BR112015002918B1 - Construção de ácido nucleico compreendeendo uma região não traduzida, vetor e métodos para produção de um peptídeo ou uma proteína e para a expressão de um gene em uma planta ou células vegetais - Google Patents

Abstract

CONSTRUTO DE ÁCIDO NUCLEICO COMPREENDEENDO UMA REGIÃO NÃO TRADUZIDA, VETOR, USOS DE UMA PLANTA OU CÉLULA VEGETAL E DE PELO MENOS UMA SEQUÊNCIA DE CONTROLE, E MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DE UM PEPTÍDEO OU UMA PROTEÍNA, PARA O AUMENTO DA EXPRESSÃO DE UM GENE EM UMA PLANTA OU CÉLULAS VEGETAIS E PARA GERAR UMA PLANTA OU SEMENTE TRANSGÊNICA. São fornecidos processos, vetores e construtos gênicos para aumentar a expressão de uma sequência de ácido nucleico recombinante em plantas e tecidos vegetais transgênicos. De acordo com a presente invenção, as sequências de ácido nucleico são obtidas e/ou derivadas das regiões não traduzidas a 3 de genes que codificam proteínas ubiquitina e engenheiradas para flanquearem as respectivas porções de uma região codificadora selecionada de um vetor. O construto de vetor pode ser introduzido em plantas e/ou tecidos vegetais através de procedimentos convencionais ou de direcionamento gênico, resultando na expressão aprimorada da região codificadora selecionada. Em algumas modalidades, a região codificadora selecionada é um gene quimérico ou um fragmento gênico que expressa uma ou mais proteínas conhecidas por conferirem um nível de atividade inseticida a uma planta e/ou um tecido vegetal transgênico.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] Esta invenção é geralmente relacionada ao campo de engenharia genética e mais especificamente ao campo de expressão de transgenes em plantas.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

[0002] A tecnologia do DNA recombinante e a engenharia genética tornaram rotineiramente possível introduzir sequências de DNA desejadas dentro de células vegetais para permitir a expressão de proteínas de interesse. Para eventos de transformação comercialmente viáveis, entretanto, a obtenção de níveis desejados de expressão estável e previsível em plantas de cultivo importantes permanece desafiadora.

[0003] Um método de expressão de genes heterólogos em níveis desejados em plantas de cultivo envolve a manipulação dos mecanismos reguladores que controlam a expressão em plantas. A regulação pode ser transcricional ou pós-transcricional e pode incluir, por exemplo, mecanismos para aumentar, limitar ou prevenir a transcrição do DNA, bem como mecanismos que limitam ou aumentam o tempo de vida de um mRNA após este ser produzido. As sequências de DNA envolvidas nestes processos reguladores podem estar localizadas a montante, a jusante ou ainda internamente às sequências de DNA estruturais que codificam o produto protéico de um gene.

[0004] Para regular a transcrição em uma planta transgênica, vá rios tipos de promotores podem ser empregados. Os promotores podem ser utilizados para controlar a expressão de genes exógenos em plantas transgênicas de uma maneira similar ao padrão de expressão do gene partindo do qual o promotor foi originalmente derivado. Em geral, os promotores são classificados em duas categorias: Promotores "constitutivos" são expressos na maioria dos tecidos na maior parte do tempo, enquanto que promotores "regulados" são tipicamente expressos apenas em certos tipos de tecidos (promotores específicos para o tecido) ou em certos momentos durante o desenvolvimento (promotores temporais). A expressão partindo de um promotor constitutivo é tipicamente mais ou menos em um nível de estado estacionário ao longo de todo o desenvolvimento. Os genes que codificam proteínas com funções de "house-keeping" são frequentemente controlados por promotores constitutivos. Os exemplos de genes expressos de forma constitutiva no milho incluem actina e ubiquitina (Ubi).

[0005] Aprimoramentos adicionais na transcrição podem ser obti dos em plantas transgênicas através da colocação de sequências "in- tensificadoras" a montante (5’) do promotor. Os elementos intensifica- dores atuam em cis e aumentam o nível de transcrição de um gene adjacente partindo de seu promotor de uma maneira que é relativamente independente da posição a montante e da orientação do intensi- ficador. Tais sequências foram isoladas de uma variedade de fontes, incluindo genes de vírus, bactérias e plantas. Um exemplo de uma sequência intensificadora bem caracterizada é o intensificador da octopina sintase (ocs) da Agrobacterium tumefaciens, como descrito nas Pat. U.S. Nos. 5.837.849, 5.710.267 e 5.573.932. Foi mostrado que esta sequência curta (40 pb) aumenta a expressão gênica tanto em dicotiledôneas quanto em monocotiledôneas, incluindo milho, em níveis significativos. Foi mostrado que repetições em tandem deste in- tensificador aumentam a expressão do gene GUS oito vezes no milho. Permanece obscuro como estas sequências intensificadoras funcionam. Presumivelmente os intensificadores se ligam a proteínas ativa- doras e dessa maneira facilitam a ligação da RNA polimerase II ao TATA box. A WO95/14098 descreve o teste de várias combinações múltiplas do intensificador ocs e do intensificador mas (manopina sin- tase) que resultaram em um aumento de várias centenas de vezes na expressão gênica do gene GUS no calo de tabaco transgênico.

[0006] O uso de um promotor específico, com ou sem um ou mais intensificadores, entretanto, não necessariamente garante níveis desejados de expressão gênica em plantas. Em adição aos níveis de transcrição desejados, outros fatores tais como processamento, poliadeni- lação e exportação nuclear inapropriados podem afetar o acúmulo tanto do mRNA quanto da proteína de interesse. Portanto, métodos de aumento da estabilidade do RNA e da eficiência de tradução através de mecanismos de regulação pós-transcricional são necessários na técnica.

[0007] Em relação à regulação pós-transcricional, foi demonstrado que certas regiões não traduzidas (UTRs) a 5’ e a 3’ de mRNAs euca- rióticos desempenham uma função importante na eficiência de tradução e na estabilidade do RNA, respectivamente. Por exemplo, as UTRs a 5’ e a 3’ dos mRNAs da proteína de revestimento do vírus mosaico do tabaco (TMV) e do vírus mosaico da alfafa (AMV) são conhecidas por aumentarem a expressão gênica nas plantas de tabaco. As UTRs a 5’ e a 3’ do gene da álcool desidrogenase-1 (adh1) do milho são conhecidas por estarem envolvidas na tradução eficiente em pro- toplastos hipóxicos.

[0008] Experimentos com várias sequências líderes de UTR a 5’ demonstram que várias características estruturais de uma UTR a 5’ podem estar correlacionadas com níveis de eficiência de tradução. Foi descoberto que certas UTRs a 5’ contêm códons AUG que podem interagir com subunidades ribossomais 40S quando estas verificam em relação ao códon AUG no sítio de iniciação, diminuindo assim a taxa de tradução. (Kozak, Mol. Cell. Biol. 7:3438 (1987); Kozak, J. Cell Biol. 108, 209 (1989)). Ainda, as sequências de nucleotídeos da UTR a 5’ que flanqueiam o sítio de iniciação de AUG sobre o mRNA podem ter um impacto sobre a eficiência de tradução. Se o contexto da UTR a 5’ flanqueadora não for favorável, parte das subunidades ribossomais 40S poderia falhar em reconhecer o sítio de início da tradução de forma que a taxa de síntese de polipeptídeo será retardada. (Kozak, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870 (1991); Pain, Eur. J. Biochem. 236, 747-771 (1996)). Estruturas secundárias de UTRs a 5’ (por exemplo, formação de grampos de cabelo) também podem impedir o movimento de subunidades ribossomais 40S durante seu processo de varredura e, portanto, ter impacto de forma negativa sobre a eficiência de tradução. (Sonenberg e outros, Nature 334:320 (1988); Kozak, Cell 44:283292, (1986)). Foi mostrado que o conteúdo de GC relativo de uma sequência de UTR a 5’ é um indicador da estabilidade da estrutura secundária potencial, com níveis mais altos de GC indicando instabilidade. (Kozak, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870 (1991). UTRs a 5’ mais longas podem exibir números mais altos de estruturas secundárias ini- bidoras. Assim, a eficiência de tradução de qualquer certa UTR a 5’ é altamente dependente de sua estrutura particular e foi mostrado que a otimização da sequência líder aumenta a expressão gênica como um resultado direto da eficiência de iniciação da tradução aprimorada. Além disso, aumentos significativos na expressão gênica foram produzidos através da adição de sequências líderes de vírus de plantas ou de genes de choque térmico. (Raju e outros, Plant Science 94: 139149 (1993)).

[0009] Em adição às sequências de UTR a 5’, sequências de 3’ UTR (trailer) de mRNAs também estão envolvidas na expressão gêni- ca. As UTRs a 3’ (também conhecidas como elementos de poliadeni- lação ou elementos de controle de adenilação) são conhecidas por controlarem a exportação nuclear, o status de poliadenilação, o direci- onamento subcelular e as taxas de tradução e de degradação de mRNA partindo das RNases. Em particular, as UTRs a 3’ podem conter uma ou mais repetições invertidas que podem se dobrar em estruturas de haste-laço que atuam como uma barreira para exorribonu- cleases, bem como interagem com proteínas conhecidas por promoverem a estabilidade do RNA (por exemplo, proteínas que se ligam ao RNA). (Barkan e outros, A Look Beyond Transcription: Mechanisms Determining mRNA Stability and Translation in Plants, American Society of Plant Physiologists, Rockville, Md., pp. 162-213 (1998)). Certos elementos encontrados dentro das UTRs a 3’ podem ser desestabili- zadores de RNA, entretanto. Tal exemplo que ocorre em plantas é o elemento DST, que pode ser encontrado nos RNAs "auxin up" pequenos (small auxin up RNAs (SAURs)). (Gil e outros, EMBO J. 15, 16781686 (1996)). Uma característica desestabilizadora adicional de algumas UTRs a 3’ é a presença de pentâmeros AUUUA. (Ohme-Takagi e outros, Pro. Nat. Acad. Sci. USA 90 11811-11815 (1993)).

[00010] Foi demonstrado que as UTRs a 3’ desempenham uma função significativa na expressão gênica de vários genes do milho. Especificamente, foi mostrado que uma sequência a 3’ de 200 pares de bases é responsável pela supressão de indução pela luz da subu- nidade m3 pequena do milho do gene da ribulose-1,5-bifosfato carbo- xilase (rbc/m3) em células de mesófilo. (Viret e outros, Proc Natl Acad Sci USA. 91 (18):8577-81 (1994)). Em plantas, especialmente milho, esta sequência não é muito bem conservada. Uma 3’ UTR frequentemente utilizada na engenharia genética de plantas é derivada de um gene da nopalina sintase (3' nos) (Wyatt e outros, Plant Mol Biol 22(5):731-49 (1993)).

[00011] Em certos vírus de plantas, tais como vírus mosaico da alfafa (AMV) e vírus mosaico do tabaco (TMV), suas UTRs a 3’ altamente estruturadas são essenciais para a replicação e podem ser dobra- das em um arranjo linear de estruturas de haste-laço que contêm vários sítios de ligação à proteína do revestimento com alta afinidade ou um sítio similar a tRNA reconhecido por RNA polimerases dependentes de RNA. (Olsthoorn e outros, EMBO J 1; 18(17):4856-64 (1999); Zeyenko e outros, 1994)).

