CN104644661A - 20(R)-人参皂苷Rg3在制备缓解或/和***的药物中的应用及药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种20(R)-人参皂苷Rg3在制备缓解或/和***药物中的新应用。试验证明,20(R)-人参皂苷Rg3***的疗效显著,见效快、毒副作用小、是一种安全、高效、稳定、制备工艺简单的***药物,适于工业化生产,易于推广。本发明为预防和***及其并发症提供了一种新的药物来源。
Description
技术领域
本发明属于医药领域,涉及一种***的药物或保健食品,特别涉及一种中药人参提取成分在缓解或/和***药物或保健食品中的应用。
背景技术
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hPeatistiBvims,HBV)引起的一种严重危害人类健康的疾病,乙型肝炎病毒(HBV)在全世界引起的发病率和死亡率是肝脏病毒中最为严重的一种。据世界卫生组织统计,全世界超过20亿人被HBV感染,其中3.6亿人为慢性HBV携带者,每年至少有100~200万慢性HBV感染患者死于HBV相关疾病(肝硬化、肝癌),世界卫生组织已把乙型肝炎列为世界第九大死因。目前,乙型肝炎感染在世界范围内仍是一个重要的健康问题,特别是在亚洲、非洲、中东、太平洋岛屿等发展中国家,人群病毒携带率在10%一20%之间。就我国而言,我国是一个乙肝(大国),乙肝病毒携带者约1.2亿,占全世界的1/3,其中因感染乙肝病毒而需要治疗的接近2800万人,且三分之一的人将逐渐会演变成慢性肝炎、肝硬化或肝癌。已确认的6种肝炎病毒中,乙型和丙型肝炎危害性最大,易转化为慢性肝炎,也是肝硬化和原发性肝癌的直接原因。
1998年全世界有200万人死于这两种肝炎病毒引起的肝癌,中国也有30万人死亡!一旦感染上肝炎,就必须长期不间断服药,我国每年治疗各种病毒性肝炎所需要的医疗费用约300~500亿人民币。高额的医药费用给国民经济和社会发展带来了巨大压力,如何预防和治疗肝炎成为当今重要的医学课题。目前***的药物主要有4种类型,即抗病毒药、调节免疫、保肝以及中草药。其中用于预防性的有血清疫苗和DNA重组疫苗两种,虽然疫苗控制HBV感染发挥很大作用,但现存大量患者需要有效的治疗,以控制传染源,降低HBV相关疾病的死亡率,改善患者生活质量;同时临床观察发现,乙型肝炎病人如仅有肝功能(如ATL)的好转或恢复正常而HBV并未消除,则极易复发且不能阻止肝脏病变的发展,因此,抗病毒治疗是慢性乙型肝炎治疗的核心问题。近年来核普类抗HBV药物的研发在国际上非常活跃,出现了一系列有开发前景的化合物,甚至有“乙肝治疗已进入核昔时代”的说法,但是目前***的药物可选择性非常少,到2004年为止,国际公认的抗HBV药物仅有a–干扰素(INF–a)、拉米夫定(lmuarldine,3TC)及阿德福韦二毗吠醋(AdeofvirdPi ivoxl i)。而其中的a–干扰素不但价格昂贵和耐受性差,而且有效率低(仅有25%~40%的患者起到缓解作用);拉米夫定(lmaiuvdine,3TC)作为第一个获批准上市的口服抗HBV药物,其问世推动了慢性乙型肝炎治疗的进程,标志着慢性乙型肝炎治疗进入核昔类似物治疗时代。拉米夫定在抑制乙肝病毒(HBV)复制,降低病毒载量,使血清丙氨酸转氨酶(ALT)降至正常,在抗原转阴及肝组织炎症坏死的改善等方面取得了确切的疗效,但长期应用拉米夫定可使HBV发生变异,降低病毒对拉米夫定的敏感程度从而出现耐药性,以及停药后易出现病毒复制的反跳;阿德福韦酯于2002年9月被美国食品药品管理局(FDA)批准治疗慢性HBV感染,是第二个被FDA批准上市的抗HBV核苷类似物药物,但是它存在肾毒性且停药后可导致严重的病情反跳。我国临床使用的肝炎治疗药,植物药及中成药占70%以上,化学合成药均为生产多年的老品种。病毒性肝炎的抗病毒治疗,目前还存在疗效不够满意!复发率高、耐药性强、有的药物毒性较大和药价昂贵等问题。因此,研究更有效的治疗药物,来治疗慢性乙型肝炎就成为广大医药工作者具有挑战性的工作。
