CN104651423A - 一种采用两阶段pH控制发酵生产花生四烯酸的方法 - Google Patents

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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
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Abstract

本发明公开了一种采用两阶段pH控制发酵生产花生四烯酸的方法，其以高山被孢霉为生产菌株，采用两阶段pH控制策略，发酵前期调节发酵液pH为4-6，待菌株由生长型转变至油脂积累型后调节发酵液pH为5-8进行发酵培养。利用本发明能显著提高花生四烯酸的产量。

Description

一种采用两阶段pH控制发酵生产花生四烯酸的方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及发酵过程控制，特别是一种两阶段pH控制策略，应用于花生四烯酸的发酵生产。
背景技术
花生四烯酸(Arachidonic acid，C20:4，简称ARA)，属于ω-6系列多不饱和脂肪酸(PUFAs)，对于维持人体正常的生理活动有着十分重要的作用。它不仅作为一种极为重要的结构脂类广泛存在于哺乳动物的组织器官中，而且是人体***素合成的重要前体物质，具有广泛的生物活性和重要的营养作用，已经在食品、医药和化妆品领域得到广泛的应用。另外，花生四烯酸对婴儿的神经及生理的发育必不可少，对生长发育和视网膜的功能完善具有重要意义，被认为人类早期发育的必需营养素。***在1994年正式批准,可在婴幼儿配方食品中添加花生四烯酸,1999年正式批准花生四烯酸作为新型营养强化剂。目前,花生四烯酸已经被世界卫生组织等国际权威机构推荐,作为营养补充添加到婴儿配方奶粉中。花生四烯酸的传统来源主要是鱼油、蛋黄、动物组织等，其缺点是含量低且产量不稳定，难以满足社会的大量需求。而微生物具有生长速度快、培养方式简单、油脂成分单一等特点，故利用微生物发酵是工业生产花生四烯酸的主流手段。高山被孢霉是被孢霉属的一种丝状真菌，由于其所含的油脂及花生四烯酸含量均较高，故利用高山被孢霉发酵产花生四烯酸具有很大的应用价值。
国内外学者利用高山被孢霉发酵产花生四烯酸的研究主要集中在两个方面：发酵条件的控制以及菌株的选育和分子改造。但究竟如何提高花生四烯酸产量还亟待研究。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有控制发酵生产花生四烯酸的方法中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的一个目的是解决现有技术中的不足，本发明提供了一种采用两阶段pH控制发酵生产花生四烯酸的方法。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种采用两阶段pH控制发酵生产花生四烯酸的方法，其以高山被孢霉为生产菌株，采用两阶段pH控制策略，发酵前期调节发酵液pH为4-6，待菌株由生长型转变至油脂积累型后调节发酵液pH为5-8进行发酵培养。
作为本发明所述的采用两阶段pH控制发酵生产花生四烯酸的方法的一种优选方案，其中：以高山被孢霉为出发菌株，接种至活化斜面，25℃培养7-8天后，加入无菌水后用接种环刮取斜面的菌丝体和孢子制备成孢子悬液，孢子悬液接种到种子培养基，25℃，200rpm培养36-40h；按10-15％的接种量接种至装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，发酵条件为：25℃，搅拌转速250rpm，空气流量为1.0-1.2m3/m3发酵液/min。
作为本发明所述的采用两阶段pH控制发酵生产花生四烯酸的方法的一种优选方案，其中：使用NaOH/HCl、氨水、氨气、硝酸铵或氢氧化铵控制初始发酵前期的pH为4-6；待发酵至油脂快速积累期时期，使用NaOH/HCl、氨水、氨气、硝酸铵或氢氧化铵控制调节pH至5-8，一直维持稳定于该pH持续到发酵结束。
