CN109055620B

CN109055620B - 同时检测大豆中cmv、smv和bcmv三种病毒的引物及其检测方法

Info

Publication number: CN109055620B
Application number: CN201811242333.XA
Authority: CN
Inventors: 尚静; 赵兰; 张磊; 杨文钰; 贾琦; 张敏; 杨辉; 孔凡磊; 常小丽; 杜俊波; 余靓; 雍太文
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2018-10-24
Filing date: 2018-10-24
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2038-10-24
Also published as: CN109055620A

Abstract

本发明公开了一种同时检测大豆中CMV、SMV和BCMV三种病毒的引物及其检测方法。该方法包括以下步骤：(1)设计引物，引物序列如SEQ ID NO.1～6；(2)提取大豆叶片RNA，并反转录制备cDNA；(3)以步骤(2)所得cDNA为模板，采用步骤(1)中所述引物进行多重PCR检测。本发明设计的引物特异性强，灵敏度高，使得大豆病毒的检测速度大大提高，尤其是在待测样品数量很大时为解决大豆病毒引起的大豆产量大幅度降低甚至绝收等问题提供了极大的便利。

Description

同时检测大豆中CMV、SMV和BCMV三种病毒的引物及其检测方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种同时检测大豆中CMV、SMV和BCMV三种病毒的引物及其检测方法。

背景技术

大豆(Glycinemax(L.)Merr)是我国重要的粮油作物。据统计，2017年进口大豆9552.6万吨，进口依存率超过87.7％，提高国内大豆产量迫在眉睫。但大豆种植过程中，多种病虫害严重影响大豆的生长发育与产量，其中由病毒引发的损失十分严重。病毒侵染后，大豆植株生长受阻，植株矮小，单株结荚数减少，产量下降，商品质量下降。严重发生时，大豆结荚少或不结荚，褐斑粒多.一般减产25％以上。受害严重者高达95％，几近绝收。

侵染大豆的病毒有50多种，其中，普遍认为大豆花叶病(Soybean mosaic virus，SMV)是在大豆上发生最普遍、危害最严重的病原，另外黄瓜花叶病毒Cucumber mosaicvirus，CMV)和菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus，BCMV)也是侵染大豆较为严重的病毒病原。大豆花叶病毒能存种子带毒是主要的初侵染来源。带毒种子发芽生长发育成幼苗后，茎、叶、芽都可能带毒并表现出受害症状，成为病株，然后在田间再通过蚜虫传毒和摩擦传毒造成田间多次再侵染。在研究和解决大豆相关问题的过程中，对大豆病毒的检测是必不可少的一个环节，但如果每次都进行单独检测，会浪费大量人力、物力和财力，而且会拉缓实验进程，因此想到了采用多重PCR技术同时检测大豆中常见的三种病毒来解决以上问题。相对单一PCR而言，多重PCR具有极大的优越性：一次PCR反应中能同时检测多个基因型，因而高效、快捷、经济；PCR反应中高度特异敏感，因而保证了扩增结果的准确、可靠；试验操作简单、程序化、耗时少。在一定程度上加速了试验进程。自1988年charnberian等首先报道了用多重PCR诊断杜式肌营养不良症(DMD)以来，多重PCR技术迅速在动物、微生物以及人类研究方面得到广泛应用。然而，多重PCR技术在植物生物学研究方面起步较晚，研究与应用相对较少。目前，随着对多重PCR技术认识的加深和研究的深入，越来越多的人热衷于研究多重PCR技术在植物生物学中的应用，例如葡萄、库尔勒香梨、白菜、烟草、棉花、番茄等。

黄瓜花叶病毒(CMV)、大豆花叶病毒(SMV)和菜豆普通花叶病毒(BCMV)属于世界性病毒病害，是大豆生长过程中发生最为普遍，危害严重的病毒，严重影响大豆的培育和产量，由此，在大豆生长培育过程中，需减轻病毒的危害。而病毒检测监控是减轻病毒危害措施中的一个重要环节。目前的检测监控方法主要有常规生物学检测、免疫学及分子生物学检测方法，但都存在不同程度的缺陷和不足，且并未发现有能够同时检测黄瓜花叶病毒(CMV)、大豆花叶病毒(SMV)和菜豆普通花叶病毒(BCMV)三种病毒的方法。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种同时检测大豆中CMV、SMV和BCMV三种病毒的引物及其检测方法，能够快速精确的同时检测出大豆中常见的三种病毒。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种同时检测大豆中CMV、SMV和BCMV三种病毒的引物，由于三对引物之间的熔解温度可能比较接近，序列可能会出现互补等因素，干扰扩增效果，由此，经筛选后，选用CMV-870bp、SMV-550bp和BCMV-288bp三个基因片段来设计引物，引物的具体序列如下：

