CN101797381B

CN101797381B - 乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101797381B
Application number: CN2010101029437A
Authority: CN
Inventors: 吴玉章; 杨曌
Original assignee: Third Military Medical University TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU
Priority date: 2010-01-29
Filing date: 2010-01-29
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2030-01-29
Also published as: CN101797381A

Abstract

本发明公开了乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物及其制备方法和应用，该复合物主要由乙肝病毒核心抗原与路易斯寡糖-x结合而成；其制备方法是先制得乙肝病毒核心抗原与链霉亲和素的偶联物，再与(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素通过链霉亲和素与生物素的高亲和力进行结合，即制得乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物；该复合物通过路易斯寡糖-x与DC-SIGN的高亲和力主动靶向树突状细胞，增强了免疫***对乙型肝炎病毒的识别能力，能够激活特异性CTL应答，诱导强有力的抗病毒免疫，可用于制备乙型肝炎治疗性疫苗。

Description

乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白与寡糖的复合物，特别涉及乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物，还涉及该复合物的制备方法和应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)是一种嗜肝的DNA病毒。乙型病毒性肝炎简称乙型肝炎，是由乙型肝炎病毒引起，主要通过血液、体液及母婴传播，具有慢性携带状态的传染病。目前世界上有3亿多人为慢性乙型肝炎病毒感染，我国约占半数。此种感染容易发展为慢性肝炎和肝硬化，少数病例可转变为原发性肝细胞癌，是当前世界卫生组织公布的人类疾病死亡原因中居第9位的疾病。为此，寻求理想的抗乙型肝炎病毒药物一直是亟待解决的研究课题。目前，慢性乙型肝炎病毒感染主要采用抗病毒药物进行治疗，应用的抗病毒药物主要有干扰素和核苷类药物如拉米夫定等，其中，干扰素的适应症有限，疗效较差，不良反应发生率较高，且价格昂贵；拉米夫定作为逆转录酶的强抑制剂，在控制慢性乙型肝炎病毒感染方面具有确切的近期疗效，且有良好的耐受性，但其不能清除肝细胞内乙型肝炎病毒复制的来源，长期用药又存在耐药问题。因此，积极寻求更为有效的抗病毒药物仍为当务之急。

CD8+T细胞是机体免疫***的主要组成部分，在针对病毒、细菌和真菌等病原性微生物以及恶性肿瘤等的免疫监视、免疫防御以及免疫治疗过程中发挥关键性作用。乙型肝炎病毒感染的慢性化主要是由于机体对乙型肝炎病毒的免疫应答特别是细胞免疫应答不能清除病原，从而导致感染的持续存在。在急性乙型肝炎病毒感染时，机体存在大量的针对乙型肝炎病毒多个抗原表位的多特异性、多克隆的细胞毒性T细胞(CTL)应答，而在慢性乙型肝炎病毒感染时，这些CTL应答非常微弱甚至检测不到。因此，采取恰当的免疫方式，打破机体对乙型肝炎病毒的免疫耐受，重建活跃的免疫应答，有望清除病毒，终止慢性乙型肝炎病毒感染。

树突状细胞(DC)是体内最强大的专职抗原递呈细胞，能够识别、捕获、加工、递呈抗原引发初始免疫反应。利用树突状细胞来改善病毒的免疫原性是治疗性疫苗设计的重要策略之一，其主要方式有体外和体内两种。体外方式是先体外分离树突状细胞，再用病毒裂解物、病毒抗原蛋白、病毒抗原多肽或病毒来源的RNA等冲击致敏树突状细胞，制成各种树突状细胞疫苗，最后回输体内。体内方式是将蛋白、多肽或基因疫苗直接体内靶向树突状细胞，是更简便、更易于临床操作的方式，但其存在如下问题：既往研究的蛋白疫苗多以树突状细胞表达的Fc受体、补体受体、甘露糖受体、CD40或B7为靶向受体，但这些受体在血细胞上也有表达，从而在树突状细胞特异性靶向方面有所欠缺；基因疫苗多采用具有高转染率的病毒载体，但大多数病毒载体并不能特异性靶向树突状细胞，且病毒载体本身可能表达大量的具有免疫原性的蛋白，不仅会干扰目的基因的免疫效果，而且可能导致含目的基因的病毒载体被机体迅速清除，另外，生物安全性也是病毒载体的固有缺陷。

