CN108949768B

CN108949768B - 一种用于诊断和/或治疗骨肉瘤的RAB22A-NoeFs融合基因系及其应用

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Publication number: CN108949768B
Application number: CN201810404047.2A
Authority: CN
Inventors: 康铁邦; 廖丹; 钟理; 沈靖南; 隋建华
Original assignee: Sun Yat Sen University Cancer Center
Current assignee: Sun Yat Sen University Cancer Center
Priority date: 2018-04-28
Filing date: 2018-04-28
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2038-04-28
Also published as: CN108949768A; WO2019206341A1

Abstract

本发明公开了一种用于诊断和/或治疗骨肉瘤的融合基因系RAB22A‑NoeFs，RAB22A基因的第1～2号外显子发生倒位与20号染色体54408036‑54476718位置发生融合，包含6个融合基因：RAB22A‑NoeF1、RAB22A‑NoeF2、RAB22A‑NoeF3、RAB22A‑NoeF4、RAB22A‑NoeF5或RAB22A‑NoeF6，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～6所示。融合基因系RAB22A‑NoeFs的6个融合基因均能促进骨肉瘤细胞的迁移以及侵袭，其中RAB22A‑NoeF1除了上述功能，还能促进骨肉瘤细胞的肺转移。本发明的融合基因系RAB22A‑NoeFs可作为骨肉瘤的特异性治疗靶标，具有较大的应用前景。

Description

一种用于诊断和/或治疗骨肉瘤的RAB22A-NoeFs融合基因系及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，更具体地，涉及一种用于诊断和/或治疗骨肉瘤的RAB22A-NoeFs融合基因系及其应用。

背景技术

骨肉瘤(Osteosarcoma)是好发于儿童和青少年的恶性骨肿瘤，容易发生肺转移，其恶性程度高，危害大，其5年生存率仅为60％左右，主要治疗手段是新辅助化疗+手术+术后化疗，且对化放疗十分不敏感，严重影响患者的生存质量且目前尚无有效的靶向药物，手术治疗通常采用截肢的手段，因此寻找一种新的治疗骨肉瘤的方法是十分急切而且必要的。

骨肉瘤中是否存在特异性的治疗靶标，是治疗骨肉瘤的根本性问题，从遗传学以及分子水平上了解骨肉瘤的发病机制、进展、预后对于寻找其特异性治疗靶点及其重要。由于骨肉瘤的基因组的不稳定性和复杂的染色体组型，骨肉瘤常常发生数目或结构上的染色体变化，已经报道的有RB1和p53突变与骨肉瘤的发病机制相关，RB1的突变与骨肉瘤的细胞分化，血管生成和衰老相关，且与预后负相关。近年来，研究发现VEGF，c-Myc，MDM2和APEX1等均在骨肉瘤中明显扩增，可能是潜在的治疗靶点。目前，正在进行的Ⅱ期临床试验，将sorafenib和everolimus联合使用。

融合基因(Fusion gene)是指两个基因的全部或一部分序列相互融合为一个新的基因的过程，其有可能是染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果，通常具有致瘤性。近年来，融合基因已成了多种肿瘤的正在或潜在治疗靶标。最早可追溯到1960年，Nowell和Hungerford在首次慢性粒细胞白血病(CML)中发现了费城染色体，即第9号与22号染色体易位形成的BCR-ABL1融合基因。这也首次证实了染色体易位在肿瘤发生、发展过程中的重要作用。

目前在上皮来源肿瘤中已经发现的融合基因有肺癌、乳腺癌、***癌、肾癌、甲状腺癌等。已经报道的在***癌中的融合基因TMPRSS2-ERG和TMPRSS2-ETV1，FISH结果显示其融合比率近80％(23/29)。在非小细胞肺癌中存在的融合基因EML4-ALK，其融合发生率约1％～3％，且目前已经有针对ALK的小分子抑制剂crizotinib、ceritinib、alectinib正在进行临床试验。故融合基因EML4-ALK有望成为非小细胞肺癌的一个新的治疗及诊断的标志物。

而在肉瘤中，EWS-FLI1融合基因在Ewing肉瘤中的发生率近100％，SS18-SSX融合基因在滑膜肉瘤中发生率高达75％。骨肉瘤(osteosarcoma)中报道的频发融合基因有LRP1-SNRNP25、KCNMB4-CCND3以及PMP22-ELOVL5，其中LRP1-SNRNP25、KCNMB4-CCND3与骨肉瘤细胞的迁移相关，但很遗憾，在这些阳性病例中，其蛋白产物尚未被检测到，从而其临床价值和意义无法评估。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种用于诊断和/或治疗骨肉瘤的RAB22A-NoeFs融合基因系。

本发明的另一目的是提供所述RAB22A-NoeFs融合基因系的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种用于诊断和/或治疗骨肉瘤的融合基因系RAB22A-NoeFs，所述RAB22A-NoeFs包含6个融合基因：RAB22A-NoeF1、RAB22A-NoeF2、RAB22A-NoeF3、RAB22A-NoeF4、RAB22A-NoeF5或RAB22A-NoeF6，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～6所示；其编码的蛋白序列均包含RAB22A的1～38个氨基酸，其对应的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：7～12所示。

本发明通过制备来源于病人组织中骨肉瘤细胞系ZOS、ZOSM以及正常骨细胞hfob1.19的RNA-seq文库，通过对RNA-seq文库进行高通量二代转录组测序，经软件分析后发现RAB22A的第1～2号外显子发生倒位与20号染色体54408036-54476718位置发生融合生成总共6个转录本，六个转录本均能促进骨肉瘤的迁移以及侵袭，RAB22A-NoeF1还能促进骨肉瘤细胞的肺转移，敲低RAB22A-NoeF1融合基因，能够抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力，同时能够抑制骨肉瘤细胞的肺转移，可用于制备诊断和/或治疗骨肉瘤的制剂或诊断试剂盒。

