CN101348812A - 一种地衣多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种采用从地衣中提取的多糖及多糖制备的方法。经动物体内药理试验证明多糖WPT-1、WPT-2均具有明显的免疫促进活性、抗肿瘤活性、辐射防护活性、升高白细胞活性及DNA损伤修复活性。
Description
技术领域
本发明涉及中草药提取多糖,更具体地说是从地衣中提取多糖和它的应用,具体包括地衣多糖HWPT-1、HWPT-2的提取方法及WPT-1、WPT-2在免疫调节、抗肿瘤、辐射防护、升高白细胞和DNA损伤修复方面的作用。
背景技术
地衣是一类特殊的生物有机体,是由真菌和藻类联合形成的共生复合体,由于这种特殊的生存状态,使得地衣有很多独特的药用价值,如抗炎、抗溃疡、祛风湿、强心、降压等等。近30年来,地衣中多糖类成分的研究逐渐引起人们的注意。由于多糖类化合物是一种免疫调节剂,作为癌症的辅助治疗药物,具有不良反应小,安全性高等优点,因此,多糖类物质是目前地衣研究领域的一个热点。迄今为止,已经有100多种地衣中的多糖成分被发现和研究。
石花是常见的地衣类植物,生于岩石上,上表面呈灰白色,背面黑色,有清热解毒及外伤止血之功效。本研究所用石花采于四川冕宁县泸宁区,经中国科学院微生物研究所地衣-真菌学家魏江春教授鉴定为梅衣科梅衣属的染色梅衣,学名为Parmelia tinctorium。本发明从地衣石花中提取获得两种均一体多糖。药理试验表明两种均一体多糖均具有明显的免疫调节活性、抗肿瘤活性、辐射防护活性、升高白细胞活性和DNA损伤修复活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种地衣多糖。
本发明的另一目的是提供一种地衣多糖提取分离方法。
本发明的再一目的是提供该多糖的医学用途。
本发明是这样实施的:
取干地衣全草粉碎品,加95%的乙醇,回流提取2-4次,每次提取时间为10-16h,滤去母液,残渣阴干。脱脂后的干品用沸水提取3-5次,每次提取时间为5-8h,将每次提取的提取液过滤,所得的水提液合并,减压浓缩至小体积,对流水透析3-4天,继续将溶液浓缩至小体积,酶法结合三氯乙酸-正丁醇法除蛋白,加入1%-3%的木瓜蛋白酶,50℃-70℃水浴酶解2h-4h,再加入多糖溶液1-2倍体积的三氯乙酸-正丁醇液(v/v=1∶5-1∶10),振摇10-30min,静置1.0-3.0h。取下清液,用1mol/LNaOH溶液中和至中性,加入1%活性炭煮沸5-10min,脱色,再用蒸馏水透析3-4天,袋内溶液浓缩至1/3-1/5体积,加入3-4倍于糖溶液体积的95%乙醇于溶液中,于4℃沉淀过夜。离心收集沉淀,在40℃的低温真空干燥箱中脱水得粗多糖WPT。
取水提粗多糖WPT,加入0.1mol/LNaCl溶解,离心除去不溶物,上清液通过纤维素柱层析分离,先用0.1mol/LNaCl溶液洗脱,自动收集仪收集流分(硫酸-苯酚法检测多糖组分),收集糖反应阳性部分减压浓缩、透析、冷冻干燥得次级多糖组分WPT-1,再用2mol/LNaCl溶液梯度洗脱,收集该组分多糖溶液,经浓缩、透析、冷冻干燥得次级多糖组分WPT-2;获得的两个组分分别经Sephadex G-150、Sephadex G-200柱层析分离,洗脱得到的糖组分经减压、浓缩、干燥得到均一体多糖HWPT-1和HWPT-2。
药理试验:
一.非特异性免疫功能影响试验-小鼠碳粒廓清试验
材料与方法
1.实验材料
1.1动物:纯种ICR小鼠,体重22-24g,雌雄兼用。
1.2药物:WPT-1、WPT-2分别用生理盐水配置,给药剂量为20mg/kg,环磷酰胺给药剂量为50mg/kg。
2.实验方法:
2.1分组与给药:
(1)对照组:1,4,7d给生理盐水,按体重0.1ml/10g,腹腔注射。
