CN117050157A - 异体共生年轻化因子及其在延缓机体衰老中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了异体共生年轻化因子在多组织细胞和分子水平上延缓机体衰老中的应用，属于生物技术领域。本发明公开了蛋白CCL3或蛋白YY1或蛋白GILZ或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1或所述蛋白GILZ编码基因表达的物质或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1或所述蛋白GILZ活性或含量的物质在调控机体和/或细胞和/或组织衰老水平中的应用。本发明为研究单细胞分辨率下的衰老和年轻化的细胞和分子变化提供了丰富资源，并且揭示了其中的关键再生因子(Ccl3、Yy1和Tsc22d3(Gilz))。

Description

异体共生年轻化因子及其在延缓机体衰老中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及异体共生年轻化因子在多组织细胞和分子水平上延缓机体衰老中的应用。
背景技术
衰老是一种涉及全身多种组织器官的***性退化过程，导致再生能力减弱、组织和器官功能下降。目前已经有多种方式被报道可以延缓衰老相关表型。其中，异时异体共生(Heterochronic parabiosis，HP)是近年来受到广泛关注的一种研究模型体系。在HP小鼠模型中，年老和年轻小鼠的循环***通过手术连接起来，构建了一个共享的循环***，其中双方产生的血源性因子与另一个个体共享。因此，HP提供了一个独特的实验范式，用来研究一个完整的衰老有机体如何通过“促年轻化因子”(“pro-youth factors”)的注入而恢复活力。反之亦然，年轻的机体又如何受到循环***的“促衰老因子”(“pro-aging factors”)的影响。到目前为止，我们对血源性因子的细胞靶点以及它们如何在***水平上促进衰老个体年轻化的了解仍然有限。
另一方面，***性衰老的许多特征都与器官特异性成体干细胞的损伤和耗竭存在关联。例如，在发育完全的器官和组织，如骨髓、皮肤、大脑和骨骼肌中，数量不多的成体干细胞群体能在整个生命过程中补充组织，以修复与年龄相关的损伤并维持组织稳态。在由多个器官和组织(包括骨髓、脾脏、外周血和造血干细胞及其直系子代)组成的造血和免疫***中，造血干祖细胞(Hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs)能产生各种免疫细胞类型。然而，随着年龄的增长，造血干祖细胞逐渐失去了维持免疫细胞组成的能力，并表现为髓系偏移的分化潜能，导致年龄相关的造血功能障碍和免疫力低下。类似地，其他器官和组织中，如皮肤、骨骼肌和大脑，也驻留不同类型的成体干细胞，即负责毛囊和表皮的再生的毛囊干细胞(HFSCs)和基底细胞、纤维/脂肪生成祖细胞(FAPS)和骨骼肌的卫星细胞以及大脑神经干细胞。这些成体干细胞随着年龄的增长逐渐失去再生能力，导致脱发和皮肤老化、骨骼肌和神经退化。因此，造血***和外周器官中的常驻成体干细胞都受到衰老的危害，但它们是否以及在多大程度上可以恢复活力还需要进一步研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何延缓衰老。
为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供一种应用，所述应用可为下述A1)-A10)中任一种：
A1)、蛋白CCL3或蛋白YY1或蛋白GILZ或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1或所述蛋白GILZ编码基因表达的物质或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1或所述蛋白GILZ活性或含量的物质在调控机体和/或细胞和/或组织衰老水平中的应用；
A2)、蛋白CCL3或蛋白YY1或蛋白GILZ或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1或所述蛋白GILZ编码基因表达的物质或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1或所述蛋白GILZ活性或含量的物质在制备机体和/或细胞和/或组织衰老水平的产品中的应用；
A3)、蛋白CCL3或蛋白YY1或蛋白GILZ或测定蛋白CCL3或蛋白YY1或蛋白GILZ含量的物质在鉴定或辅助鉴定机体和/或细胞和/或组织衰老水平中的应用；
A4)、蛋白CCL3或蛋白YY1或蛋白GILZ或测定蛋白CCL3或蛋白YY1或蛋白GILZ含量的物质在制备鉴定或辅助鉴定机体和/或细胞和/或组织衰老水平的产品中的应用；
A5)、蛋白CCL3或蛋白YY1或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1编码基因表达的物质或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1活性或含量的物质在调控造血干(祖)细胞的重建能力中的应用；
A6)、蛋白CCL3或蛋白YY1或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1编码基因表达的物质或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1活性或含量的物质在制备调控造血干(祖)细胞的重建能力的产品中的应用；
A7)、蛋白CCL3或蛋白YY1或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1编码基因表达的物质或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1活性或含量的物质在调控造血干(祖)细胞的谱系分化的应用；
A8)、蛋白CCL3或蛋白YY1或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1编码基因表达的物质或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1活性或含量的物质在制备调控造血干(祖)细胞的谱系分化的产品中的应用；
A9)、蛋白GILZ或调控所述蛋白GILZ编码基因表达的物质或调控所述蛋白GILZ活性或含量的物质在调控皮肤成纤维细胞的增殖能力中的应用；
A10)、蛋白GILZ或调控所述蛋白GILZ编码基因表达的物质或调控所述蛋白GILZ活性或含量的物质在制备调控皮肤成纤维细胞的增殖能力的产品中的应用。
上文中，所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1或所述蛋白GILZ可为天然的蛋白，如来源于哺乳动物的蛋白，也可为非天然的蛋白，如重组蛋白等，所述重组蛋白只要具有天然的蛋白的功能即可。
所述CCL3蛋白可为人CCL3蛋白或小鼠CCL3蛋白。所述人CCL3蛋白的氨基酸序列的GenBank号为NP_002974.1，所述小鼠CCL3蛋白的氨基酸序列的GenBank号为NP_035467.1。
所述YY1蛋白可为人YY1蛋白或小鼠YY1蛋白。所述人YY1蛋白的氨基酸序列的GenBank号为NP_003394.1，所述小鼠YY1蛋白的氨基酸序列的GenBank号为NP_033563.2。
所述GILZ蛋白可为人GILZ蛋白或小鼠GILZ蛋白。所述人GILZ蛋白的GenBank号为：NP_001015881.1，所述小鼠GILZ蛋白的GenBank号为：NP_001070832.1。
进一步地，上述的应用中，所述调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1编码基因表达的物质或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1蛋白活性或含量的物质可为生物材料B1，所述生物材料B1可为下述B11)至B17)中的任一种：
B11)、编码所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1的核酸分子；
B12)、含有B11)所述核酸分子的表达盒；
B13)、含有B11)所述核酸分子的重组载体、或含有B12)所述表达盒的重组载体；
B14)、含有B11)所述核酸分子的重组微生物、或含有B12)所述表达盒的重组微生物、或含有B13)所述重组载体的重组微生物；
B15)、含有B11)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有B12)所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有B13)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B16)、含有B11)所述核酸分子的转基因动物组织、或含有B12)所述表达盒的转基因动物组织、或含有B13)所述重组载体的转基因动物组织；
B17)、含有B11)所述核酸分子的转基因动物器官、或含有B12)所述表达盒的转基因动物器官、或含有B13)所述重组载体的转基因动物器官。