树突状细胞表面特异性C型凝集素-细胞间黏附分子3结合非整合素分子(DC-SIGN)是新近发现的限制性表达于树突状细胞和某些组织巨噬细胞上的凝集素受体，可有效地摄取颗粒性抗原和可溶性抗原，再以主要组织相容性复合体(MHC)I类分子和II类分子限制性方式进行抗原递呈，因此，DC-SIGN是较好的树突状细胞特异性靶向受体。进一步研究发现，与DC-SIGN结合的实际是表达于自然配体上的结构简单的寡糖，主要有高甘露糖结构和路易斯寡糖(Lewis)系列包括路易斯寡糖-a(Lea)、路易斯寡糖-x(Lex)和路易斯寡糖-y(Ley)等。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物；目的之二在于提供所述乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物的制备方法；目的之三在于提供所述乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物在医药方面的应用。

为达到上述目的，本方面采用如下技术方案：

1、乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物，主要由乙肝病毒核心抗原与路易斯寡糖-x结合而成。

进一步，由乙肝病毒核心抗原与路易斯寡糖-x通过链霉亲和素与生物素的高亲和力结合而成；

进一步，由乙肝病毒核心抗原和链霉亲和素的偶联物与(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素结合而成。

2、所述乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物的制备方法，包括以下步骤：

a、乙肝病毒核心抗原-链霉亲和素的制备：将链霉亲和素与Traut’s试剂反应制得巯基化修饰的链霉亲和素，再将巯基化修饰的链霉亲和素与乙肝病毒核心抗原进行偶联，即得乙肝病毒核心抗原-链霉亲和素；

b、乙肝病毒核心抗原-链霉亲和素与(路易斯寡糖-x)-生物素的结合：在酶标板中加入(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素溶液，4℃包被过夜，弃去包被液，用PBS洗涤后，再加入牛血清白蛋白溶液，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用PBS洗涤后，再加入步骤a所得乙肝病毒核心抗原-链霉亲和素溶液，37℃反应0.5～2小时，再室温反应10～60分钟，即得乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物。

进一步，所述步骤a是将链霉亲和素与Traut’s试剂在含有PBS和乙二胺四乙酸的水溶液中4℃避光反应2小时，超滤脱盐，再用含有PBS和乙二胺四乙酸的水溶液稀释后继续超滤以稀释Traut’s试剂，即得巯基化修饰的链霉亲和素；向巯基化修饰的链霉亲和素溶液中，加入乙肝病毒核心抗原溶液，4℃反应4小时，即得乙肝病毒核心抗原-链霉亲和素；

进一步，所述步骤b是在酶标板中加入浓度为10μg/ml的(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素溶液，4℃包被过夜，弃去包被液，用PBS洗涤后，再加入质量百分浓度为2％的牛血清白蛋白溶液，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用PBS洗涤后，再加入浓度为10μg/ml的乙肝病毒核心抗原-链霉亲和素溶液，37℃反应1小时，再室温反应30分钟，即得乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物。

3、所述乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物在制备乙肝病毒治疗性疫苗中的应用。

本发明的有益效果在于：乙型肝炎病毒核心抗原是乙型肝炎病毒的一种结构蛋白，是机体CTL识别和攻击乙型肝炎病毒感染细胞的主要靶抗原。路易斯寡糖-x是DC-SIGN的高亲和力配体，对DC-SIGN具有较强的特异性。本发明先制得乙肝病毒核心抗原与链霉亲和素的偶联物，再将其与(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素通过链霉亲和素与生物素的高亲和力进行结合，从而制得乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物。该复合物通过路易斯寡糖-x与DC-SIGN的高亲和力主动靶向树突状细胞，增强免疫***对乙型肝炎病毒的识别能力，并激发有力的特异性细胞免疫，从而解决了慢性乙型肝炎病毒感染患者体内免疫应答低、特异性细胞免疫激活不足的问题。研究结果显示，本发明复合物能够有效激发CTL分泌干扰素-γ；能够有效激发CTL产生细胞毒效应，杀伤乙型肝炎病毒感染肝细胞，使血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性明显升高；还能够有效抑制乙型肝炎病毒的复制，显著降低血清乙型肝炎病毒DNA载量；证实本发明复合物在体内能够激活特异性CTL应答，诱导强有力的抗病毒免疫。因此，本发明复合物可以用于制备乙型肝炎治疗性疫苗，在乙型肝炎免疫治疗领域有着良好的开发应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为琼脂糖凝胶电泳检测乙型肝炎病毒核心抗原基因的PCR产物；