[00012] Entretanto, permanece uma necessidade de identificar UTRs a 5’ e a 3’ adicionais para seu uso na regulação da expressão de ácidos nucleicos recombinantes em plantas transgênicas porque não há sequências de UTR ótimas disponíveis para cada aplicação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00013] São fornecidos métodos, vetores e construções gênicos para aumentar a expressão de uma sequência de ácido nucleico re- combinante em plantas e tecidos vegetais transgênicos. De acordo com a presente invenção, as sequências de ácido nucleico são obtidas e/ou derivadas das regiões não traduzidas a 3’ de genes que codificam proteínas ubiquitina e engenheiradas para flanquearem porções respectivas de uma região codificadora selecionada de um vetor. A construção de vetor pode ser introduzida em plantas e/ou tecidos vegetais através de procedimentos convencionais ou de direcionamento gênico, resultando na expressão intensificada da região codificadora selecionada. Em algumas modalidades, a região codificadora selecionada é um gene quimérico ou um fragmento gênico que expressa uma ou mais proteínas conhecidas por conferirem um nível de atividade inseticida a uma planta transgênica e/ou um tecido vegetal.

[00014] Em um aspecto, é fornecido uma construção de ácido nuclei- co que compreende pelo menos um gene estrutural de interesse ligado de forma funcional a um promotor heterólogo e uma ou mais sequências de controle que possuem 80% de identidade em relação a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 1-3, seus complementos e combinações das mesmas.

[00015] Em uma modalidade, o pelo menos um gene estrutural de interesse compreende um gene que confere um fenótipo não nativo em uma planta. Em outra modalidade, o pelo menos um gene estrutural de interesse compreende um gene que confere resistência a insetos ou resistência a herbicidas em uma planta. Em uma modalidade, o promotor heterólogo não compreende um promotor viral. Em outra modalidade, o promotor heterólogo não compreende um promotor de planta. Em outra modalidade, o promotor heterólogo compreende um promotor viral. Em outra modalidade, o promotor heterólogo compreende um promotor de planta.

[00016] Em uma modalidade, a uma ou mais sequências de controle possuindo 85%, 90%, 95%, 98% ou 100% de identidade em relação a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 1-3, seus complementos e combinações das mesmas. Em uma modalidade adicional, a uma ou mais sequências de controle são selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 13, seus complementos e combinações das mesmas. Em outra modalidade, a uma ou mais sequências de controle podem ser amplificadas utilizando oligonucleotídeos selecionados do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 4-15.

[00017] Em uma modalidade, a construção de ácido nucleico compreende um vetor binário para transformação mediada por Agrobacterium. Em outra modalidade, a construção de ácido nucleico é transformada estavelmente dentro de plantas transgênicas. Em uma modalidade adicional, as plantas são plantas monocotiledôneas. Em outra modalidade adicional, as plantas são plantas dicotiledôneas. Em outra modalidade, as plantas não são plantas monocotiledôneas. Em outra modalidade, as plantas não são plantas dicotiledôneas. Em uma modalidade, a construção de ácido nucleico compreende um marcador selecionável. Em uma modalidade adicional, o marcador selecionável compreende um ariloxialcanoato dioxigenase. Em uma modalidade adicional, a ariloxialcanoato dioxigenase é AAD-1 ou AAD-12.

[00018] Em outro aspecto, é fornecido um vetor que compreende a construção de ácido nucleico fornecido aqui. Em outro aspecto, é fornecida uma planta ou uma célula vegetal transformada com a construção de ácido nucleico fornecida aqui. Em uma modalidade, a planta ou as células vegetais compreendem um gene estrutural de interesse adicional acumulado com o pelo menos um gene de interesse.

[00019] Em outro aspecto, é fornecido um método para a produção de forma recombinante de um peptídeo ou uma proteína que compreende a ligação de forma funcional de um promotor heterólogo e uma ou mais sequências de controle que possuem 80% de identidade em relação a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 1-3, seus complementos e combinações das mesmas. Em outro aspecto, é fornecido um método para o aumento da expressão de um gene em uma planta ou células vegetais que compreende a ligação de forma funcional de um promotor heteró- logo e uma ou mais sequências de controle que possuem 80% de identidade em relação a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NOS: 1-3, seus complementos e combinações das mesmas.

[00020] Em uma modalidade dos métodos fornecidos, o promotor heterólogo não compreende um promotor viral. Em outra modalidade, o promotor heterólogo não compreende um promotor de planta. Em outra modalidade, o promotor heterólogo compreende um promotor viral. Em outra modalidade, o promotor heterólogo compreende um promotor de planta. Em uma modalidade dos métodos fornecidos, a uma ou mais sequências de controle possuindo 85%, 90%, 95%, 98% ou 100% de identidade em relação a uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 1-3, seus com- plementos e combinações das mesmas. Em uma modalidade adicional, a uma ou mais sequências de controle são selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 1-3, seus complementos e combinações das mesmas. Em outra modalidade, a uma ou mais sequências de controle podem ser amplificadas utilizando oligonucleotídeos selecionados do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 4-15.

[00021] Em outro aspecto, é fornecido o uso de pelo menos uma sequência de controle selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 1-3, seus complementos e combinações das mesmas, para a expressão de transgene em plantas. Em outro aspecto, é fornecido o uso de uma ou mais sequências de controle que podem ser amplificadas utilizando oligonucleotídeos selecionados do grupo que consiste das SEQ ID NOS: 4-15, para a expressão de transgene em plantas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00022] A Figura 1A mostra um exemplo de sequência de controle do 3’ UTR de Ubi1 de Zea mays da presente invenção (SEQ ID NO: 1). A Figura 1B mostra outro exemplo de sequência de controle da presente invenção ZMEXP9396.1 (SEQ ID NO: 2). A Figura 1C mostra outro exemplo de sequência de controle da presente invenção ZMEXP9707.1 (SEQ ID NO: 3).

[00023] A Figura 2A mostra mapas de plasmídeos representativos de pDAB112330 e pDAB112323. A Figura 2B mostra um mapa de plasmídeo representativo de pDAB112332.

[00024] A Figura 3 mostra um exemplo de resultados de expressão partindo de construções de ácido nucleico diferentes incluindo 3’ UTR de St PinII (pDAB112332) e 3’ UTR de Ubi1 de Zea mays (pDAB112330), bem como um controle negativo.

[00025] A Figura 4 mostra mapas de plasmídeos representativos de pDAB112357 (ZMEXP9396.1) e pDAB112354 (ZMEXP9707.1).

[00026] A Figura 5 mostra exemplos de resultados de expressão partindo de construções de ácido nucleico diferentes incluindo pDAB112357 (ZMEXP9396.1), pDAB112354 (ZMEXP9707.1) e pDAB112332 (3’ UTR de St PinII), em que todas as três construções fornecem bons níveis de expressão comparáveis. Os níveis de expressão de Cry34 são mostrados em ng/mL.

[00027] A Figura 6 mostra mapas de plasmídeos representativos de pDAB108744 e pDAB108746. A Figura 7 mostra mapas de plasmídeos representativos de pDAB112396 e pDAB112397.

[00028] A Figura 8 mostra dados de expressão em T1 representativos (folha V4) em relação à 3’ UTR de Ubi1 de Zm com construções pDAB108744 e pDAB108746. A Figura 9 mostra dados de expressão em T1 representativos (folha V12) em relação à 3’ UTR de Ubi1 de Zm com construções pDAB108744 e pDAB108746.

[00029] A Figura 10 mostra dados de expressão em T0 representativos (folha V4) em relação à 3’ UTR de milho sem ser Ubi1 com construções pDAB112396 e pDAB112397.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00030] São fornecidos composições e métodos para modificar ge-neticamente células, tecidos ou organismos utilizando regiões de UTR a 5’ e/ou a 3’ isoladas ou derivadas de um gene da ubiquitina de Zea mays. As regiões de UTR a 5’ e/ou a 3’/sequências de controle da presente invenção, quando engenheiradas para flanquearem um ácido nucleico estrutural de interesse, melhoram o término da transcrição, a estabilidade do mRNA e/ou aumentam a eficiência de tradução do gene estrutural de interesse em uma planta transgênica. Assim, a presente invenção facilitará a engenharia genética de plantas para expressarem fenótipos de valor econômico ou investigativo.

[00031] Uma ou ambas as regiões de UTR a 5’ e a 3’/sequências de controle isoladas ou derivadas de um gene da ubiquitina de Zea mays são geneticamente engenheiradas para flanquearem um gene estrutural de interesse que codifica uma proteína que é expressa de forma recombinante em uma planta, uma célula vegetal ou um tecido vegetal. A 3’ UTR de Ubi1 de milho descrita é de interesse particular para seu uso na produção de construções transgênicas que contêm genes isolados ou múltiplos.

[00032] O desenvolvimento de produtos transgênicos requer a expressão estável em longo prazo de transgenes. Os elementos reguladores tais como promotores e terminadores são necessários em combinação e configuração apropriadas para que os transgenes sejam expressos apropriadamente. Cada transgene requer um promotor exclusivo para transcrição. Em adição, uma região não traduzida a 3’ (3’ UTR) ou um terminador é necessário para o término da transcrição e poliadenilação. O término da transcrição e a poliadenilação de mRNA apropriados são importantes para a expressão estável de transgene. O término da transcrição se torna mais crítico para acúmulos multigêni- cos para evitar a leitura da transcrição no transgene a seguir. Similarmente, RNA aberrante não poliadenilado (aRNA) é um substrato para RNA polimerases dependentes de RNA (RdRPs) de plantas para converter o aRNA em RNA de fita dupla (dsRNA) levando à produção de RNA pequeno e ao silenciamento do transgene. Os terminadores de transcrição fortes, portanto, são muito úteis tanto para acúmulos de um único gene quanto de vários genes. São fornecidos 3’ UTR de Ubi1 (Ubiquitina1) de milho e seu uso para a produção de construção trans- gênica.

[00033] Os promotores e as UTRs a 3’ de plantas são dois elementos de expressão básicos necessários para construir uma expressão de transgene funcional ou uma unidade de transcrição de planta. Os promotores são necessários para controlar a transcrição enquanto que as UTRs a 3’ são necessárias para o término da transcrição e a polia- denilação do produto da transcrição. A 3’ UTR do mRNA é necessária na expressão gênica para o término e a poliadenilação do produto da transcrição do RNA. A 3’ UTR também desempenha uma função importante no processamento, na localização, na estabilidade e na tradução do mRNA.

[00034] São fornecidas a identificação e a caracterização das UTRs a 5’ e a 3’ de Ubi1 de milho como sequências de controle para a expressão de transgene em plantas. A 3’ UTR de Ubi1 fornecida aqui pode ser utilizada com outro promotor de planta ou viral para a construção de vetor e não limitado ao promotor de Ubi1 de milho.

[00035] Como utilizada aqui, a expressão "vetor" refere-se a um pedaço de DNA, tipicamente de fita dupla, que pode ter inserido dentro do mesmo um pedaço de DNA exógeno. O vetor pode ser, por exemplo, de origem plasmideal ou viral, que tipicamente codifica um marcador que pode ser selecionado ou que pode ser verificado ou transgenes. O vetor é utilizado para transportar o DNA exógeno ou heterólogo para dentro de uma célula hospedeira adequada. Uma vez na célula hospedeira, o vetor pode se replicar independentemente de ou de forma coincidente com o DNA cromossômico do hospedeiro. Alternativamente, o vetor pode direcionar a inserção do DNA exógeno ou heteró- logo para dentro de um cromossomo do hospedeiro.