CMV-F:GGATGCTTCTCCRCGAGDT；

CMV-R:GCTGGATGGACAACCCGTTC；

SMV-F:AGCTCGCTTCGTCTGGAAAA；

SMV-R:ATCATCACCCACACGCCATT；

BCMV-F:GCAACAAAGGAAAAGGYCCTGA；

BCMV-R:CATACTCGCCCTTCACAGCA。

2.一种同时检测大豆中CMV、SMV和BCMV三种病毒的方法，，包括以下步骤：

(1)提取大豆叶片RNA，反转录制备cDNA；

(2)以步骤(2)所得cDNA为模板，采用权利要求1中所述引物进行多重PCR检测。

进一步地，步骤(2)中所述反转录体系为：oligo(dT)₁₈或CMV-R 2μL、大豆叶片RNA4μL、RT buffer 2μL、RNase inhibitor 0.2μL、M-MLV 0.2μL、dNTP1μL，最后用ddH₂O补足至10μL。

进一步地，步骤(3)中所述PCR体系为：Mix 12.5μL、混合引物2μL、cDNA1μL，最后用ddH₂O补足至25μL。

进一步地，混合引物包括等量均匀混合的CMV-F、CMV-R、SMV-F、SMV-R、BCMV-F，以及BCMV-R。

进一步地，步骤(3)中所述PCR反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

本发明的有益效果为：

本发明检测用的引物特异性强，灵敏度高，且引物之间没有相互干扰，能一次性检测出大豆中常见的三种病毒，大大提升了大豆病毒的检测速度。

因此，本项目是为了使大豆病毒的检测操作更加方便快捷，为解决因大豆病毒引起的大豆产量大幅度降低等实际生产生活中遇到的问题奠定基础，同时可以加快解决问题的研究进程，达到从根本上解决问题的目的。

附图说明

图1为引物特异性检测图；

图2为三种引物检测大豆病毒的电泳结果图；

图3为引物灵敏度检测图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例

1、设计引物

由于三对引物之间的熔解温度可能比较接近，序列可能会出现互补等因素，干扰扩增效果，由此，经筛选后，选取CMV-870bp、SMV-550bp和BCMV-288bp三组保守基因序列片段设计引物，其具体序列如下：

CMV-F:GGATGCTTCTCCRCGAGDT；(SEQ ID NO.1)

CMV-R:GCTGGATGGACAACCCGTTC；(SEQ ID NO.2)

SMV-F:AGCTCGCTTCGTCTGGAAAA；(SEQ ID NO.3)

SMV-R:ATCATCACCCACACGCCATT；(SEQ ID NO.4)

BCMV-F:GCAACAAAGGAAAAGGYCCTGA；(SEQ ID NO.5)

BCMV-R:CATACTCGCCCTTCACAGCA。(SEQ ID NO.6)

2、提取大豆叶片中的RNA

取大豆叶片约0.2g，加液氮研磨至粉末状，转入Ep管(置于冰上)中，加入0.5mLRNA提取缓冲液和0.5mL酚/仿/异戊醇溶液，漩涡匀浆；于2℃、12000rpm离心10min；取上清液置于另一Ep管中，加入两倍体积4M LiCl，-20℃环境下沉淀12h(沉淀2h以上即可，一般沉淀时间越长，浓度越高)；于2℃、12000rpm离心10min，弃上清液；加入70％冰乙醇洗涤离心两次，弃上清液，真空干燥，加入30-40μL无菌水备用。

3、反转录

取一支洁净干燥的Ep管，加入2μL oligo(dT)₁₈或CMV-R，再加4μL提取的RNA，在72℃水浴5min，之后迅速冰浴冷却5min，每Ep管中加入2μL RT buffer、0.2μL RNaseinhibitor、0.2μL M-MLV、1μL dNTP、0.6μL ddH2O，于42℃水浴60min，-20℃保存。其中，oligo(dT)₁₈、RT buffer、RNase inhibitor、M-MLV和dNTP均购至生工生物工程股份有限公司。