因此，本发明还保护上述融合基因系RAB22A-NoeFs在制备诊断和/或治疗骨肉瘤的制剂或诊断试剂盒中的应用。

一种用于扩增上述融合基因系RAB22A-NoeFs的引物组，包括上游引物RAB22A-NoeFs-F和下游引物RAB22A-NoeF1-R、RAB22A-NoeF2-R、RAB22A-NoeF3-R、RAB22A-NoeF4-R、RAB22A-NoeF5-R、RAB22A-NoeF6-R，所述引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：13～19。

本发明请求保护一种用于诊断疗骨肉瘤的试剂盒，所述试剂盒含有检测上述融合基因系RAB22A-NoeFs或其表达产物的试剂。

优选地，所述试剂盒含有SEQ ID NO：13～19所示的上游引物RAB22A-NoeFs-F和下游引物RAB22A-NoeF1-R、RAB22A-NoeF2-R、RAB22A-NoeF3-R、RAB22A-NoeF4-R、RAB22A-NoeF5-R、RAB22A-NoeF6-R。

优选地，所述试剂盒还含有dNTPmix，PrimerStarDNA聚合酶，RNasefreedH2O。

具体地，所述试剂盒PCR反应体系为：DNA模板(或反转录产物)1μL，dNTP mix4μL，reverse primer(20μM)1μL，forward primer(20μM)1μL，Primer Star DNA聚合酶2.5μL，RNasefreedH₂O至50μL。

所述PCR扩增条件为：95℃5min，1循环；98℃10s，60℃20s，72℃20s，40循环；72℃10min，1循环。

优选地，所述试剂盒包含分别检测RAB22A基因和NoeF1的FISH探针，RAB22A探针选用的克隆片段为RP11-109J9，NoeF1探针选用的克隆片段为RP11-6L15，RAB22A基因的探针用红色荧光标记，NoeF1的探针用绿色荧光标记。

一种治疗骨肉瘤的生物制剂，所述生物制剂下调融合基因系RAB22A-NoeFs在骨肉瘤细胞中的表达量或使融合基因RAB22A-NoeFs的融合蛋白不表达。

优选地，所述试剂下调融合基因RAB22A-NoeF1在骨肉瘤细胞中的表达量。

更优选地，所述生物制剂含有融合基因RAB22A-NoeF1的shRNA。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次发现了一种骨肉瘤中的融合基因系RAB22A-NoeFs，为RAB22A基因的第1～2号外显子发生倒位与20号染色体54408036-54476718位置发生融合，包含6个融合基因：RAB22A-NoeF1、RAB22A-NoeF2、RAB22A-NoeF3、RAB22A-NoeF4、RAB22A-NoeF5或RAB22A-NoeF6，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～6所示。所述融合基因系RAB22A-NoeFs的六个6个融合基因均能促进骨肉瘤细胞的迁移以及侵袭，其中RAB22A-NoeF1除了上述功能，还能促进骨肉瘤细胞的肺转移，敲低RAB22A-NoeF1融合基因，能够抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力，同时能够抑制骨肉瘤细胞的肺转移；所述融合基因系RAB22A-NoeFs可作为骨肉瘤的特异性治疗靶标，具有较大的应用前景。

附图说明

图1为本发明基于RNA-seq技术，在ZOS骨肉瘤原代细胞系中发现的RAB22A-NoeFs融合基因的融合方式概略图。

图2为RAB22A-NoeFs融合基因的圆环示意图。

图3为本发明基于RT-PCR技术，验证RAB22A-NoeFs融合基因在ZOS、ZOSM是否存在。左图为RAB22A-NoeFs六个转录本在ZOS，ZOSM以及Hfob1.19中的RT-PCR条带。右图为相应RT-PCR条带回收纯化DNA的SANGER测序结果。

图4为RT-PCR检测RAB22A-NoeF1融合基因在骨肉瘤病人组织样本中的表达。图中L表示DNA marker2000；NC表示阴性对照；T表示骨肉瘤组织样本；PBC表示骨肉瘤癌旁组织样本；ZOS：骨肉瘤原代细胞系，作为阳性对照。

图5为RT-PCR检测RAB22A-NoeF1融合基因在骨肉瘤细胞系以及其它肿瘤组织(***、食管癌、乳腺癌)中的表达。

图6为基于荧光原位杂交(FISH)技术，检测RAB22A-NoeFs融合基因在骨肉瘤病人非脱钙组织切片的融合。需要说明的是，正常骨组织中，RAB22A基因的基因组定位(红色)和DOK5基因的基因组定位(绿色)不存在融合现象，而在骨肉瘤病人组织样本783275中存在RAB22A-NoeFs基因的融合(黄色)。

图7为RAB22A-NoeFs增强骨肉瘤细胞的迁移侵袭能力。需要说明的是，在U2OS/MTX300，143B细胞中过表达RAB22A-NoeFs能促进骨肉瘤细胞的迁移和侵袭。

图8为体外细胞实验中，敲低RAB22A-NoeF1融合基因，能够抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力。

图9为RAB22A-NoeF1具有癌基因的功能。需要说明的是，(A)在U2OS细胞中过表达RAB22A-NoeF1能抑制骨肉瘤细胞的凋亡，促进骨肉瘤细胞的增值；(B)加强骨肉瘤细胞的克隆形成能力。

图10为RAB22A-NoeF1融合基因具有恶性转化的能力。需要说明的是，在裸鼠皮下成瘤模型中，NIH-3T3细胞中过表达RAB22A-NoeF1融合基因能在裸鼠皮下形成肿瘤。