[00036] Como utilizada aqui, a expressão "vetor do transgene" refere-se a um vetor que contém um segmento de DNA inserido, o "transgene" que é transcrito no mRNA ou replicado na forma de um RNA dentro de uma célula hospedeira. A expressão "transgene" refere-se não somente a tal porção do DNA inserido que é convertida em RNA, mas também àquelas porções do vetor que são necessárias para a transcrição ou a replicação do RNA. Um transgene tipicamente compreende um gene de interesse, mas não precisa necessariamente compreender uma sequência de polinucleotídeos que contém um quadro aberto de leitura capaz de produzir uma proteína.

[00037] Como utilizada aqui, a expressão "transformada" ou "transformação" refere-se à introdução de DNA em uma célula. As expressões "transformante(s)" ou "transgênica(s)" referem-se a células vegetais, plantas e similares que foram transformadas ou sofreram um procedimento de transformação. O DNA introduzido está geralmente na forma de um vetor que contém um pedaço de DNA inserido.

[00038] Como utilizada aqui, a expressão "marcador selecionável" ou "gene marcador selecionável" refere-se a um gene que é opcionalmente utilizado na transformação de plantas, por exemplo, para proteger as células vegetais de um agente seletivo ou fornecer resistên- cia/tolerância a um agente seletivo. Apenas aquelas células ou plantas que recebem um marcador selecionável funcional são capazes de se dividir ou de crescer sob condições que possuem um agente seletivo. Os exemplos de agentes seletivos podem incluir, por exemplo, antibióticos, incluindo espectinomicina, neomicina, canamicina, paromomici- na, gentamicina e higromicina. Estes marcadores selecionáveis incluem gene para neomicina fosfotransferase (npt II), que expressa uma enzima que confere resistência ao antibiótico canamicina e genes para os antibióticos relacionados neomicina, paromomicina, gentamicina e G418 ou o gene para higromicina fosfotransferase (hpt), que expressa uma enzima que confere resistência à higromicina. Outros genes marcadores selecionáveis podem incluir genes que codificam resistência a herbicidas incluindo Bar (resistência contra BASTA® (amônio glufosina- to) ou fosfinotricina (PPT)), acetolactato sintase (ALS, resistência contra inibidores tais como sulfoniluréias (SUs), imidazolinonas (IMIs), triazolopirimidinas (TPs), oxibenzoatos de pirimidinila (POBs) e sulfoni- lamino carbonil triazolinonas que previnem a primeira etapa na síntese dos aminoácidos de cadeia ramificada), glifosato, 2,4-D e resistência ou sensibilidade a metais. A expressão "positivas em relação ao marcador" refere-se a plantas que foram transformadas para incluírem o gene marcador selecionável.

[00039] Vários marcadores que podem ser selecionados ou detectados podem ser incorporados dentro do vetor de expressão escolhido para permitir a identificação e a seleção de plantas transformadas ou transformantes. Muitos métodos estão disponíveis para confirmar a expressão de marcadores de seleção em plantas transformadas, incluindo, por exemplo, sequenciamento do DNA e PCR (reação em cadeia da polimerase), Southern blotting, Northern blotting, métodos imunoló- gicos para a detecção de uma proteína expressa partindo do vetor, por exemplo, proteína precipitada que medeia resistência à fosfinotricina ou outras proteínas tais como genes repórteres β-glicuronidase (GUS), luciferase, proteína fluorescente verde (GFP), DsRed, β-galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), fosfatase alcalina e similares (Ver Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001, cujo conteúdo é incorporado aqui como referência em sua totalidade).

[00040] Os genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados. Os genes marcadores selecionáveis incluem genes que codificam resistência a antibióticos, tais como aqueles que codificam neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT) bem como genes que conferem resistência a compostos herbicidas. Os genes de resistência a herbicidas geralmente codificam uma proteína alvo modificada insensível ao herbicida ou uma enzima que degrada ou desintoxica o herbicida na planta antes que este possa atuar. Ver DeBlock e outros (1987) EMBO J., 6:2513-2518; DeBlock e outros (1989) Plant Physiol., 91:691-704; Fromm e outros (1990) 8:833-839; Gordon-Kamm e outros (1990) 2:603-618). Por exemplo, a resistência aos herbicidas glifosato ou sul- fonilureia foi obtida através da utilização de genes que codificam as enzimas alvos mutantes, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) e acetolactato sintase (ALS). A resistência a amônio glufosi- nato, bromoxinil e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) foi obtida através da utilização de genes bacterianos que codificam fosfinotricina acetiltrans- ferase, uma nitrilase ou uma 2,4-diclorofenoxiacetato monooxigenase, que desintoxicam os respectivos herbicidas. Enzimas/genes para resistência ao 2,4-D foram previamente divulgados na US 2009/0093366 e na WO 2007/053482, cujos conteúdos são incorporados aqui como referência em suas totalidades.

[00041] Outros herbicidas podem inibir o ponto de crescimento ou meristema, incluindo imidazolinona ou sulfonilureia. Os exemplos de genes nesta categoria codificam ALS mutante e a enzima AHAS como descrito, por exemplo, por Lee e outros, EMBO J. 7:1241 (1988); e Mi- ki e outros, Theon. Appl. Genet. 80:449 (1990), respectivamente.

[00042] Os genes de resistência ao glifosato incluem genes de 5- enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPs) mutantes (através da in-trodução de ácidos nucleicos recombinantes e/ou várias formas de mu- tagênese in vivo de genes EPSPs nativos), genes aroA e genes de gli- fosato acetil transferase (GAT), respectivamente). Os genes de resistência para outros compostos de fosfono incluem glufosinato (genes da fosfinotricina acetil transferase (PAT) de espécies de Streptomyces, in-cluindo Streptomyces hygroscopicus e Streptomyces viridichromoge- nes) e ácidos piridinóxi ou fenóxi propriônicos e ciclohexonas (genes que codificam inibidor de ACCase), Ver, por exemplo, a Pat. U.S. No. 4.940.835 a Shah e outros e a Pat. U.S. No. 6.248.876 a Barry e outros, que divulgam sequências de nucleotídeos de formas de EPSPs que podem conferir resistência ao glifosato a uma planta. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtida sob o número de acesso da ATCC 39256 e a sequência de nucleotídeos do gene mutante é divulgada na Pat. U.S. No. 4.769.061 a Comai, Pedido de Patente Europeia No. 0 333 033 a Kumada e outros e Pat. U.S. No. 4.975.374 a Goodman e outros, que divulgam sequências de nucleotídeos de genes da glutamina sintetase que conferem resistência a herbicidas tal como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeos de um gene PAT é fornecida no Pedido de Patente Europeia No. 0 242 246 a Leemans e outros. Ainda DeGreef e outros, Bio/Technology 7:61 (1989), descrevem a produção de plantas transgênicas que expressam genes bar quiméricos que codificam a atividade de PAT. Os exemplos de genes que conferem resistência aos ácidos fenóxi propriônicos e às ciclohexonas, incluindo setoxidim e haloxifop, são os genes Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1- S3 descritos por Marshall e outros, Theon. Appl. Genet. 83:435 (1992). Os genes GAT capazes de conferir resistência ao glifosato são descritos na WO 2005012515 a Castle e outros. Os genes que conferem resistência aos herbicidas 2,4-D, fop e piridilóxi auxina são descritos na WO 2005107437 e no Pedido de Patente U.S. No. de Série 11/587.893.

[00043] Outros herbicidas podem inibir a fotossíntese, incluindo triazina (genes psbA e 1s+) ou benzonitrila (gene da nitrilase). Przibila e outros, Plant Cell 3:169 (1991), descrevem a transformação de Chlamydomonas com plasmídeos que codificam genes psbA mutan- tes. As sequências de nucleotídeos para genes da nitrilase são divulgadas na Pat. U.S. No. 4.810.648 a Stalker e moléculas de DNA que contêm estes genes estão disponíveis sob os Nos. de Acesso da ATCC 53435, 67441 e 67442. A clonagem e a expressão do DNA que codifica uma glutationa S-transferase são descritas por Hayes e outros, Biochem. J. 285:173 (1992).

[00044] Para as finalidades da presente invenção, os genes marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a genes que codificam: neomicina fosfotransferase II (Fraley e outros (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science, 4:1-25); cianamida hidratase (Maier- Greiner e outros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4250-4264); aspartato quinase; dihidrodipicolinato sintase (Perl e outros (1993) Bio/Technology, 11:715-718); triptofano descarboxilase (Goddijn e outros (1993) Plant Mol. Bio., 22:907-912); dihidrodipicolinato sintase e aspartato quinase dessensibilizada (Perl e outros (1993) Bio/Technology, 11:715-718); gene bar (Toki e outros (1992) Plant Physiol., 100:1503-1507 e Meagher e outros (1996) e Crop Sci., 36:1367); triptofano descarboxilase (Goddijn e outros (1993) Plant Mol. Biol., 22:907-912); neomicina fosfotransferase (NEO) (Southern e outros (1982) J. Mol. Appl. Gen., 1:327; higromicina fosfotransferase (HPT ou HYG) (Shimizu e outros (1986) Mol. Cell Biol., 6:1074); dihi- drofolato redutase (DHFR) (Kwok e outros (1986) PNAS USA 4552); fosfinotricina acetiltransferase (DeBlock e outros (1987) EMBO J., 6:2513); ácido 2,2-dicloropropiônico desalogenase (Buchanan- Wollatron e outros (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330); ácido acetohi- dróxi sintase (Anderson e outros, Pat. U.S. No. 4.761.373; Haughn e outros (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266); 5-enolpiruvil-shikimato- fosfato sintase (aroA) (Comai e outros (1985) Nature 317:741); haloari- lnitrilase (Stalker e outros, pedido de patente PCT publicado WO87/04181); acetil-coenzima A carboxilase (Parker e outros (1990) Plant Physiol. 92:1220); dihidropteroato sintase (sul I) (Guerineau e outros (1990) Plant Mol. Biol. 15:127); e polipeptídeo do fotossistema II de 32 kD (psbA) (Hirschberg e outros (1983) Science, 222:1346).

[00045] Também são incluídos genes que codificam resistência a: cloranfenicol (Herrera-Estrella e outros (1983) EMBO J., 2:987-992); metotrexato (Herrera-Estrella e outros (1983) Nature, 303:209-213; Meijer e outros (1991) Plant Mol Bio., 16:807-820 (1991); higromicina (Waldron e outros (1985) Plant Mol. Biol., 5:103-108; Zhijian e outros (1995) Plant Science, 108:219-227 e Meijer e outros (1991) Plant Mol. Bio. 16:807-820); estreptomicina (Jones e outros (1987) Mol. Gen. Genet., 210:86-91); espectinomicina (Bretagne-Sagnard e outros (1996) Transgenic Res., 5:131-137); bleomicina (Hille e outros (1986) Plant Mol. Biol., 7:171-176); sulfonamida (Guerineau e outros (1990) Plant Mol. Bio., 15:127-136); bromoxinil (Stalker e outros (1988) Science, 242:419-423); 2,4-D (Streber e outros (1989) Bio/Technology, 7:811816); glifosato (Shaw e outros (1986) Science, 233:478-481); e fosfino- tricina (DeBlock e outros (1987) EMBO J., 6:2513-2518). Todas as referências citadas na divulgação são incorporadas aqui como referência em suas totalidades a não ser que seja citado o contrário.