图2为蛋白免疫印迹(Western Blot)检测乙型肝炎病毒核心抗原；

图3为十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测乙型肝炎病毒核心抗原-链霉亲和素；

图4为SDS-PAGE检测乙型肝炎病毒抗原与路易斯寡糖的复合物；

图5为酶联免疫斑点(ELISPOT)法检测本发明复合物激发CTL分泌干扰素-γ的能力；

图6为乙型肝炎病毒转基因小鼠血清丙氨酸氨基转移酶活性检测结果；

图7为乙型肝炎病毒转基因小鼠血清乙型肝炎病毒DNA抑制率检测结果。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、本发明复合物的制备

1、乙型肝炎病毒核心抗原的制备

(1)乙型肝炎病毒核心抗原基因的克隆

根据GenBank登录号为NC_003977.1的乙型肝炎病毒核心抗原基因序列，设计并合成如下引物以PCR扩增两端带有酶切位点的乙型肝炎病毒核心抗原cDNA全长(SEQ ID No.1)：上游引物：5’-cggaattcggcatggacatcgacccttat-3’(SEQID No.3)，下划线部分为EcoR I酶切位点；下游引物：5’-ccgctcgagagttccccacctt-atgagtc-3’(SEQ ID No.4)，下划线部分为Xho I酶切位点。

分离乙型肝炎病毒转基因小鼠的肝脏细胞，用RPMI 1640培养基常规培养，收集细胞，PBS洗涤3次，用总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA；将所得细胞总RNA逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增，PCR条件为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定(结果如图1所示，其中M泳道为DNA分子量标准，1泳道为PCR产物，可见PCR产物在约550bp处呈单一特异性条带，与目的片段大小相符)，凝胶回收试剂盒切胶回收纯化后，与pGEM-T Easy载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，委托上海生工公司测定质粒序列，将pGEM-T Easy序列中正确***了乙型肝炎病毒核心抗原cDNA全长序列的阳性克隆质粒命名为pGEM-HBcAg。

(2)乙型肝炎病毒核心抗原重组原核表达载体的构建

将pGEM-HBcAg和原核表达载体pET32a(+)分别用EcoR I和Xho I进行双酶切，用凝胶回收试剂盒切胶回收纯化双酶切后的乙型肝炎病毒核心抗原cDNA全长和线性载体pET32a(+)，16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，用含有氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆，提取阳性克隆质粒，用EcoR I和Xho I进行双酶切鉴定，并委托上海生工公司测定质粒序列，将pET32a(+)序列中正确***了乙型肝炎病毒核心抗原cDNA全长序列的阳性克隆质粒命名为乙型肝炎病毒核心抗原重组原核表达载体pET32-HBcAg。

(3)乙型肝炎病毒核心抗原工程菌的构建

将pET32-HBcAg用Sal I酶切线性化后，用电穿孔法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，转化产物涂布于MD平板，30℃培养3～4天，挑取白色酵母菌落，分别点接于MD和MM平板，30℃培养3～6天(每天向MM平板中添加甲醇100μL)，挑取MD平板上生长明显快于MM平板的酵母菌落，点接于含有浓度为4mg/mL的G418的YPD平板，30℃培养7天，所得酵母单菌落即为高拷贝乙型肝炎病毒核心抗原工程菌；

(4)乙型肝炎病毒核心抗原的诱导表达

将乙型肝炎病毒核心抗原工程菌于30℃培养至OD600为2，按10％接种量接入BMGY培养基中，30℃培养24小时，5000g离心5分钟，弃上清，菌体用无菌水洗涤2次后，重悬于等体积的BMMY培养基中，30℃诱导表达3天(每24小时补加诱导剂甲醇至最终体积百分浓度为0.5％)，4℃、6000g离心5分钟，收集上清，加入质量百分浓度为80％的硫酸铵使蛋白质沉淀，离心弃上清，蛋白质沉淀用浓度为0.02mol/L、pH为8.0的磷酸盐缓冲液(PBS)透析脱盐，再用琼脂糖凝胶(Q-Sepharose)柱进行分离纯化，用浓度为1mol/L的氯化钠溶液线性梯度洗脱，收集含有乙型肝炎病毒核心抗原的洗脱液，适当浓缩后用葡聚糖凝胶(Sephdex G-25)柱脱盐，即得纯化的乙型肝炎病毒核心抗原(氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)。