(2)地衣多糖(WPT-1、WPT-2):剂量20mg/kg,第1,4,7d按体重0.1ml/10g腹腔注射。
(3)环磷酰胺组:按体重0.1ml/10g给药,腹腔注射2次。
(4)地衣多糖(D)+环磷酰胺(Cy):地衣多糖WPT-1、WPT-2,剂量20mg/kg,第1,4,7d按体重0.1ml/10g腹腔注射;环磷酰胺,剂量50mg/kg,按体重0.1ml/10g,腹腔注射2次。
2.2观察指标:取体重22-24g小鼠,分组给药。末次给药30min后,尾静脉注射印度墨汁0.1ml/10g,注射后不同时间(1min和10min),用20μl吸管分别从眼眶静脉取血20μl,溶于2ml、0.1%Na2CO3溶液中摇匀,于波长680nm下比色,测定光密度(OD),计算吞噬指数K。
K=logOD1-logOD2/t2-t1
实验结果:
地衣多糖WPT-1对RES吞噬功能的影响
注:t值和P值均是与环磷酰胺组相比;***为P<0.001
地衣多糖WPT-2对RES吞噬功能的影响
注:t值和P值均是与环磷酰胺组相比;**为P<0.01
经统计学处理,地衣多糖WPT-1、WPT-2对由化疗药环磷酰胺造成的免疫功能低下的小鼠,对其网状内皮***吞噬功能具有明显的激活、增强作用。
二.抗肿瘤试验
材料与方法
1材料
动物选择:放射所自繁殖IRM-2纯系小鼠,雌雄兼用。
瘤种:放射所动物室从IRM-2纯系小鼠自发淋巴瘤(病理结论)传代培养。
药物配置:WPT-1、WPT-2各设三个剂量组20mg/kg,40mg/kg,60mg/kg,溶剂为蒸馏水。
2方法
接种:选择肿瘤生长旺盛且无溃破,健康情况良好的IRM-2小鼠,脱臼处死,固定于手术板上,用碘酒,新洁而灭消毒动物皮肤,无菌条件下在超净台内剥肿瘤,切开肿瘤成直径2mm左右的小块,在动物左侧腹股沟处皮下接种。
分组给药:接种后次日将动物随机分组(8只一组,雌雄各半),设对照组及高、中、低四个组,每天给药一次,腹腔注射,每次0.5ml,对照组给予蒸馏水0.5ml,连续给药10天。
疗效评价:停药后24h后处死动物,称体重,解剖剥离瘤块,称瘤重。
肿瘤抑制率:C-T/C×100%
式中T为给药组平均瘤重,C为对照组平均瘤重。
实验结果:
地衣多糖WPT-1抑制淋巴瘤实验
注:t值和P值均是与对照组相比;*为P<0.05;**为P<0.01
地衣多糖WPT-2抑制淋巴瘤实验
注:t值和P值均是与对照组相比;*为P<0.05
经统计学处理,地衣多糖WPT-1在高、中、低3个剂量时对小鼠自发恶性淋巴瘤均有一定的抑制作用,高剂量组抑瘤效果最好;WPT-2在高、中2个剂量时对小鼠自发恶性淋巴瘤有一定的抑制作用,中剂量组抑瘤效果较好。
三.抗放射、升高白细胞试验
1.实验材料
1.1动物:纯种C57小鼠,体重22-24g。
1.2实验方法:
1.2.1分组与给药:动物随机分为四组(8只一组,雌雄各半):空白对照组、阳性对照药组(茜草双脂)、药物(WPT-1、WPT-2)20mg/kg、50mg/kg、80mg/kg五个剂量组。照射前第3、2、1日连续3次给药,腹腔注射,0.5ml/只;对照组给予生理盐水,腹腔注射,0.5ml/只。
1.2.2致伤条件:137Csγ射线一次全身照射,照射剂量率为1.9932×102C·kg-1·min-1,小鼠吸收剂量为6.5Gy。
观察指标:(1)白细胞数:照射后第7天将小鼠颈部脱椎处死,眼眶取血,白细胞稀释液稀释,电子显微镜下记数细胞数。
(2)股髓有核细胞数(bone marrow nucleated cells,BMNC):照射后7天将小鼠颈部脱椎处死,取一侧股骨,白细胞稀释液冲洗骨髓,电子显微镜下记细胞数。
(3)脾指数:取出脾脏,称重,计算脾指数。
