。
表2列出了用于扩增控制序列ZMEXP9396.1、ZMEXP9707.1和玉米Ubi13’UTR的引物。
实施例3
载体的构建：使用对相应的玉米基因的翻译终止密码子的直接下游的序列退火的正向引物来PCR扩增3'UTR序列。反向引物被设计成对终止密码子下游大约900-1000bp的序列退火。这条大约1000bp的序列包括了3'UTR以及可能为适当的转录所需要的下游非转录区域。使用Invitrogen公司Topo试剂盒将PCR产物克隆到TOPO载体中。使用玉米B73作为参照基因组对3'UTR***物进行了测序确认。
将3’UTR进一步PCR扩增以在末端添加大约15nt的突出端，获得适合于无缝克隆(Invitrogen,目录号A13288)的序列。利用无缝克隆反应来产生(INVITROGEN)入门载体pDAB112330(ZmUbi1启动子v8/Cry34Ab1 v2/ZmUbi1 3'UTR v1；见图2A),pDAB112354(ZmUbiv8/Cry34Abi v2/ZMEXP9707.1 3'UTR；见图4),和pDAB112357(ZmUbiv8/Cry34Abi v2/ZMEXP9396.1 3'UTR；亦见图4)。还构建了另一个含有玉米(Zm)泛素(Ubi)启动子v8/Cry34Ab1v2/St PinII 3'UTR v2的载体(pDAB112332,图2B)用来比较Ubi1 3’UTR与马铃薯PinII 3’UTR的表达。
利用标准克隆方法和重组反应来构建用于土壤杆菌介导的玉米胚转化的转化/表达载体，其中重组反应使用典型的目的双元载体(pDAB104153)和如上所述的入门载体。双元目的载体pDAB104153包含处于玉米(Zm)泛素(Ubi)启动子的表达控制之下的除草剂耐受性基因(芳基氧基链烷酸双加氧酶(AAD-1)；美国专利7,838,733,和Wright et al.(2010)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:20240-20245)。使用一个包含来自玉米脂肪酶基因的3’UTR(ZmLip 3'UTR,美国专利7,179,902)的片段来终止PAT mRNA的转录。重组反应用于ZmUbi1v8/Cry34Abi v2/3'UTR表达盒，如上文中就四个入门载体所描述的，位于T-DNA边界与T-DNA边界之间，并在AAD-1表达盒上游。四个最终的表达载体pDAB108744,pDAB108746,pDAB112396和pDAB112397示于图6和图7。
根癌土壤杆菌的转化：将双元载体转化入根癌土壤杆菌DAt13192三重株(公开于WO 2012/016222国际PCT申请中)。从细菌菌落中分离双元质粒DNA，并利用限制酶消化加以确认。
玉米转化：含有项目载体的宿主根癌土壤杆菌菌株DAt13192(RecA-三重菌株)的甘油储液从DAS重组培养物保藏中心(RCC)中获得。将土壤杆菌培养物从甘油储液划线到AB基本培养基(培养基ID：AT00002247)上，并在黑暗中在20℃温育三天。然后将土壤杆菌菌培养物划线接种到YEP培养基(培养基ID：AT00002245)的平板上，并在黑暗中在20℃下温育一天。
制备对于实验中的构建体数目而言合适体积的接种培养基(培养基ID:ZM00002914)与乙酰丁香酮的混合物。将接种培养基吸取到无菌的一次性250ml烧瓶中。向含有接种培养基的烧瓶中加入适当体积的溶于100％二甲亚砜的1M乙酰丁香酮储液(储液配方ID:EPS000400)，使得最终的乙酰丁香酮浓度为200μM。表3列出了接种培养基和1M乙酰丁香酮储液的示例体积。
对于每种构建体，在无菌的一次性50ml离心管中将来自YFP的1-2个环的土壤杆菌悬浮在15ml的接种培养基/乙酰丁香酮混合物中，在分光光度计中测量溶液600nm的光密度(O.D.600)。然后使用额外的接种培养基/乙酰丁香酮混合物将悬液稀释到0.25-0.35O.D.600。然后将土壤杆菌的管水平地放置在设置为约75rpm的平台式摇床上，室温下历时1-4小时后使用。