图11为在小鼠原位骨肉瘤原位以及肺转移模型中，过表达RAB22A-NoeF1融合基因，能够促进骨肉瘤细胞的肺转移。

图12为在小鼠原位骨肉瘤肺转移模型中，敲低RAB22A-NoeF1融合基因，能够抑制骨肉瘤细胞的肺转移。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 RAB22A-NoeFs融合基因序列鉴定

利用RNA-seq，在人骨肉瘤细胞系ZOS、ZOSM中发现了RAB22A-NoeFs融合基因。随后扩增出RAB22A-NoeFs融合基因的CDS区的全长，验证所得到的RAB22A-NoeFs融合基因。具体过程如下：

1、高通量测序鉴定骨肉瘤细胞中的融合基因：

选取骨肉瘤原代细胞ZOS、骨肉瘤细胞系ZOSM、正常骨细胞Hfob1.19，用TRIZOL提取总RNA，送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司建库并进行高通量二代转录组测序，生物信息学分析后得到RAB22A-NoeFs融合基因特异表达于骨肉瘤原代细胞ZOS和ZOSM中(表1)；RAB22A-NoeFs融合基因的融合方式概略图如图1所示，RAB22A-NoeFs融合基因的圆环示意图如图2所示。

表1 RNA-seq结果中RAB22A-NoeFs的reads数

2、RAB22A-NoeFs融合基因CDS区序列鉴定：利用PCR技术，在骨肉瘤原代细胞ZOS以及ZOSM中得到RAB22A-NoeFs完整的CDS区序列：

RAB22A-NoeF1：

ATGGCGCTGAGGGAGCTCAAAGTGTGTCTGCTCGGGGATACAGGTGTAGGTAAATCGAGTATTGTGTGGCGGTTTGTGGAAGACAGTTTTGATCCAAACATCAACCCAACAATAGGgacatatgtagggagcacttgcgctatgccaggtatcaggttccacgtaaataacccttccgtggacctccagggtgtattccagcaacagaaatccaccaccccggcttcgaaccacggaaaatccagattcaagtatctacccaagttggccccgaccagaggccagcccgcaccgcctttgacacgacacctgggacagaggtggggggatccaaagacaccttacgcttggcagaaatctctccctggggtcagagggttcgtgacctcgttcacaccgagtatgcgtgtcctctttctcaaccagccgatccatcccccggaaaagttaagttggcggcgagtgggaaaagaggggaaccgggggcatccggcaggcacccccgcccgggcttctcagctccaacttccatggctaccgagaaatatttatttcgagtag(SEQ ID NO：1)，SEQ ID NO：1中大写英文表示RAB22A基因的序列，小写英文表示NoeF1的序列，两者通过染色体内倒位进行融合；SEQ IDNO：1所示序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

RAB22A-NoeF2：

ATGGCGCTGAGGGAGCTCAAAGTGTGTCTGCTCGGGGATACAGGTGTAGGTAAATCGAGTATTGTGTGGCGGTTTGTGGAAGACAGTTTTGATCCAAACATCAACCCAACAATAGGcactgttcacaatatcaaaggaaccaacccagatgcctatcaatga(SEQ ID NO：2)，SEQ ID NO：2中大写英文表示RAB22A基因的序列，小写英文表示NoeF3的序列，两者通过染色体内倒位进行融合；SEQ ID NO：2所示序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

RAB22A-NoeF3：

ATGGCGCTGAGGGAGCTCAAAGTGTGTCTGCTCGGGGATACAGGTGTAGGTAAATCGAGTATTGTGTGGCGGTTTGTGGAAGACAGTTTTGATCCAAACATCAACCCAACAATAGGttttctgattttggaaggtagctgttgtcctagctaccttagaggctga(SEQ ID NO：3)，SEQ ID NO：3中大写英文表示RAB22A基因的序列，小写英文表示NoeF3的序列，两者通过染色体内倒位进行融合；SEQ ID NO：3所示序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

RAB22A-NoeF4：

ATGGCGCTGAGGGAGCTCAAAGTGTGTCTGCTCGGGGATACAGGTGTAGGTAAATCGAGTATTGTGTGGCGGTTTGTGGAAGACAGTTTTGATCCAAACATCAACCCAACAATAGGatggagtttcactcttgtcatcccggctggaatgcagtggcatgatcttggctcactgcaacctccacctcccgggttcaagcaattcgcctgcctcagcctcctgagaagctggaattacaggtgctcacaaccacacctggctaatttttgtagttttagtagagacggggtttcaccatgttggccaggctggtctcgaactcctgacctcaggtga(SEQ ID NO：4)，SEQ ID NO：4中大写英文表示RAB22A基因的序列，小写英文表示NoeF4的序列，两者通过染色体内倒位进行融合；SEQID NO：4所示序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

RAB22A-NoeF5：

ATGGCGCTGAGGGAGCTCAAAGTGTGTCTGCTCGGGGATACAGGTGTAGGTAAATCGAGTATTGTGTGGCGGTTTGTGGAAGACAGTTTTGATCCAAACATCAACCCAACAATAGGctcacgtgtgcagccctgtccatggcctttctttggacaactagtggttggtgattggttcagatatgggcacatgacctaa(SEQ ID NO：5)，SEQ IDNO：5中大写英文表示RAB22A基因的序列，小写英文表示NoeF5的序列，两者通过染色体内倒位进行融合；SEQ ID NO：5所示序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。

