CN104651389A - 一种脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法,具体为:1)采摘菌褶未破的幼嫩蘑菇子实体,清洁表面后,收集菌褶组织并切成块;2)将脂质体和质粒混匀,于-5-5℃放置15-60min;3)将步骤2)产物用无菌超纯水稀释1000倍,与菌褶组织块混匀,室温放置80-120min;4)将步骤3)所得产物加入到RCM固体培养基中,室温培养8-12d;5)将萌发的双孢蘑菇菌褶组织块转移到含潮霉素的PDA平板上,室温培养10-20d;6)切下新生长的菌丝块移植到PDA斜面培养,传代培养2-5次,再转接到含潮霉素的PDA平板上,能够正常生长的即为转化子。该方法具有操作简便、转化率高、转化子稳定等优点。
Description
技术领域
本发明属于脂质体转化技术领域,具体涉及一种脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法。
背景技术
双孢蘑菇(Agaricus bisporus)又称白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇,是世界上栽培最广泛、生产量和消费量最大的食用菌,产量约占世界食用菌总产量的3/4。然而,双孢蘑菇的遗传转化一直缺乏简便有效的方法。双孢蘑菇遗传转化方法先后报道的有原生质体电转化法、原生质体PEG介导转化法、基因枪法轰击双孢蘑菇的菌丝体和子实体、及农杆菌介导的菌褶转化法,把外源基因转入双孢蘑菇菌株中。这些方法普遍存在操作繁琐、装置复杂、转化率低、转化子不稳定等缺点。有些方法需要制备原生质体,制备过程复杂,如原生质体电转化法和PEG介导的原生质体转化法。有些方法不需要制备原生质体,但装置复杂、转化成本高,如基因枪转化法。有些方法的转化率不稳定,转化率受多种因素的影响,如农杆菌转化法转化率受农杆菌菌株类型、质粒载体类型及两者间的匹配情况、培养基成分及诱导条件等多种因素的影响。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术不足,提供一种脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法,该方法操作简便快捷、转化率高、转化子遗传稳定,不需要复杂装置。
为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法,其包括以下步骤:
1)采摘菌褶未破的幼嫩双孢蘑菇子实体,清洁表面后,收集菌褶组织并切成块,获得菌褶组织块;
2)将脂质体Lipofectamine TM 2000和质粒pBHg-dsACO混匀,于-5-5℃放置15-60 min;
3)将步骤2)产物用无菌超纯水稀释1000倍,然后与步骤1)菌褶组织块混匀,室温(25±5℃)放置80-120 min;
4)将步骤3)所得产物加入到RCM固体培养基中,20-30℃培养8-12d;
5)将萌发的双孢蘑菇菌褶组织块转移到含潮霉素的PDA平板上,20-30℃培养10-20d;
6)切下新生长的菌丝块移植到PDA斜面进行培养,如此传代培养2-5次,再转接到含潮霉素的PDA平板上,能够正常生长的即为转化子。可将转化子接种到常规PDA斜面进行培养和保存。
具体的,所述步骤2)中将1 μL脂质体Lipofectamine TM 2000和2-3 μg质粒pBHg-dsACO混匀。
所述步骤4)中的RCM固体培养基组成为:胰蛋白胨2.0 g,酵母提取物2.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,K2HPO4 0.46 g,KH2PO4 1 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,甘露醇109.3 g,蒸馏水1000 mL,pH 7.0。
所述步骤5)和6)中的PDA平板含潮霉素浓度为20-100 μg/mL。
和现有技术相比,本发明所述的双孢蘑菇脂质体介导转化菌褶方法具有操作简便、快捷,转化率高,转化子遗传稳定,且不需要制备原生质体,不需要复杂装置等优点。
附图说明
图1为质粒pBHg-dsACO的物理图谱;
图2为双孢蘑菇的转化子;CK:AS2796出发菌株;箭头处为在复筛抗性板上长出的转化子;
图3为转化子的 PCR验证;A为hph 基因PCR结果;B为ACO基因PCR结果;图中,M:DNA Marker;WT:出发菌株 AS2796;p:质粒pBHg-dsACO;1-5,转化子;
图4为转化子ACO基因的半定量PCR分析;WT:出发菌株AS2796;1-5:转化子;**,与WT相比差异达到显著水平(p<0.01);
图5为转化子ACO酶活力测定结果;WT:出发菌株AS2796;1-5:转化子;WT:*,与WT相比差异达到显著水平(p<0.05);