(4)脾结节(Colong forming unit of spleen,CFU-s):将脾脏放入Bouin氏液内,24h后,肉眼记数突出脾脏表面结节数。
实验结果:
地衣多糖WPT-1对辐射损伤小鼠升高白细胞及造血功能保护实验
注:t值和P值均是与对照组相比;*为P<0.05;**为P<0.01;***为P<0.001
地衣多糖WPT-2对辐射损伤小鼠升高白细胞及造血功能保护实验
注:t值和P值均是与对照组相比;*为P<0.05;**为P<0.01;***为P<0.001
经统计学处理,地衣多糖WPT-1、WPT-2在高、中2个剂量时WBC、BMNC、CFU-S、脾指数各项指标,与对照组相比差异显著。
四.单细胞凝胶电泳实验(SCGE)检测辐射损伤小鼠DNA修复试验:
1.实验材料
1.1动物:纯种C57小鼠,体重22-24g。
1.2实验方法:
1.2.1分组与给药:动物随机分为五组(8只一组,雌雄各半):空白对照组、阳性对照药组(茜草双脂)、药物(WPT-1、WPT-2)20mg/kg、50mg/kg、80mg/kg五个剂量组。照射前第3、2、1日连续3次给药,腹腔注射,0.5ml/只;对照组给予生理盐水,腹腔注射,0.5ml/只。
1.2.2致伤条件:137Csγ射线一次全身照射,照射剂量率为1.9932×102C·kg-1·min-1,小鼠吸收剂量为6.5Gy。
观察指标:(1)采小鼠外周血约0.2ml,肝素抗凝。所取外周血与小鼠对应编号后,做单细胞凝胶电泳(SCGE)实验检测小鼠淋巴细胞照射后的DNA双链断裂,CASP软件分析彗星图像,观察彗星尾部DNA%(TDNA%)、尾长(TL)、尾矩(TM)和Olive尾矩(OTM)等指标。
1.2.3淋巴细胞分离
预先在0.5ml离心管中加入4℃预冷的0.2ml淋巴细胞分离液,所取外周血沿离心管内壁轻轻加在淋巴细胞分离液面上,3500rpm离心2min,离心后吸取中间层淋巴细胞,置于2ml离心管中,加PBS至2ml,1500r/min离心6min,弃上清。如此重复洗涤2次,再将淋巴细胞悬于PBS,调整细胞密度为2×104/ml,置4℃冰箱备用。
1.2.4碱性单细胞凝胶电泳实验
(1)铺胶:取100μl正常熔点琼脂糖凝胶均匀铺于自制微电泳槽内,置4℃冰箱固化,25μl淋巴细胞悬液与75μl低熔点琼脂糖凝胶混匀后均匀铺于第1层凝胶上面,置于4℃冰箱固化;(2)裂解和电泳:胶板置于新鲜配制的碱性裂解液,4℃冰箱中裂解1.5h;用双蒸水漂洗去掉多余的盐分,于4℃电泳液中静置20min,然后在20V,200mA电泳条件下电泳20min;③染色和观察:溴化乙锭(EB)染色,双蒸水漂洗,荧光显微镜下观察彗星,用Nikon相机随机摄取彗星图像,每只动物拍摄40个彗星图像。
1.2.5彗星图像分析
彗星图像采用波兰弗罗茨瓦夫(University of Wroclaw)大学提供的CASP***自动分析,分析结果用SPSS13.0统计软件直接读取。选取尾部DNA百分含量(TDNA%)、尾长(TL)、尾矩(TM)和Olive尾矩(OTM)作为分析指标。
实验结果:
地衣多糖WPT-1对辐射损伤小鼠淋巴细胞DNA修复实验
注:t值和P值均是与对照组相比;***为P<0.001
地衣多糖WPT-2对辐射损伤小鼠淋巴细胞DNA修复实验
注:t值和P值均是与对照组相比:***为P<0.001
经统计学处理,阳性对照组、地衣多糖WPT-1、WPT-2高、中、低剂量组受照小鼠淋巴细胞DNA双链断裂的彗星各项指标TDNA%、TL、TM和OTM逐渐减小,给药组DNA损伤修复增加,残余损伤逐渐减少,呈显著的剂量效应关系,80mg/kg剂量组对DNA损伤的修复作用最好。
具体实施方式
实施例:
