CN105039345A

CN105039345A - 一种增强桑树耐盐能力的miRNA的克隆及其应用

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Publication number: CN105039345A
Application number: CN201510589099.8A
Authority: CN
Inventors: 冀宪领; 盖英萍; 张华梁
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2015-09-16
Filing date: 2015-09-16
Publication date: 2015-11-11
Anticipated expiration: 2035-09-16
Also published as: CN105039345B

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种增强桑树耐盐能力的miRNA的克隆及其应用，该miRNA命名为mul-miRn1，其具有序列表中SEQ.ID.NO.1所示的RNA序列，其前体RNA和编码基因序列分别具有序列表中SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列；在桑树中过表达SEQ.ID.NO.1所示的miRNA，可培育出具有较强耐盐性的转基因桑树；本发明的mul-miRn1为培育耐盐性桑树新品种提供了新的基因资源，同时在耐盐作物的培育中具有重要的意义和潜在的应用价值。

Description

一种增强桑树耐盐能力的miRNA的克隆及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，提供了一种增强桑树耐盐能力的miRNA的克隆及其应用。

背景技术

土壤干旱和盐渍化是世界范围内限制农林业生产的重要问题，已经引起国际社会的广泛关注。我国是世界上干旱和盐渍化最为严重的国家之一，干旱半干旱地区面积和盐渍化土地分别占全国可耕地面积的50％和20％以上。土壤干旱和盐渍化成为制约我国农林业发展及生态环境建设的重要因素。桑树是多年生经济树种，作为家蚕的饲料树种，是蚕丝产业的重要物质基础。同时，桑树对环境有极强的适应性，具有耐旱、耐盐碱、耐贫瘠、耐寒、耐涝等生理生态特性，广泛用于荒山绿化、防沙治沙、石漠化治理、水土保持、盐碱地治理、退耕还林等方面，具有良好的生态、经济和社会效益，目前已成为生态环境建设中的重要生态树种之一。因此，培育抗性新品种是增强桑树适应性，扩大栽培面积，实现其经济和生态价值的重要途径。

miRNAs是一类长度约为20-25nt的非编码单链小分子RNA，可在转录水平对基因组区域进行特殊修饰而抑制靶基因转录，也可以在转录后水平介导具有同源序列的靶基因mRNA裂解或抑制其翻译，其功能涉及到生长发育、信号转导以及环境响应等生命进程的各个方面。研究表明miRNA在植物感受盐分胁迫并产生适应性的过程中也发挥着重要作用，植物可以通过诱导或抑制相应miRNA表达来调控相关基因表达水平，形成复杂的响应机制来适应盐分胁迫环境。目前国内外已从胡杨、陆地棉、大豆等作物克隆获得多个miRNAs基因并应用于分子育种且有多项研究成果申请了专利。其中包括张荃等发明的“一种与植物耐盐性相关的miRNA及其应用”(中国专利CN103114091A)，公开了一种来源于盐芥的与植物耐盐性相关的miRNA，在作物如小麦、水稻、玉米、棉花中过表达miRNA可培育出具有高耐盐性的转基因作物。刘进元等发明的“来源于棉花的miRNA—GramiRn22及其应用”(中国专利CN102250899A)，公开了一种miRNA—GramiRn22，应用该miRNA有望获得在耐受逆境胁迫以及生长发育方面有重要表型的植株。王兴军等发明的“一种盐芥耐盐性调控miRNA—tsa-miRn1927及其应用”(中国专利CN103146701A)，公开了一种盐芥耐盐性调控miRNA—tsa-miRn1927及其应用。所提供的盐芥耐盐性调控miRNA在植物耐逆性尤其是耐盐性中起重要作用。李霞等发明专利(中国专利CN102220334A、CN102220331A、CN102220332A、CN102220333A)，公开了几种与植物耐盐性相关的miRNAs，在大豆中过表达这些miRNAs可以培育出具有高耐盐性的转基因大豆。夏新莉等发明专利“胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法”(中国专利CN103361346A)，公开了一种与高盐逆境胁迫相关胡杨microRNAs前体的克隆与分析方法。但关于miRNA在桑树抗盐育种中的作用，目前还未见报道。

发明内容

本发明的发明人针对上述现有技术的情况，提供了一种增强桑树耐盐能力的miRNA的克隆及其应用，该miRNA命名为mul-miRn1，其具有序列表中SEQ.ID.NO.1所示的RNA序列，其前体RNA和编码基因序列分别具有序列表中SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列。利用SEQ.ID.NO.1所示的miRNA，可培育出具有高耐盐性的转基因桑树；本发明的mul-miRn1为培育耐盐性桑树新品种提供了新的基因资源，同时在耐盐作物的培育中具有重要的意义和潜在的应用价值。