[00046] Não é pretendido que a lista anterior de genes marcadores selecionáveis e repórteres seja limitante. Qualquer gene repórter ou marcador selecionável é abrangido pela presente invenção. Se necessário, tais genes podem ser sequenciados através de métodos conhecidos na técnica.

[00047] Os genes repórteres e marcadores selecionáveis são sintetizados para expressão ótima na planta. Ou seja, a sequência codificadora do gene foi modificada para aumentar a expressão em plantas. O gene marcador sintético é planejado para ser expresso em plantas em um nível mais alto resultando em eficiência de transformação mais alta. Os métodos para a otimização sintética de genes estão disponíveis na técnica. Na verdade, vários genes foram otimizados para aumentar a expressão do produto gênico em plantas.

[00048] A sequência do gene marcador pode ser otimizada para a expressão em uma espécie de planta particular ou alternativamente pode ser modificada para expressão ótima em famílias de plantas. Os códons preferidos pelas plantas podem ser determinados partindo dos códons de frequência mais alta nas proteínas expressas na quantidade maior na espécie de planta particular de interesse. Ver, por exemplo, EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak e outros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3324-3328; e Murray e outros (1989) Nucleic Acids Research, 17: 477-498; Pat. U.S. No. 5.380.831; e Pat. U.S. No. 5.436.391, incorporados aqui como referência. Desta maneira, as sequências de nucleotídeos podem ser otimizadas para a expressão em qualquer planta. É reconhecido que toda ou qualquer parte da sequência gênica possa ser otimizada ou sintética. Ou seja, sequências completamente otimizadas ou parcialmente otimizadas também podem ser utilizadas.

[00049] Em adição, várias estratégias de transformação que utilizam o sistema de transformação mediado por Agrobacterium foram desenvolvidas. Por exemplo, a estratégia de vetor binário se baseia em um sistema de dois plasmídeos em que o T-DNA está em um plasmídeo diferente do resto do plasmídeo Ti. Em uma estratégia de cointegração, uma pequena porção do T-DNA é colocada no mesmo vetor que o gene exógeno, cujo vetor subsequentemente se recombina com o plasmídeo Ti.

[00050] Como utilizada aqui, a expressão "explante" refere-se a uma seção removida de tecido ou órgão vivo partindo de um ou mais tecidos ou órgãos de um indivíduo.

[00051] Como utilizada aqui, a expressão "planta" inclui plantas di- cotiledôneas e plantas monocotiledôneas. Os exemplos de plantas di- cotiledôneas incluem tabaco, Arabidopsis, soja, tomate, papaia, canola, girassol, algodão, alfafa, batata, videira, guandu, ervilha, Brassica, grão-de-bico, beterraba de açúcar, semente de colza, melancia, melão, pimenta, amendoim, jerimu, rabanete, espinafre, abóbora, bróco- lis, repolho, cenoura, couve-flor, aipo, acelga, pepino, berinjela e alface. Os exemplos de plantas monocotiledôneas incluem milho, arroz, trigo, cana de açúcar, cevada, centeio, sorgo, orquídeas, bambu, banana, tifas, lírios, aveia, cebola, painço e triticale.

[00052] Como utilizada aqui, a expressão "construção gênica quimérica" refere-se a um ácido nucleico recombinante que compreende genes ou porções dos mesmos provenientes de mais de um organismo.

[00053] Como utilizada aqui, a expressão "deleção" refere-se a uma modificação na sequência de aminoácidos ou de nucleotídeos em que um ou mais resíduos de aminoácidos ou de nucleotídeos, respectivamente, estão ausentes.

[00054] A(s) UTR(s) de Ubi1 a 5’ e/ou a 3’ da presente invenção pode(m) estar "ligada(s) de forma funcional" a uma sequência de ácido nucleico estrutural de interesse se estes elementos estiverem situados em relação a um outro de forma que a(s) UTR(s) de Ubi1 a 5’ e/ou a 3’ pode(m) influenciar na estabilidade do mRNA, na eficiência de tradução de produtos da transcrição da sequência de ácido nucleico estrutural de interesse.

[00055] Como utilizada aqui, a expressão "gene heterólogo" refere- se a um gene que codifica uma proteína, um polipeptídeo, um RNA ou uma porção de qualquer um dos mesmos, cuja sequência de aminoáci- dos exata não é normalmente encontrada na célula hospedeira, mas é introduzida através de técnicas de transferência gênica padronizadas.

[00056] Como utilizado aqui, as expressões "identidade" e "similaridade" referem-se às relações entre duas sequências polipeptídicas ou duas sequências de polinucleotídeos, como é determinado através da comparação das sequências. Na técnica, a identidade também significa o grau de relação de sequência entre duas sequências de polipep- tídeos ou duas sequências de polinucleotídeos que é determinado pela combinação entre duas fileiras de tais sequências. Tanto a identidade quanto a similaridade podem ser facilmente calculadas (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press. New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M. e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York (1991)). Os métodos comumente empregados para determinar a identidade ou a similaridade entre duas sequências incluem, mas não estão limitados àqueles divulgados em Carillo, H. e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Os métodos conhecidos para determinar a identidade são planejados para fornecer a maior combinação entre as duas sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade e a similaridade são codificados em programas de computador. Os métodos de programas de computador típicos para determinar a identidade e a similaridade entre duas sequências incluem: o pacote de programa GCG (Devereux, J. e outros, Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA e TFASTA (Atschul, S. F. e outros, J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)).

[00057] Como utilizada aqui, a expressão "inserção" ou "adição" refere-se a uma modificação em uma sequência de aminoácidos ou de nucleotídeos que resulta na adição de um ou mais resíduos de amino- ácidos ou de nucleotídeos, respectivamente, quando comparada à molécula que ocorre naturalmente.

[00058] Como utilizada aqui, a expressão "expressão modificada" refere-se à expressão em uma planta transgênica que é geneticamente engenheirada para ter uma ou ambas as UTRs de Ubi1 a 5’ e/ou a 3’ da presente invenção flanqueando as respectivas regiões de um gene heterólogo estrutural de interesse em que os níveis de mRNA, os níveis de proteínas ou a atividade específica à enzima do gene estrutural de interesse foi alterada em relação a 1) uma versão nativa da planta ou 2) uma planta transgênica que carrega o gene estrutural de interesse, mas não incluindo a uma ou ambas as UTRs de Ubi1 a 5’ e a 3’ como região(ões) flanqueadora(s) do mesmo.

[00059] Como utilizada aqui, a expressão "fenótipo não nativo" refere-se a uma característica que ocorre ou é influenciada pela expressão do DNA recombinante em uma planta.

[00060] Como utilizada aqui, a expressão "ácido nucleico recombi- nante" refere-se ao ácido nucleico que foi derivado ou isolado partindo de qualquer fonte, que pode ser subsequentemente quimicamente alterado e posteriormente introduzido em uma planta transgênica. Um exemplo de ácido nucleico recombinante "derivado" de uma fonte, seria uma sequência de DNA ou de RNA que é identificada como um fragmento útil dentro de certo organismo e que é então quimicamente sintetizada na forma essencialmente pura. Um exemplo de tal DNA "isolado" de uma fonte seria uma sequência de DNA útil que é cortada ou removida da dita fonte através de meios químicos, por exemplo, através do uso de endonucleases de restrição, de forma que este possa ser adicionalmente manipulado, por exemplo, amplificado, para uso na invenção, através da metodologia de engenharia genética.

[00061] Como utilizada aqui, a expressão "sequência de ácido nu- cleico estrutural de interesse" refere-se a uma sequência de DNA, RNA ou nucleotídeos sintéticos que codificam uma proteína. O termo "ácido nucleico estrutural de interesse" pode ser utilizado de forma in- tercambiável aqui com o termo "gene estrutural de interesse".

[00062] Como utilizada aqui, a expressão "planta transgênica" refere-se a uma planta que contém uma sequência de nucleotídeos exógena inserida em seu genoma nuclear ou seu genoma organelar.

[00063] Para modificar a(s) presente(s) sequência(s) de UTR a 5’ e/ou a 3’ de acordo com os ensinamentos desta invenção, os exemplos de técnicas incluem aquelas para mutagênese direcionada ao sítio mediada por polinucleotídeos bem como técnicas bem conhecidas para o uso de enzimas de restrição, amplificação através de PCR e ligase para modificar e/ou ligar moléculas de ácido nucleico existentes. (Ver, por exemplo, Zoller e outros, DNA, 3:479-488 (1984); Higuchi e outros, Nucl. Acids Res., 16:7351-7367 (1988); Ho e outros, Gene, 77:51-59 (1989); Horton e outros, Gene, 77:61 (1989); PCR Techno logy: Principles and Applications for DNA Amplification, (ed.) Erlich (1989); e Pat. U.S. No. 6.271.360 a Metz e outros, Single-stranded oli-godeoxynucleotide mutational vectors (publicado em 7 de agosto de 2001)). Em uma modalidade preferida da invenção, uma ou mais estruturas de haste laço são adicionadas para fornecer proteção adicional contra a degradação do mRNA. Em um aspecto desta modalidade, as estruturas de haste laço adicionais são derivadas através da amplificação pela PCR. Em uma modalidade adicional da invenção, uma ou mais estruturas de haste laço existentes são deletadas, por exemplo, através do uso de enzimas de restrição específicas ao sítio conhecidas pelos peritos na técnica.

[00064] Em algumas modalidades, a(s) UTR(s) de Ubi1 a 5’ e/ou a 3’ da presente invenção é(são) utilizada(s) em associação a uma outra em relação ao flanqueamento das regiões apropriadas de um ou mais genes estruturais de interesse. A presente invenção, entretanto, não é limitada dessa forma. Uma ou ambas as UTRs de Ubi1 a 5’ ou a 3’ da presente invenção podem assim ser utilizadas, por exemplo, em associação a uma UTR nativa ao(s) gene(s) estrutural(is) de interesse, he- teróloga(s) ao(s) gene(s) estrutural(is) de interesse e o gene Ubi1 ou em adição a tal UTR nativa ou heteróloga.

[00065] A(s) UTR(s) de Ubi1 a 5’ e/ou a 3’ para uso na presente invenção pode(m) ser isolada(s) através de técnicas de hibridização de ácidos nucleicos conhecidas na técnica utilizando, por exemplo, as sequências de nucleotídeos divulgadas aqui ou porções das mesmas como sondas de hibridização. Tais sondas podem consistir no gene Ubi1 inteiro ou porções do mesmo, incluindo as UTRs a 5’ e a 3’ identificadas aqui. A(s) presente(s) UTR(s) de Ubi1 a 5’ e/ou a 3’ pode(m) também ser sinté- tica(s) e obtida(s) utilizando as sequências descritas anteriormente e as técnicas de síntese de ácidos nucleicos conhecidas na técnica.