图6为转化子乙烯合成量测定结果;WT:出发菌株AS2796;1-5:转化子;WT:*,与WT相比差异达到显著水平(p<0.05)。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明,但本发明的保护范围并不局限于此。
实施例1
1 实验材料
1.1 菌株
双孢蘑菇CGMCC NO.0214,来自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
1.2 质粒
质粒pBHg,购自美国 Sylvan 公司。质粒pBHg-dsACO由pBHg改造而成,含有潮霉素抗性基因(hph)表达框和双孢蘑菇1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶基因(ACO)部分序列双链RNA(ds RNA)的表达框,其物理图谱见图1,其中S-ACO的序列为:GAACCCACCCAGAACCTCTTAGGCCGTTCCTATCTGAAATCGACGATTTCTCGGATCAAATCCACTCTGATATAATTAACACAATTCTTCGCCTCATCGCAATGAGCTTGGAGCTAGATGAAGATTACTTCATCCAAATGCATGATCGTTCTGCGAACGCAGAAACATTCCTCCGGTTTGTGAATTATTTCCCTCATCCAGAAGAAGAAGAGAATAAATCCGGCGGAGTCTGGTTGAAAGGACATACTG,R-ACO的序列为:ACCTAGCAGCCGAACATCATCGGGGGACAGTCCTTAAGTTAACGGAGAGGTTATAACTGTTCTTGAGGTAAGAGTTGCACGAACTGGGTGAAGGTAACGGGTAGAAATCAGTAATAGACCTCCCTACGATGACCGACCGACTTATCGTTGCAATCGCAGTATTTCAGTCATACAGGAAAGTTGGTCTGAGGCGGCCTAAATAAGAGAAGAAGAAGACCTACTCCCTTTATTAAGTGTTTGGCCTCCTTACAAAGACGCAAGCGTCTTGCTAGTACGTAAACCTACTTCATTAGAAGTAGATCGAGGTTCGAGTAACGCTACTCCGCTTCTTAACACAATTAATATAGTCTCACCTAAACTAGGCTCTTTAGCAGCTAAAGTCTATCCTTGCCGGATTCTCCAAGACCCACCCAAG。具体改造方法为本领域常规技术,可参见文献(Smith, N. A., Singh, S. P., Wang, M. B., Stoutjesdijk, P. A., Green, A. G., & Waterhouse, P. M. (2000). Gene expression: Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature, 407(6802), 319-320)。其中,优选按下述方法构建质粒pBHg-dsACO:
质粒pBHg-dsACO由双孢蘑菇ACO基因CDS部分序列双链RNA(dsRNA)的表达框***质粒 pBHg的多克隆位点处构建而成。双孢蘑菇ACO基因CDS部分序列dsRNA表达框由四个DNA片段经酶切酶连得到,四个DNA片段分别是双孢蘑菇3-磷酸甘油脱氢酶基因gpd启动子、双孢蘑菇ACO基因CDS部分正向序列S-ACO、双孢蘑菇ACO基因CDS部分反向序列R-ACO和CaMV35S基因的终止序列T35S。S-ACO和R-ACO二者有248 bp的重复序列。gpd启动子的PCR扩增使用的引物是GPD-U、GPD-D(表1),模板是质粒pBHg,PCR扩增条件:94℃预变性5 min,94℃ 40 s、55℃ 1 min、72℃ 1 min共30个循环,72℃延伸10 min。扩增S-ACO和R-ACO使用的引物是S-ACO-U、S-ACO-D和R-ACO-U、R-ACO-D,依据双孢蘑菇AS2796 ACO基因cDNA序列(GeneBank登录号JQ314344.1)设计,模板是双孢蘑菇AS2796的总RNA经采用MMLV Reverse Transcriptase 1st-Strand cDNA Synthesis Kit合成的cDNA。PCR扩增条件:94℃预变性5 min,94℃ 40 s、56℃ 1 min、72℃ 1 min共30个循环,72℃延伸10 min。T35S扩增使用的引物是T35S-U、T35S-D(表1),模板是质粒pBHg,PCR扩增条件:94℃预变性5 min,94℃ 40 s、55℃ 1 min、72℃ 1 min共30个循环,72℃延伸10 min。