发明人首先提供了一种增强桑树耐盐能力的miRNA，该miRNA命名为mul-miRn1，其具有序列表中SEQ.ID.NO.1所示的RNA序列；

其前体RNA具有序列表中SEQ.ID.NO.2所示的核苷酸序列；

其编码基因序列为SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列；

除了如SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列之外，还包括能够在植物体内转录SEQ.ID.NO.2所示的miRNA前体RNA序列并且与SEQ.ID.NO.3所示序列具有90％以上相似度的核苷酸序列；此序列被导入植物细胞后可被转录成miRNA前体，所述的miRNA前体可在植物细胞中加工成成熟的miRNA，因此也在本发明的保护范围之列。

本发明构建了桑树mul-miRn1基因的超表达载体pBI121mul-miRn1，将该表达载体转入农杆菌GV3101感受态细胞，筛选转化子，采用叶盘转化法转化桑树。对获得的转基因桑树植株进行抗盐性分析表明，转基因桑树植株的耐盐能力显著提高，具有良好的应用前景。

本发明涉及一种植物表达载体，包含有如SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.2或SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列，用于提高桑树的耐盐能力。

本发明提供了桑树mul-miRn1基因在植物中应用的方法，可提高植物的耐盐能力。步骤为：

1)将mul-miRn1基因序列置于CaMV35S强启动子之下，构建植物表达载体pBI121mul-miRn1；

2)将构建的表达载体转入农杆菌感受态细胞，筛选出转化子；

3)利用2)获得的转化子转化桑树，得到转mul-miRn1基因桑树。

基于上述的发现，发明人进一步通过基因工程技术在桑树中超量表达mul-miRn1基因，可培育出具有较高耐盐能力的转基因桑树；本发明的mul-miRn1为培育抗盐桑树新品种提供了新的基因资源，该基因可用于桑树或其他植物抗盐性育种研究。

附图说明

图1为mul-miRn1前体序列的二级结构图，

本发明提供的miRNA来源于桑树，命名为mul-miRn1，其前体序列可折叠成一种稳定的茎环结构，属于miRNA前体典型的二级结构，符合miRNA前体的结构特征；

图2为桑树mul-miRn1基因植物超表达载体pBI121mul-miRn1的构建图；

图3为超表达载体pBI121mul-miRn1经BamHΙ和SacΙ双酶切的电泳图谱，

图中M：MarkerDL2000；P：酶切产物，

由图可知我们已经将桑树mul-miRn1基因核苷酸序列***到植物表达载体pBI121中，成功构建了mul-miRn1基因植物超表达载体；

图4为转基因植株的PCR鉴定结果示意图，

图中WT：野生型桑树对照；L1-L3：转基因桑树阳性株系；M：MarkerDL2000；

以筛选出的阳性植株的DNA为模板，根据35S启动子序列设计一对特异引物进行相应转基因株系的PCR扩增，结果均能扩增到530bp左右条带，说明我们已成功地将mul-miRn1基因转入桑树体内，并获得了转基因植株；

图5为mul-miRn1成熟体在转基因植株中的表达检测结果柱状图，

图中WT：野生型桑树对照；L1-L3：转基因桑树阳性株系，

由图可知转基因桑树植株中mul-miRn1成熟体的表达丰度明显高于野生型植株，说明mul-miRn1的成熟体在转基因桑树中得以高效表达；

图6为过量表达mul-miRn1的转基因桑树与野生型桑树在不同浓度盐分胁迫下的生长状况比较结果柱状图，其中图6A为株高比较图，图6B为总生物量比较图；

由图可知在不同浓度盐分胁迫下过量表达mul-miRn1的转基因桑树植株的株高(A)和总生物量(B)都明显高于野生型桑树植株，表明过量表达mul-miRn1的转基因桑树植株的耐盐能力明显高于野生型桑树植株。

具体实施方式

以下实施例中进一步定义本发明，根据以上的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明作出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。除特殊注明外，本发明所采用的均为本领域现有技术；

实施例1.桑树mul-miRn1基因的克隆方法

1、采用常规CTAB法提取桑树叶片DNA；

2、根据转录组测序所得mul-miRn1基因的核苷酸序列，设计一对特异引物，miRn1-5′(CTCATACACACAGAGATAGACC)其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示和miRn1-3′(CAGAAGATTGTGTTGACAGAAG)其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，以桑树叶片DNA为模板进行PCR扩增，体系如下：

反应程序如下：

反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收目的片段进行克隆及测序分析，测序结果显示其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，该序列可折叠成miRNA前体典型的茎环结构(如图1所示)，符合miRNA前体的结构特征，表明我们已成功克隆得到mul-miRn1基因。

实施例2.桑树mul-miRn1植物表达载体pBI121mul-miRn1的构建

1、根据分离出的桑树mul-miRn1基因的核苷酸序列，设计引物miRn1-F(GGATCCCTCATACACACAGAGATAG)其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示和miRn1-R(GAGCTCCAGAAGATTGTGTTGACAG)其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示，以桑树叶片提取的DNA为模板，进行PCR扩增。