干地衣全草粉碎品,加95%的乙醇,回流提取2次,每次提取时间为12h,滤去母液,残渣阴干。脱脂后的干品(2公斤)用沸水提取,每次加水20升,提取时间为6h,以苯酚硫酸法检测提取液糖含量,直至糖反应不明显,共计提取3次。将每次提取过滤所得的水提母液合并,减压浓缩至小体积,使用半透膜对流水透析3天,继续将溶液浓缩至小体积,加入1%的木瓜蛋白酶,50℃水浴酶解3h,再加入与多糖溶液同体积的三氯乙酸-正丁醇液(v/v=1∶10),振摇10min,静置1.0h。取下清液,用1mol/LNaOH溶液中和至中性,加入1%活性炭煮沸5min,脱色,再用蒸馏水透析3天,袋内溶液浓缩至适当体积(1/3-1/5),加入95%的乙醇3倍于糖溶液的体积于4℃沉淀过夜。离心收集沉淀,经无水乙醇,丙酮,无水***依次洗涤三次后在40℃的低温真空干燥箱中脱水得到50g棕灰色的固体(WPT,产率2.5%)。
取4g水提粗多糖WPT,加入适量0.1mol/L NaCl溶解,离心除去不溶物,上清液通过DEAE-纤维素柱层析分离,先用0.1mol/L NaCl溶液洗脱,自动收集仪收集流分,硫酸-苯酚法检测,收集糖组分。减压浓缩、透析、冷冻干燥得次级多糖组分WPT-1,再用2mol/LNaCl溶液梯度洗脱,收集该组分多糖溶液,经浓缩、透析、冷冻干燥得次级多糖组分WPT-2。获得的组分分别经Sephadex G-150柱层析得到洗脱主要糖组分,组分WPT-1经减压、浓缩、干燥得到多糖HWPT-1(250mg),组分WPT-2经减压、浓缩、干燥得到多糖HWPT-2(150mg)。
药理试验:
取上述WPT-1、WPT-2分别按照试验中提及的药理试验方法进行小鼠碳粒廓清试验、抗肿瘤试验、抗放射、升高白细胞试验及单细胞凝胶电泳实验。结果表明,地衣多糖WPT-1、WPT-2具有良好的免疫调节活性、抗肿瘤活性、辐射防护活性、升高白细胞活性和DNA损伤修复活性。
Claims (6)
1.一种地衣多糖的制备方法,其特征是包括以下步骤:
A.干地衣全草粉碎物95%的药用乙醇回流提取2-4次后,滤去母液,残渣阴干;
B.上述脱脂后的干品沸水提取3-5次,提取液过滤,合并提取液减压浓缩至小体积,用对流水透析3-4天,继续将溶液浓缩到小体积,酶法结合三氯乙酸-正丁醇法除蛋白,静置分层取下清液,用1mol/L NaOH溶液中和至中性,加入1%活性炭煮沸脱色,再用蒸馏水透析3-4天,袋内溶液浓缩至1/3-1/5体积,加入3-4倍于糖溶液体积的95%乙醇,在冰箱中(4℃)放置过夜,离心收集沉淀,在40℃的低温真空干燥箱中脱水的粗多糖WPT;
C.加入0.1mol/L NaCl溶解粗多糖,离心除去不溶物,上清液通过纤维素柱层析分离,先用0.1mol/L NaCl溶液洗脱,自动收集仪收集流分(硫酸-苯酚法检测多糖组分),收集糖反应阳性部分减压浓缩、透析、冷冻干燥得次级多糖组分WPT-1,再用2mol/LNaCl溶液梯度洗脱,收集该组分多糖溶液,经浓缩、透析、冷冻干燥得次级多糖组分WPT-2;获得的组分分别经Sephadex G-150、Sephadex G-200柱层析得到洗脱主要糖组分,组分WPT-1经减压、浓缩、干燥得到多糖HWPT-1,组分WPT-2经减压、浓缩、干燥得到多糖HWPT-2。
2.权利要求1所述的地衣多糖提取物,其特征是步骤B中除蛋白工艺为加入1%-3%的木瓜蛋白酶,50℃-70℃水浴酶解2h-4h,再加入多糖溶液1-2倍体积的三氯乙酸-正丁醇液(v/v=1∶5-1∶10),振摇10-30min,静置1.0-3.0h。
3.权利要求1所述的地衣多糖的用途,其特征在于作为免疫调节药物的应用。
4.权利要求1所述的地衣多糖的用途,其特征在于作为抗肿瘤药物的应用。
5.权利要求1所述的地衣多糖的用途,其特征在于作为辐射防护药物及升白药物的应用。
6.权利要求1所述的地衣多糖的用途,其特征在于作为DNA损伤防护剂的应用。
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