进一步地，上述的应用中，B11)所述核酸分子可为所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1蛋白的编码基因，所述蛋白CCL3的编码基因为Ccl3基因或Ccl3基因的编码序列；所述蛋白YY1的编码基因为Yy1基因或Yy1基因的编码序列。
所述Ccl3基因可为人CCL3基因或小鼠Ccl3基因。所述人CCL3基因的GenBank号为NM_002983.3，其编码序列为核苷酸序列是NM_002983.3的第86-364位所示的DNA分子；所述小鼠Ccl3基因的GenBank号为NM_011337.2，其编码序列为核苷酸序列是NM_011337.2的第102-380位所示的DNA分子。
所述Yy1基因可为人YY1基因或小鼠Yy1基因。所述人YY1基因的GenBank号为NM_003403.5，其编码序列是核苷酸序列是NM_003403.5第102-1346位所示的DNA分子。所述小鼠Yy1基因的GenBank号为NM_009537.4，其编码序列为核苷酸序列是NM_009537.4第117-1361位所示的DNA分子。
进一步地，上述的应用中，所述调控所述蛋白GILZ编码基因表达的物质或调控所述蛋白GILZ活性或含量的物质可为生物材料B2，所述生物材料B2可为抑制或降低所述蛋白GILZ的编码基因的表达的RNA分子或抑制或降低所述蛋白GILZ的活性或含量的RNA分子；
进一步地，上述的应用中，B21)所述抑制或降低所述蛋白GILZ的编码基因的表达的RNA分子或抑制或降低所述蛋白GILZ的活性或含量的RNA分子可为下述i1)或i2)或i3)：
i1)、RNA分子的靶标序列为蛋白GILZ的编码基因；
i2)、RNA分子的靶标序列的核苷酸序列是SEQ ID No.1；
i3)、RNA分子的靶标序列的核苷酸序列是SEQ ID No.2。
所述GILZ蛋白可为人GILZ蛋白或小鼠GILZ蛋白。所述人GILZ蛋白可为人Gilz基因编码的蛋白质，所述人Gilz基因的GenBank号为XM_005262103.5，其编码序列为核苷酸序列是XM_005262103.5的第160-762位所示的DNA分子，所述人GILZ蛋白的GenBank号为NP_001015881.1。所述小鼠GILZ蛋白可为小鼠Gilz基因编码的蛋白质，所述小鼠Gilz基因的GenBank号为NM_001077364.1，其编码序列为核苷酸序列是NM_001077364.1第204-809位所示的DNA分子，所述小鼠GILZ蛋白的GenBank号为NP_001070832.1。
为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供异体共生动物在如下P1)-P18)中任一种中的应用：
P1)、降低脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或大脑组织中衰老细胞比例；
P2)、降低脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或骨骼肌组织中细胞凋亡比例；
P3)、减轻肝脏组织炎症面积；
P4)、减轻肝脏组织和/或脾脏组织纤维化面积；
P5)、增加骨骼肌组织肌纤维直径；
P6)、增加皮肤组织毛囊数量；
P7)、增加骨髓中pro-B细胞比例；
P8)、增加造血干祖细胞中CCL3蛋白或/和YY1蛋白表达水平；
P9)、上调Ccl3基因或/和Yy1基因表达水平。
P10)通过降低脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或大脑组织中衰老细胞比例延缓衰老；
P11)通过降低脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或骨骼肌组织中细胞凋亡比例延缓衰老；
P12)通过降低肝脏组织炎症面积延缓衰老；
P13)通过降低肝脏组织和/或脾脏组织纤维化面积延缓衰老；
P14)通过降低骨骼肌组织肌纤维直径延缓衰老；
P15)通过降低皮肤组织毛囊数量延缓衰老；
P16)通过增加骨髓中pro-B细胞比例延缓衰老；
P17)通过增加造血干祖细胞中CCL3蛋白或/和YY1蛋白表达水平延缓衰老；
P18)通过上调Ccl3基因或/和Yy1基因表达水平延缓衰老；
为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供构建重组细胞的方法，所述方法包括向受体细胞中导入目的蛋白的编码基因，促进或提高或上调所述目的蛋白的编码基因表达，或促进或提高或上调所述目的蛋白的活性或含量，得到衰老水平低于所述受体细胞的重组细胞；
所述目的蛋白为权利要求1中所述CCL3蛋白或权利要求1中所述YY1蛋白。
为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供由上述的方法构建得到的重组细胞。
本发明中，所述重组细胞可为重组哺乳动物细胞。
所述哺乳动物可为人，也可为非人哺乳动物。
为解决上述技术问题，第五个方面，本发明提供上述重组细胞系在下述D1)或D2)中的应用：
D1)、在提高年老造血干细胞的重建能力中的应用；
D2)、在制备提高年老造血干细胞的重建能力的产品中的应用。
本发明所提供的的应用或方法可以是疾病的诊断和治疗的目的，也可以是非疾病的诊断和治疗的目的。
为解决上述技术问题，第六个方面，本发明提供上述的蛋白CCL3或蛋白YY1或蛋白GILZ，或上述的生物材料B1或/和生物材料B2。
在本发明的一个实施例中，通过评估造血干(祖)细胞的重建能力来评估机体和/或细胞和/或组织衰老水平。
在本发明的一个实施例中，通过竞争移植性实验评估造血干(祖)细胞的重建能力。
在本发明的一个实施例中，所述提高造血干(祖)细胞的重建能力具体表现为：在竞争性移植实验中，过表达蛋白CCL3的年老小鼠供体来源的T细胞占比显著(P＜0.05)高于对照组；过表达YY1的年老小鼠供体来源的整体细胞、T细胞、Myeloid细胞的占比显著(P＜0.05)高于对照组。
在本发明的一个实施例中，通过评估成纤维细胞的增殖能力来评估机体和/或细胞和/或组织衰老水平。
在本发明的一个实施例中，通过Ki67染色实验和凋亡细胞占比来评估成纤维细胞的增殖能力。
在本发明的一个实施例中，所述转基因细胞系降低成纤维细胞的增殖能力具体表现为：Gilz基因的RNA干扰组(si-GILZ)的人成纤维细胞和小鼠成纤维细胞中，被Ki67染色的细胞数目显著低于对照组(si-NC)，表明RNA干扰组(si-GILZ)的细胞增殖能力降低；并且RNA干扰组(si-GILZ)的人成纤维细胞和小鼠成纤维细胞中，凋亡细胞的比例(7.81％、7.89％)显著低于对照组(11.80、12.20)，表明RNA干扰组(si-GILZ)的细胞凋亡水平升高。
在本发明的一个实施例中，所述异体共生动物为异体共生小鼠模型。
在本发明的一个实施例中，所述小鼠异体共生模型的制备方法是：将2只小鼠中的每只从肘部、侧腹和要连接一侧的膝盖沿连续线剃毛。用碘消毒+70％酒精皮肤擦洗超过3个交替循环，为切口做准备。使用高压灭菌仪器并保持无菌区域。在每只小鼠上，用剪刀沿侧腹切开皮肤，从膝盖近端到肘部近端，不带扰乱皮下的肌肉。用2条间断缝合线连接动物的三头肌。沿着侧翼连接体壁，连续缝合7-9遍。用2条间断缝合线连接动物的股四头肌。用间断缝合缝合2个个体的皮肤。然后将小鼠以仰卧姿势放置在加热垫上，并让其在环境空气中醒来。在抛物手术后，每一对分别接受单独的饲养，每天皮下注射0.25％布比卡因1ml生理盐水，持续3天。
在本发明的一个实施例中，所述降低脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或大脑组织中衰老细胞比例体现在减少脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或大脑组织中SA-β-gal染色阳性区域。
所述减轻肝脏组织炎症体现在减少肝脏组织中HE染色炎症细胞浸润面积。
所述降低脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或骨骼肌组织中细胞凋亡体现在TUNEL染色中阳性细胞比例。
所述减轻肝脏组织和/或脾脏组织纤维化体现在马松染色中阳性面积。
所述增加骨骼肌组织肌纤维直径体现在HE染色中肌纤维面积的测量。
所述增加皮肤组织毛囊数量体现在HE染色中毛囊数量的变化。
上述应用中，所述延缓造血干祖细胞衰老体现在增强年老造血干(祖)细胞的重建能力和/或谱系分化的能力；
所述YY1和/或CCL3表达水平均为蛋白表达水平。
所述Yy1和/或Ccl3表达水平均为基因表达水平。
上述应用中，所述外周血、所述骨髓、所述脾脏组织、所述脑组织、所述肝脏组织、所述骨骼肌组织和所述皮肤组织为哺乳动物外周血、骨髓、脾脏组织、脑组织、肝脏组织、骨骼肌组织和皮肤组织，所述哺乳动物包括人类。
本发明中***地分析了取样自异时异体共生和同时异体共生(Isochronicparabiosis)小鼠(Mus musculus)的造血和免疫***(造血干祖细胞、骨髓、外周血和脾脏)以及受造血和免疫器官影响的四个实体组织/器官(皮肤、骨骼肌、大脑和肝脏)的单细胞转录组。通过这一方法，本发明能够构建一个多组织单细胞转录组图谱来研究HP对衰老的影响，并探索成体干细胞及其微环境的复杂变化和调控作用。本发明分析了年轻的循环***环境如何使年老的个体恢复活力，以及年老的循环***环境如何损害年轻的个体，从而改变细胞类群、基因表达特征和细胞-细胞间通信。在我们的异体共生图谱中，本发明发现造血干祖细胞是在造血和免疫***中对互相浸润最为抵抗，同时对***调节最敏感的细胞类型之一。此外，本发明还发现了具有逆转衰老相关损伤潜力的调控因子。本研究可以促进我们对衰老相关***性变化的理解，以及发展新型衰老干预策略。