RAB22A-NoeF6：

ATGGCGCTGAGGGAGCTCAAAGTGTGTCTGCTCGGGGATACAGGTGTAGGTAAATCGAGTATTGTGTGGCGGTTTGTGGAAGACAGTTTTGATCCAAACATCAACCCAACAATAGGgttcaagccaattttcccaaaagaccagattggaatatcgatttag(SEQ ID NO：6)，SEQ ID NO：6中大写英文表示RAB22A基因的序列，小写英文表示NoeF6的序列，两者通过染色体内倒位进行融合；SEQ ID NO：6所示序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。

实施例2 RAB22A-NoeFs融合基因的检测

1、RT-PCR检测

提取骨肉瘤细胞ZOS、ZOSM和正常成骨细胞Hhob1.19的RNA，反转录成cDNA；以cDNA为模板，对RAB22A-NoeFs融合基因进行PCR验证，对PCR产物进行Sanger测序；包括如下步骤：

(1)设计并筛选特异性RT-PCR引物，特异性RT-PCR引物如下：

RAB22A-NoeFs-F：GGCCTCTCCCTTCTCAACTTAG(SEQ ID NO：13)

RAB22A-NoeF1-R：GTGGCTTTCTCAGCCGAAAC(SEQ ID NO：14)

RAB22A-NoeF2-R：TCATTGATAGGCATCTGGGTTGGTT(SEQ ID NO：15)

RAB22A-NoeF3-R：TCAGCCTCTAAGGTAGCTAGGACAA(SEQ ID NO：16)

RAB22A-NoeF4-R：TCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGAC(SEQ ID NO：17)

RAB22A-NoeF5-R：TTAGGTCATGTGCCCATATCTGAAC(SEQ ID NO：18)

RAB22A-NoeF6-R：CTAAATCGATATTCCAATCTGGTCT(SEQ ID NO：19)

(2)Trizol法提取RNA

液氮研钵研碎的组织或培养的细胞，加入1mL Trizol试剂，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入1.5mlEP管中，室温静置5分钟；加入0.2ml氯仿(1ml TRIZOL加入200μL氯仿)，剧烈震荡15秒，室温静置2～3分钟，12000g，4℃离心15分钟。取上层水相置于新EP管中，加入0.5ml异丙醇，室温静置10分钟，12000g，4℃离心10分钟。弃上清，加入1ml75％乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g，4℃离心5分钟，弃上清。让沉淀的RNA在室温下自然干燥。用Rnase-free water溶解RNA沉淀。

(3)反转录PCR

Microtube中配制下列反应混合试剂：

65℃保温5min后，冰上迅速冷却。在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，总量为20μL。

缓慢混匀后按下列条件进行反转录反应：42℃，30～60min；95℃，5min(酶失活)后，冰上冷却。

(4)RT-PCR检测

反应体系如下：

PCR扩增条件：95℃5min，1循环；98℃10s，60℃20s，72℃20s，40循环；72℃10min，1循环。

结果表明，RAB22A-NoeFs融合基因在ZOS、ZOSM细胞系中存在(图3)；

另外，利用RT-PCR技术，在骨肉瘤、***、食管癌、乳腺癌这些肿瘤样本中检测RAB22A-NoeF1融合基因。

结果表明，RAB22A-NoeF1融合基因可能为骨肉瘤特异性表达(图4)；在***、食管癌、乳腺癌病人标本中均不存在RAB22A-NoeF1的融合(图5)。

2、荧光原位杂交(FISH)

针对RAB22A基因和NoeF1在染色体上的位置，设计特异的DNA探针，RAB22A基因的探针用红色荧光标记，NoeF1的探针用绿色荧光标记，两个探针的克隆号分别是RP11-10959和RP11-6L15。

荧光原位杂交具体操作：

(1)组织切片预处理：将先前准备的非脱钙骨肉瘤组织切片在65±1℃恒温箱烤片过夜，取出后放入二甲苯浸泡30min，再放入无水乙醇浸泡10min。接着放入100％、85％、70％梯度乙醇和纯化水中复水各3min，放入纯化水中100±5℃煮片20min。切片取出晾干后，在样本区域滴加10μL胃蛋白酶液，消化5min。迅速放入2×SSC溶液中洗涤5min，最后放入室温的70％、85％、100％梯度乙醇依次脱水各3min，取出晾干。

(2)组织切片与探针共变性：加10μL的探针杂交液至干燥22×22mm盖玻片上，将步骤(1)处理过的组织切片样本面朝下盖在盖玻片上，反转后轻压盖玻片使杂交液均匀分布，用橡皮胶水沿盖玻片边缘封片。将玻片放在85±1℃的热台上变性5min，迅速放入预热的杂交盒中，37±1℃避光孵育过夜。

(3)杂交后洗涤及复染：在37土1℃的水浴箱中，预热2×SSC溶液、0.1％NP-40/2×SSC溶液。将步骤(2)处理过的组织切片去除橡皮胶水和盖玻片，放入2XSSC溶液中洗涤10min，再放入0.1％NP-40/2XSSC溶液中洗涤5min，然后室温下70％乙醇脱水3min，暗处晾干。滴加10μL DAPI复染剂至另一张干燥的22×22mm盖玻片上，将先前晾干的组织切片样本面朝下，使目标区域接触盖破片，反转后轻压盖玻片去除气泡，暗室中用Olympus BX51荧光显微镜DAPI/FIFC/TexasRed三色滤光镜激发，在100倍物镜下观察FISH荧光信号，用Imstar公司提供的FISH分析软件分析图像，评估整个切片的探针杂交情况。

病人组织标本判定阳性标准：选取视野中的能清晰区分的单个细胞，总计100个。计算融合的数目，超过20％的细胞表现出RAB22A-NoeFs的融合(红绿探针重合呈黄色)，即判定该病人组织为阳性。