4、引物特异性检测

用上述引物分别扩增携带CMV、SMV和BCMV病毒的不同采集样品，扩增体系均为：Mix 12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、底物cDNA 1μL，最后用双蒸水补足至25μL；其中，Mix、上游引物和下游引物均购至诺唯赞生物科技有限公司；

扩增条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min；其检测结果见图1。

由图1可知，3种病毒均可扩增到预期大小的目的条带，并且3对引物扩增的目的条带均明亮清晰，无非特异性扩增条带出现。同时，空白对照均无扩增，由此可得所选的3对引物具有强特异性。

5、多重PCR检测

以步骤3所得cDNA为模板，采用步骤1中的引物进行多重PCR检测，经优化后的反应体系为：Mix 12.5μL、混合引物2μL(混合引物包括等量均匀混合的CMV-F、CMV-R、SMV-F、SMV-R、BCMV-F，以及BCMV-R)、cDNA 1μL，最后用ddH₂O补足至25μL；

经优化后的反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

最后取5μL多重PCR产物，于1％的琼脂糖凝胶电泳，其结果见图2。

如图2所示，三条条带(CMV-870bp、SMV-550bp和BCMV-288bp)均明亮清晰，且无杂带，其中SMV条带最亮，BCMV次之，CMV最淡，但不影响判断，由此可见，多重PCR具有较强的特异性，能够同时检测三种病毒，方便快捷。

6、引物灵敏性检测

分别将步骤3制备得到的cDNA稀释1倍，10倍，100倍，1000倍，10000倍后，进行步骤4所述的多重PCR检测，其检测结果见图3。

如图3所示，其中1～5号条带分别对应稀释1倍、10倍、100倍、1000倍和10000倍后的cDNA，1～5号条带亮度逐渐降低，但不影响判断，由此说明三队引物的灵敏度较高。

综上所述，本发明建立了一种快速检测大豆中三种常见病毒的多重PCR法，使得大豆病毒的检测速度大大提高，尤其是在待测样品数量很大时为解决大豆病毒引起的大豆产量大幅度降低甚至绝收等问题提供了极大的便利。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 同时检测大豆中CMV、SMV和BCMV三种病毒的引物及其检测方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggatgcttct ccrcgagdt 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gctggatgga caacccgttc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agctcgcttc gtctggaaaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atcatcaccc acacgccatt 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcaacaaagg aaaaggycct ga 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catactcgcc cttcacagca 20

Claims

1.一种同时检测大豆中CMV、SMV和BCMV三种病毒的引物，其特征在于，其引物序列如下：

CMV-F: GGATGCTTCTCCRCGAGDT；

CMV-R: GCTGGATGGACAACCCGTTC；

SMV-F: AGCTCGCTTCGTCTGGAAAA；

SMV-R: ATCATCACCCACACGCCATT；

BCMV-F: GCAACAAAGGAAAAGGYCCTGA；

BCMV-R: CATACTCGCCCTTCACAGCA。

2.一种同时检测大豆中CMV、SMV和BCMV三种病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取大豆叶片RNA，反转录制备cDNA；

（2）以步骤（1）所得cDNA为模板，采用权利要求1中所述引物进行多重PCR检测。

3.根据权利要求2中所述的同时检测大豆中CMV、SMV和BCMV三种病毒的方法，其特征在于，步骤（1）中所述反转录体系为： oligo(dT)₁₈2μL、CMV-R 2μL、大豆叶片RNA 4μL、RTbuffer 2μL、RNase inhibitor 0.2μL、M-MLV 0.2μL、dNTP 1μL，最后用ddH₂O补足至10μL。

4.根据权利要求2中所述的同时检测大豆中CMV、SMV和BCMV三种病毒的方法，其特征在于，步骤（2）中所述PCR体系为：Mix 12.5μL、混合引物2μL、cDNA 1μL，最后用ddH₂O补足至25μL。

5.根据权利要求4中所述的同时检测大豆中CMV、SMV和BCMV三种病毒的方法，其特征在于，所述混合引物包括等量均匀混合的CMV-F、CMV-R、SMV-F、SMV-R、BCMV-F，以及BCMV-R。

6.根据权利要求2中所述的同时检测大豆中CMV、SMV和BCMV三种病毒的方法，其特征在于，步骤（2）中所述PCR反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。