CN104650200A - 一种肿瘤抗原性植物蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从低等植物地衣中提取的植物蛋白，经验证该蛋白具有肿瘤抗原性，本发明还公开了制备该植物蛋白的步骤方法。该植物蛋白与至少七种癌细胞(人乳腺癌细胞、胃癌细胞、肺鳞癌细胞、人结肠癌细胞、子***细胞、人肝癌细胞、人肾癌细胞)的细胞破碎物均能有效结合。

Description

一种肿瘤抗原性植物蛋白

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种肿瘤抗原性植物蛋白。

背景技术

由于癌症目前不能进行早期检测，而肿瘤抗原的确定对肿瘤免疫治疗具有重要意义，已有报道发现不同种属的同类基因表现为一定的同源性，生物亲缘关系越远，其免疫性越强。据此，人们便期望能发现一类异种同源的肿瘤抗原性物质，并利用它检测人体内肿瘤抗体，实现癌症早期诊断的目的。

发明内容

本研究从低等植物地衣中提取了一种植物蛋白，通过免疫印迹法(Westen Blotting)证实了该种蛋白具有肿瘤抗原性，可以作为早期肿瘤诊断的标记物。

本发明的目的是提供一种肿瘤抗原性植物蛋白，将该蛋白命名为植物蛋白，该植物蛋白具有肿瘤相关抗原性。

一种肿瘤抗原性植物蛋白，组成该蛋白的氨基酸具有SEQ ID NO：1的序列，该蛋白可用于肿瘤的检测，也可用于制备抑制肿瘤生长的药物。

制备该肿瘤抗原性植物蛋白的方法：

(6)称取40g地衣组织，捣碎，再分别用液氮研磨和超声波破碎法进行破碎，破碎后离心，用磷酸盐缓冲液溶解上清液；

(7)用蒸馏水或磷酸盐缓冲液冻融法对取得的地衣组织细胞进一步破碎，细胞破碎后离心取上清；

(8)硫酸铵盐析对蛋白进行粗提，加硫酸铵盐至20％饱和度，离心取上清后加硫酸铵盐至40％饱和度，离心，沉淀用等量的1mmol/L磷酸缓冲液(ph6.8)溶解，可得20％-40％的硫酸，离心后上清加硫酸铵盐至60％饱和度，离心，沉淀用等量的1mmol/L磷酸缓冲液(ph6.8)溶解，铵沉淀粗蛋白和40％-60％的硫酸铵沉淀粗蛋白；

(9)上述两种粗蛋白经初步检测后，将含目的蛋白的提取液经滤膜过滤后，通过sephadex25脱盐柱进行脱盐；

(10)脱盐后，上吸附性HA柱，以离子强度不断增加的磷酸盐缓冲液(ph6.8含不同浓度Nacl)洗脱，分步收集，用SDS-PAGE蛋白电泳检测收集的各浓度洗脱液中目的蛋白；

(6)用考马斯亮蓝试剂盒检测所得的纯的蛋白的浓度，-70℃保存备用。

进一步，上述步骤均在避光和不高于4℃的条件下进行。

进一步，步骤(2)中离心为4℃，5000r/min，15min。

提取出的纯的植物蛋白蛋白经N端测序得到SEQ ID NO：1的蛋白序列。

该植物蛋白在癌症早期检测中的应用。

该植物蛋白在抗癌药物中的应用。

经证实，该植物蛋白与人乳腺癌细胞、胃癌细胞、肺鳞癌细胞、人结肠癌细胞、子***细胞、人肝癌细胞、人肾癌细胞的细胞破碎物均能有效结合，证实该植物蛋白具有多种肿瘤抗原的特性。

附图说明

图1是该植物蛋白的SDS-PAGE电泳图。

图2是该植物蛋白与七种肿瘤标志物结合的western-blot图。

具体实施方式

实施例1.植物蛋白蛋白的制备

称取40g地衣组织，研钵捣碎，再分别用液氮研磨和超声波破碎法进行破碎，破碎后离心，用磷酸盐缓冲液溶解上清液；用磷酸盐缓冲液冻融法进一步对取得的组织液的细胞进行破碎，在4℃，5000rpm，经离心15min，取上清液；加入硫酸铵至20％饱和度，4℃过夜，5000rpm离心10min，在上清液中加入硫酸铵至40％饱和度，4℃过夜，5000rpm离心10min，收集沉淀，用1mmol/L磷酸缓冲液(ph6.8)溶解，溶解沉淀，得到20％-40％硫酸铵沉淀粗蛋白。在上述上清液中继续加入硫酸铵至60％饱和度，4℃过夜，5000rpm离心10min，收集沉淀，沉淀用等量的1mmol/L磷酸缓冲液(ph6.8)溶解，得40％-60％硫酸铵沉淀粗蛋白，本实施例对40％-60％硫酸铵沉淀粗蛋白进行进一步分离纯化。