Western Blot鉴定：取乙型肝炎病毒核心抗原，加入内参β-actin和上样缓冲液，100℃加热3～5分钟，用质量百分浓度为12％的分离胶、质量百分浓度为5％的积层胶进行SDS-PAGE，电泳完毕后，将分离产物电转移至PVDF膜上，用质量百分浓度为5％的脱脂牛奶封膜，加入鼠抗人乙型肝炎病毒核心抗原单克隆抗体和鼠抗人β-actin单克隆抗体，37℃孵育1小时，洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG，37℃孵育1小时，洗膜，显色；同时设置阴性对照(不加入乙型肝炎病毒核心抗原)；结果见图2，其中1泳道为乙型肝炎病毒核心抗原，2泳道为阴性对照，可见1泳道除内参β-actin条带外，还有一明显蛋白条带，而2泳道未见相应条带。

2、乙型肝炎病毒核心抗原-链霉亲和素的制备

取浓度为5mg/ml的链霉亲和素溶液1ml，加入新鲜配制的浓度为2mg/ml的Traut’s试剂68.8μl、10×PBS 0.2ml、浓度为0.5mol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液8μl和超纯水1ml，混匀，4℃避光反应2小时，超滤离心管10KD超滤脱盐，再用含有1×PBS和浓度为2mmol/L的EDTA的平衡溶液稀释后继续超滤以稀释Traut’s试剂，制得巯基化修饰的链霉亲和素溶液；向上述巯基化修饰的链霉亲和素溶液中，加入浓度为10mg/ml的乙型肝炎病毒核心抗原溶液200μl，混匀，4℃反应4小时，制得乙型肝炎病毒核心抗原-链霉亲和素，用Sepharose 4B柱纯化，冻干保存，取样进行SDS-PAGE鉴定(结果如图2所示，其中M泳道为蛋白质分子量标准，1泳道为乙型肝炎病毒核心抗原-链霉亲和素，可见1泳道在20KD处出现电泳带，与预期结果相符)。

3、乙型肝炎病毒核心抗原-链霉亲和素与(路易斯寡糖-x)-生物素的结合

在酶标板中，每孔加入浓度为10μg/ml的(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素(Lex-PAA-biotin)溶液，4℃包被过夜，弃去包被液，用PBS洗涤后，再加入质量百分浓度为2％的牛血清白蛋白溶液(以PBS为溶剂)，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用PBS洗涤后，加入浓度为10μg/ml的乙型肝炎病毒核心抗原-链霉亲和素溶液，37℃反应1小时，再室温反应30分钟，即得乙型肝炎病毒抗原与路易斯寡糖的复合物，冻干保存，取样进行SDS-PAGE鉴定(结果如图3所示，其中M泳道为蛋白质分子量标准，1泳道为乙型肝炎病毒抗原与路易斯寡糖的复合物，可见1泳道在20KD处出现电泳带，与预期结果相符)。

二、本发明复合物的抗病毒活性研究

效应细胞的制备：将30只6～8周龄雌性乙型肝炎病毒转基因Babl/c小鼠随机分为3组：实验组、对照组和空白组，每组10只；实验组以本发明复合物(用浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS溶解制成浓度为0.5mg/mL的溶液)为免疫原，对照组以卵清蛋白与路易斯寡糖的复合物(以卵清蛋白替代乙型肝炎病毒核心抗原并按照本发明所述方法制得，用浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS溶解制成浓度为0.5mg/mL的溶液)为免疫原，空白组以浓度为0.1mol/L、pH为7.4的PBS为免疫原；各组于小鼠背侧尾根部皮下注射免疫原，每只100μL，之后每间隔1周，以同样方法加强免疫1次，共免疫3次。

1、ELISPOT法检测本发明复合物激发CTL分泌干扰素-γ的能力

末次免疫后1周，断颈处死各组小鼠，在无菌条件下取脾脏，用100目筛网碾磨，收集细胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脾淋巴细胞，用含有质量百分浓度为10％的胎牛血清的RPMI 1640培养基调节细胞密度为1×10⁶个/mL，作为效应细胞；采用ELISPOT检测试剂盒进行检测，按照试剂盒说明书操作：在96孔培养板中，每孔加入体积百分浓度为70％的乙醇100μL，室温放置10分钟，PBS洗涤，再加入干扰素-γ捕获抗体(稀释度为1∶100)100μL，温度4℃孵育过夜，PBS洗涤，再加入质量百分浓度为2％的脱脂奶粉100μL，室温封闭2小时，PBS洗涤，再加入效应细胞100μL，温度37℃孵育48小时，PBST(即含有质量百分浓度为0.1％的吐温20的PBS)洗涤，再加入生物素标记的抗干扰素-γ抗体(稀释度为1∶100)100μL，温度37℃孵育1.5小时，PBST洗涤，再加入链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(稀释度为1∶5000)100μL，温度37℃孵育1小时，PBST洗涤，拍干培养板，再加入即用型BCIP/NBT底物反应液100μL，室温避光显色2～10分钟至斑点形成，用蒸馏水终止反应，干燥后检测斑点数；同时设置阴性对照组(不加入效应细胞)，各组斑点数以3个复孔的均值表示。结果如图5所示，实验组的斑点数明显高于对照组、空白组和阴性对照组，表明本发明复合物具有良好的免疫原性，能够有效激发CTL分泌干扰素-γ。