附图说明
图1为四组小鼠不同组织中SA-β-Gal染色分析。
图2为四组小鼠不同组织中TUNEL染色分析细胞凋亡比例。
图3为四组小鼠肝脏、皮肤和骨骼肌的HE染色分析。
图4为四组小鼠肝脏和脾脏的MASSON染色分析。
图5为造血***伪时间分化轨迹分析。
图6为四组小鼠造血干细胞分化相关基因集评分。
图7为四组小鼠单细胞数据中B细胞组细胞比例变化。
图8为流式细胞术检测不同组别小鼠骨髓B细胞比例变化。
图9为不同组别小鼠骨髓pro-B细胞占总B细胞比例统计数据。
图10为流式细胞术检测不同组别小鼠骨髓pro-B细胞比例变化以及统计数据。
图11为衰老和异体共生小鼠差异基因计算模式图。
图12为细胞类型特异差异基因调控网络。
图13为核心调控转录因子调控网络分析。
图14为核心调控转录因子表达量及靶基因评分。
图15为异体共生恢复的细胞间配体受体互作对。
图16为WB水平验证在小鼠LSK细胞中过表达YY1的效率。
图17为评估感染不同病毒的年老造血干(祖)细胞功能的移植示意图和折线图展示过表达YY1增强年老造血干(祖)细胞的重建能力。
图18为WB水平验证在小鼠LSK细胞中过表达CCL3的效率。
图19为折线图展示过表达CCL3增强年老造血干(祖)细胞的重建能力。
图20为柱状图展示过表达CCL3对年老造血干(祖)细胞谱系分化的影响。
图21为跨细胞类型异体共生恢复因子-Tsc22d3(Gilz)。
图22为RT-qPCR检测人和小鼠皮肤成纤维细胞中Gilz基因的敲低效率。
图23为Ki67免疫荧光显示GILZ/Gilz敲低之后人和小鼠成纤维细胞细胞增殖能力。
图24为凋亡检测显示GILZ/Gilz敲低之后人和小鼠成纤维细胞细胞增殖能力。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的所有动物实验均获得中国科学院动物保护与利用委员会的批准。下述实施例中的人脂肪干细胞的分离已通过北京协和医学院伦理审查委员会的审查。
下述实施例中的实验数据采用GraghPad Prism 8统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准差表示，采用单尾t检验、双尾t检验，P＜0.05(*)表示具有统计学意义，P<0.01表示具有极显著差异(**)，P<0.001表示具有极显著差异(***)。
下述实施例中的生物材料来源如下：C57BL6/J小鼠购自北京SPF生物技术有限公司。异氟烷购自瑞沃德公司，货号R510-22。4-0聚二氧六环缝合材料和4-0聚丙烯缝合材料购自金环医疗，货号F406。马松试剂盒购自索莱宝公司，货号G1346。TUNEL试剂盒购自碧云天公司，货号C1088。
造血干细胞培养基：SFEM培养基(Stem Cell Technology)加入SCF(终浓度为20ng/mL，PeproTech)，TPO(终浓度为20ng/mL，PeproTech)和青霉素-链霉素(终浓度为1％，Gibco)。
HBSS+溶液：Hanks平衡盐溶液(HBSS，Solarbio)加入2％FBS和1％N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES，Solarbio)。
293T细胞培养基：89体积份DMEM高糖培养基(Hyclone)，10体积份胎牛血清(Gibco)，1体积份青霉素/链霉素(Gibco)。
下述实施例中的生物材料来源如下：
人胚胎肾细胞293T细胞：ATCC，CRL-3216；
慢病毒包装载体psPAX2(简称质粒psPAX2)：Addgene产品，#12260；
慢病毒包装载体pMD2G(简称质粒pMD2G)：Addgene产品，#12259；
SF-LV-EGFP载体记载于文献“Aging-induced IL27Ra Signaling ImpairsHematopoieticStem Cells.He H,et.al,.Blood.2020Jul 9；136(2):183-198.”中(文献中名称为SF-LV-cDNA-EGFP vector.)，公众可从申请人处获得该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
SF-LV-Yy1-EGFP载体：在SF-LV-EGFP载体上进行构建。
SF-LV-Ccl3-EGFP载体：在SF-LV-EGFP载体上进行构建。
下述实施例中，FITC anti-mouse Lineage Cocktail with Isotype Ctrl(clone:145-2C11；RB6-8C5；RA3-6B2；Ter-119；M1/70)，货号为133302；Ki67(abcam，货号：15580)；APCanti-mouse Ly-6A/E(Sca-1)(clone:D7)，货号为108112；PerCP anti-mouseCD117(c-Kit)(clone:2B8)，货号为105822；FITC anti-mouse/human CD45R/B220(clone:RA3-6B2)，货号为103206；Brilliant Violet 421TManti-mouse IgM(clone:RMM-1)，货号为406518；APC anti-mouse CD43(clone:S11)，货号为143208；Biotin anti-mouse CD3ε(clone:145-2C11)，货号为100304；Biotinanti-mouse CD4(clone:RM4-5)，货号为100508；Biotin anti-mouse CD8a(clone:53-6.7)，货号为100704；Biotin anti-mouse/humanCD45R/B220(clone:RA3-6B2)，货号为103204；Biotinanti-mouse/human CD11b(clone:M1/70)，货号为101204；Biotin anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)(clone:RB6-8C5)，货号为108404；Biotin anti-mouse TER-119/Erythroid Cells(clone:TER-119)，货号为116204；PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD48(clone:HM48-1)，货号为103422；APCanti-mouse CD3ε(clone:145-2C11)，货号为100312；PerCP anti-mouse/human CD11b(clone:M1/70)，货号为101230；Brilliant Violet 605TManti-mouse/human CD45R/B220(clone:RA3-6B2)，货号为103244；PE anti-mouse CD45.1(clone:A20)，货号为：110708，以上抗体均购自Biolegend公司。APC anti-mouse CD117(c-Kit)(clone:2B8)，货号为17-1171-83；PE-CyTM7Sca-1anti-mouse(clone:D7)，货号为：25-5981-82；Streptavidin ConjugateAPC-eFluorTM780，货号为47-4317-82；DAPI，货号为：62248；Propidium iodide，货号为P3566，以上抗体试剂均购自Invitrogen公司。7-AAD Staining Solution，货号为：559925，购自BD公司。Mouse monoclonal anti-YY1，货号为sc-7341；Mouse monoclonal anti-CCL3，货号为sc-365691，均购自Santa Cruz公司。Anti-APC MicroBeads，货号为：130-090-855，购自Miltenyi Biotec公司；小鼠和人siRNA购自锐博公司。
实施例1、异体共生对小鼠衰老表型的恢复作用
一、实验分组
三组C57BL6/J小鼠的年龄和性别信息如下：同体年轻小鼠(Iso-Y)(2个月大，n＝7，雄性小鼠)、异体年轻小鼠(Het-Y)和异体年老小鼠(Het-O)(分别为2个月大和23个月大，n＝5，雄性小鼠)和同体年老小鼠(Iso-O)(23个月大，n＝9，雄性小鼠)组。
另外，为了追溯供体/宿主细胞的来源和区分，我们使用CD45.1/CD45.2同源***制备了异体年轻小鼠(2月龄，n＝4只，CD45.1雄性小鼠)和异体年老小鼠(23月龄，n＝4只，CD45.2雄性小鼠)。在进行手术之前，每对异体小鼠需要关在同一个笼子里至少两周。每天检查小鼠的身体状况和整体外观。
手术操作过程如下：
在诱导后和手术操作前给予镇痛剂(丁丙诺啡，SR/缓释，0.1mg/kg皮下注射)。涂抹眼部润滑剂。对于所有体内缝合，使用4-0聚二氧六环缝合材料。对于所有外部缝合，使用4-0聚丙烯缝合材料。将2只小鼠中的每只从肘部、侧腹和要连接一侧的膝盖沿连续线剃毛。用碘消毒+70％酒精皮肤擦洗超过3个交替循环，为切口做准备。使用高压灭菌仪器并保持无菌区域。在每只小鼠上，用剪刀沿侧腹切开皮肤，从膝盖近端到肘部近端，不带扰乱皮下的肌肉。用2条间断缝合线连接动物的三头肌。沿着侧翼连接体壁，连续缝合7-9遍。用2条间断缝合线连接动物的股四头肌。用间断缝合缝合2个副生体的皮肤。然后将小鼠以仰卧姿势放置在加热垫上，并让其在环境空气中醒来。在抛物手术后，每一对分别接受单独的饲养，每天皮下注射0.25％布比卡因1ml生理盐水，持续3天。在异体共生组中，年轻小鼠在左侧连接，老年小鼠在右侧连接。手术后六周，进行组织取材和组织学检测。