用KpnI 单酶切gpd启动子和R-ACO片段,用 ApaLI单酶切T35S和S-ACO片段,纯化回收后用T4连接酶分别连接gpd启动子和R-ACO片段及T35S和S-ACO片段。以酶连产物为模板,用GPD-U、R-ACO-D为引物,PCR扩增gpd启动子+R-ACO片段,用T35S-D和S-ACO-D为引物,PCR扩增S-ACO+T35S片段,PCR扩增条件均是:94℃预变性5 min,94℃ 40 s、55℃ 1 min、72℃ 1 min共30个循环,72℃延伸10 min。PCR产物纯化回收,分别将gpd启动子+R-ACO片段和S-ACO+T35S片段与pMD19-T simple 载体相连,转入E. coli JM109,培养后提取得到二个重组质粒。二个重组质粒用SalI/ NcoI分别双酶切,纯化回收含gpd启动子+R-ACO片段的质粒酶切后的大片段、含S-ACO+T35S的质粒酶切后的小片段,并用T4连接酶连接,得到克隆载体pMD19-dsACO。将pMD19-dsACO转入E. coli JM109,培养增殖后提取克隆载体pMD19-dsACO。用SalI/BamHI 双酶切质粒pBHg和pMD19-dsACO,分别回收大片段和小片段,用T4连接酶将大、小片段进行酶连,得到表达质粒pBHg-dsACO(图1),转化入E. coli HA105中,经增殖培养后提取质粒pBHg-dsACO,用于转化双孢蘑菇菌褶。
1.3 培养基
PDA固体培养基:马铃薯200 g(去皮切块加水煮沸20 min用四层纱布过滤取滤液),琼脂20 g,葡萄糖 20 g,蒸馏水1000 mL。
PD液体培养基:马铃薯200 g(去皮切块加水煮沸20 min用四层纱布过滤取滤液),葡萄糖 20 g,蒸馏水1000 mL。
RCM固体培养基:胰蛋白胨2.0 g,酵母提取物2.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,K2HPO4 0.46 g,KH2PO4 1 g,葡萄糖 20 g,琼脂 20 g,甘露醇109.3 g,蒸馏水1000 mL,pH 7.0。
1.4 脂质体
脂质体Lipofectamine TM 2000购自invitorgen公司。
2.1 实验方法
一种脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法,其包括以下步骤:
1)采摘菌褶未破的幼嫩蘑菇子实体,清洁表面后,收集菌褶组织并切成细块,获得菌褶组织细块,把菌褶组织细块加入到50 mL无菌的离心管中;
2)将1 μL脂质体Lipofectamine TM 2000和2.5 μg质粒pBHg-dsACO混匀,0℃放置30 min;
3)将步骤2)产物用无菌超纯水稀释1000倍,然后转入到装有菌褶组织细块的离心管中(以淹没菌褶组织细块为宜),混匀,25℃放置100 min;
4)将步骤3)所得产物加入到RCM固体培养基中,倒平板,25℃倒置培养10d;
5)将萌发的双孢蘑菇菌褶组织块转移到含30 μg/mL潮霉素的PDA平板上,25℃培养2周;
6)切下新生长的菌丝块移植到常规PDA斜面进行培养,如此传代培养3次,再转接到含30 μg/mL潮霉素的PDA平板上,能够正常生长的即为转化子(见图2)。
2.2 转化子的PCR鉴定
选取长势良好的5个转化子,转接到PDA液体培养基中,摇瓶培养。收集菌丝,采用CTAB法提取转化子菌丝的基因组DNA,以提取的基因组DNA为模板,用hph基因和ACO基因的CDS的特异性引物进行PCR扩增验证。
hph基因扩增引物是hph-F(5′-CTATTCCTTTGCCCTCGG-3′)和hph-R(5′-ATGAAAAAGCCTGAA CTCACC-3′)。扩增条件:94℃预变性5 min,94℃ 40 s、50℃ 1 min、72℃ 1 min共30个循环,72℃延伸10 min。
ACO基因的CDS扩增引物是T4-F(5′-GAACCCACCCAGAACCTC-3′)和T4-R(5′-ATGTTCGGCTGTTAGGTA-3′)。扩增条件:94℃预变性5 min,94℃45 s、52℃ 1 min、72℃ 30 s共30个循环,72℃延伸10 min。
分别取5 μl PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明(见图3):均能扩增出hph基因(产物大小为750 bp)和ACO基因产物(产物大小为416 bp)。
2.3 转化子ACO基因表达量的半定量PCR分析
随机选取5个转化子,采用Trizol法提取转化子菌丝的总RNA。利用宝生物工程(大连)有限公司提供的AMV Reverse Transcriptase试剂盒进行反转录,合成cDNA第一链。
ACO基因扩增用引物是T4-F(5′-GAACCCACCCAGAACCTC-3′)和T4-R(5′-ATGTTCGGCTGTTAGGTA-3′)。内参基因GAPDH扩增引物是GAPDH-F(5′-TCACGCCACCACCGCTACTCAA-3′)和GAPDH-R(5′-CGGGCTTCTCAAGACGAACAACAA-3′),扩增产物大小分别为416 bp和200 bp。扩增条件均为:94℃预变性5 min,94℃ 30 s、52℃ 30 S、72℃ 45 S共26个循环,72℃延伸10 min。