[00066] A sequência de ácido nucleico estrutural de interesse está ligada de forma operacional às sequências de controle de UTR a 5’ e/ou a 3’ isoladas ou derivadas de um gene Ubi1 através de técnicas de clonagem conhecidas. A sequência de ácido nucleico estrutural de interesse pode ser heteróloga ou homóloga aos genes nativamente presentes na planta, célula(s) vegetal(is) ou tecido vegetal receptor. Em qualquer caso, a(s) UTR(s) de Ubi1 a 5’ e/ou a 3’ da presente invenção é(são) útil(úteis) para a regulação da eficiência de tradução de uma sequência de ácido nucleico de interesse de forma a: aumentar a meia-vida do mRNA transcrito; e/ou expressar a proteína codificada pela sequência de ácido nucleico estrutural de interesse em maior abundância no tecido vegetal do que seria expressa sem o uso da(s) UTR(s) de Ubi1 a 5’ e/ou a 3’ da presente invenção. É ainda especificamente considerado aqui que a presente invenção é utilizada em uma construção gênica engenheirado de forma que a proteína codificada pela sequência de ácido nucleico estrutural de interesse seja expressa apenas em certo tecido preferido de uma planta, tal como as raízes, as folhas ou os caules e não na semente.

[00067] A presente invenção é geralmente aplicável à expressão de genes estruturais de interesse tanto em plantas monocotiledôneas quanto dicotiledôneas. Esta invenção é assim adequada para qualquer membro da família de plantas monocotiledôneas (monocot) incluindo, mas não limitadas a milho, arroz, cevada, aveias, trigo, sorgo, centeio, cana de açúcar, abacaxi, inhames, cebola, banana, coco e tâmaras. Uma aplicação preferida da presente invenção está na produção de plantas de milho transgênicas. As espécies de dicotiledôneas (dicot) para uso com a presente invenção incluem, mas não estão limitadas a tabaco, tomate, girassol, algodão, beterraba de açúcar, batata, alface, melão, soja e canola (semente de colza).

[00068] A sequência de ácido nucleico estrutural de interesse utili zada nas construções da presente invenção pode ser qualquer se- quência de ácido nucleico que forneça ou melhore uma característica benéfica de uma planta transgênica resultante. As sequências de ácido nucleico particularmente úteis são aquelas que codificam proteínas ou produtos da transcrição de RNA antissenso com a finalidade de promover maiores valores nutricionais, maiores rendimentos, tolerância a herbicidas, insetos ou doenças e similares. Mais preferencialmente, as sequências de ácido nucleico serão genes úteis que são inerentemente instáveis devido ao seu tamanho relativamente grande (pelo menos 4-5 kb de comprimento), que é conhecido por tornar os genes mais suscetíveis à degradação física, química ou enzimática. Os genes inerentemente instáveis devido ao seu tamanho incluem genes inseticidas de Xenorhabdus (ver a Pat. U.S. No. 6.048.838) e Pho- torabdus (por exemplo, Toxina A).

[00069] Em uma modalidade preferida da presente invenção, um ou mais ácidos nucleicos estruturais de interesse são flanqueados por uma ou mais UTRs de Ubi1/sequências de controle da presente invenção que foram "acumuladas" em relação uma às outras em uma variedade de planta de cultivo particular. Pelo uso da expressão "acumulado" ou "acúmulo", entende-se aqui que vários genes estruturais de interesse, cada gene estrutural de interesse preferencialmente conferindo uma característica desejável comercialmente, foram introduzidos de forma transgênica em uma única variedade de planta de cultivo (in- tracruzada ou híbrida). Por exemplo, um híbrido de milho com genes acumulados poderia conter genes para a resistência a insetos (por exemplo, genes Cry1F B.t.) bem como genes de resistência a herbicidas (por exemplo, genes de resistência ao glifosato).

[00070] Em algumas modalidades, uma ou mais da(s) UTR(s) de Ubi1/sequência(s) de controle da presente invenção são ligadas de forma funcional a um gene da Toxina A de Photorabdus, que é então acumulado com um ou mais genes de resistência a inseticidas e/ou a herbicidas em uma única variedade de planta de cultivo. Em algumas modalidades, o(s) gene(s) para inseticida(s) será(ão) de um Bacillus thuringiensis ou Xenorhabdus spp. e o(s) gene(s) para herbicida(s) se- rá(ão) um ou mais de um gene de resistência a glufosinato, glifosato, imidazolinona ou 2.4-D ou sulfonil ureia. Evidentemente, qualquer um dos genes para inseticida ou para herbicida "acumulados" pode ser ligado de forma funcional às UTRs de Ubi1 da presente invenção.

[00071] A sequência de ácido nucleico estrutural de interesse pode ser derivada totalmente ou em parte de um genoma ou um epissoma bacteriano, DNA genômico eucariótico, mitocondrial ou plastideal, cDNA, ácido nucleico viral ou ácido nucleico quimicamente sintetizado. É considerado que a sequência de ácido nucleico estrutural de interesse pode conter uma ou mais modificações na região codificadora que poderia afetar a atividade biológica ou na estrutura química do produto de expressão, na taxa de expressão ou na maneira de controle da expressão. Tais modificações incluem, mas não estão limitadas a mutações, inserções, deleções, rearranjos e substituições de um ou mais nucleotídeos. A sequência de ácido nucleico estrutural de interesse pode constituir uma sequência codificadora ininterrupta ou pode incluir um ou mais íntrons, ligados pelas junções de processamento funcionais da planta apropriadas. A sequência de ácido nucleico estrutural de interesse pode ser uma combinação de segmentos derivados de um grande número de fontes, que ocorrem naturalmente ou sintéticas. A sequência de ácido nucleico estrutural de interesse também pode codificar uma proteína de fusão, contanto que as manipulações experimentais mantenham a funcionalidade na junção das sequências codificadoras.

[00072] Na realização da presente invenção, técnicas de clonagem são empregadas de forma a se obter um vetor contendo a(s) UTR(s) de Ubi1 a 5’ e/ou a 3’ que flanqueia(m) o gene estrutural de interesse para a introdução subsequente nas células hospedeiras desejadas. A(s) UTR(s) de Ubi1 a 5’ e/ou a 3’, a sequência de ácido nucleico estrutural de interesse e quaisquer promotores, intensificadores, marcadores selecionáveis desejados etc. podem assim ser isolados e clona- dos em vetores utilizando procedimentos de clonagem padronizados na técnica, tais como aqueles descritos por J. Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2a ed., 1989) e Ausubel, F. M. e outros (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. dos quais ambos são incorporados aqui como referência.

[00073] Uma ampla variedade de vetores de clonagem está disponível ou pode ser preparada, em que o vetor de clonagem inclui uma construção gênica funcional em uma espécie de planta desejada. Os vetores ilustrativos incluem, por exemplo, pBR322, a série de pUC, pACYC184, a série de Bluescript (Stratagene) e similares. Tais vetores estão assim disponíveis comercialmente ou podem ser facilmente preparados para a transformação de células vegetais. Em geral, os vetores plasmideais ou virais conterão sequências de ácido nucleico necessárias tanto para a manutenção quanto para a expressão de uma sequência de DNA heteróloga em certo hospedeiro. A seleção de elementos apropriados para otimizar a expressão em qualquer espécie particular é uma questão de perícia comum na técnica utilizando os ensinamentos desta divulgação. Os componentes de DNA, os genes marcadores selecionáveis, os genes repórteres, os intensificadores, os íntrons adequados e similares são descritos por K. Weising e outros, Ann. Rev. Genetics, 22, 421 (1988).

[00074] Tipicamente, a sequência de ácido nucleico estrutural de interesse e a(s) UTR(s) de Ubi1 a 5’ e/ou a 3’ são inseridas em um vetor de clonagem apropriado no(s) sítio(s) de restrição apropriado(s) de forma que o gene estrutural de interesse esteja ligado de forma operacional a um promotor desejado e a(s) UTR(s) de Ubi1 a 5’ e/ou a 3’ esteja(m) ligada(s) de forma funcional à sequência de ácido nucleico estrutural de interesse. Na preparação das construções gênicas desta invenção, os vários fragmentos de ácido nucleico podem ser manipulados, de forma a fornecer as sequências de ácido nucleico na orientação apropriada e, quando apropriado, no quadro de leitura apropriado. Evidentemente, adaptadores ou ligantes podem ser empregados para a ligação de fragmentos de ácido nucleico ou outras manipulações podem ser envolvidas para fornecer sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição ou similar.

[00075] A expressão de genes estruturais empregados na presente invenção pode ser controlada por qualquer número de promotores. Embora o promotor endógeno de um gene estrutural de interesse possa ser utilizado aqui para a regulação da transcrição do gene, em algumas modalidades, o promotor é uma sequência reguladora exógena. Para vetores de expressão de planta, os promotores virais adequados incluem o promotor do Vírus Mosaico do Veio da Mandioca (Verdaguer e outros, Plant Mol. Biol. 31(6):1129-39 (1996); promotores de RNA de 35S e de RNA de 19S do Vírus Mosaico da Couve-Flor (CaMV) (Brisson e outros, Nature 310:511 (1984); Odell e outros, Nature, 313:810 (1985); o promotor de CaMV35S aprimorado e duplamente aprimorado (Kay e outros, Science 236:1299-1302 (1987); o promotor do produto da transcrição de comprimento completo do Vírus Mosaico da Escrofulária (FMV) (Gowda e outros, J. Cell Biochem., 13D: 301, 1989) e o promotor da proteína de revestimento de TMV (Takamatsu e outros, EMBO J. 6:307, 1987). Outros promotores úteis incluem o promotor que pode ser induzido pela luz da ribulose 1,5- bisfosfato carboxilase oxigenasse de subunidade pequena (ssRUBIS- CO) (Coruzzi e outros, EMBO J., 3:1671 (1984); Broglie e outros, Science 224:838 (1984); promotor da actina do arroz (McElroy e outros, Plant Cell. 2(2):163-71 (1990); e promotor de Adh1 (Dennis e outros, Nucleic Acids Res. 12(9):3983-4000 (1984)); promotor da manopina sintase (Velten e outros, EMBO J., 3:2723, 1984); promotores da no- palina sintase (NOS) e da octopina sintase (OCS) (carregados nos plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens) ou promotores de choque térmico, por exemplo, hsp17.5-E ou hsp17.3-B da soja (Gurley e outros, Mol. Cell. Biol. 6:559 (1986); Severin e outros, Plant Mol. Biol. 15:827, (1990)).

[00076] A análise das etapas de clonagem pode ser tipicamente conduzida e pode envolver análise de sequências, análise de restrição, eletroforese ou similar. Após cada manipulação, a sequência de DNA que será utilizada na construção final pode ser submetida à restrição e ligada à sequência seguinte, em que cada uma das construções parciais pode ser clonada no mesmo ou em plasmídeos diferentes.