穗灭菌和胚分离：来自玉米栽培种B104的穗在印第安纳波利斯的温室设施中生产，在授粉后10-12天收获。将收获的穗去壳(de-husk)并在市售漂白剂(UltraGermicidal Bleach,6.15％次氯酸钠)的20％溶液加两滴吐温20中表面灭菌20分钟，然后在层流罩中用无菌的去离子水清洗三次。将未成熟的合子胚(1.8-2.2mm长)从每个穗上无菌地切下，分装到一个或多个装有2.0ml的土壤杆菌悬液(加有2μl的10％S233表面活性剂)的微型离心管中。
土壤杆菌共培养：胚分离活动一旦完成，即将胚的管盖上，放置在摇杆平台上5分钟。然后将管的内容物倒在共培养培养基(培养基ID:ZM00003237)的平板上，用一根无菌一次性转移滴管去除液体土壤杆菌悬浮物。将含有胚的共培养平板盖子稍微打开放置在层流罩的后部三十分钟；在这段时间之后，利用显微镜使得胚的方向盾片朝上。然后将共培养平板连同胚一起放回层流罩的后部，盖子稍微打开再放置15分钟。然后盖上平板，用3M微孔胶带密封，并放置在25℃，24小时/天光照、约60μmol m-2s-1光强度的培养箱中。
愈伤组织的选择和转基因事件的再生：在共培养期之后，将胚转移到静息培养基(培养基ID:ZM00003262)上。每块平板上最多移入36个胚。将平板放置在透明的箱中，以27℃、24小时/天光照、大约50μmol m-2s-1光强度温育7-10天。然后将愈伤胚转移到选择I培养基(培养基ID:ZM00003233)上。每块选择I平板上移入最多18个愈伤胚。将平板放置在透明的箱中，以27℃、24小时/天光照、大约50μmol m-2s-1光强度温育7天。然后将愈伤胚转移到选择II培养基(培养基ID:ZM00003234)上。每块选择II平板上移入最多12个愈伤胚。将平板放置在透明的箱中，以27℃、24小时/天光照、大约50μmolm-2s-1光强度温育14天。
在此阶段，将抗性的愈伤组织移到预再生培养基(培养基ID:ZM00003235)上。每块预再生培养基平板上最多移入9个愈伤组织。将平板放置在透明的箱中，以27℃、24小时/天光照、大约50μmol m-2s-1光强度温育7天。然后将再生中的愈伤组织转移到PhytatraysTM中的再生培养基(培养基ID:ZM00003236)中，以28℃、每天16小时光照/8小时黑暗、大约150μmol m-2s-1光强度温育7-14天，直到长出芽。每个PhytatrayTM放置最多5个愈伤组织。将具有初生根的小芽分离并转移到芽伸长培养基(培养基ID:ZM00003269)中。将6cm或更高的有根小植物移植到土壤中，并移出到生长室中以进行炼苗(hardening off)。
转移植物并在温室中建成：转基因植物通过TOPAZ数据库指派唯一的标识，并定期转移到温室中。将植物从PhytatraysTM移栽到小盆(T.O.Plastics,3.5”SVD,700022C)中，小盆中装满生长培养基(Premier Tech Horticulture,ProMix BX,0581 P)并用保湿盖覆盖以帮助植物适应环境。将植物置于Conviron生长室(28℃/24℃,16-小时光周期，50-70％RH,200μmol m-2s-1光强)内直到达到V3-V4期。这可帮助植物适应土壤和更严酷的温度。然后将植物移到温室(光暴露类型：光合(Photo)或同化(Assimilation)；高光限：1200μmol m-2s-1光合活性照射(PAR)；16-小时昼长；27℃昼/24℃夜)，并从小盆移栽到5.5英寸盆中。将T0植物与B104回交以获得T1半合种子。
AAD-1和Cry34蛋白的ELISA定量：用酶联免疫吸附测定(ELISA)测量玉米细胞或稳定转化的组织中AAD-1和Cry34蛋白的产生。AAD-1蛋白分别使用来自ACADIA BIOSCIENCES(目录号ABS-041)和Agdia,Inc(目录号04500/4800)的试剂盒定量。使用根据供应商的试剂和说明书，使用植物提取物的多个稀释液进行ELISA。