二、实验方法：
(1)SA-β-gal染色
取各组小鼠脾脏、皮肤、肝脏、脑组织进行衰老相关β-半乳糖苷酶染色分析。衰老相关β-半乳糖苷酶染色是基于衰老时SA-β-gal(senescence-associated-β-galactosidase)活性水平上调而对衰老组织进行染色检测的方法。
具体步骤如下：小鼠组织的冷冻切片恢复至室温干燥，用PBS洗涤，并在室温下用2％甲醛和0.2％戊二醛固定15分钟。然后在37℃下使用染色溶液染色48-96h。然后用80％甘油固定载玻片。使用共聚焦激光扫描显微镜(Leica，CS2)获得图像，以X-Gal为底物，在衰老特异性的β-半乳糖苷酶催化下会生成深蓝色产物。在普通的光学显微镜下就可以观测到组织的衰老情况，并通过ImageJ量化SA-β-gal阳性区域的百分比或强度。
其中，染色液配方如下：柠檬酸/磷酸钠缓冲液40mM、K4[Fe(CN)6]·6H2O 5mM、K3[Fe(CN)6]5mM、NaCl 150mM、MgCl2 2mM、X-gal 1mg/ml。
(2)TUNEL染色
石蜡包埋组织用旋转切片机以10μm的厚度切片。切片在二甲苯中脱蜡，在梯度已醇(100％、100％、95％、80％、70％)中再水化，使用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒进行TUNEL染色。使用共聚焦激光扫描显微镜(Leica TCS SP5Ⅱ)获得图像，并使用ImageJ量化阳性细胞的百分比。
(3)HE染色
石蜡包埋组织用旋转切片机以5μm的厚度切片。切片在二甲苯中脱蜡，在梯度已醇(100％、100％、95％、80％、70％)中再水化，在苏木精溶液中孵育，在自来水中冲洗以去除多余的苏木精，用1％酸性酒精进行5s分化，然后在自来水中冲洗10min。最后，切片用伊红染色，在梯度乙醇和二甲苯中脱水，并用中性树胶封固，在显微镜下收集图像，并通过ImageJ量化阳性区域的面积。
(4)马松染色
在石蜡包埋后，组织以5μm厚切片，用二甲苯脱蜡，并用100％乙醇、95％乙醇、70％乙醇和自来水水合。然后切片用重铬酸钾溶液(浓度)染色过夜。用自来水冲洗5-10分钟后，切片在铁苏木精工作溶液中染色10分钟，在胭脂红酸性品红溶液中染色5-10分钟。然后，载玻片在磷钼磷钨酸溶液中分化10-15分钟，用苯胺蓝溶液染色5-10分钟。然后在蒸馏水中短暂冲洗，在1％乙酸溶液中分化2-5分钟。然后用70％乙醇、95％乙醇和100％乙醇脱水切片，然后用二甲苯去除，用盖玻片覆盖，并用中性树胶封固。使用共聚焦激光扫描显微镜(Leica，CS2)获得图像，并通过ImageJ量化阳性区域的面积。
三、实验结果
SA-β-gal染色结果如图1所示，图1分别展示了同体年轻组、同体年老组、异体年轻组和异体年老组小鼠的脾脏、皮肤、肝脏和大脑中与衰老相关的半乳糖苷酶阳性细胞的显微镜照片以及ImageJ量化的SA-β-gal阳性区域占比的柱形图。其中，柱形图的纵坐标为ImageJ量化的SA-β-gal阳性区域占比，柱形图的横坐标从左至右分别表示同体年轻组、同体年老组、异体年轻组和异体年老组小鼠。
图1结果表明：同体年轻组小鼠的脾脏、皮肤和肝脏中的与衰老相关的半乳糖苷酶阳性区域占比显著低于同体年老组小鼠(P＜0.001(皮肤和肝脏)或P＜0.01(脾脏)或P＜0.05(大脑))，异体年轻组小鼠和异体年老组小鼠的脾脏、皮肤和大脑中与衰老相关的半乳糖苷酶阳性区域占比无显著差异(P＞0.05)，异体年轻组小鼠的肝脏中与衰老相关的半乳糖苷酶阳性区域占比显著低于异体年老组小鼠(P＜0.05)。
异体年轻小鼠和异体年老小鼠的脾脏、皮肤、肝脏和大脑中与衰老相关的半乳糖苷酶阳性区域占比介于同体年轻组和同体年老组小鼠之间；与同体年老小鼠相比，异体年老组小鼠的脾脏、皮肤、肝脏和大脑中与衰老相关的半乳糖苷酶阳性区域减少，说明衰老相关的表型在多个器官的细胞水平上得到缓解。
TUNEL染色结果如图2所示，图2分别展示了同体年轻组、同体年老祖、异体年轻组和异体年老组小鼠的脾脏、皮肤、肝脏和骨骼肌中凋亡细胞的显微镜照片以及ImageJ量化的TUNEL阳性细胞占比的柱形图。其中，柱形图的纵坐标为凋亡细胞占比，柱形图的横坐标从左至右分别表示同体年轻组、同体年老祖、异体年轻组和异体年老组小鼠。
图2结果表明：同体年轻组小鼠的脾脏、皮肤、肝脏和骨骼肌中的凋亡细胞占比显著低于同体年老组小鼠(P＜0.001(脾脏)或P＜0.01(肝脏和骨骼肌)或P＜0.05(皮肤))；异体年轻组小鼠和异体年老组小鼠的皮肤、肝脏和骨骼肌中的凋亡细胞占比无显著差异(P＞0.05)，异体年轻组小鼠的脾脏中的凋亡细胞占比显著低于异体年老组小鼠(P＜0.05)。
异体年轻小鼠和异体年老小鼠的脾脏、皮肤、肝脏和骨骼肌中的凋亡细胞占比介于同体年轻组和同体年老组小鼠之间；与同体年老小鼠相比，异体年老组小鼠的脾脏、皮肤、肝脏和骨骼肌中凋亡细胞减少，说明衰老相关的表型在多个器官的细胞水平上得到缓解。
通过SA-β-gal染色、TUNEL染色分析表明：与同体年老小鼠相比，异体年老小鼠的脾脏、皮肤、肝脏和大脑中与衰老相关的半乳糖苷酶阳性细胞减少(图1)，脾脏、皮肤、肝脏和骨骼肌中的凋亡细胞减少(图2)。说明衰老相关的表型在多个器官的细胞水平上得到缓解。
HE染色结果如图3所示，图3分别展示了同体年轻组、同体年老祖、异体年轻组和异体年老组小鼠的肝脏炎症浸润面积占比、皮肤单位面积内毛囊数量和骨骼肌的肌纤维直径的显微镜照片以及对应的柱形图。其中柱形图的横坐标从左至右分别表示同体年轻组、同体年老祖、异体年轻组和异体年老组小鼠。
图3结果表明：同体年老组小鼠肝脏中的炎症浸润面积显著高于同体年轻组小鼠(P＜0.001)；异体年轻组小鼠和异体年老组小鼠的肝脏中的炎症浸润面积无显著差异(P＞0.05)，且异体年轻组小鼠和异体年老组小鼠的肝脏中炎症浸润面积介于同体年轻组小鼠和同体年老组小鼠之间；同体年轻组小鼠的单位面积内的毛囊数量显著高于同体年老组小鼠(P＜0.001)；异体年轻组小鼠和异体年老组小鼠的毛囊数量无显著差异(P＞0.05)，且异体年轻组小鼠和异体年老组小鼠的毛囊数量介于同体年轻组小鼠和同体年老组小鼠之间；同体年老组小鼠骨骼肌的肌纤维直径显著高于同体年轻组小鼠(P＜0.001)，异体年轻组小鼠和异体年老组小鼠的骨骼肌中的肌纤维直径无显著差异(P＞0.05)，且异体年轻组小鼠和异体年老组小鼠的骨骼肌直径介于同体年轻组小鼠和同体年老组小鼠之间。
马松染色结果如图4所示，图4分别展示了同体年轻组、同体年老祖、异体年轻组和异体年老组小鼠的肝脏和脾脏纤维化的显微镜照片以及ImageJ量化的纤维化占比的柱形图。其中，柱形图的纵坐标表示纤维化面积单位为mm2，柱形图的横坐标从左至右分别表示同体年轻组、同体年老祖、异体年轻组和异体年老组小鼠。
图4结果表明：同体年老组小鼠肝脏和脾脏中纤维化面积高于同体年轻组小鼠(P＜0.001)；异体年轻组小鼠和异体年老组小鼠的肝脏和脾脏的纤维化面积无显著差异(P＞0.05)，且异体年轻组小鼠和异体年老组小鼠的肝脏和脾脏中的纤维化面积介于同体年轻组小鼠和同体年老组小鼠之间。
通过HE染色和马松染色分析表明：与同体年老小鼠相比，异体年老小鼠减轻了肝脏中与衰老相关的炎症，减轻了肝脏和脾脏的纤维化，并使骨骼肌肌纤维的平均直径和皮肤中的毛囊数量(通常随着年龄的增长而减少)有所“年轻化”恢复。
实施例2、异体共生对细胞比例变化的影响和验证
一、实验方法：
以实施例1中培养6周的三组实验小鼠作为实验样本，进行以下操作。
1、组织细胞分离与测序
(1)外周血细胞的分离
小鼠外周血采用EDTA-2Na抗凝管进行收集。加入红细胞裂解液(BD Biosciences)在室温裂解15-20分钟。预冷的PBS洗涤两次，采用2％FBS的PBS重悬细胞。用流式细胞仪(BDInflux)分选出活细胞，离心之后，加入含0.04％BSA的PBS重悬，用于10xGenomics测序。
(2)骨髓细胞的分离
分离出小鼠的股骨和胫骨。采用2％FBS和2mM EDTA的PBS缓冲液，将骨髓细胞从骨髓腔中冲出。细胞重悬液通过40μm细胞过滤器，过滤得到单细胞悬液。1,200rpm、4℃，离心5分钟。细胞沉淀采用红细胞裂解液(BD Biosciences)进行重悬，室温裂解5min。预冷的PBS洗涤两次，采用2％FBS的PBS重悬细胞。用流式细胞仪(BD Influx)分选出活细胞，离心之后，加入含0.04％BSA的PBS重悬，用于10xGenomics测序。
(3)Lin-c-Kit+Sca-llo/+细胞分离
分离出的骨髓细胞用2％FBS的PBS重悬，加入lineage混合抗体、c-Kit和Sca-1抗体，充分混匀，4℃避光孵育30分钟。其中，Lineage混合抗体包括：anti-mouse CD3,B220,CD11b,Ly6G/Ly-6C和Ter-119。PBS洗涤两次，采用2％FBS的PBS重悬细胞。采用流式细胞仪(BDInflux)进行分选，离心之后，加入含0.04％BSA的PBS重悬，用于10xGenomics测序。
(4)脾脏细胞的分离