[00077] Uma vez que as etapas de clonagem foram completadas, existem várias técnicas que permitem a introdução, a regeneração de plantas, a integração estável e a expressão de vetores recombinantes exógenos que contêm genes heterólogos de interesse nas células vegetais. Uma tal técnica envolve a aceleração de micropartículas revestidas com material genético diretamente para dentro de células vegetais (Pat. U.S. No. 4.945.050 a Cornell; Pat. U.S. No. 5.141.131 a Do- wElanco; e Pat. U.S. Nos. 5.538.877 e 5.538.880, ambas a Dekalb). Esta técnica é comumente referida como "bombardeio de micropartícu- las" ou "biolística". As plantas também podem ser transformadas utilizando tecnologia de Agrobacterium (Pat. U.S. No. 5.177.010 a University of Toledo, Pat. U.S. No. 5.104.310 a Texas A&M, Pedido de Patente Europeia 0131624B1, Pedidos de Patentes Europeias 120516, 159418B1 e 176.112 a Schilperoot, Pat. U.S. Nos. 5.149.645, 5.469.976, 5.464.763 e 4.940.838 e 4.693.976 a Schilperoot, Pedidos de Patentes Europeias 116718, 290799, 320500 todas a Max Planck, Pedidos de Patentes Europeias 604662, 627752 e Pat. U.S. No. 5.591.616 a Japan Tobacco, Pedidos de Patentes Europeias 0267159 e 0292435 e Pat. U.S. No. 5.231.019 todos a Ciba-Geigy, Pat. U.S. Nos. 5.463.174 e 4.762.785 ambas a Calgene e Pat. U.S. Nos. 5.004.863 e 5.159.135 ambas a Agracetus). Outro método de transformação envolve o uso de microfibras similares a agulhas alongadas ou "whiskers" para transformar culturas de suspensão de células de milho (Pat. U.S. Nos. 5.302.523 e 5.464.765 ambas a Zeneca). Em adição, a tecnologia de eletroporação foi utilizada para transformar células vegetais partindo das quais plantas férteis foram obtidas (WO 87/06614 a Boyce Thompson Institute; Pat. U.S. Nos. 5.472.869 e 5.384.253 ambas a Dekalb; Pat. U.S. Nos. 5.679.558, 5.641.664, WO9209696 e WO9321335 a Plant Genetic Systems).

[00078] Ainda técnicas adicionais para a transformação de células vegetais incluem: mecanismos de captação direta de DNA (ver Mandel e Higa, J. Mol. Biol., 53:159-162 (1972); Dityatkin e outros, Biochimica et Biophysica Acta, 281:319-323 (1972); Wigler e outros, Cell, 16:77 (1979); e Uchimiya e outros, Em: Proc. 5th Intl. Cong. Plant Tissue and Cell Culture, A. Fujiwara (ed.), Jap. Assoc. for Plant Tissue Culture, Tóquio, pp. 507-508 (1982)); mecanismos de fusão (ver Uchidaz e outros, Em: Introduction of Macromolecules Into Viable Mammalian Cells, Baserga e outros (eds.) Wistar Symposium Series, 1:169-185 (1980)); recombinação específica ao sítio (ver WO/9109957) e vários agentes infecciosos (ver Fraley e outros, CRC Crit Rev. Plant Sci., 4: 1-46 (1986); e Anderson, Science, 226:401-409 (1984)).

[00079] O procedimento apropriado para transformar uma célula vegetal selecionada pode ser escolhido de acordo com a célula vegetal utilizada. Com base na experiência até agora, parece haver pouca diferença na expressão de genes, uma vez inseridos dentro das células, que pode ser atribuída ao próprio método de transformação. Particularmente, a atividade do gene exógeno inserido nas células vegetais é dependente da influência do DNA vegetal endógeno adjacente ao inserto. Geralmente, a inserção de genes heterólogos parece ser aleatória utilizando qualquer técnica de transformação; entretanto, existe atualmente tecnologia para a produção de plantas com recombinação específica ao sítio de DNA dentro das células vegetais (ver WO91/09957).

[00080] Os métodos particulares utilizados para transformar tais células vegetais não são críticos a esta invenção, assim como não são as etapas subsequentes, tal como a regeneração de tais células vegetais, quando necessário. Qualquer método ou combinação de métodos que resulta na expressão da sequência ou das sequências desejadas sob o controle regulador de uma ou mais das presentes UTRs de Ubi1 a 5’ e/ou a 3’ é aceitável.

[00081] Uma vez introduzido no tecido vegetal, a expressão do gene estrutural pode ser analisada em um sistema de expressão transitória ou pode ser determinada após a seleção em relação à integração estável dentro do genoma da planta.

[00082] Qualquer número de sistemas de seleção pode ser utilizado para recuperar linhagens de células transformadas. Estes incluem, mas não estão limitados aos genes da timidina quinase (Wigler e outros, Cell 11:223 (1977)) e da adenina fosforibosiltransferase (Lowy e outros, Cell 22:817 (1980)) do vírus herpes simplex que podem ser empregados em células tk- ou aprt-, respectivamente. Ainda, resistência a antimetabólitos, antibióticos ou herbicidas pode ser utilizada como a base para seleção; por exemplo, dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., 77:3567 (1980)); npt, que confere resistência aos aminoglicosídeos neomicina e G-418 (Colbere-Garapin e outros, J. Mol. Biol., 150:1)(1981)); e ALS (Pat. U.S. No. 5.378.824 a Bedbrook) ou PAT (Wehrmann e outros, Nat Bio- technol 14(10):1274-8 (1996)), que confere resistência a clorsulfurona e fosfinotricina acetiltransferase, respectivamente. Foram descritos genes que podem ser selecionados adicionais, por exemplo, trpB, que permite que as células utilizem indol no lugar de triptofano ou hisD, que permite que as células utilizem histinol no lugar de histidina (Hartman e Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8047 (1988)). Mais recentemente, o uso de marcadores visíveis ganhou popularidade com tais marcadores como GFP, antocianinas, α-glicuronidase e seu substrato GUS, luciferase e seu substrato luciferina, que são amplamente utilizados não somente para identificar transformantes, mas também para quantificar a quantidade de expressão de proteína transitória ou estável que pode ser atribuída a um sistema de vetor específico (Rhodes e outros, Methods Mol. Biol., 55:121 (1995)).

[00083] Embora a presença/ausência de expressão do gene marcador sugira que o gene de interesse também esteja presente, sua presença e expressão podem precisar ser confirmadas. Por exemplo, se a sequência que codifica um polipeptídeo for inserida dentro de uma sequência do gene marcador, as células recombinantes que contêm as sequências que codificam o polipeptídeo podem ser identificadas pela ausência da função do gene marcador. Alternativamente, um gene marcador pode ser colocado em tandem com uma sequência que codifica o polipeptídeo sob o controle de um único promotor. A expressão do gene marcador em resposta à indução ou à seleção geralmente também indica a expressão do gene em tandem.

[00084] Alternativamente, as células hospedeiras que contêm a sequência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de interesse (por exemplo, um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico da presente invenção) e expressam o polipeptídeo podem ser identificadas por uma variedade de procedimentos conhecidos pelos peritos na técnica. Estes procedimentos incluem, mas não estão limitados a hibridizações de DNA-DNA ou DNA-RNA e ensaio biológico de proteínas ou técnicas de ensaio imunológico que incluem tecnologias baseadas em membrana, solução ou chip para a detecção e/ou para a quantificação de ácido nucleico ou proteína.

[00085] A presença de sequências de polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo de interesse (por exemplo, um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico da presente invenção) pode ser detectada por hibridização de DNA-DNA ou DNA-RNA ou amplificação utilizando sondas ou porções ou fragmentos de polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo. Os ensaios baseados na amplificação de ácidos nucleicos envolvem o uso de oligonucleotídeos ou oligômeros baseados nas sequências que codificam o polipeptídeo para detectar trans- formantes que contêm DNA ou RNA que codifica o polipeptídeo. Como utilizado aqui "oligonucleotídeos" ou "oligômeros" referem-se a uma sequência de ácido nucleico de pelo menos aproximadamente 10 nu- cleotídeos e tanto quanto aproximadamente 60 nucleotídeos, preferencialmente aproximadamente 15 até 30 nucleotídeos e mais preferencialmente aproximadamente 20-25 nucleotídeos, que pode ser utilizada como uma sonda ou um amplímero.

[00086] Uma variedade de protocolos para a detecção e para a medida da expressão de um polipeptídeo (por exemplo, um polipeptídeo codificado por um ácido nucleico da presente invenção), utilizando anticorpos policlonais ou monoclonais específicos para a proteína é conhecida na técnica. Os exemplos incluem ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e separação de células ativada por fluorescência (FACS). Um ensaio imunológico com base monoclonal de dois sítios utilizando anticorpos monoclonais reativos a dois epítopos não interferentes sobre o polipeptídeo é preferido, mas um ensaio de ligação competitiva pode ser empregado. Estes e outros ensaios são descritos, entre outros lugares, em Hampton e outros, Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul, Minn. (1990) e Maddox e outros, J. Exp. Med., 158:1211 (1983).

[00087] Uma ampla variedade de marcações e técnicas de conjugação é conhecida pelos peritos na técnica e pode ser utilizada em vários ensaios com ácidos nucleicos e aminoácidos. Os meios para produzir hibridização marcada ou sondas de PCR para a detecção das sequências relacionadas aos polinucleotídeos que codificam um poli- peptídeo de interesse incluem oligonucleotídeo marcação, tradução de pequenos cortes, marcação terminal ou amplificação através de PCR utilizando um nucleotídeo marcado. Alternativamente, as sequências que codificam o polipeptídeo ou quaisquer porções do mesmo podem ser clonadas em um vetor para a produção de uma sonda de mRNA. Tais vetores são conhecidos na técnica, estão disponíveis comercialmente e podem ser utilizados para sintetizar sondas de RNA in vitro através da adição de uma RNA polimerase apropriada tal como T7, T3 ou SP6 e nucleotídeos marcados. Estes procedimentos podem ser conduzidos utilizando uma variedade de kits disponíveis comercialmente da Pharmacia & Upjohn (Kalamazoo, Mich.), Promega Corporation (Madison, Wis.) e U.S. Biochemical Corp. (Cníveland, Ohio). As moléculas ou as marcações repórteres adequadas, que podem ser utilizadas, incluem radionuclídeos, enzimas, agentes fluorescentes, qui- mioluminescentes ou cromogênicos bem como substratos, cofatores, inibidores, partículas magnéticas e similares.

[00088] São conhecidas técnicas para a cultura de tecido vegetal in vitro e, em um número de casos, para a regeneração em plantas inteiras. O procedimento apropriado para produzir plantas transgênicas maduras pode ser escolhido de acordo com a espécie de planta utilizada. A regeneração varia de espécie para espécie de plantas. A regeneração eficiente dependerá do meio, do genótipo e do histórico da cultura. Uma vez que plantas inteiras foram obtidas, estas podem ser reproduzidas de forma sexual ou clonal de tal maneira que pelo menos uma cópia da sequência esteja presente nas células da progênie. A semente proveniente das plantas regeneradas pode ser coletada para uso futuro e as plantas crescidas partindo desta semente. Os procedimentos para a transferência do gene introduzido partindo da planta originalmente transformada para cultivares comercialmente úteis são conhecidos pelos peritos na técnica.

[00089] Modalidades particulares desta invenção são adicionalmente exemplificadas nos Exemplos. Entretanto, os peritos na técnica considerarão facilmente que os experimentos específicos detalhados são apenas ilustrativos da invenção como descrito de forma mais completa nas reivindicações que se seguem posteriormente aqui.