人参中药中名贵药材,现代医学研究表明人参的主要功效和作用有:对于神经中枢***的作用,抗癌抗肿瘤作用,免疫功能调节作用,抗糖尿病的作用,增强肝功能作用,心脑血管障碍改善,抗动脉硬化作用,血压调节作用,以及更年期障碍和抗骨质疏松作用,抗疲劳,抗氧化,抑制衰老等。人参皂苷作为人参的主要有效成分,被广泛研究和使用,其中以20(R)-人参皂苷Rg3最为引人瞩目,其作为人参的主要有效成分,安全性良好,已经被制成抗肿瘤口服制剂应用于临床,作为注射剂被深入研究。
本发明人采用先进的分离纯化技术从人参药材中提取其***的有效成分20(R)-人参皂苷Rg3,可以为乙肝患者提供一种高效低毒的药物。
发明内容
本发明的首要目的是针对上述治疗乙型肝炎疾病的现有技术中存在的技术问题,提供20(R)-人参皂苷Rg3缓解或/和***疾病的性能和功效,并提供20(R)-人参皂苷Rg3新的药用用途,即在治疗、调理和缓解乙肝的药物或保健食品中的新应用。
为实现上述目的,本发明一方面提供一种20(R)-人参皂苷Rg3在制备缓解或/和***的药物或保健品中的应用。
在筛选具有***作用的天然活性成分的过程中,发明人发现人参的化学成分中20(R)-人参皂苷Rg3具有强烈的抑制乙肝的作用。
其中,所述药物由20(R)-人参皂苷Rg3和药学上可接受的载体组成。
其中,所述的20(R)-人参皂苷Rg3含量为1%~98%;优选为30~80%,进一步优选为60%。
特别是,所述的20(R)-人参皂苷Rg3含量≥1%,优选为≥30%,进一步优选为≥60%,更进一步优选为≥80%,再更进一步优选为≥98%。
特别是,药学上可接受的载体通常被保健专家认可用于这一目的且作为药剂的非活性成分。有关药学上可接受的载体的汇编可以在《药物赋形剂手册》(Handbook of Pharmaceutical excipients,第2版,由A.Wade和P.J.Weller编辑;American Pharmaceutical Association出版,Washington and The PharmaceuticalPress,London,1994)等工具书中找到。
尤其是,所述的载体包括赋形剂,如淀粉、水等;润滑剂,如硬脂酸镁等;崩解剂,如微晶纤维素等;填充剂,如乳糖等;粘结剂,如预胶化淀粉、糊精等;甜味剂;抗氧化剂;防腐剂、矫味剂、香料等;
其中,所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、霜剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂形式存在。
特别是,所述的20(R)-人参皂苷Rg3含量≥1%,优选为≥30%,进一步优选为≥60%,更进一步优选为≥80%,再更进一步优选为≥98%。
本发明另一方面提供一种含有20(R)-人参皂苷Rg3的缓解或/和***疾病的药物或保健品。
其中,所述的20(R)-人参皂苷Rg3含量≥1%,优选为1%~98%;优选为30~80%,更进一步优选为60%。
特别是,所述的20(R)-人参皂苷Rg3含量≥1%,优选为≥30%,进一步优选为≥60%,更进一步优选为≥80%,再更进一步优选为≥98%。
特别是,所述20(R)-人参皂苷Rg3的重量与所述药物或保健品的总重量之比为0.01~10:100,优选为0.1~10:100,进一步优选为1~10:100。
特别是,所述药物或保健品中还包括丹参提取物、猪苓提取物、黄芩提取物、甘草提取物、黄芪提取物、党参提取物、白术提取物、太子参提取物、首乌提取物、银杏提取物、黑芝麻提取物、生姜提取物、葡萄子提取物、石榴子提取物、植物精油、熊果苷、维生素C及其衍生物或维生素E及其衍生物。
所述药物可以采用本领域公知的方法制成各种剂型,如片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、霜剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂等。
本发明还提供了一种***疾病的方法,包括向受试者给予治疗有效量的20(R)-人参皂苷Rg3的药物组合物,其治疗有效量为0.06~12mg/kg.d,优选为1~6mg/kg.d,进一步优选为1.5~3mg/kg.d。
除非另外说明,本文所用的术语“治疗有效量”为需要产生有效作用的药物的用量;“治疗有效量”是可以调整和变化的,最终由医务人员确定,其所考虑的因素包括给药途径和制剂的性质、接受者的体重、年龄等一般情况以及所治疗疾病的性质和严重程度。