2、取PCR产物与pMDl8-TSimple克隆载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，氨苄青霉素(50mg/L)抗性筛选阳性克隆，菌液PCR鉴定后提取重组质粒DNA,酶切鉴定后进行序列测定。

3、将经序列测定含有桑树mul-miRn1基因正确片段的重组质粒用BamHI和SacI酶切，回收mul-miRn1基因片段与用相同的限制性内切酶酶切的pBI121表达载体连接(如图2所示)。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，卡那霉素(50mg/L)抗性筛选阳性克隆，对选取的阳性克隆进行菌液PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定(如图3所示)。

4、采用冻融法将构建好的桑树mul-miRn1基因植物表达载体转化农杆菌GV3101感受态细胞，卡那霉素(50mg/L)抗性筛选阳性克隆。

实施例3.转基因桑树植株的获得

1、挑取农杆菌(实施例2中获得的携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中，28℃，250rpm，振荡培养约48h至对数生长后期；将菌液用MS培养液稀释10倍，备用；

2、取桑树无菌苗叶片，剪成小块(0.5×0.5cm)作为外植体，置于MS预分化培养基(MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.2mg/L)中，28℃，光照时间16h/d，光照强度2000Lux，预培养2d。

3、将预培养后的外植体浸入菌液2-l0min，然后用灭菌的滤纸吸干多余菌液，接入MS基本培养基；弱光下，28℃共培养2d。

4、共培养后的外殖体先用含头孢青霉素250mg/L的无菌水洗涤3次，再用含头孢青霉素250mg/L的MS培养液洗1次，然后用无菌滤纸吸干，转入含卡那霉素100mg/L，头孢青霉素250mg/L的MS选择培养基(MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L+卡那霉素50mg/L+头孢青霉素250mg/L)上，28℃，光照时间16h/d，光照强度2000Lux培养；每15d转接一次。

5、待分化芽长至lcm左右时，切下分化芽转入MS生根培养基(MS+卡那霉素50mg/L+头孢青霉素250mg/L)中，促其生根。

6、当分化苗长至5-6片叶，根系发育好后，移入盛有无菌土的花盆中，室温常规管理。

实施例4.转基因桑树植株的PCR鉴定

1、采用CTAB法提取抗性植株及野生型植株的DNA。

2、根据35S启动子序列设计一对特异引物35S-5(GGCCATGGAGTCAAAGATTC)其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示和35S-3(CCGTGTTCTCCAAATG)其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示，分别以提取的抗性植株及野生型植株的DNA为模板，进行PCR，扩增35S启动子，反应体系如下：

反应程序如下：

反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。通过琼脂糖凝胶电泳检测结果，如图4所示，抗性植株基因组DNA中均能扩增出一条530bp左右的条带，而野生型植物基因组DNA未能扩增出该条带，表明我们已成功将mul-miRn1基因导入了桑树基因组中。

实施例5.mul-miRn1成熟体在转基因桑树中的表达检测

1、采用荧光定量PCR的方法对转基因桑树中mul-miRn1的成熟体的表达量进行检测。

2、用Trizol法提取野生型和转基因桑树的总RNA，使用DNaseI除去基因组DNA，用宝生物工程有限公司的OneStepmiRNAcDNASynthesisKit进行miRNA的反转录。

3、以桑树U6为内参基因，以野生型和转基因桑树miRNAs的反转录产物为模板，反应体系和反应步骤参照PremixExTaq^TMⅡ说明书进行反应，根据反应结果用Excel作图，分析桑树mul-miRn1成熟体在转基因桑树中能否成功表达及其表达丰度。由图5可以看出mul-miRn1成熟体在转基因桑树中均得以高效表达，表明转入的桑树mul-miRn1基因能够在桑树中超表达，并成功加工形成成熟体。

实施例6.转基因桑树耐盐能力分析

1、将转基因和野生型桑树幼苗移栽到直径40cm，高27cm的花盆中，每盆定植1株。

2、幼苗移栽后，选取生长相对一致的幼苗进行盐胁迫处理。共设4个处理，每个处理6株重复，分别浇灌含50、100、150、200mmol/L的NaCl的1/2Hoagland完全营养液，以浇1/2Hoagland完全营养液为对照(CK)，每隔5d浇灌1次，每个花盆每次浇灌1000mL。

3、幼苗盐碱处理30d后，分别测定其植株高度和总生物量。

通过对转基因桑树耐盐能力分析(如图6所示)看出，转基因桑树相对于野生型桑树具有较强的耐盐能力，有很好的应用前景。

Claims

1.一种增强桑树耐盐能力的miRNA，其特征在于：该miRNA命名为mul-miRn1，其具有序列表中SEQ.ID.NO.1所示的RNA序列。

2.根据权利要求1所述的miRNA，其特征在于：其前体RNA序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.根据权利要求1所述的miRNA，其特征在于：其编码基因序列为SEQ.ID.NO.3所示的核苷酸序列。

4.权利要求1所述的miRNA在桑树中增强桑树的抗盐能力的应用。