EXEMPLOS Exemplo 1

[00090] A sequência do 3’ UTR de Ubi1 é amplificada por PCR utilizando um iniciador direto que se anela à sequência imediata a jusante do códon de terminação da tradução do gene Ubi1 do milho. É planejado um iniciador reverso que se anelou à sequência 910 pb a jusante do códon de terminação. Esta sequência de 910 pb inclui a 3’ UTR e a região não transcrita a jusante potencialmente necessárias para a transcrição apropriada. As sequências de iniciadores são mostradas na Tabela 1. Os produtos da PCR são clonados no vetor topo utilizando um Invitrogen Topo kit. O inserto do 3’ UTR é confirmado por se- quenciamento utilizando milho B73 como um genoma de referência. Tabela 1: Sequências de iniciadores utilizados para amplificar a 3’ UTR de Ubi1 de ZM

[00091] A 3’ UTR é adicionalmente amplificada pela PCR para adi- cionar pontas penduradas de ~15 nt nas extremidades para se obter a sequência compatível à clonagem "sem emendas" (Invitrogen, Catalog no. A13288). Uma reação de clonagem "sem emendas" é utilizada para criar o vetor pDAB112330 (ZmUbi1 Promoter v8/Cry34Ab1 v2/maizeUbi1 3'UTR v1, Figura 2A). Outro vetor que contém Zea mays (Zm) Ubiquitin (Ubi) Promoter v8/Cry34Ab1 v2/St PinII 3'UTR v2 (pDAB112332, Figura 2B) é também construído para comparar a expressão do 3’ UTR de Ubi1 com aquela do 3’ UTR de PinII da batata.

[00092] Teste de Expressão Transitória: a expressão transitória é testada utilizando bombardeio de partículas de embrião de milho imaturos (B104) colhidos 10-12 dias após a polinização. Vinte embriões são utilizados por tratamento e três réplicas são utilizadas. O ELISA é realizado após a incubação durante toda a noite dos embriões após o bombardeio de partículas. A Figura 3 mostra que bons níveis de expressão de proteína são obtidos partindo de construções de ácido nu- cleico que compreendem a combinação com 3’ UTR de PinII da batata ou de Ubi1 do milho, em que a 3’ UTR de Ubi1 de milho fornece melhor expressão. Neg é o controle não bombardeado.

Exemplo 2

[00093] Uma comparação de expressão similar ao Exemplo 1 é realizada entre as sequências de controle ZMEXP9396.1, ZMEXP9707.1 e St PinII 3’UTR.

[00094] A Figura 4 mostra mapas de plasmídeos representativos de pDAB112357 (ZMEXP9396.1) e pDAB112354 (ZMEXP9707.1). O gene Cry34Ab1 é utilizado para testar a expressão de um transgene. O nível de expressão de Cry34Ab1 pode ser medido através de métodos conhecidos na técnica.

[00095] A Figura 5 mostra exemplos de resultados de expressão partindo de construções de ácido nucleico diferentes incluindo pDAB112357 (ZMEXP9396.1), pDAB112354 (ZMEXP9707.1) e pDAB112332 (St PinII 3’UTR). Todas as três construções fornecem boa expressão comparável para Cry34Ab1.

[00096] A Tabela 2 lista os iniciadores utilizados para amplificar as sequências de controle ZMEXP9396.1, ZMEXP9707.1 e Zea mays Ubi1 3’UTR. Tabela 2. Iniciadores utilizados neste exemplo.

Exemplo 3

[00097] Construção de Vetor: As sequências de 3’ UTR são amplificadas por PCR utilizando um iniciador direto que se anela à sequência imediata a jusante do códon de terminação da tradução gênica de milho correspondente. É planejado um iniciador reverso que se anelou à sequência aproximadamente 900-1000 pb a jusante do códon de ter-minação. Esta sequência de 1000 pb aproximada inclui a 3’ UTR e região não transcrita a jusante potencialmente necessárias para a trans- crição apropriada. Os produtos da PCR são clonados no vetor topo utilizando um Invitrogen Topo kit. O inserto do 3’ UTR é confirmado por sequenciamento utilizando milho B73 como um genoma de referência.

[00098] A 3’ UTR é adicionalmente amplificada pela PCR para adicionar pontas penduradas de aproximadamente 15 nt nas extremidades para a obtenção da sequência compatível à clonagem "sem emendas" (Invitrogen, Catalog no. A13288). Uma reação de clonagem "sem emendas" é utilizada para criar os vetores Gateway® (INVITRO- GEN) Entry pDAB112330 (ZmUbi1 Promoter v8/Cry34Ab1 v2/ZmUbi1 3'UTR v1; ver a Figura 2A), pDAB112354 (ZmUbi v8/Cry34Abi v2/ZMEXP9707.1 3'UTR; ver a Figura 4) e pDAB112357 (ZmUbi v8/Cry34Abi v2/ ZMEXP9396.1 3'UTR; ver também a Figura 4). Outro vetor que contém Zea mays (Zm) Ubiquitin (Ubi) Promoter v8/Cry34Ab1 v2/St PinII 3'UTR v2 (pDAB112332, Figura 2B) também é construído para comparar a expressão do 3’ UTR de Ubi1 com aquela do 3’ UTR de PinII da batata.

[00099] Os vetores de transformação/expressão para transformação de embriões de milho mediada por Agrobacterium são construídos através do uso de métodos de clonagem padronizados e reações de recombinação Gateway® que empregam um vetor binário de direcionamento típico (pDAB104153) e vetores de entrada que são descritos anteriormente. O vetor de direcionamento binário pDAB104153 compreende um gene de tolerância a herbicida (ariloxialcnoato dioxige- nase (AAD-1); Patente U.S. No. 7.838.733 e Wright e outros (2010) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107:20240-20245) sob o controle de expressão de um Promotor da Ubiquitina (Ubi) de Zea mays (Zm). Um fragmento que compreende uma 3’ UTR de um gene da lipase do milho (ZmLip 3'UTR, Patente U.S. No. 7.179.902) é utilizado para terminar a transcrição do mRNA de PAT. A reação de recombinação de Gateway® é utilizada para o cassete de expressão ZmUbi1v8/Cry34Abi v2/ 3'UTR, como descrito em quatro vetores de entrada anteriormente, entre as bordas do T-DNA e a montante do cassete de expressão de AAD-1. Os quatro vetores de expressão finais pDAB108744, pDAB108746, pDAB112396 e pDAB112397 são mostrados nas Figuras 6 e 7.

[000100] Transformação de Agrobacterium tumefaciens: Os vetores binários são transformados na cepa DAt13192 ternária de Agrobacterium tumefaciens (publicada no Pedido de Patente PCT Internacional WO 2012/016222). O DNA do plasmídeo binário é isolado partindo de colônias bacterianas e confirmado utilizando digestões com enzimas de restrição.

[000101] Transformação do milho: Estoques em glicerol dos vetores do projeto na cepa DAt13192 de Agrobacterium tumefaciens hospedeira (cepa ternária RecA menos) são obtidos na DAS Recombinant Culture Collection (RCC). As culturas de Agrobacterium são estriadas partindo dos estoques em glicerol sobre meio mínimo AB (ID do meio: AT00002247) e incubadas a 20°C na escuridão durante três dias. As culturas de Agrobacterium são então estriadas sobre uma placa de meio YEP (ID do meio: AT00002245) e incubadas a 20°C na escuridão durante um dia.

[000102] Uma mistura do Meio de inoculação (ID do meio: ZM00002914) e acetossiringona é preparada em um volume apropriado para o número de construções no experimento. O meio de inoculação é pipetado dentro de um frasco de 250 mL descartável esterilizado. A solução estoque a 1 M de acetossiringona em 100% de dimetil sulfóxido (ID do protocolo de estoque: EPS000400) é adicionada no frasco contendo meio de inoculação em um volume apropriado para atingir uma concentração de acetossiringona final de 200 μM. Exemplos de volumes de Meio de inoculação e solução estoque de acetos- seringona a 1 M são listados na Tabela 3.

[000103] Para cada construção, 1-2 alças de Agrobacterium da placa com YEP são suspensas em 15 mL da mistura de meio de inocula- ção/acetossiringona dentro de um tubo de centrífuga de 50 mL descartável esterilizado e a densidade óptica da solução em 600 nm (D.O.600) é medida em um espectrofotômetro. A suspensão é então diluída até D.O.600 de 0,25 - 0,35 utilizando mistura adicional de Meio de inocu- lação/acetossiringona. O tubo de suspensão de Agrobacterium é então colocado horizontalmente sobre um agitador de plataforma ajustado em aproximadamente 75 rpm à temperatura ambiente durante entre 1 e 4 horas antes do uso.

[000104] Esterilização da espiga e isolamento do embrião: Espigas de Zea mays cultivar B104 são produzidas em unidades de estufa em Indianópolis e colhidas 10-12 dias após a polinização. As espigas colhidas são descascadas e têm a superfície esterilizada em uma solução a 20% de alvejante comercial (Ultra Clorox® Germicidal Bleach, hipoclorito de sódio a 6,15%) e duas gotas de Tween 20, durante vinte minutos, seguidos por três lavagens em água deionizada esterilizada dentro de uma capela de fluxo laminar. Os embriões zigóticos imaturos (1,8 - 2,2 mm de comprimento) são cortados de forma asséptica de cada espiga e distribuídos dentro de um ou mais tubos de microcentrí- fuga contendo 2,0 mL de suspensão de Agrobacterium dentro dos quais 2 μL de tensoativo Break-Thru® S233 a 10% são adicionados.

[000105] Cocultivo de Agrobacterium: Após completar a atividade de isolamento dos embriões o tubo de embriões é fechado e colocado sobre uma plataforma giratória durante 5 minutos. O conteúdo do tubo é então vertido sobre uma placa de meio de cocultivo (ID do meio: ZM00003237) e a suspensão líquida de Agrobacterium é removida como uma pipeta de transferência descartável esterilizada. A placa de cocultivo que contém os embriões é colocada no fundo da capela de fluxo laminar com a tampa entreaberta durante trinta minutos; após cujo período de tempo os embriões são orientados com o escutelo voltado para cima utilizando um microscópio. A placa de cocultivo com os embriões é então devolvida para o fundo da capela de fluxo laminar com a tampa entreaberta durante mais quinze minutos. A placa é então fechada, selada com fita Micropore da 3M e colocada em uma incubadora a 25°C com luz 24 horas/dia à intensidade de luz de aproximadamente 60 μmoles m-2 s-1.

[000106] Seleção de Calos e Regeneração de Eventos Transgêni- cos: Após o período de cocultivo, os embriões são transferidos para o meio de Repouso (ID do meio: ZM00003262). Até 36 embriões são transferidos para cada placa. As placas são colocadas em caixas transparentes e incubadas a 27°C com luz 24 horas/dia à intensidade de luz de aproximadamente 50 μmoles m-2 s-1 durante 7-10 dias. Os embriões que produziram calos são então transferidos para o meio de Seleção I (ID do meio: ZM00003233). Até 18 embriões que produziram calos são transferidos para cada placa de Seleção I. As placas são colocadas em caixas transparentes e incubadas a 27°C com luz 24 horas/dia à intensidade de luz de aproximadamente 50 μmoles m-2 s-1 durante 7 dias. Os embriões que produziram calos são então transferidos para o meio de Seleção II (ID do meio: ZM00003234). Até 12 embriões que produziram calos são transferidos para cada placa de Seleção II. As placas são colocadas em caixas transparentes e incubadas a 27°C com luz 24 horas/dia à intensidade de luz de aproximadamente 50 μmoles m-2 s-1 durante 14 dias.