与现有技术相比,本发明具有如下的明显优点:
1、本发明对已知化合物20(R)-人参皂苷Rg3发掘了新的药用价值,将其用于缓解、***,并可制备成用于缓解或/和***的药物或保健食品,从而为人参药材的应用开拓了一个新的领域。
2、本发明的系列试验研究证明20(R)-人参皂苷Rg3具有显著的缓解、***的功效。
3、本发明的20(R)-人参皂苷Rg3抑制乙型肝炎的药理作用强,用于缓解、调理和***的功效显著,见效快、毒副作用小、安全性好,能够长期服用,具有良好的药用前景。
4、本发明的产品原料来源丰富、价廉、临床使用安全,制备工艺简单,可制成各种剂型,且服量小,使用方便,因此易于推广。
5、本发明既可采用单一成分的20(R)-人参皂苷Rg3活性成分制备成用于缓解和***的药物,又可采用20(R)-人参皂苷Rg3与其它活性成分(例如与丹参提取物、猪苓提取物、黄芩提取物、甘草提取物、黄芪提取物、党参提取物、白术提取物、太子参提取物、首乌提取物、银杏提取物、黑芝麻提取物、生姜提取物、葡萄子提取物、石榴子提取物、植物精油、熊果苷、维生素C及其衍生物或维生素E及其衍生物的一种或多种)共同组方,制备***的复方药物。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步描述本发明所述配方的有益效果,这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的配方思路、用途范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 Rg3片剂
按照如下配比制备Rg3片剂:
将人参皂苷Rg3和淀粉混合均匀后,制成颗粒,加入滑石粉和硬脂酸镁混合均匀后压制成10000片。
实施例2 Rg3颗粒剂
按照如下配比制备Rg3颗粒剂:
人参皂苷Rg3(含量63%) 200g
微晶纤维素 1000g
将人参皂苷Rg3和微晶纤维素混合均匀后,制成颗粒装袋,制成10000袋。
实施例3 Rg3胶囊剂
按照如下配比制备Rg3胶囊剂:
人参皂苷Rg3(含量98%) 10g
淀粉 1000g
将人参皂苷Rg3和淀粉混合均匀后装胶囊,制成10000粒。
实施例4 Rg3片剂
按照如下配比制备Rg3片剂:
将人参皂苷Rg3、丹参提取物、白术提取物、太子参提取物和淀粉混合均匀后制粒,加入滑石粉和硬脂酸镁混匀后压制成10000片。
实施例5 Rg3胶囊剂
按照如下配比制备Rg3胶囊剂:
将人参皂苷Rg3、猪苓提取物、甘草提取物和淀粉混合均匀后装胶囊,制成10000粒。
实施例6 Rg3颗粒剂
按照如下配比制备Rg3颗粒剂:
将人参皂苷Rg3、黄芩提取物、黄芪提取物和蔗糖粉混合均匀制成颗粒后装袋,制成10000袋。
试验例1 20(R)-人参皂苷Rg3抗乙肝病毒的实验研究
1实验材料
1.1药物与试剂
20(R)-人参皂苷Rg3(含量>98%),大连富生天然药物开发有限公司生产,批号:2012303;以中国药品生物制品检定所提供的人参皂苷Rg3标准品对照并进行HPLC标定,含量为98.2%;
阳性对照药:拉米夫定葛兰素威康(苏州)制药有限公司产品(批号:20110125);
1.2细胞
乙型肝炎病毒(HBV)转染人肝癌细胞(HepG2)的2.2.15细胞系,美国MountSinai医学中心构建,复旦大学上海医学院分子病毒实验室引进后自行传代培养。
1.3仪器
2实验方法
2.1人参皂苷Rg3对HepG22.2.15细胞的毒性试验
采用MTT法检测人参皂苷Rg3对HepG22.2.15细胞生长的抑制作用。
试验分为实验药物组(即人参皂苷Rg3组、阳性药物拉米夫定对照组和空白对照组(即不加药物的细胞对照组)。将人参皂苷Rg3和拉米夫定用培养液配制成10mg/ml溶液,倍比稀释为10mg/ml,1mg/ml,1×10-1mg/ml,1×10-2mg/ml,1×10-3mg/ml,5个浓度备用。
取HepG22.2.15细胞一瓶,用胰酶消化后制备成单细胞悬液,加入细胞计数板计数,调整细胞浓度至2×104cells/ml,接种于96孔培养板,每孔接种100μL,置于37℃,5%CO2细胞培养箱培养过夜待贴壁。次日吸去上清,分别加入100μL不同浓度人参皂苷Rg3、拉米夫定的溶液,每浓度3个复孔;细胞对照组3个复孔;同时设一空白孔;置于37℃,5%CO2细胞培养箱培养72小时之后,于各孔中加入10μL MTT(噻唑蓝)(5mg/ml),继续培养4h,然后仔细吸去上清(不要碰到底部的细胞),每孔再各加入150μL的二甲基亚矾(DMSO),轻轻振荡使甲臜颗粒(formazan)溶解,最后用自动酶标仪比色,以空白孔调零,测570nm处的OD值。