结果表明RAB22A-NoeF1融合基因在骨肉瘤病人组织中存在(图6)正常骨组织中，RAB22A基因的基因组定位(红色)和DOK5基因的基因组定位(绿色)不存在融合现象，而在骨肉瘤病人组织样本783275中存在RAB22A-NoeFs基因的融合(黄色)。

实施例3 RAB22A-NoeFs融合基因在骨肉瘤中的功能

一、构建稳定过表达细胞

1、过表达载体构建

(1)RAB22A-NoeFs的CDS区域序列扩增

使用TAKARA的高保真酶MIX primSTAR，实施例2的特异性引物扩增RAB22A-NoeFs的CDS区域序列，体系如下：

将其混匀后置于PCR仪器中，反应条件如下：

95℃预变性5min后，下列条件进行38个循环：

98℃ 15s

55-60℃ 30s

72℃ 5kb/min

38个循环过后，再进行一步72℃，10min延长反应，此后回收扩增产物；

(2)酶切(包括过表达载体PBABE和扩增产物)

在200μL PCR管中进行酶切反应。反应体系如下：

37℃酶切1h，回收酶切产物。

(3)连接

在室温进行连接反应，反应体系如下:

(4)转化

将10μL连接产物加入到感受态细胞(Stbl3)中，轻轻混匀，冰浴20min，42℃热激60s，随后冰浴2min，加入500μL无抗生素的LB培养基，摇床37℃，200rpm，30min。使用无菌玻璃珠在需转化质粒对应的抗性固体LB培养板上涂板，放入37℃细菌培养箱中，培养过夜，第二天挑取单克隆菌落，送SANGER测序验证克隆是否成功。

2、包装病毒

(1)转染前一天在直径10cm平皿中接种293T细胞，用10％FBS的DMEM培养基培养；

(2)包装细胞50％融合时共转染质粒pBABE与PIK各6μg，以及30μL标准的脂质体转染试剂Lipofectamine^TM2000；

(3)6h后换液，加入10ml的新鲜培养基；

(4)48～72h后培养上清用0.45μm的非硝酸纤维滤器(醋酸纤维素等滤器)消毒过滤(因为硝酸纤维与病毒细胞膜蛋白结合而破坏病毒)，以清除细胞碎屑及污染的包装细胞，4℃暂时保存，-80℃长期保存备用。

3、逆转录病毒感染目标细胞

(1)感染前一天(18-24h)，目标细胞铺板(六孔板)；

(2)50％融合，2ml的含病毒上清液加入8μg/ml的Polybrene(已配成1000×工作液)；

(3)6h后更换正常培养基10％FBS的DMEM；通常感染2次。

(4)48h后开始用浓度0.5～1.0μg/ml(范围500-1000μg/ml，每次递减100μg/ml)嘌呤霉素筛选；

(5)每1～2天更换培养基(均含相同嘌呤霉素浓度，根据细胞死亡情况，调整嘌呤霉素浓度)；

(6)约1周后可用western blot检测表达效率。

结果显示，检测到RAB22A-NoeFs表达的蛋白产物，表明，成功构建稳定过表达细胞。

二、构建稳定敲低细胞系

1、敲低表达载体构建

(1)合成特异针对RAB22A-NoeF1的shRNA序列；

shRAB22A-NoeF1#1:CCGGAATCCAGATTCAAGTATCTACCCAACTCGAGTTGGGTAGATACTTGAATCTGGATTTTTTTG(SEQ ID NO：20)；

shRBA22A-NoeF1#2:CCGGCCGAGTATGCGTGTCCTCTTTCTCACTCGAGTGAGAAAGAGGACACGCATACTCGGTTTTTG(SEQ ID NO：21)。

(2)酶切稳定敲低载体PLKO.1；

在200μL PCR管中进行酶切反应。反应体系如下：

37℃酶切1h，回收酶切产物。

(3)连接

在室温进行连接反应，反应体系如下:

(4)转化

2、包装病毒

(2)包装细胞50％融合时共转染质粒干扰片段/对照片段、PSA及PIG各5μg，以及30μL标准的脂质体转染试剂Lipofectamine^TM2000；

(3)6h后换液，加入10ml的新鲜培养基；

3、慢病毒感染目标细胞

(1)感染前一天(18-24h)，目标细胞铺板(六孔板)；

(3)6h后更换正常培养基10％FBS的DMEM；通常感染2次。

(4)48h后开始用浓度0.5-1.0μg/ml(范围500-1000μg/ml，每次递减100μg/ml)嘌呤霉素筛选；

(6)约1周后可用western blot检测干扰效率。

结果显示，成功检测到RAB22A-NoeF1的表达量下降，表明成功构建稳定敲低细胞。

三、细胞迁移以及侵袭实验

1、Transwell小室制备

(1)包被基质胶的Transwell的小室制备(做迁移试验无需包被基质胶)

①包被基底膜：将50mg/LMatrigel 1：8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干(或冰箱4℃过夜)。

②水化基底膜：每孔加入50μL含10g/LBSA的无血清培养液，37℃，30min。

2、制备细胞悬液

取步骤一和二成功构建得到的过表达细胞和敲低表达细胞系，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1～2遍，用无血清或低血清的培养基重悬。调整细胞密度至1～10×10⁵。

3、接种细胞

(1)吸出培养板中残余液体，取细胞悬液100～200μL加入Transwell上室。

(2)24孔板下室一般加入500μL含FBS或趋化因子的培养基。

(3)培养细胞：常规培养24h

4、结果统计：通过计数穿过膜的细胞数来比较侵袭和迁移的能力。

(1)用棉签擦去基质胶和上室内的细胞。

(2)0.1％结晶紫染色，方法如下：(1)4％多聚甲醛固定15min，冲洗(2)浸泡0.05％结晶紫染色15～30min(3)PBS冲洗2～3次

(3)细胞计数：取若干个视野计数细胞个数一般随机选取3～10个视野。

结果表明，RAB22A-NoeFs增强骨肉瘤细胞的迁移侵袭能力(图7)；当敲低RAB22A-NoeF1融合基因，能够抑制骨肉瘤细胞的迁移和侵袭能力(图8)