利用本发明能显著提高花生四烯酸的产量。通过两个阶段分别控制pH，最终使花生四烯酸产量达到8.2g/L，提高了32％。同时，两阶段pH控制提高了葡萄糖和氮源的利用率，可以缩短发酵周期，降低生产成本。本发明所提供的两阶段pH控制发酵策略简单、经济、高效，不需要增加额外发酵设备，是根据菌体代谢特性调整相关的发酵工艺，实现花生四烯酸的快速积累，有着重要的工业应用价值，同时对其他产油真菌发酵生产微生物油脂有一定的指导意义。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面通过本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
该方法以高山被孢霉(Mortierela alpina)为生产菌株，采用两阶段分别控制pH的发酵策略，提高了花生四烯酸的生产效率。在发酵第一阶段(0-48h)控制pH为4-6，使菌体细胞快速增殖，在发酵第二阶段(48h后)控制pH为5-8，使其处于最佳的花生四烯酸合成环境。具体方法如下：
(1)菌株的活化：将高山被孢霉菌株在斜面培养活化7-8天后，加入一定体积的无菌水，用接种环刮下菌丝及孢子，经震荡过滤后获得高山被孢霉的孢子悬液；
(2)种子培养：将高山被孢霉孢子悬液(108个/mL)接种于种子培养基中，接种量为每50mL培养基接种1mL孢子悬液，25℃，200rpm培养36-40h，获得种子培养液；
(3)发酵培养：将种子培养液接种到装有发酵培养基的发酵罐进行发酵。具体参数为：装液量60％，接种量15％，温度25℃，通气量1.0-1.2m3/m3发酵液/min，搅拌转速为250rpm。
(4)pH控制：使用NaOH/HCl、氨水、氨气、硝酸铵或氢氧化铵控制初始发酵前期的pH为4-6；待发酵至油脂快速积累期时期(48h)，使用NaOH/HCl、氨水、氨气、硝酸铵或氢氧化铵控制调节pH至5-8，一直维持稳定于该pH持续到发酵结束。
(5)油脂的提取：发酵结束后，将发酵液进行真空抽滤，湿菌体在60℃下恒重。将烘干后的菌丝体研磨至均匀粉末后，利用有机溶剂(正己烷、氯仿/甲醇)进行油脂的提取，获得含有高浓度花生四烯酸的菌油。
上述菌株活化培养基为PDA培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000g，pH自然。
上述种子培养基成分为(g/L):葡萄糖30，酵母膏20，磷酸二氢钾0.1；
上述发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖80，酵母膏30，磷酸二氢钾0.1，七水硫酸镁2。
上述获得孢子悬液的方法具体为：将刮下的菌丝体和孢子混合液在无菌条件下转移至已经灭菌处理过的铺有玻璃珠(3-4mm)的250mL锥形瓶中，玻璃珠厚度在0.5mm左右。25℃，200rpm条件下在摇床震荡20min，然后用4层无菌的擦镜纸进行过滤，可得到分散均匀的孢子悬液。
上述方法中涉及的相关参数测定：
生物量的测定：将发酵液真空抽滤，蒸馏水洗涤3次，置于60℃烘干过夜，称重。
油脂提取方法：将干菌体研磨成粉末，用浓盐酸75℃破壁1h，用正己烷分3次提取粗菌油，最后用氮气吹干溶剂，称重。
脂肪酸测定：脂肪酸甲酯化：取菌体油脂0.1g，加入0.5M NaOH-甲醇溶液2mL，65℃水浴30min。冷却室温后加入2mL三氟化硼-甲醇溶液(体积比为1:3)，70℃水浴震荡5min。加入2mL正己烷振荡分层，加入1mL饱和NaCl溶液，吸取上清液加入无水Na2SO4离心后进行气相分析。
气相色谱工作条件：气相色谱分析采用GC2014(日本岛津)，色谱柱：P/N053187(30m×0.32mm,0.22μm)；FID检测器，吹扫流量3.0mL/min；进样口和检测器温度为250℃；分流方式进样1μL，分流比50:1，载气为氮气。
对照实施例1维持发酵液pH＝4-6积累花生四烯酸
以高山被孢霉(Mortierella alpina)为生产菌株，接种至PDA斜面，25℃条件下活化7天。待斜面长满菌丝和孢子后，用15mL无菌水洗下菌丝，并制成孢子悬液，接种到种子培养基中，25℃，200rpm培养36h；按15％的接种量接种至发酵罐中进行发酵，发酵条件为：装液量60％，接种量15％，温度25℃，通气量1.0-1.2m3/m3发酵液/min，搅拌转速为250rpm，使用NaOH/HCl、氨水、氨气、硝酸铵或氢氧化铵控制控制整个发酵过程的pH为4-6，发酵周期为8天。发酵结束后测定生物量、油脂含量及花生四烯酸含量。其中培养基配方如下：
种子培养基成分为(g/L):葡萄糖30，酵母膏20，磷酸二氢钾0.1；
发酵培养基成分为(g/L):葡萄糖80，酵母膏30，磷酸二氢钾0.1，七水硫酸镁2。