将小鼠脾脏放置于2％FBS的PBS中，用剪刀剪成小块之后，在40μm细胞过滤器上用5毫升注射器柱塞轻轻研磨。收集所有的脾脏细胞，1,200rpm、4℃，离心5分钟。细胞沉淀采用红细胞裂解液(BD Biosciences)进行重悬，室温裂解5min。预冷的PBS洗涤两次，采用2％FBS的PBS重悬细胞。用流式细胞仪(BD Influx)分选出活细胞，离心之后，加入含0.04％BSA的PBS重悬，用于10xGenomics测序。
2、细胞比例分析
(1)数据预处理
从NovaSeq平台得到高通量测序原始数据后，首先用bcl2fastq软件(版本2.20.0.422)将BCL格式的原始文件转换成FASTQ格式文件。FASTQ文件经过Cell Ranger软件(版本3.1.0)的处理，被比对到mm10小鼠参考基因组上，然后得到过滤后的表达矩阵。
(2)细胞聚类和细胞类型鉴定
从LSK细胞、骨髓、外周血、脾脏和皮肤的免疫细胞得到的单细胞转录组的基因表达矩阵通过Scanpy(版本1.4.4)进行低质量细胞过滤、样本整合、数据标准化、数据降维、细胞聚类以及基因差异表达分析。首先利用scrublet软件(版本0.2.1)来检测数据中可能的多细胞结果，并将其去除。过滤后的表达矩阵将根据以下步骤进行分析：①满足四种条件任意一种的细胞将首先被剔除：基因数少于500或多于6000、特异分子标记(UMI)数少于500或多余40000、线粒体基因比例超过10％、核糖体基因比例超过40％；②通过Scanpy标准流程对不同样本的数据进行整合和标准化，利用“sc.external.pp.bbknn”函数去除不同样本的批次效应；③通过Scanpy的“sc.tl.umap”、“sc.pp.neighbors”和“sc.tl.louvain”函数根据前75个主要成分来进行降维分析和数据聚类；④通过Seurat软件包(版本3.2.3)的“FindAllMarkers”函数进行不同细胞群之间的差异表达分析(Wilcoxon秩和检验)，并计算差异倍数(FC)，筛选标准为矫正后P值小于0.05、|logFC|大于0.5；⑤高表达Gm42418或AY036118基因的细胞群被进一步剔除，并重复步骤2至步骤4的分析，接着根据每个细胞群的经典细胞类型标志基因确定细胞类型。
经过上述流程，我们得到了包含74323个高质量细胞的小鼠造血和免疫***的单细胞图谱。
(3)单细胞伪时间轨迹分析
实施Scanpy软件包中的PAGA分析(iter＝1000，layout＝fa)构建小鼠造血和免疫***单细胞图谱的发育轨迹。对经过随机抽取的细胞(每组保留3000个)使用Monocle2软件包进行伪时间分析。用于排序的基因筛选阈值为至少在10个细胞中表达且表征群间表达差异及离散度的q值小于0.01。使用DDRTree降维算法在二维平面上进行轨迹结构的绘制，并对上述经过随机抽取的细胞进行伪时间排序。调用Monocle2的“BEAM_rest”函数确定了聚类成6个基因簇的1000个差异表达基因(DEGs)(P-value<0.001)，并通过Monocle2的“plot_genes_branched_heatmap”函数绘制这些基因在伪时间轨迹上的表达变化情况。
(4)基因集评分分析
使用Seurat的“AddModuleScore”函数对每个细胞中对应基因集的表达情况进行评分。同体年轻、同体年老、异体年轻和异体年老组别间基因集评分的变化由ggpubr软件包(https://github.com/kassambara/ggpubr)(版本0.2.4)的Wilcoxon检验进行计算。
(5)细胞组成变化分析
在进行细胞比例变化分析之前，我们首先去除了数量少于各个组织总细胞数2.5％的细胞类型。不同组别(Iso-Y、Het-Y、Iso-O、Het-O)中同一细胞类型的数据将除以所在组别的总细胞数，以得到其对应的细胞比例，从而进一步计算特定细胞类型在各个分组中所占的百分比。接着，我们根据Iso-O和Iso-Y之间的细胞比例差别的Log2FC来确定因衰老发生比例变化的细胞类型(|Log2FC|>0.5)，根据Het-Y和Iso-Y组或Het-O和Iso-O组之间的差别来确定因异体共生发生比例变化的细胞类型(|Log2FC|>0.5)。
3、对生信数据提示有变化的细胞进行实验验证
通过流式分析对几种生信数据提示有显著变化的细胞类型。具体步骤如下：
将冻存的骨髓细胞从含有10％DMSO和90％FBS(Gibco)的细胞冻存液中进行复苏，加入B220、IgM和CD43抗体，4℃避光孵育30分钟。PBS洗涤(1200rpm，5min，4℃)两次。在分析之前，加入7-AAD进行染色，以排除死亡细胞，采用流式细胞仪(BD Fortessa)检测pro-B细胞比例，使用FlowJo软件(Tree Star Inc.)进行数据分析。
二、实验结果
计算获得造血干组细胞向髓系和淋系分化相关的6个基因集(图5)。对于四组间不同基因集的基因集评分结果显示，年老过程中造血干细胞向髓系分化的潜能增加(基因集2)，向淋系分化的潜能降低(基因集5和6)，而异体共生可以恢复造血干组细胞向淋系细胞分化的潜能(基因集5和6)(图6)。单细胞数据的细胞比例分析发现，B细胞祖细胞(pro-B)随着衰老比例降低，而异体共生可以有效恢复其数量的降低(图7)。跟同体共生年轻组(Iso-Y)比较，同体年老组pro-B细胞比例下调；跟同体年轻组比较，异体年轻组pro-B细胞比例下调；跟同体年老组比较，异体年老组pro-B细胞比例上调(图8-10)，这些结果均与生信分析数据一致。
实施例3、衰老对造血干(祖)细胞关键的差异基因分析及验证
一、实验方法
1、差异基因计算
(1)差异表达及细胞类型特异的差异基因网络分析
使用Seurat软件包(版本3.2.3)的“FindMarkers”函数中的Wilcoxon秩和检验作为统计计算的方法，对不同组别(Iso-O/Iso-Y、Het-Y/Iso-Y和Het-O/Iso-O)间每种细胞类型进行差异表达分析。在进行差异表达分析之前，预先排除在某一组别中数量小于三个细胞的细胞类型。计算Iso-O组和Iso-Y组之间的差异基因，得到与衰老相关的差异基因集(aging DEGs)(|LogFC|>0.25,adjusted P-value<0.05)；计算Het-O组和Iso-O组之间的差异基因，得到与异体共生年轻组相关的差异基因集(HY DEGs)(|LogFC|>0.25,adjusted P-value<0.05)；计算Het-O组和Iso-O组之间的差异基因，得到与异体共生年老组相关的差异基因集(HODEGs)(|LogFC|>0.25,adjusted P-value<0.05)(详细的基因列表见附表4)。在上述差异表达基因集中，删去了可能无法表征生物学变化的Gm42418和AY036118基因。基于上述基因集，确定“逆转衰老差异基因(aging-R DEGs)”，即在HO DEGs中显著上调或下调而在aging DEGs中分别显著下调或上调的基因；确定“促进衰老差异基因(aging-P DEGs)”，即在HY DEGs和aging DEGs中同时显著上调或下调的基因。
(2)转录因子(TF)调控网络分析
转录因子调控网络分析通过SCENIC软件包(版本1.1.2.2)的标准分析流程实现：以RcisTarget软件包(版本1.6.0)的mm10数据库为参考数据库，调用GENIE3软件包(版本1.6.0)，根据骨髓、外周血和脾脏组织各细胞类型的差异基因建立基因表达调控网络。富集的TF结合基序、预测的候选靶基因(regulons)和靶基因活性的信息从RcisTarget中获取，并通过Cytoscape软件包(版本3.7.2)进行转录调控网络的可视化。
(3)细胞间通讯分析
使用CellPhoneDB软件包(版本1.1.0)(www.cellphonedb.org)进行基于单细胞测序数据的细胞间通讯分析。只有在特定细胞类型至少10％的细胞中表达的受体和配体被纳入后续的分析，而当配体或受体之一不符合至少在10％的细胞中表达的标准时，则舍弃该细胞间通讯。对不同细胞类型间每个配体-受体对的平均表达量进行比较，显著的配体-受体对(P-value<0.01)将被用于预测Iso-Y、Iso-O和Het-O三个组别内跨组织的细胞间通讯交流。
2、含有过表达Yy1或Ccl3基因的重组慢病毒的病毒液的制备
(1)构建重组质粒
小鼠Yy1和Ccl3基因通过PCR的方式从C57BL6/J小鼠的骨髓细胞cDNA中进行扩增，通过酶切酶连的方式连接到经过Mlu1和BamH1(NEB)酶切的SF-LV-EGFP载体中去，即得到过表达Yy1和Ccl3基因的重组慢病毒质粒SF-LV-Yy1-EGFP(将SF-LV-EGFP的Mlu1和BamH1识别位点间的序列替换为小鼠Yy1基因，保持SF-LV-EGFP的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体)以及SF-LV-Ccl3-EGFP(将SF-LV-EGFP的Mlu1和BamH1识别位点间的序列替换为小鼠Ccl3基因，保持SF-LV-EGFP的其它核苷酸序列不变得到的重组表达载体)。
其中，小鼠CCL3蛋白的氨基酸序列的GenBank号为NP_035467.1，编码小鼠CCL3蛋白的核酸分子为小鼠Ccl3基因，小鼠Ccl3基因的GenBank号为NM_011337.2，其编码序列为核苷酸序列是NM_011337.2的第102-380位所示的DNA分子。
其中，小鼠YY1蛋白的氨基酸序列的GenBank号为NP_033563.2，编码小鼠YY1蛋白的核酸分子为小鼠Yy1基因，小鼠Yy1基因的GenBank号为NM_009537.4，其编码序列为核苷酸序列是NM_009537.4第117-1361位所示的DNA分子。