四、克隆形成实验

1、制备细胞悬液：消化细胞并吹打成单细胞悬液，将细胞悬浮在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中。

2、接种细胞：根据细胞增殖能力，将细胞悬液作梯度倍数稀释，以适当的细胞密度接种到直径6cm培养皿中。一般可按每皿100～200个细胞接种到以有4～5ml培养基的培养皿中。(轻轻吹打，使细胞分散)

3、培养：将培养皿孵育在培养箱中10～14d。

4、染色：将培养液吸出，用PBS小心洗1次，用4％多聚甲醛固定10min。去固定液后用0.005％甲紫染色15min，然后去染液，干燥。

5、计数：把培养板放在倒置显微镜上，镜下计数含50个细胞以上的克隆，并计算克隆形成率。

五、细胞增殖实验

1、消化贴壁细胞，制成1x10⁵个/ml的单细胞悬液(可根据不同细胞的生长情况调整浓度)；

2、接种：每个浓度梯度至少设3个孔(当然复孔越多越好)，每空加细胞悬液80～100μL；

3、24h细胞贴壁后再加已配置好的各个浓度的ADM20μL，至试验所需的终浓度；

4、37℃5％CO₂100％湿度培育48小时；

5、加5MG/ML MTT10μL，培育4小时；

6、去上清，加DMSO原液100μL，震荡5分钟，室温10分钟；

7、A492nm波长测吸光度

8、设置空白对照：与实验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照，余步骤同前。

实验结果分析：细胞存活数(％)＝实验组光吸收率/对照组光吸收率×100％

六、细胞凋亡实验

利用Annexin V-FITC/PI双标法流式检测细胞凋亡，将贴壁细胞消化后离心收集，PBS洗2次，加入500μLBinding Buffer以及5μLAnnexin V-FITC和5μLPI，室温避光孵育30分钟后立即利用流式细胞术检测分析。

上述试验四～试验六的研究结果表明，RAB22A-NoeF1具有癌基因的功能，过表达RAB22A-NoeF1促进骨肉瘤细胞的增殖，并抑制其凋亡(图9A)；过表达RAB22A-NoeF1增强骨肉瘤细胞的克隆形成能力(图9B)。

七、小鼠皮下成瘤模型

将NIH3T3细胞消化并离心收集，用PBS洗两次后，用PBS重悬细胞，最终细胞密度为1×10⁶/100μL，皮下注射100μL细胞悬液至裸鼠腋下，实时观察肿瘤细胞的生长并记录生成肿瘤的大小。

结果表明，RAB22A-NoeF1融合基因具有恶性转化的能力(图10)。

八、小鼠原位骨肉瘤肺转移模型

将骨肉瘤细胞消化并离心收集，用PBS洗两次后，用PBS重悬细胞，最终细胞密度为8x10⁵/20μL，于胫骨近端股骨远端注射20μL细胞悬液，4周后观察小鼠的肺部转移情况。

九、小鼠尾静脉肺转移模型

将骨肉瘤细胞消化并离心收集，用PBS洗两次后，用PBS重悬细胞，最终细胞密度为1x10⁶/100μL，于尾静脉注射细胞悬液，4周后观察小鼠的肺部转移情况。

上述试验八和试验九结果表明，RAB22A-NoeF1融合基因促进骨肉瘤细胞的肺转移(图11)；敲低RAB22A-NoeFs融合基因，能够抑制骨肉瘤细胞的肺转移(图12)。

实施例4一种检测RAB22A-NoeFs融合基因的试剂盒

1、试剂盒组分

(1)特异性RT-PCR引物，上下游引物浓度均为20μM，特异性RT-PCR引物序列如下：

RAB22A-NoeFs-F：GGCCTCTCCCTTCTCAACTTAG(SEQ ID NO：13)

RAB22A-NoeF1-R：GTGGCTTTCTCAGCCGAAAC(SEQ ID NO：14)

RAB22A-NoeF2-R：TCATTGATAGGCATCTGGGTTGGTT(SEQ ID NO：15)

RAB22A-NoeF3-R：TCAGCCTCTAAGGTAGCTAGGACAA(SEQ ID NO：16)

RAB22A-NoeF4-R：TCACCTGAGGTCAGGAGTTCGAGAC(SEQ ID NO：17)

RAB22A-NoeF5-R：TTAGGTCATGTGCCCATATCTGAAC(SEQ ID NO：18)

RAB22A-NoeF6-R：CTAAATCGATATTCCAATCTGGTCT(SEQ ID NO：19)

(2)RT-PCR扩增所需试剂：dNTP mix，Primer Star DNA聚合酶，RNase free dH2O。

2、试剂盒检测方法

(1)Trizol法提取RNA

(2)反转录PCR

Microtube中配制下列反应混合试剂：

(3)RT-PCR检测

反应体系如下：

实施例5一种检测RAB22A-NoeF1融合基因的荧光原位杂交试剂盒

1、试剂盒组分

(1)针对RAB22A基因和NoeF1的FISH探针，RAB22A基因的探针用红色荧光标记，NoeF1的探针用绿色荧光标记，两个探针的克隆号分别是RP11-10959和RP11-6L15。