取5 μl PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,用凝胶成像***照相并用Gel Base/Gel Blot Support软件分析各电泳条带的灰度值。结果表明(见图4):5个转化子的ACO基因表达水平显著降低,比出发菌株降低47-74%。
2.4 转化子ACO氧化酶酶活性测定
将随机选取的5个转化子,转接到PD液体培养基中,摇瓶培养20 d。离心收集菌丝球,取1g新鲜的双孢蘑菇菌丝球样品放入20 mL试管中,再加入3 mL Mops缓冲液(100 mmol /L,pH7.2),混匀;每个转化子做6个重复。向作为空白对照的试管中加50 μL无菌水。其余试管中则加入50 μL 含50mmol/L ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)的水溶液,并立即用橡皮塞密封,并用注射器加入CO2使试管中的CO2体积约达到5%。然后将试管置于26℃水浴中反应30 min。用气密针抽取1 mL试管内的气体样品,用气相色谱仪测定乙烯生成量,从而计算出ACC氧化酶活性。以在26℃条件下1h每毫克蛋白产生乙烯的纳摩数表示为1个酶活力单位(U)。
结果表明(见图5):与出发菌株相比,5个转化子的ACO酶活力显著降低,酶活力降低68-86%。
2.5 转化子乙烯合成量测定
将双孢蘑菇的出发菌株与转化子分别接种到PD液体培养基中,于25℃、160 r/min 条件下进行培养,每种处理做6个重复。培养20 d时,打开封口膜在无菌条件下吹4 h(用以除去乙烯),密封培养8 h后,利用气相色谱法测定各样品中乙烯含量,进样量为1 mL。气相色谱条件:Agilent 7890型气相色谱仪;色谱柱:HP-2 55%(毛细管柱)Phenyl Met hyl Siloxane Capillary 3010 m×320 μm×0.125 μm nominal,FID检测器,柱温100℃;氢离子火焰检测器(FID),检测器温150℃;载气N2流速50 mL/min,燃气H2流速50 mL/min,空气流速400 mL/min,保留时间为3.0 min。用进样针进1 mL乙烯样品在色谱仪上测定,气样的进样流速为115 mL/min,重复测定 6 次。
结果表明(见图6):与出发菌株相比,5个转化子的乙烯产量显著降低,乙烯产量降低27-48%。
2.6 共培养时间对菌褶萌发率的影响
1)采摘菌褶未破的幼嫩蘑菇子实体,清洁表面后,收集菌褶组织并切成细块,获得菌褶组织细块,把菌褶组织细块加入到50 mL无菌的离心管中;
2)将1 μL脂质体Lipofectamine TM 2000和2.5 μg质粒pBHg-dsACO混匀,0℃放置30 min;
3)将步骤2)产物用无菌超纯水稀释1000倍,然后转入到装有菌褶组织细块的离心管中(以淹没菌褶组织细块为宜),混匀,25℃放置20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min,共六个时间梯度用作对比;
4)将步骤3)所得产物加入到RCM固体培养基中,倒平板,25℃倒置培养一周,计算菌褶块的萌发数。
萌发率=菌褶块的萌发数/参与转化的菌褶块总数。结果见表2。随着共培养时间的增加,双孢蘑菇菌褶组织的萌发率不断升高。当共培养时间达到100 min后再延长共培养时间,萌发率升高较少,综合考虑共培养时间与萌发率的比例,确定共培养时间以100 min为最佳。
结论
由上述结果可以看出,本发明所述双孢蘑菇脂质体介导转化菌褶方法具有操作简便、转化率高、转化子稳定等优点。
Claims (4)
1.一种脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)采摘菌褶未破的幼嫩双孢蘑菇子实体,清洁表面后,收集菌褶组织并切成块,获得菌褶组织块;
2)将脂质体Lipofectamine TM 2000和质粒pBHg-dsACO混匀,于-5-5℃放置15-60 min;
3)将步骤2)产物用无菌超纯水稀释1000倍,然后与步骤1)菌褶组织块混匀,室温放置80-120 min;
4)将步骤3)所得产物加入到RCM固体培养基中,20-30℃培养8-12d;
5)将萌发的双孢蘑菇菌褶组织块转移到含潮霉素的PDA平板上,20-30℃培养10-20d;
6)切下新生长的菌丝块移植到PDA斜面进行培养,如此传代培养2-5次,再转接到含潮霉素的PDA平板上,能够正常生长的即为转化子。
2.如权利要求1所述脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法,其特征在于,所述步骤2)中将1 μL脂质体Lipofectamine TM 2000和2-3 μg质粒pBHg-dsACO混匀。