将上述粗蛋白经过滤后，通过sephadex25柱脱盐进行脱盐。再上吸附性HA柱，以离子强度不断增加的磷酸盐缓冲液洗脱(洗脱液的浓度依次用0.05mol/L、0.10mol/L、0.20mol/L、0.30mol/L、0.40mol/L、0.8mol/L、1.Omol/L的NaCl溶液洗脱，洗脱液的PH为6.8)，分步收集，收集各个洗脱液浓度的蛋白，用SDS-PAGE蛋白电泳检测各洗脱浓度的蛋白。经检测含0.8mol/L的NaCl的洗脱液含有目的蛋白的单一条带，如图1所示，该植物蛋白的大小为47KD，与经生物信息学软件分析的分子量大小一致。

实施例2.兔抗植物蛋白抗体的制备

将制备得到的植物蛋白制备成注射液，选用1.5-2kg的雌性新西兰大白鼠，每隔3周免疫一次，共免疫4次，第一次免疫用0.4g抗原加完全弗氏佐剂且经背部皮下多点(不少于8点)注射抗原进行免疫，后面三次肌肉注射用0.2g抗原加不完全弗氏佐剂进行免疫，在最后一次免疫7天后，于耳静脉取血分离血清，以间接ELISA法协定血清抗体的效价，效价为2×10¹。

实施例3.兔抗植物蛋白与肿瘤抗原的Western-blot检测

取七种癌细胞分别为人乳腺癌MCF-7细胞，胃癌BGC-823细胞，肺鳞癌NCI-H520细胞，人结肠癌SW480细胞，子***Hela细胞，人肝癌HepG2细胞，人肾癌HEK293细胞，将七种癌细胞进行裂解，以细胞裂解物为抗原，实施例2中制备的兔抗植物蛋白抗体为抗体，然后以鼠抗兔单克隆抗体与抗原抗体复合物结合，再以HRP标记的羊抗鼠多克隆抗体结合，然后以ECL发光液进行检测，检测结果如图2所示，蛋白电泳结果显示，在90kD的位置七种癌细胞裂解物与该植物蛋白的抗体均有的结合条带，证明兔抗该植物蛋白的抗体能与七种癌细胞的抗原有效结合，该植物蛋白有多种肿瘤抗原的特性。

实施例4.植物蛋白蛋白肿瘤早期诊断应用

用¹³¹I标记实施例2中的兔抗植物蛋白抗体，检测其在荷瘤小鼠体内的分布，¹³¹I标记的兔抗植物蛋白抗体将其经尾静脉注射给荷S-180移植瘤小鼠，于注药后12h、24h、36h、48h、72h和96h分别处死动物，进行放射免疫显像，取一定量眼球血、心、肝、脾及肿瘤组织，称重并用γ-计数器测定其放射性计数。

结果：¹³¹I标记的兔抗植物蛋白抗体在注入小鼠体内36-96h肿瘤部位有放射性浓聚，高放射性浓聚区与荷瘤小鼠所荷瘤的位置大小基本一致，显像以注入抗体后48-72h最为清晰，各时相肿瘤组织的摄取率显著高于其他实质性器官组织，在12h、24h、36h、48h、72h和96h肿瘤组织的摄取率分别为1.63、2.42、2.92、3.10、2.88、2.64，其他实质性组织的最大值为0.86，不同肿瘤组织与其他组织放射活性的比值随时间的延长不断增高，48h达到最高，72-96h又逐渐减小，说明兔抗植物蛋白抗体能特异性结合肿瘤细胞。

以上对本发明的具体实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (5)

1.一种肿瘤抗原性植物蛋白，其特征在于：组成该蛋白的氨基酸具有SEQ ID N0：1的序列。

2.制备权利要求1所述肿瘤抗原性植物蛋白的方法：

(1)称取40g地衣组织，捣碎，再分别用液氮研磨和超声波破碎法进行破碎，破碎后离心，用磷酸盐缓冲液溶解上清液；

(2)用蒸馏水或磷酸盐缓冲液冻融法对取得的地衣组织细胞进一步破碎，细胞破碎后离心取上清；

(3)硫酸铵盐析对蛋白进行粗提，加硫酸铵盐至20％饱和度，离心取上清后加硫酸铵盐至40％饱和度，离心，沉淀用等量的1mmol/L磷酸缓冲液(ph6.8)溶解，可得20％-40％的硫酸，离心后上清加硫酸铵盐至60％饱和度，离心，沉淀用等量的1mmol/L磷酸缓冲液(ph6.8)溶解，铵沉淀粗蛋白和40％-60％的硫酸铵沉淀粗蛋白；

(4)上述两种粗蛋白经初步检测后，将含目的蛋白的提取液经滤膜过滤后，通过sephadex25脱盐柱进行脱盐；

(5)脱盐后，上吸附性HA柱，以离子强度不断增加的磷酸盐缓冲液(ph6.8含不同浓度Nacl)洗脱，分步收集，用SDS-PAGE蛋白电泳检测收集的各浓度洗脱液中目的蛋白；

(6)用考马斯亮蓝试剂盒检测所得的纯的蛋白的浓度，-70℃保存备用。

3.根据权利要求2所述的制备肿瘤抗原性植物蛋白的方法，其特征在于：上述步骤均在避光和不高于4℃的条件下进行。

4.根据权利要求2所述的制备肿瘤抗原性植物蛋白的方法，其特征在于：步骤(2)中离心为4℃，5000r/min，15min。

5.权利要求1所述植物蛋白在制备抗癌药物中的应用。