(2)荧光原位杂交所需试剂：二甲苯，无水乙醇，胃蛋白酶液，SSC溶液，NP-40，DAPI复染剂。

2、试剂盒检测方法

(3)杂交后洗涤及复染：在37土1℃的水浴箱中，预热2×SSC溶液、0.1％NP-40/2×SSC溶液。将步骤(2)处理过的组织切片去除橡皮胶水和盖玻片，放入2×SSC溶液中洗涤10min，再放入0.1％NP-40/2XSSC溶液中洗涤5min，然后室温下70％乙醇脱水3min，暗处晾干。滴加10μLDAPI复染剂至另一张干燥的22×22mm盖玻片上，将先前晾干的组织切片样本面朝下，使目标区域接触盖破片，反转后轻压盖玻片去除气泡，暗室中用Olympus BX51荧光显微镜DAPI/FIFC/TexasRed三色滤光镜激发，在100倍物镜下观察FISH荧光信号，用Imstar公司提供的FISH分析软件分析图像，评估整个切片的探针杂交情况。

序列表

<110> 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）

<120> 一种用于诊断和/或治疗骨肉瘤的RAB22A-NoeFs融合基因系及其应用

<130> YG18103323AA042

<141> 2018-04-28

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 561

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

atggcgctga gggagctcaa agtgtgtctg ctcggggata caggtgtagg taaatcgagt 60

attgtgtggc ggtttgtgga agacagtttt gatccaaaca tcaacccaac aatagggaca 120

tatgtaggga gcacttgcgc tatgccaggt atcaggttcc acgtaaataa cccttccgtg 180

gacctccagg gtgtattcca gcaacagaaa tccaccaccc cggcttcgaa ccacggaaaa 240

tccagattca agtatctacc caagttggcc ccgaccagag gccagcccgc accgcctttg 300

acacgacacc tgggacagag gtggggggat ccaaagacac cttacgcttg gcagaaatct 360

ctccctgggg tcagagggtt cgtgacctcg ttcacaccga gtatgcgtgt cctctttctc 420

aaccagccga tccatccccc ggaaaagtta agttggcggc gagtgggaaa agaggggaac 480

cgggggcatc cggcaggcac ccccgcccgg gcttctcagc tccaacttcc atggctaccg 540

agaaatattt atttcgagta g 561

<210> 2

<211> 162

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

atggcgctga gggagctcaa agtgtgtctg ctcggggata caggtgtagg taaatcgagt 60

attgtgtggc ggtttgtgga agacagtttt gatccaaaca tcaacccaac aataggcact 120

gttcacaata tcaaaggaac caacccagat gcctatcaat ga 162

<210> 3

<211> 165

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 3

atggcgctga gggagctcaa agtgtgtctg ctcggggata caggtgtagg taaatcgagt 60

attgtgtggc ggtttgtgga agacagtttt gatccaaaca tcaacccaac aataggtttt 120

ctgattttgg aaggtagctg ttgtcctagc taccttagag gctga 165

<210> 4

<211> 165

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 4

atggcgctga gggagctcaa agtgtgtctg ctcggggata caggtgtagg taaatcgagt 60

attgtgtggc ggtttgtgga agacagtttt gatccaaaca tcaacccaac aataggtttt 120

ctgattttgg aaggtagctg ttgtcctagc taccttagag gctga 165

<210> 5

<211> 198

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 5

atggcgctga gggagctcaa agtgtgtctg ctcggggata caggtgtagg taaatcgagt 60

attgtgtggc ggtttgtgga agacagtttt gatccaaaca tcaacccaac aataggctca 120

cgtgtgcagc cctgtccatg gcctttcttt ggacaactag tggttggtga ttggttcaga 180

tatgggcaca tgacctaa 198

<210> 6

<211> 162

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 6

atggcgctga gggagctcaa agtgtgtctg ctcggggata caggtgtagg taaatcgagt 60

attgtgtggc ggtttgtgga agacagtttt gatccaaaca tcaacccaac aatagggttc 120

aagccaattt tcccaaaaga ccagattgga atatcgattt ag 162

<210> 7

<211> 186

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 7

Met Ala Leu Arg Glu Leu Lys Val Cys Leu Leu Gly Asp Thr Gly Val

1 5 10 15

Gly Lys Ser Ser Ile Val Trp Arg Phe Val Glu Asp Ser Phe Asp Pro

20 25 30

Asn Ile Asn Pro Thr Ile Gly Thr Tyr Val Gly Ser Thr Cys Ala Met

35 40 45

Pro Gly Ile Arg Phe His Val Asn Asn Pro Ser Val Asp Leu Gln Gly

50 55 60

Val Phe Gln Gln Gln Lys Ser Thr Thr Pro Ala Ser Asn His Gly Lys

65 70 75 80

Ser Arg Phe Lys Tyr Leu Pro Lys Leu Ala Pro Thr Arg Gly Gln Pro

85 90 95

Ala Pro Pro Leu Thr Arg His Leu Gly Gln Arg Trp Gly Asp Pro Lys

100 105 110

Thr Pro Tyr Ala Trp Gln Lys Ser Leu Pro Gly Val Arg Gly Phe Val

115 120 125

Thr Ser Phe Thr Pro Ser Met Arg Val Leu Phe Leu Asn Gln Pro Ile

130 135 140

His Pro Pro Glu Lys Leu Ser Trp Arg Arg Val Gly Lys Glu Gly Asn

145 150 155 160

Arg Gly His Pro Ala Gly Thr Pro Ala Arg Ala Ser Gln Leu Gln Leu

165 170 175

Pro Trp Leu Pro Arg Asn Ile Tyr Phe Glu

180 185

<210> 8

<211> 53

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 8

Met Ala Leu Arg Glu Leu Lys Val Cys Leu Leu Gly Asp Thr Gly Val