2、乙型肝炎病毒转基因小鼠血清丙氨酸氨基转移酶活性检测

末次免疫后1周，断颈处死各组小鼠，取眼眶静脉血，用全自动生化仪检测血清丙氨酸氨基转移酶活性，同时设置未免疫小鼠为阴性对照组。结果如图6所示，实验组的血清丙氨酸氨基转移酶活性明显高于对照组、空白组和阴性对照组，表明本发明复合物能够有效激发CTL产生细胞毒效应，杀伤乙型肝炎病毒感染肝细胞，使血清丙氨酸氨基转移酶活性明显升高。

3、乙型肝炎病毒转基因小鼠血清乙型肝炎病毒DNA抑制率检测

末次免疫后1周，断颈处死各组小鼠，取眼眶静脉血，用全自动生化仪进行血清乙型肝炎病毒DNA定量测定，并计算乙型肝炎病毒DNA抑制率，同时设置未免疫小鼠为阴性对照组。结果见图7，实验组的血清乙型肝炎病毒DNA抑制率明显高于对照组、空白组和阴性对照组，表明本发明复合物能够有效抑制乙型肝炎病毒的复制，显著降低血清乙型肝炎病毒DNA载量。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物及其制备方法和应用

<160>4

<210>1

<211>552

<212>DNA

<213>乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CDS

<222>(1)......(552)

<400>1

atggacattg acccgtataa agaatttgga gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct 60

tctgacttct ttccttccat tcgtgatctt ctcgacaccg cctctgctct gtatcgggag 120

gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct caccatacag cactaaggca agctattctc 180

tgttggggtg agttgatgaa tctggccacc tgggtgggaa gtaatttgga agacccagca 240

tccagggaat tagtagtaag ctatgtcaat gttaatatgg gcctaaaaat cagacaacta 300

ttgtggtttc acatttcctg tcttactttt ggaagagaaa ctgttcttga gtatttggtg 360

tcttttggag tgtggattcg cactcctccc gcttacagac caccaaatgc ccctatctta 420

tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact 480

ccctcgcctc gcagacgaag gtctcaatcg ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa 540

tctcaatgt tag 552

<210>2

<211>183

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)

<400>2

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu

5 10 15

Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp

20 25 30

Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys

35 40 45

Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu

50 55 60

Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala

65 70 75 80

Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys

85 90 95

Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg

100 105 110

Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr

115 120 125

Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro

130 135 140

Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr

145 150 155 160

Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser

165 170 175

Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys

180

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物

<400>3

cggaattcgg catggacatc gacccttat 29

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物

<400>4

ccgctcgaga gttccccacc ttatgagtc 29

Claims

1.乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物，其特征在于：将乙肝病毒核心抗原和巯基化修饰的链霉亲和素偶联，形成乙肝病毒核心抗原-链霉亲和素，再将其与(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素通过链霉亲和素与生物素的高亲和力结合而成。

2.权利要求1所述的乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤a是将链霉亲和素与Traut’s试剂在含有PBS和乙二胺四乙酸的水溶液中4℃避光反应2小时，超滤脱盐，再用含有PBS和乙二胺四乙酸的水溶液稀释后继续超滤以稀释Traut’s试剂，即得巯基化修饰的链霉亲和素；向巯基化修饰的链霉亲和素溶液中，加入乙肝病毒核心抗原溶液，4℃反应4小时，即得乙肝病毒核心抗原-链霉亲和素。

4.根据权利要求2所述的乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物的制备方法，其特征在于：所述步骤b是在酶标板中加入浓度为10μg/ml的(路易斯寡糖-x)-聚丙烯酸钠-生物素溶液，4℃包被过夜，弃去包被液，用PBS洗涤后，再加入质量百分浓度为2％的牛血清白蛋白溶液，4℃封闭过夜，弃去封闭液，用PBS洗涤后，再加入浓度为10μg/ml的乙肝病毒核心抗原-链霉亲和素溶液，37℃反应1小时，再室温反应30分钟，即得乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物。

5.权利要求1所述的乙肝病毒抗原与路易斯寡糖的复合物在制备乙肝病毒治疗性疫苗中的应用。