3.如权利要求1所述脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法,其特征在于,所述步骤4)中的RCM固体培养基组成为:胰蛋白胨2.0 g,酵母提取物2.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,K2HPO4 0.46 g,KH2PO4 1 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,甘露醇109.3 g,蒸馏水1000 mL,pH 7.0。
4.如权利要求1所述脂质体介导转化双孢蘑菇菌褶的方法,其特征在于,所述步骤5)和6)中的PDA平板含潮霉素浓度为20-100 μg/mL。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111349649A (zh) * | 2020-03-16 | 2020-06-30 | 三峡大学 | 一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0870835A1 (en) * | 1997-04-07 | 1998-10-14 | Unilever N.V. | Agrobacterium mediated transformation of moulds, in particular those belonging to the genus Aspergillus |
WO2002000896A2 (en) * | 2000-06-28 | 2002-01-03 | The Penn State Research Foundation | Method for transformation of agaricus bisporus |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0870835A1 (en) * | 1997-04-07 | 1998-10-14 | Unilever N.V. | Agrobacterium mediated transformation of moulds, in particular those belonging to the genus Aspergillus |
WO2002000896A2 (en) * | 2000-06-28 | 2002-01-03 | The Penn State Research Foundation | Method for transformation of agaricus bisporus |
Non-Patent Citations (5)
Title |
---|
RAN CHAI等: "Liposome-mediated mycelial transformation of filamentous fungi", 《FUNGAL BIOLOGY》 * |
SHICHANG CHEN等: "Effect of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase producing bacteria on the hyphal growth and primordium initiation of Agaricus bisporus", 《FUNGAL ECOLOGY》 * |
XI CHEN等: "A Fruiting Body Tissue Method for Efficient Agrobacterium-Mediated Transformation of Agaricus bisporus", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
张岩 等: "脂质体介导遗传转化双孢蘑菇菌褶及1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶基因(ACO)功能初探", 《农业生物技术学报》 * |
曹育博 等: "基因枪法遗传转化双孢蘑菇菌褶", 《食用菌学报》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111349649A (zh) * | 2020-03-16 | 2020-06-30 | 三峡大学 | 一种用于双孢蘑菇的基因编辑的方法及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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Granted publication date: 20170606 Termination date: 20181229 |
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