1 5 10 15

Gly Lys Ser Ser Ile Val Trp Arg Phe Val Glu Asp Ser Phe Asp Pro

20 25 30

Asn Ile Asn Pro Thr Ile Gly Thr Val His Asn Ile Lys Gly Thr Asn

35 40 45

Pro Asp Ala Tyr Gln

50

<210> 9

<211> 54

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 9

Met Ala Leu Arg Glu Leu Lys Val Cys Leu Leu Gly Asp Thr Gly Val

1 5 10 15

Gly Lys Ser Ser Ile Val Trp Arg Phe Val Glu Asp Ser Phe Asp Pro

20 25 30

Asn Ile Asn Pro Thr Ile Gly Phe Leu Ile Leu Glu Gly Ser Cys Cys

35 40 45

Pro Ser Tyr Leu Arg Gly

50

<210> 10

<211> 111

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 10

Met Ala Leu Arg Glu Leu Lys Val Cys Leu Leu Gly Asp Thr Gly Val

1 5 10 15

Gly Lys Ser Ser Ile Val Trp Arg Phe Val Glu Asp Ser Phe Asp Pro

20 25 30

Asn Ile Asn Pro Thr Ile Gly Trp Ser Phe Thr Leu Val Ile Pro Ala

35 40 45

Gly Met Gln Trp His Asp Leu Gly Ser Leu Gln Pro Pro Pro Pro Gly

50 55 60

Phe Lys Gln Phe Ala Cys Leu Ser Leu Leu Arg Ser Trp Asn Tyr Arg

65 70 75 80

Cys Ser Gln Pro His Leu Ala Asn Phe Cys Ser Phe Ser Arg Asp Gly

85 90 95

Val Ser Pro Cys Trp Pro Gly Trp Ser Arg Thr Pro Asp Leu Arg

100 105 110

<210> 11

<211> 65

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 11

Met Ala Leu Arg Glu Leu Lys Val Cys Leu Leu Gly Asp Thr Gly Val

1 5 10 15

Gly Lys Ser Ser Ile Val Trp Arg Phe Val Glu Asp Ser Phe Asp Pro

20 25 30

Asn Ile Asn Pro Thr Ile Gly Ser Arg Val Gln Pro Cys Pro Trp Pro

35 40 45

Phe Phe Gly Gln Leu Val Val Gly Asp Trp Phe Arg Tyr Gly His Met

50 55 60

Thr

65

<210> 12

<211> 53

<212> PRT

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 12

Met Ala Leu Arg Glu Leu Lys Val Cys Leu Leu Gly Asp Thr Gly Val

1 5 10 15

Gly Lys Ser Ser Ile Val Trp Arg Phe Val Glu Asp Ser Phe Asp Pro

20 25 30

Asn Ile Asn Pro Thr Ile Gly Phe Lys Pro Ile Phe Pro Lys Asp Gln

35 40 45

Ile Gly Ile Ser Ile

50

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 13

ggcctctccc ttctcaactt ag 22

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 14

gtggctttct cagccgaaac 20

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 15

tcattgatag gcatctgggt tggtt 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 16

tcagcctcta aggtagctag gacaa 25

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 17

tcacctgagg tcaggagttc gagac 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 18

ttaggtcatg tgcccatatc tgaac 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 19

ctaaatcgat attccaatct ggtct 25

<210> 20

<211> 66

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 20

ccggaatcca gattcaagta tctacccaac tcgagttggg tagatacttg aatctggatt 60

tttttg 66

<210> 21

<211> 66

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 21

ccggccgagt atgcgtgtcc tctttctcac tcgagtgaga aagaggacac gcatactcgg 60

tttttg 66

Claims

1.一种用于诊断和/或治疗骨肉瘤的融合基因系RAB22A-NoeFs，其特征在于，包含6个融合基因：RAB22A-NoeF1、RAB22A-NoeF2、RAB22A-NoeF3、RAB22A-NoeF4、RAB22A-NoeF5或RAB22A-NoeF6，其核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1～6所示。

2.权利要求1所述融合基因系RAB22A-NoeFs编码的蛋白，其特征在于，所述融合基因对应编码的蛋白的氨基酸序列依次如SEQ ID NO：7～12所示。

3.权利要求1所述的融合基因系RAB22A-NoeFs在制备诊断和/或治疗骨肉瘤的制剂或诊断试剂盒中的应用。

4.一种用于扩增检测权利要求1所述融合基因系RAB22A-NoeFs的引物组，其特征在于，包括上游引物RAB22A-NoeFs-F和下游引物RAB22A-NoeF1-R、RAB22A-NoeF2-R、RAB22A-NoeF3-R、RAB22A-NoeF4-R、RAB22A-NoeF5-R、RAB22A-NoeF6-R，所述引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：13～19所示。

5.一种用于诊断疗骨肉瘤的试剂盒，其特征在于，含有检测权利要求1所述融合基因系RAB22A-NoeFs或检测其表达产物的试剂。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括SEQ ID NO：13～19所示的上游引物RAB22A-NoeFs-F和下游引物RAB22A-NoeF1-R、RAB22A-NoeF2-R、RAB22A-NoeF3-R、RAB22A-NoeF4-R、RAB22A-NoeF5-R、RAB22A-NoeF6-R。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，包含分别检测RAB22A基因和NoeF1的FISH探针，RAB22A探针选用的克隆片段为RP11-109J9，NoeF1探针选用的克隆片段为RP11-6L15，RAB22A基因的探针用红色荧光标记，NoeF1的探针用绿色荧光标记。

8.一种治疗骨肉瘤的生物制剂，其特征在于，所述生物制剂含有融合基因RAB22A-NoeF1的shRNA，其序列分别如SEQ ID NO：20～21所示。