[000107] Neste estágio os calos resistentes são transferidos para o meio de Pré-Regeneração (ID do meio: ZM00003235). Até 9 calos são transferidos para cada placa de Pré-Regeneração. As placas são colocadas em caixas transparentes e incubadas a 27°C com luz 24 ho- ras/dia à intensidade de luz de aproximadamente 50 μmoles m-2 s-1 durante 7 dias. Os calos em regeneração são então transferidos para o meio de Regeneração em Phytatrays™ (ID do meio: ZM00003236) e incubados a 28°C com 16 horas de luz/8 horas de escuridão por dia à intensidade de luz de aproximadamente 150 μmoles m-2 s-1 durante 714 dias ou até que os brotos se desenvolvam. Até 5 calos são colocadas em cada Phytatray™. Brotos pequenos com raízes primárias são isolados e transferidos para o meio de Alongamento do Broto (ID do meio: ZM00003269). Plantas jovens enraizadas de aproximadamente 6 cm ou mais altas são transplantadas para dentro do solo e transferidas para uma câmara de crescimento para fortalecimento.

[000108] Transferência e Estabelecimento de Plantas na Estufa: Às plantas transgênicas são atribuídos identificadores únicos através do banco de dados TOPAZ e estas são transferidas em uma base regular para a estufa. As plantas são transplantadas das Phytatrays™ para pequenos vasos (T. O. Plastics, 3.5" SVD, 700022C) preenchidos com meio de crescimento (Premier Tech Horticulture, ProMix BX, 0581 P) e cobertos com domos de umedecimento para ajudar a aclimatar as plantas. As plantas são colocadas em uma câmara de crescimento Conviron (28°C/24°C, fotoperíodo de 16 horas, 50 - 70% de umidade relativa, intensidade de luz de 200 μmoles m-2 s-1) até atingirem o estágio V3-V4. Isto ajudou a aclimatar as plantas ao solo e temperaturas mais ríspidas. As plantas são então transferidas para a estufa (Tipo de Exposição à Luz: Foto ou Assimilação; Limite de Luz Alto: radiação fotossinteticamente ativa de 1200 μmoles m-2 s-1 (PAR); período de tempo de dia de 16 horas; 27°C dia/24°C noite) e transplantadas dos pequenos vasos para vasos de 5,5 polegadas. As plantas T0 são re- trocruzadas com B104 para a obtenção de semente hemizigota T1.

[000109] Quantificação por ELISA das proteínas AAD-1 e Cry34: Os Ensaios Imunoabsorventes Ligados à Enzima (ELISA) são utilizados para medir a produção das proteínas AAD-1 e Cry34 em células ou tecidos estavelmente transformados de milho. A proteína AAD-1 é quantificada utilizando kits da ACADIA BIOSCIENCES (Cat # ABS- 041) e da Agdia, Inc (Cat# 04500/4800), respectivamente. Os ELISAs são realizados utilizando várias diluições de extratos vegetais e utilizando os reagentes e as instruções de acordo com os fornecedores.

[000110] Extração de proteína da planta: As proteínas são extraídas partindo de 4 discos foliares (totalizando 1,3 cm2) ou 40 embriões imaturos (para estudos de expressão transitória) em 0,6 mL de PBST (tampão PBS contendo 0,05 % de Tween 20) contendo 0,5% de BSA (para extração de AAD-1) ou 1% de PVP-40 (PoliVinilPirrolidona; para Cy34). Uma esfera de aço de 2 mm é adicionada, os tubos são tampados e fixados em um GENO/GRINDER (CERTIPREP; Metuchen, NJ) e agitados durante 5 min a 1500 rpm. Os tubos são centrifugados a 4000 rpm durante 7 min a 4°C e os sobrenadantes contendo as proteínas solúveis são armazenados a -80°C até serem utilizados. As concentrações de proteína total são determinadas utilizando um PIERCE 660 nm Protein Assay kit (THERMO SCIENTIFIC; Rockford, IL) de acordo com as instruções do fornecedor.

[000111] qPCR com Sonda de Hidrólise para a análise do número de cópias: Vários tipos de análises moleculares são empregados para verificar em relação a eventos simples com baixo número de cópias. O tecido foliar é coletado partindo de plantas transgênicas supostamente enraizadas antes de transplantar para o solo. O DNA é extraído com um kit QIAGEN MagAttract™ utilizando processadores de partículas magnéticas THERMO FISHER KingFisher™ e os protocolos recomendados pelo fornecedor. A análise do número de cópias do transgene integrado é realizada utilizando ensaios com Sondas de Hidrólise específicas para os genes AAD-1 e Cry34. Em adição, a contaminação pela integração inadvertida da estrutura do plasmídeo de vetor binário é detectada através de um ensaio com Sonda de Hidrólise específica para o gene de resistência à Especti- nomicina (Spec) carregado na estrutura do vetor binário. Os ensaios com Sonda de Hidrólise para os genes endógenos do milho Invertase; (No. de Acesso do GenBank™ U16123) e Fator de Alongamento 1α (EF1α) (No. de Acesso do GENBANK AF136823.1) são desenvolvidos como padrões de referência internos. A Tabela 4 lista as sequências de oligonucleotídeos dos componentes do ensaio com Sonda de Hidrólise (sintetizadas pela INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES, Coralville, IA).

[000112] As reações de PCR com Sonda de Hidrólise Biplex são preparadas de acordo com a Tabela 5 com aproximadamente 10 ng de DNA e as condições de ensaio são apresentadas na Tabela 6.

[000113] Para a amplificação, o LIGHTCYCLER®480 Probes Master mix (ROCHE APPLIED SCIENCE, Indianápolis, IN) é preparado na concentração final de 1X em uma reação multiplex com volume de 10 μL contendo 0,1% de PVP, 0,4 μM de cada iniciador e 0,2 μM de cada sonda. O grupamento fluorescente FAM (6-Carbóxi Fluoresceína Ami- dita) é excitado em 465 nm e a fluorescência é medida em 510 nm; os valores correspondentes para o grupamento fluorescente HEX (he- xaclorofluoresceína) eram 533 nm e 580 nm e para VIC® os valores são 538 nm e 554 nm. O nível de fluorescência gerado para cada reação é analisado utilizando o sistema ROCHE LIGHTCYCLER®480 Real-Time PCR de acordo com as recomendações do fabricante. O número de cópias do transgene é determinado através da comparação dos resultados de LIGHTCYCLER®480 de valores de genes Al- vos/Referência para amostras desconhecidas com os valores de genes Alvos/Referência de padrões com número de cópias conhecido (1 Cópia representando plantas hemizigotas, 2 Cópias representando plantas homozigotas).

[000114] Os escores de Cp, isto é, o ponto em que o sinal de fluorescência cruza o limite residual utilizando o algoritmo de pontos de ajuste (software LIGHTCYCLER® versão 1.5) e o módulo Relative Quant (baseado no método de ΔΔCt), são utilizados para realizar a análise de dados de PCR em tempo real.

[000115] No software LIGHTCYCLER® Fit Points Algorithm, um gráfico dos dados é feito através da representação gráfica do logaritmo da concentração do molde de DNA de entrada contra os valores de Cp medidos. A inclinação da curva é um parâmetro de comparação desejado; portanto o número de entrada de log inicial pode ser um ponto de partida arbitrário sobre a curva, com a advertência de que os valores de concentração arbitrários utilizados para o molde de DNA de entrada são representativos da diluição em série real utilizada. Por exemplo, para uma série de diluição em série de 10 vezes, as concentrações de entrada reais podem ser 1000, 100, 10 etc., para cujos pontos o software LC480 Fit Points Algorithm representa graficamente 3, 2, 1 etc. como os logaritmos das entradas. Utilizando uma regressão linear, o melhor ajuste resultante desta linha (log de entrada vs Cp) é então utilizado para estimar uma inclinação (m) partindo de uma equação da forma y = mx+b. Há uma relação inversa entre a quantidade de molde de partida e o valor de Cp e, portanto, a inclinação (m) é sempre negativa.

[000116] Uma reação de PCR perfeita (isto é, 100% eficiente) duplica o molde total a cada ciclo. A eficiência da PCR (Eff) é calculada como: Eff = 10e(-1/m). Assim, a inclinação (m) do gráfico de entrada de log vs Cp será -3,3219 para uma reação perfeitamente eficiente (cuja eficiência é definida como 2,00). Em outras palavras, uma reação de PCR 100% eficiente é definida por: 2,0 = 10e(-1/-3,3219). O software LC480 Fit Points Algorithm relata o valor de eficiência pela primeira fórmula. Assim, uma reação 99% eficiente possui um valor de Eff de 1,99 ao invés de 0,99. Para expressar isto na forma de uma porcentagem de eficiência, subtrair 1 deste valor e multiplicar por 100 ou de acordo com a equação %Eff = [(10e(-1/m)-1)] x 100.

[000117] Análise de proteína de plantas transgênicas estáveis: Plantas T0 transgênicas estáveis (1 até 2 cópias dos transgenes) são transferidas para a estufa para a produção de plantas maduras. Para cada construção, 8 até 12 plantas T0 são testadas em relação à expressão nas folhas das proteínas Cry34 e AAD-1. Para a análise de T1, 8-10 plantas por evento são plantadas para a análise de proteína. Os dados são obtidos e são comparados entre as construções com Zm Ubi1 3’UTR e construções com St PinII 3'UTR. Os resultados mostram que é coerente um aumento de mais de 2,5 vezes na produção de proteína Cry34 utilizando Zm Ubi1 3’UTR (por exemplo pDAB108744) comparada com St PinII 3'UTR (por exemplo pDAB108746) no estágio foliar tanto V4 quanto V12 das plantas de milho. Assim, a Zm Ubi1 3’UTR fornecida é útil na produção de características transgênicas. Em adição, dados provenientes de ZMEXP9396.1 e ZMEXP9707.1 3'UTR (por exemplo, pDAB112396 e pDAB112397) mostram expressão robusta da proteína Cry34.

Claims (13)

1. Construção de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um gene estrutural de interesse ligado de forma funcional a um promotor heterólogo e uma ou mais sequências de controle selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1-3.

2. Construção de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um gene estrutural de interesse compreende um gene que confere um fenótipo não nativo em uma planta.

3. Construção de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um gene estrutural de interesse compreende um gene que confere resistência a insetos ou resistência/tolerância a herbicidas em uma planta.

4. Construção de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a uma ou mais sequências de controle podem ser amplificadas utilizando oligonucleotídeos selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4-15.

5. Construção de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor binário para transformação mediada por Agrobacterium.

6. Construção de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um marcador se- lecionável.

7. Construção de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o marcador selecionável compreende uma ariloxialcanoato dioxigenase.

8. Construção de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a ariloxialcanoato dioxigenase é AAD-1 ou AAD-12.

9. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a construção de ácido nucleico como definida na reivindicação 1.

10. Método para produção de forma recombinante de um peptídeo ou uma proteína, caracterizado pelo fato de que compreende a ligação de forma funcional à sequência a montante de um gene que codifica o peptídeo ou a proteína de um promotor heterólogo e uma ou mais sequências de controle selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-3, em que as sequências de controle estão localizadas entre o gene que codifica o peptídeo ou a proteína e o promotor heterólogo.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais sequências de controle são amplificadas utilizando oligonucleotídeos selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4-15.

12. Método para expressão de um gene em uma planta ou células vegetais, caracterizado pelo fato de que compreende a ligação de forma funcional ao gene de um promotor heterólogo, que está localizado a montante do gene, e uma ou mais sequências de controle selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 1-3, em que as sequências de controle estão localizadas entre o gene que codifica o peptídeo ou a proteína e o promotor heterólogo.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais sequências de controle podem ser amplificadas utilizando oligonucleotídeos selecionados do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4-15.

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