Yy1-F和Yy1-R序列如下：
Yy1-F：5’-CGACGCGTGCCACCATGGCCTCGGGCGACACCCTCTACAT-3’(下划线示Mlu1识别位点)；
Yy1-R：5’-CGCGGATCCTCACTGGTTGTTTTTGGCTTTAGCGTGT-3’(下划线示BamH1识别位点)。
Ccl3-F和Ccl3-R序列如下：
Ccl3-F：5’-CGACGCGTGCCACCATGAAGGTCTCCACCACTGCCCTTGCTG-3’(下划线示Mlu1识别位点)；
Ccl3-R：5’-CGCGGATCCTCAGGCATTCAGTTCCAGGTCAGTGATG-3’(下划线示BamH1识别位点)。
(2)制备重组病毒
2-1)采用Lipo3000转染试剂盒(Thermo Fisher Scientific)将10μg SF-LV-EGFP或SF-LV-Yy1-EGFP或SF-LV-Ccl3-EGFP慢病毒质粒，10μg psPAX2质粒和pMD2G质粒共转染1个10cm皿的293T细胞。培养8小时后，更换新的培养基。
2-2)收集24h，36h，72h的上清液，采用0.22μm滤器过滤，过滤得到的病毒上清液储存于4℃。
2-3)19400rpm，4℃，离心2.5个小时，弃上清，用造血干培养基进行重悬，分别得到重组慢病毒LV/SF-LV-EGFP(VC)，重组慢病毒LV/SF-LV-Yy1-EGFP(表达Yy1基因)和重组慢病毒LV/SF-LV-Ccl3-EGFP(表达Ccl3基因)，分装于-80℃保存。
3、LSK细胞分离以及慢病毒转染
(1)LSK细胞分离
1-1)安乐死24个月龄的小鼠(C57BL6/J，CD45.2，4-6只)，仔细解剖出小鼠股骨，胫骨和臀骨，放入灭菌研钵内，加入5mL预冷的HBSS+溶液，用研磨棒轻轻将骨头压碎，分离出骨髓细胞。将骨髓细胞通过40μm细胞过滤器，过滤得到单细胞悬液，450g，4℃，离心5分钟收集骨髓细胞；
1-2)细胞重悬后，加入c-Kit-APC的抗体，4℃避光孵育30分钟，加入HBSS+溶液离心洗涤之后，加入anti-APC microbeads，4℃避光孵育30分钟；
1-3)采用MACS磁柱(Miltenyi Biotec,Germany)富集c-Kit+细胞。磁柱先用HBSS+溶液进行润洗；将染色完的细胞加入HBSS+溶液，并转到磁柱中，待c-Kit阴性细胞流过后，加入HBSS+溶液润洗一次；将磁柱撤离磁场，加入HBSS+溶液到磁柱中，用活塞缓慢推出细胞，重复一次。450g，4℃，离心5分钟，收集c-Kit+细胞；
1-4)将Lineage-biotin混合抗体加入c-Kit+细胞中。充分混合，4℃避光孵育30分钟。其中，Lineage-biotin混合抗体包括：anti-mouse CD3,CD4,CD8,B220,CD11b,Ly6G/Ly-6C和Ter-119；
1-5)加入HBSS+溶液，450g，4℃，离心5分钟，收集细胞；
1-6)加入Strepavidin-APC-eFluorTM780，Sca-1-PE-CyTM7，c-Kit-APC抗体，4℃避光孵育30分钟，450g，4℃，离心5分钟，收集细胞；
1-7)在分选之前，加入DAPI进行染色，以排除死亡细胞，采用流式细胞仪(BDFusion)分选LSK细胞。
(2)慢病毒转染
2-1)2×105个LSK细胞采用HSC培养基培养于低粘附的96孔板中(Nest Biotech)，2h后，加入浓缩的慢病毒(重组慢病毒LV/SF-LV-EGFP或重组慢病毒LV/SF-LV-Yy1-EGFP或重组慢病毒LV/SF-LV-Ccl3-EGFP)进行病毒转染效率滴定；转染72h后，收集细胞(重组慢病毒LV/SF-LV-EGFP或重组慢病毒LV/SF-LV-Yy1-EGFP转染得到的重组LSK细胞或重组慢病毒LV/SF-LV-Ccl3-EGFP转染得到的重组LSK细胞)WB验证过表达效率；
2-2)转染72h后，450g，4℃，离心5分钟收集细胞，加入Sca-1-PE-CyTM7，CD48-PerCP/Cyanine5.5抗体，4℃避光孵育30分钟，450g，4℃，离心5分钟，收集细胞；
2-3)在分选之前，加入DAPI进行染色，以排除死亡细胞，采用流式细胞仪(BDFusion)分选GFP+Sca1+CD48-细胞到HBSS+溶液中，分别得到重组细胞GFP+Sca1+CD48-/LV/SF-LV-EGFP(LV/SF-LV-EGFP转染得到的重组细胞)、GFP+Sca1+CD48-/LV/SF-LV-Yy1-EGFP(LV/SF-LV-Yy1-EGFP转染得到的重组细胞)和GFP+Sca1+CD48-/LV/SF-LV-Ccl3-EGFP(LV/SF-LV-Ccl3-EGFP转染得到的重组细胞)。
4、移植和外周血检测
(1)小鼠移植
1-1)准备辐射的小鼠：在移植前对8周龄CD45.2受体小鼠(C57BL6/J，8-10只)采用X-ray辐照仪(RS-2000,Rad Source Technologies)进行辐射，总剂量是10Gy(分两次，每次5Gy，相隔3小时)；
1-2)准备竞争骨髓细胞：安乐死1-2只2-3个月龄CD45.1小鼠(C57BL6/J)，取出股骨，分离出骨髓单细胞悬浮液(HBSS+溶液重悬)，采用Vi-Cell XR细胞存活率分析计数仪器(Beckman Coulter)进行计数，得到CD45.1竞争性骨髓细胞；
1-3)在分选得到2000个GFP+Sca1+CD48-细胞(GFP+Sca1+CD48-/LV/SF-LV-EGFP或GFP+Sca1+CD48-/LV/SF-LV-Yy1-EGFP或GFP+Sca1+CD48-/LV/SF-LV-Ccl3-EGFP)中加入2×105个CD45.1竞争性骨髓细胞，通过尾静脉注射的方式移植到经过1-1)处理的受体小鼠体内，得到VC小鼠(注射GFP+Sca1+CD48-/LV/SF-LV-EGFP和CD45.1竞争性骨髓细胞得到的小鼠)、YY1小鼠(注射GFP+Sca1+CD48-/LV/SF-LV-Yy1-EGFP和CD45.1竞争性骨髓细胞得到的小鼠)、CCL3小鼠(注射GFP+Sca1+CD48-/LV/SF-LV-Ccl3-EGFP和CD45.1竞争性骨髓细胞得到的小鼠)。
(2)外周血检测
2-1)小鼠移植四周后，对VC小鼠、YY1小鼠和CCL3小鼠进行尾静脉采血，加入CD45.1、CD11b、B220和CD3抗体，4℃避光孵育30分钟后，采用红细胞裂解液对红细胞进行裂解，加入2％FBS的PBS进行离心洗涤之后(1200rpm，5min，4℃)，收集细胞；
2-2)在分析之前，加入DAPI或PI进行染色，以排除死亡细胞，采用流式细胞仪(BDFortessa)检测供体来源的嵌合率，分析Myeloid细胞、B细胞和T细胞的比例分布情况；
2-3)每次间隔4周，对移植小鼠尾静脉血采用上述方法进行检测分析。
5、WB验证YY1或CCL3过表达效率
(1)收集转染72h的LSK细胞，采用1×SDS裂解液(包含4％SDS和100mM Tris-HCl(pH＝6.8))在105℃加热裂解10分钟；
(2)采用BCA蛋白试剂盒对总蛋白进行定量；
(3)蛋白样品采用SDS-PAGE电泳，然后再转到PVDF膜(Millipore)；
(4)加入YY1(Santa Cruz)或CCL3(Santa Cruz)一抗4℃过夜孵育，在室温用偶联HRP的二抗孵育1小时；
(5)曝光，显影。
二、实验结果
结果发现：在骨髓造血干祖细胞中计算获得171个逆转衰老的差异基因(149个上调和22个下调)，以及540个衰老相关差异基因(131个上调和409个下调)，119个促衰老差异基因(96个下调和23个上调)(图11)。这其中又可以得到36个异体共生核心基因。其中Zfp36(Gene ID：22695),Cd69(Gene ID：12515),Cxcl2(Gene ID：20310),Jun(Gene ID：16476),Junb(Gene ID：16477),Dusp2(Gene ID：13537),Ier2(Gene ID：15936),Ier3(Gene ID：15937),Nfkbiz(Gene ID：80859),Ppp1r15a(Gene ID：17872),Egr1(Gene ID：13653),Icam1(Gene ID：15894),Gadd45b(Gene ID：17873),Cxcl10(Gene ID：15945),Nfkbia(GeneID：18035),Tnfaip3(Gene ID：21929),Etv3(Gene ID：27049),Ccl3(Gene ID：20302),Ccrl2(GeneID：54199),Dntt(Gene ID：21673),Rhob(Gene ID：11852),Fosb(Gene ID：14282),Tnf(GeneID：21926),Sox4(Gene ID：20677),Zfp36l2(Gene ID：12193),Gimap6(Gene ID：231931),Phlda1(Gene ID：21664),Egr3(Gene ID：13655)在同体共生衰老个体和异体共生年轻个体的造血干祖细胞中下调表达，在异体共生年老个体中上调表达(逆转衰老)。此外，Prtn3(GeneID：19152),Lars2(Gene ID：102436),Hp(Gene ID：15439),Ms4a3(Gene ID：170813),Mpo(Gene ID：17523),S100a8(Gene ID：20201),Elane(Gene ID：50701),S100a9(Gene ID：20202)在同体共生衰老个体和异体共生年轻个体的造血干祖细胞中上调表达，在异体共生年老个体中下调表达(逆转衰老)(图12)。更进一步的核心调控转录因子分析发现，Atf3、Atf4和Yy1是其中关键调控因子(图13)，并且都在同体共生衰老个体和异体共生年轻个体的造血干祖细胞中下调表达，其中Atf3和Atf4在异体共生年老个体中上调表达(逆转衰老)(图14)。此外，细胞间通讯的结果分析显示，异体共生可以部分恢复骨髓造血干祖细胞的细胞间配体受体相互作用，其中进一步筛选发现了Ccl3相关的配体受体对在其中也得到了有效恢复，推测其可能在造血干祖细胞分化过程中扮演关键调控作用(图15)。随后，我们对Yy1基因和Ccl3基因进行了验证。