对照实施例2维持发酵液pH＝5-8积累花生四烯酸
发酵方法、条件除以下变动之外，其余同对照实施例1：发酵过程用NaOH/HCl、氨水、氨气、硝酸铵或氢氧化铵控制控制整个发酵过程的pH为5-8。发酵结束后测定生物量、油脂含量及花生四烯酸含量。
对照实施例3维持发酵液pH自然条件下积累花生四烯酸
发酵方法、条件除以下变动之外，其余同对照实施例1：整个发酵过程不调节pH，仅初始pH调节至4-6。发酵结束后测定生物量、油脂含量及花生四烯酸含量。
实施例1两阶段pH控制策略积累花生四烯酸
发酵方法、条件除以下变动之外，其余同对照实施例1：使用NaOH/HCl、氨水、氨气、硝酸铵或氢氧化铵控制控制初始发酵前期的pH为4-6；待发酵至油脂快速积累期时期(48h)，使用NaOH/HCl、氨水、氨气、硝酸铵或氢氧化铵控制调节pH至5-8，一直维持稳定于该pH持续到发酵结束。发酵结束后测定生物量、油脂含量及花生四烯酸含量。
其中以上每个实例生物量的测定方法为：将发酵液真空抽滤，蒸馏水洗涤3次，将湿菌体置于60℃烘箱中烘干过夜，称重。生物量的计算公式为：
油脂提取方法：称取一定质量的干菌体，将干菌体研磨成粉末，用浓盐酸75℃破壁1h，用2mL正己烷分3次提取粗菌油，最后用氮气吹干溶剂，称重，得到油脂的相对含量：
脂肪酸测定：脂肪酸甲酯化：取菌体油脂0.1g，加入0.5M NaOH-甲醇溶液2mL，65℃水浴30min。冷却室温后加入2mL三氟化硼-甲醇溶液(体积比为1:3)，70℃水浴震荡5min。加入2mL正己烷振荡分层，加入1mL饱和NaCl溶液，吸取上清液加入无水Na2SO4离心后进行气相检测分析，利用面积归一化法得到花生四烯酸的相对含量，并计算最终花生四烯酸产量：
花生四烯酸产量(g/L)＝生物量×油脂相对含量×花生四烯酸相对含量
气相色谱工作条件：气相色谱分析采用GC2014(日本岛津)，色谱柱：P/N053187(30m×0.32mm,0.22μm)；FID检测器，吹扫流量3.0mL/min；进样口和检测器温度为250℃；分流方式进样1μL，分流比50:1，载气为氮气。
残留葡萄糖浓度测定：采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定。
两阶段pH控制策略与对照组相比：
(1)对照实施例1(恒定pH 4-6)中花生四烯酸产量为6.4g/L，对照实施例2(恒定pH 5-8)中花生四烯酸产量为7.4g/L，对照实施例3(pH自然)中花生四烯酸产量为6.2g/L，实施例1(两阶段pH控制)中花生四烯酸产量提高到8.2g/L，比对照组分别提高了28.1％、10.8％和32.3％；
(2)对照实施例1(恒定pH 4-6)中葡萄糖利用率为87.5％，对照实施例2(恒定pH 5-8)中葡萄糖利用率91.2％，对照实施例3(pH自然)中葡萄糖利用率为85.3％，实施例1(两阶段pH控制)葡萄糖利用率提高到100％，比对照组分别提高了14.3％、9.6％和17.2％。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (3)

1.一种采用两阶段pH控制发酵生产花生四烯酸的方法，其特征在于：以高山被孢霉为生产菌株，采用两阶段pH控制策略，发酵前期调节发酵液pH为4-6，待菌株由生长型转变至油脂积累型后调节发酵液pH为5-8进行发酵培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：以高山被孢霉为出发菌株，接种至活化斜面，25℃培养7-8天后，加入无菌水后用接种环刮取斜面的菌丝体和孢子制备成孢子悬液，孢子悬液接种到种子培养基，25℃，200rpm培养36-40h；按10-15％的接种量接种至装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵，发酵条件为：25℃，搅拌转速250rpm，空气流量为1.0-1.2m3/m3发酵液/min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：使用NaOH/HCl、氨水、氨气、硝酸铵或氢氧化铵控制初始发酵前期的pH为4-6；待发酵至油脂快速积累期时期，使用NaOH/HCl、氨水、氨气、硝酸铵或氢氧化铵控制调节pH至5-8，一直维持稳定于该pH持续到发酵结束。
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