植物蛋白提取：从4个叶盘(共计1.3cm2)或40个未成熟胚(对于瞬时表达研究)用0.6毫升的PBST(含0.05％吐温20的PBS缓冲液)，其含有0.5％BSA(对于AAD-1提取)或含有1％的PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮；用于Cy34)提取蛋白质。放入一个2mm的钢珠，将管加盖并固定在GENO/GRINDER(CERTIPREP；Metuchen,NJ)中，并以1500rpm振荡5分钟。将管在4℃以4000rpm离心7分钟，将含有可溶蛋白质的上清液储存在-80℃直至使用。根据供应商的说明；使用PIERCE 660nm蛋白测定试剂盒(THERMO SCIENTIFIC；Rockford,IL)测定总蛋白浓度。
用于拷贝数分析的水解探针qPCR：使用多种类型的分子分析来筛选低拷贝的简单事件。从生根的推定转基因植物收集叶组织然后移栽到土壤。用QIAGEN MagAttractTM，利用THERMO FISHER KingFisherTM磁颗粒处理仪和供应商推荐的规程来提取DNA。利用针对AAD-1和Cry34基因的特异性水解探针测定来进行整合转基因拷贝数分析。此外，通过对双元载体骨架上携带的大观霉素(Spec)抗性基因特异性的水解探针测定来检测双元载体质粒骨架意外整合所造成的污染。开发了针对内源玉米基因转化酶(GenBankTMAccession No.U16123)和延伸因子1α(EF1α)(GENBANK Accession No.AF136823.1)的水解探针测定作为内部参考标准品。表4列出了水解探针测定组分的寡核苷酸序列(由INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES,Coralville,IA合成)。
根据表5用大约10ng DNA设立了双重水解探针PCR，测定条件如表6所示。
为了扩增，将探针预混物(ROCHE APPLIEDSCIENCE,Indianapolis,IN)以1X最终浓度制备为10μL体积的多重反应，其中含有0.1％的PVP、0.4μM的每种引物、和0.2μM的每种探针。FAM(6-羧基荧光素亚酰胺)荧光部分在465nm被激发，荧光在510nm测量；对于HEX(六氯荧光素)荧光部分，相应的值分别为533nm和580nm，而对于的值为538nm和554nm。每个反应产生的荧光的水平用ROCHE实时PCR***根据制造商的推荐加以分析。通过比较未知样品的输出的靶/参比基因值和已知拷贝数的标准品的靶/参比基因值来确定转基因拷贝数(1拷贝代表半合植物，2拷贝代表纯合植物)。
使用Cp得分(即使用拟合点算法(软件1.5推出版)时荧光信号在该点处穿过背景阈值的点)和相对量模块(Relative Quant module)(基于ΔΔCt法)来实施对实时PCR数据的分析。
在拟合点算法软件中，通过用输入DNA模板浓度的对数对测得的Cp值作图获得数据图。该曲线的斜率是一个期望的比较参数；因此初始的log输入数可以是曲线上的任意起始点，但应当注意的是用于输入DNA模板的任意浓度值应能代表所使用的真实系列稀释。例如，对于10倍系列稀释序列，真实的输入浓度可以是1000、100、10等，对此LC480拟合点算法软件描入3、2、1等作为输入的对数。然后使用线性回归，利用所得的这条线的最佳拟合(输入log-对-Cp)根据y＝mx+b的形式的方程估计斜率(m)。起始模板量和Cp值之间有反相关的关系，因此斜率(m)总是负的。
完美的(即效率100％的)PCR反应每个循环令总模板倍增。PCR效率(Eff)计算为：Eff＝10e(-1/m)。因此对于效率完美的PCR反应(其效率定义为2.00)而言，log输入-对-Cp的图的斜率(m)将是-3.3219。换言之，效率100％的PCR反应定义为：2.0＝10e(-1/-3.3219)。LC480拟合点算法软件报告按第一个式子计算的效率值。因此，效率99％的反应的Eff值为1.99而非0.99。为了将此表示为百分比效率，将该值减去1并乘以100，或者根据方程％Eff＝[(10e(-1/m)-1)]x 100。