1、LSK细胞过表达YY1的鉴定结果
为了研究YY1在年老造血干(祖)细胞中的作用，对LSK细胞进行了慢病毒转染，WB结果显示，在蛋白水平，YY1在重组慢病毒LV/SF-LV-Yy1-EGFP转染得到的重组LSK细胞中显著增加(图16)。
2、过表达YY1增强年老造血干(祖)细胞的重建能力
通过竞争性移植实验来评估过表达YY1对年老造血干(祖)细胞重建能力的影响，实验结果如图17所示。图17中A为竞争性移植实验的流程图；图17中B为小鼠外周血测试供体来源分析，图17中B的纵坐标表示年老小鼠供体来源的细胞占比，单位为％，横坐标为小鼠移植实验后的周数，单位为周(7天)。图17中B表明：小鼠外周血的整体细胞、T细胞及Myeloid细胞中，过表达YY1的年老小鼠(YY1小鼠)供体来源占比显著(P＜0.05)高于对照组(VC小鼠)；小鼠的外周血的B细胞中，过表达YY1的年老小鼠供体来源占比与对照组无显著差异(P＞0.05)。表明过表达YY1能够提高年老造血干(祖)细胞的重建能力，主要体现在整体水平、T细胞和Myeloid细胞上。
3、LSK细胞过表达CCL3的鉴定结果
为了研究CCL3在年老造血干(祖)细胞中的作用，对LSK细胞进行了慢病毒转染，WB结果显示，在蛋白水平，CCL3在重组慢病毒LV/SF-LV-Ccl3-EGFP转染得到的重组LSK细胞中显著增加(图18)。
4、过表达CCL3增强年老造血干(祖)细胞的重建能力
通过竞争性移植实验来评估过表达CCL3对年老造血干(祖)细胞重建能力的影响，实验结果如图19所示。图19的纵坐标表示年老小鼠供体来源的细胞占比，单位为％，横坐标为小鼠移植实验后的周数，单位为周(7天)。图19表明：小鼠外周血的T细胞中，过表达CCL3的年老小鼠供体来源占比显著(P＜0.05)高于对照组(VC)；小鼠外周血的整体细胞、B细胞及Myeloid细胞中，过表达CCL3的年老小鼠供体来源占比与对照组无显著差异(P＞0.05)。表明过表达CCL3能够提高年老造血干(祖)细胞的重建能力，主要体现在整体水平、T细胞和Myeloid细胞上。结果显示，过表达CCL3能够提高年老造血干(祖)细胞的重建能力，主要体现在T细胞水平上。
5、过表达CCL3增强造血干(祖)细胞往淋系分化的影响
通过竞争性移植实验进一步评估分析CCL3对年老造血干(祖)细胞谱系分化能力的影响，结果如图20所示，每个柱状图由上至下分别表示髓系、B细胞和T细胞的占比。图20的纵坐标为年老小鼠测试供体来源的谱系分析比例，单位为％，其中髓系细胞、B细胞、T细胞的总和为100％，横坐标为小鼠移植实验后的周数，单位为周(7天)。图20的结果表明，过表达CCL3的年老小鼠细胞，T细胞的比例在不同时间点检测均显著(P＜0.05)高于对照组(VC)。髓系和B细胞的比例在移植12周、16周和20周与对照组无显著差异(P＞0.05)。结果显示，过表达CCL3能够提高年老造血干(祖)细胞往淋系分化的方向，主要体现在T细胞水平上。
实施例4、衰老对皮肤成纤维细胞关键的差异基因验证
一、实验方法
1、小鼠或人成纤维细胞培养
人皮肤组织获取通过北京协和医院的伦理委员会审核，捐献者均签署了知情同意书。27岁健康人的上眼睑眼皮组织，用剪刀剪碎组织，贴于6孔板底部，添加0.5ml的成纤维细胞生长培养基(90％DMEM，10％胎牛血清，1％NEAA,1％GlutaMax,0.10％plasmocin)。细胞生长至80％，用0.25％Tryposin于消化传代。所获取的细胞用于后续实验分析。
小鼠成纤维细胞来自7周雄性小鼠背部皮肤组织，剪刀剪碎，8mg/mL的Collagenase 4在37摄氏度水浴1小时30分钟，经过40微米滤膜过滤，添加10ml的成纤维细胞生长培养基，接种于10cm培养皿种，细胞生长至80％，0.25％Trypsin用于消化传代。所获取的细胞用于后续实验分析。
2、Tsc22d3(Gilz)基因敲低
人GILZ蛋白可人Gilz基因编码的蛋白质，人Gilz基因的GenBank号为XM_005262103.5，其编码序列为核苷酸序列是XM_005262103.5的第160-762位所示的DNA分子，人GILZ蛋白的GenBank号为：NP_001015881.1。小鼠GILZ蛋白可为小鼠Gilz基因编码的蛋白质，小鼠Gilz基因的GenBank号为NM_001077364.1，其编码序列为核苷酸序列是NM_001077364.1第204-809位所示的DNA分子，小鼠GILZ蛋白的GenBank号为：NP_001070832.1。
使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Thermo Fisher Scientific)，用针对目标基因的阴性对照和siRNA(锐博)转染成纤维细胞48小时，然后用50ng/mL IL-6处理成纤维细胞24小时，模拟老化组织中的炎症环境。GILZ基因siRNA见表1：
表1：Gilz基因siRNA
收集细胞进行RT-qPCR、Ki67免疫染色和凋亡分析。
2、RT-qPCR
人或小鼠转染RNAi序列的细胞48小时后，用TRIzol试剂(Thermo FisherScientific)提取总RNA，用master mix(Promega)将2μg总RNA逆转录成cDNA。用iTaqUniversal SYBR GreenSuper Mix(Bio-Rad)进行RT-qPCR。以GAPDH为内参，检测小鼠或人Gilz基因表达，Gilz基因的引物序列见表2。
表2：Gilz基因的引物序列
检测结果见图23。结果表明，siRNA有效降低小鼠和人成纤维细胞中GILZ基因的表达。
3、Ki67免疫荧光染色
为了测量细胞增殖的变化，小鼠或人的成纤维细胞接种于24孔板的玻璃片种，按照步骤2经siRNA处理之后72小时进行检测，每组包含三个实验重复以及两个独立实验。每个样本统计不少于300个细胞用于数据分析。
将成纤维细胞用4％PFA固定25min,0.4％Triton X-100透性25min,室温下用封闭缓冲液(10％驴血清)孵育1h,4℃下Ki67抗体(abcam 15580)染色过夜。然后，用二抗和Hoechst33342(Thermo Fisher Scientific)孵育细胞1小时，用共聚焦激光扫描显微镜(Zeiss 900共聚焦***)扫描成像。统计Ki67阳性细胞所占比例。
结果表明，在人或小鼠成纤维细胞种敲低GILZ,经IL6处理，细胞增殖能力明显降低。
4、凋亡细胞检测
为了测量细胞凋亡的变化，小鼠或人的成纤维细胞以1x10e细胞每孔接种于12孔板，按照步骤2经siRNA处理之后72小时进行检测，每组包含三个实验重复以及两个独立实验。
新鲜收集的成纤维细胞按照Annexin V-EGFP凋亡检测试剂盒(VazymeBiotechnology,A211-02)的说明书进行染色，然后用BD LSRFortesa流式细胞仪进行流式分析，数据用FlowJo软件(TreeStar)进行分析。
结果表明，在人或小鼠成纤维细胞种敲低GILZ,经IL6处理，细胞凋亡数量明显升高。
二、实验结果
生信计算的结果如图21所示。图21表明：相比于同体年轻组小鼠，同体年老组小鼠的造血干祖细胞中的髓系祖细胞(CMP)、多能组细胞(MPP)和淋系祖细胞(CLP)中Tsc22d3(Gilz)基因表达下调；皮肤中基底层干细胞(Basal-1)、有棘层细胞(Spi)、网状层成纤维细胞(RetiFib)和毛囊干细胞(HFSC)中Tsc22d3(Gilz)基因表达下调；骨骼肌的IIX型肌纤维细胞(Fast_IIX)中Tsc22d3(Gilz)基因表达差异较小；肝脏中库普弗细胞(Kupffer_cell)、Zone 1区肝实质细胞(Hepatocyte_Z1)、胆管细胞(Cholangiocyte)、内皮细胞(EC)、Zone3区肝实质细胞(Hepatocyte_Z3)和Zone 2区肝实质细胞(Hepatocyte_Z2)中Tsc22d3(Gilz)基因表达下调。相比于同体年老组小鼠，异体年老组小鼠的造血干祖细胞中的髓系祖细胞(CMP)、多能组细胞(MPP)和淋系祖细胞(CLP)中Tsc22d3(Gilz)基因表达上调；皮肤中基底层干细胞(Basal-1)、有棘层细胞(Spi)和网状层成纤维细胞(RetiFib)中Tsc22d3(Gilz)基因表达上调；肝脏中Zone 2区肝实质细胞(Hepatocyte_Z2)中Tsc22d3(Gilz)基因表达上调。由图21结果可以推断：Tsc22d3(Gilz)在多种外周组织细胞类型中随着衰老下调表达，而异体共生能够部分恢复其变化。
RT-qPCR检测目的基因相对表达量的结果如图22所示。图22表明：RNA干扰组(si-GILZ)的人成纤维细胞和小鼠成纤维细胞均显著低于对照组(si-NC)，表明RNAi的方式成功构建了Tsc22d3(Gilz)基因沉默的人和小鼠的成纤维细胞