稳定的转基因植物的蛋白分析：将稳定的转基因T0植物(1-2个拷贝的转基因)转移到温室用于产生成熟植物。对于每种构建体，对8-12个T0植物测试Cry34和AAD-1的叶表达。对于T1分析，每个事件种植8-10株植物用于蛋白分析。获得并比较具有Zm Ubi1 3’UTR的构建体和具有St PinII 3'UTR的构建体的数据。结果显示，在玉米植物的V4和V14叶阶段，使用Zm Ubi13’UTR(例如pDAB108744)的Cry34产量相比于St PinII 3'UTR(例如pDAB108746)一贯地是2.5倍以上。因此，所提供的Zm Ubi1 3’UTR对于制作转基因性状是有用的。此外，来自ZMEXP9396.1和ZMEXP9707.1 3'UTR(例如pDAB112396和pDAB112397)的数据显示出强健的Cry34蛋白表达。

Claims (22)

1.一种核酸构建体，包含与异源启动子和一个或多个控制序列功能连接的至少一个感兴趣的结构基因，所述一个或多个控制序列与选自下组的核酸序列有至少80％同一性：SEQ ID NO:1-3，它们的互补物，或其组合。
2.权利要求1的核酸构建体，其中所述至少一个感兴趣的结构基因包括赋予植物中的非天然表型的基因。
3.权利要求1的核酸构建体，其中所述至少一个感兴趣的结构基因包括赋予植物中的昆虫抗性或除草剂抗性/耐性的基因。
4.权利要求1的核酸构建体，其中所述一个或多个控制序列选自下组：SEQ ID NO:1-3，它们的互补物，或其组合。
5.权利要求1的核酸构建体，其中所述一个或多个控制序列能够使用选自SEQ ID NO:4-15的寡核苷酸扩增。
6.权利要求1的核酸构建体，其中所述核酸构建体包括用于土壤杆菌介导的转化的双元载体。
7.权利要求1的核酸构建体，其中所述核酸构建体是稳定转化到转基因植物中的。
8.权利要求6的核酸构建体，其中所述植物是单子叶植物。
9.权利要求6的核酸构建体，其中所述植物是双子叶植物。
10.权利要求1的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含可选择标记。
11.权利要求10的核酸构建体，其中所述可选择标记包括芳基氧基链烷酸双加氧酶。
12.权利要求11的核酸构建体，其中所述芳基氧基链烷酸双加氧酶是AAD-1或AAD-12。
13.一种包含权利要求1的核酸构建体的载体。
14.经权利要求1的核酸构建体转化的植物或植物细胞。
15.权利要求13的植物或植物细胞，其还包含与所述至少一个感兴趣的基因叠加的其他感兴趣的结构基因。
16.一种重组产生肽或蛋白质的方法，所述方法包括将异源启动子与一个或多个控制序列功能连接，所述一个或多个控制序列与选自下组的核酸序列有至少80％同一性：SEQ ID NO:1-3，它们的互补物，或其组合。
17.权利要求16的方法，其中所述一个或多个控制序列能够使用选自SEQ ID NO:4-15的寡核苷酸扩增。
18.一种增加植物或植物细胞中基因的表达的方法，所述方法包括将异源启动子与一个或多个控制序列功能连接，所述一个或多个控制序列与选自下组的核酸序列有至少80％同一性：SEQ ID NO:1-3，它们的互补物，或其组合。
19.权利要求18的方法，其中所述一个或多个控制序列选自下组：SEQID NO:1-3，它们的互补物，或其组合。
20.权利要求18的方法，其中所述一个或多个控制序列能够使用选自SEQ ID NO:4-15的寡核苷酸扩增。
21.选自SEQ ID NO:1-3、它们的互补物、或其组合的至少一个控制序列用于在植物中表达转基因的用途。
22.能够利用选自SEQ ID NO:4-15的寡核苷酸扩增的一个或多个控制序列用于在植物中表达转基因的用途。
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