Ki67免疫荧光染色的结果如图23所示。图23结果表明：RNA干扰组(si-GILZ)的人成纤维细胞和小鼠成纤维细胞中，被Ki67染色的细胞数目显著低于对照组(si-NC)，表明RNA干扰组(si-GILZ)的细胞增殖能力降低。
凋亡细胞比例检测的结果如图24所示。图24结果表明：RNA干扰组(si-GILZ)的人成纤维细胞和小鼠成纤维细胞中，凋亡细胞的比例(7.81％、7.89％)显著低于对照组(11.80、12.20)，表明RNA干扰组(si-GILZ)的细胞凋亡水平升高。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国科学院动物研究所
<120> 异体共生年轻化因子及其在延缓机体衰老中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
ccatggacct cgtgaagaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
gtgagaacac cctgttgaa 19

Claims (10)

1.应用，所述应用为下述A1)-A10)中任一种：
A1)、蛋白CCL3或蛋白YY1或蛋白GILZ或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1或所述蛋白GILZ编码基因表达的物质或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1或所述蛋白GILZ活性或含量的物质在调控机体和/或细胞和/或组织衰老水平中的应用；
A2)、蛋白CCL3或蛋白YY1或蛋白GILZ或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1或所述蛋白GILZ编码基因表达的物质或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1或所述蛋白GILZ活性或含量的物质在制备机体和/或细胞和/或组织衰老水平的产品中的应用；
A3)、蛋白CCL3或蛋白YY1或蛋白GILZ或测定蛋白CCL3或蛋白YY1或蛋白GILZ含量的物质在鉴定或辅助鉴定机体和/或细胞和/或组织衰老水平中的应用；
A4)、蛋白CCL3或蛋白YY1或蛋白GILZ或测定蛋白CCL3或蛋白YY1或蛋白GILZ含量的物质在制备鉴定或辅助鉴定机体和/或细胞和/或组织衰老水平的产品中的应用；
A5)、蛋白CCL3或蛋白YY1或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1编码基因表达的物质或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1活性或含量的物质在调控造血干细胞的重建能力中的应用；
A6)、蛋白CCL3或蛋白YY1或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1编码基因表达的物质或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1活性或含量的物质在制备调控造血干细胞的重建能力的产品中的应用；
A7)、蛋白CCL3或蛋白YY1或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1编码基因表达的物质或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1活性或含量的物质在调控造血干细胞的谱系分化的应用；
A8)、蛋白CCL3或蛋白YY1或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1编码基因表达的物质或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1活性或含量的物质在制备调控造血干细胞的谱系分化的产品中的应用；
A9)、蛋白GILZ或调控所述蛋白GILZ编码基因表达的物质或调控所述蛋白GILZ活性或含量的物质在调控皮肤成纤维细胞的增殖能力中的应用；
A10)、蛋白GILZ或调控所述蛋白GILZ编码基因表达的物质或调控所述蛋白GILZ活性或含量的物质在制备调控皮肤成纤维细胞的增殖能力的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1编码基因表达的物质或调控所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1蛋白活性或含量的物质为生物材料B1，所述生物材料B1为下述B11)至B17)中的任一种：
B11)、编码所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1的核酸分子；
B12)、含有B11)所述核酸分子的表达盒；
B13)、含有B11)所述核酸分子的重组载体、或含有B12)所述表达盒的重组载体；
B14)、含有B11)所述核酸分子的重组微生物、或含有B12)所述表达盒的重组微生物、或含有B13)所述重组载体的重组微生物；
B15)、含有B11)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有B12)所述表达盒的转基因动物细胞系、或含有B13)所述重组载体的转基因动物细胞系；
B16)、含有B11)所述核酸分子的转基因动物组织、或含有B12)所述表达盒的转基因动物组织、或含有B13)所述重组载体的转基因动物组织；
B17)、含有B11)所述核酸分子的转基因动物器官、或含有B12)所述表达盒的转基因动物器官、或含有B13)所述重组载体的转基因动物器官。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B11)所述核酸分子为所述蛋白CCL3或所述蛋白YY1蛋白的编码基因，所述蛋白CCL3的编码基因为Ccl3基因或Ccl3基因的编码序列；所述蛋白YY1的编码基因为Yy1基因或Yy1基因的编码序列。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控所述蛋白GILZ编码基因表达的物质或调控所述蛋白GILZ活性或含量的物质为生物材料B2，所述生物材料B2为抑制或降低所述蛋白GILZ的编码基因的表达的RNA分子或抑制或降低所述蛋白GILZ的活性或含量的RNA分子。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：B21)所述抑制或降低所述蛋白GILZ的编码基因的表达的RNA分子或抑制或降低所述蛋白GILZ的活性或含量的RNA分子为下述i1)或i2)或i3)：
i1)、RNA分子的靶标序列为蛋白GILZ的编码基因；
i2)、RNA分子的靶标序列的核苷酸序列是SEQ ID No.1；
i3)、RNA分子的靶标序列的核苷酸序列是SEQ ID No.2。
6.异体共生动物在如下P1)-P18)中任一种中的应用：
P1)、降低脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或大脑组织中衰老细胞比例；
P2)、降低脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或骨骼肌组织中细胞凋亡比例；
P3)、减轻肝脏组织炎症面积；
P4)、减轻肝脏组织和/或脾脏组织纤维化面积；
P5)、增加骨骼肌组织肌纤维直径；
P6)、增加皮肤组织毛囊数量；
P7)、增加骨髓中pro-B细胞比例；
P8)、增加造血干细胞中CCL3蛋白或/和YY1蛋白表达水平；
P9)、上调Ccl3基因或/和Yy1基因表达水平。
P10)通过降低脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或大脑组织中衰老细胞比例延缓衰老；
P11)通过降低脾脏组织和/或皮肤组织和/或肝脏组织和/或骨骼肌组织中细胞凋亡比例延缓衰老；
P12)通过降低肝脏组织炎症面积延缓衰老；
P13)通过降低肝脏组织和/或脾脏组织纤维化面积延缓衰老；
P14)通过降低骨骼肌组织肌纤维直径延缓衰老；
P15)通过降低皮肤组织毛囊数量延缓衰老；
P16)通过增加骨髓中pro-B细胞比例延缓衰老；
P17)通过增加造血干细胞中CCL3蛋白或/和YY1蛋白表达水平延缓衰老；
P18)通过上调Ccl3基因或/和Yy1基因表达水平延缓衰老。
7.构建重组细胞的方法，其特征在于：所述方法包括向受体细胞中导入目的蛋白的编码基因，促进或提高或上调所述目的蛋白的编码基因表达，或促进或提高或上调所述目的蛋白的活性或含量，得到衰老水平低于所述受体细胞的重组细胞；
所述目的蛋白为权利要求1中所述CCL3蛋白或权利要求1中所述YY1蛋白。
8.由权利要求7所述的方法构建得到的重组细胞。
9.权利要求8所述重组细胞系在下述D1)或D2)中的应用：
D1)、在提高年老造血干细胞的重建能力中的应用；
D2)、在制备提高年老造血干细胞的重建能力的产品中的应用。
10.权利要求1所述的蛋白CCL3或蛋白YY1或蛋白GILZ，或权利要求2-5中任一项所述的生物材料B1或/和生物材料B2。
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