根据测定结果计算人参皂苷Rg3对HepG22.2.15细胞的抑制百分率,Reed–Meuench法计算半数有毒浓度TC50(公式3–1)和最大无毒浓度TC0。TC50即细胞存活率为50%时的药物浓度;一般药物作用下若细胞存活率>95%,则认为此药物浓度为TC0,对培养细胞无毒性,为药物作用的安全浓度。其中细胞抑制率(%)的计算工式如(3–1)、TC50计算工式如(3–2)所示。
细胞抑制率(%)=(对照组OD值一试验组OD值)/对照组OD值×l00.0 (3–1)
TC50=A ntilog(B+(50-<50%抑制百分率)/(>50%抑制百分率-<50%抑制百分率)×C) (3–2)
其中,式(3–2中:B为log<50%药物浓度;A为log>50%药物浓度;C为A-B。
2.2人参皂苷Rg3对HepG22.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制实验
实验分为实验药物组(即人参皂苷Rg3组、阳性药物拉米夫定对照组)和细胞对照组。HepG22.2.细胞用胰酶消化后制备成单细胞悬液,加入细胞计数板计数,调节细胞浓度至2×104cells/ml,加入24孔细胞培养板中,每孔接种1ml,置于细胞培养箱37℃,5%CO2培养过夜。次日取出24孔细胞培养板,吸出上清后依次加入用培养液梯度稀释的人参皂苷Rg3和拉米夫定继续培养,最大无毒浓度以下梯度稀释,浓度依次为:1mg/ml,1×10-1mg/ml,1×10-2mg/ml,1×10-3mg/ml,1×10-4mg/ml。每浓度3个复孔;细胞对照组3个复孔。于第3天、第6天分别更换新鲜的含不同浓度人参皂苷Rg3和拉米夫定的培养液。第9天收集各孔上清液至1.5ml的离心管中,-20℃冻存备用。2.3ELISA法测HbsAg、HBeAg
2.3.1.ELISA法测HbsAg、HBeAg的具体步骤
l)将试剂盒各组分从盒中取出,平衡至室温(18一25℃);2)浓缩洗涤液配制前充分摇匀(如有晶体应充分融解),浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水按1:19稀释后使用;3)将微孔板条固定于支架,按序编号;4)每孔分别用移液器加入待测样品50μL,设阴、阳性对照各2孔,每孔加阴、阳对照各50μL,并设空白对照一孔;5)每孔加入酶标记抗体50μL(空白对照除外),轻拍混匀;6)置37℃温育60min,室温平衡5min。;7)手工洗板,弃去孔内液体,贮满洗涤液,静置5一10秒后甩干,重复洗涤5次;8)每孔加底物A、B各50μL,轻拍混匀,37℃暗置15min;9)每孔加终止液各50μL,轻拍混匀;10)用全自动酶标分析仪,以空白孔调零,单波长450nm处测定OD值。
2.3.2.数据分析
根据测定数据计算药物抑制抗原百分率(如式3–3所示);药物抑制抗原半数有效浓度IC,(如式3–4所示),即HBSAg和HBeAg抑制率为50%时的药物浓度;选择指数SI(如式3–5所示),SI大于1以上者为有效,在1~2之间说明药物有效,但有一定毒性;大于2者效果较好,毒性较小;指数越大,则疗效越好,安全范围越大。统计学处理,采用t检验作组间均数比较,数据统计分析由sPSS11.5软件处理,P<0.05表示差异有显著性。
抑制抗原百分率(%)=(细胞对照组OD值-实验药物组OD值)/细胞对照组OD值×100 (3–3)IC50=A ntilog(B+(50-<50%抑制百分率)/(>50%抑制百分率-<50%抑制百分率)×C) (3–4)
其中,式3–4中:B为log<50%药物浓度;A为log>50%药物浓度;C为A-B
SI=半数毒性浓度/半数有效浓度 (3-5)
3结果
3.1人参皂苷Rg3对HepG22.2.15细胞的毒性
不同浓度人参皂苷Rg3、拉米夫定处理组培养72h后,MTT试验结果显示人参皂苷Rg3对HepG22.2.15细胞生长有抑制作用,且其作用具有一定的浓度依赖性,浓度越大,抑制作用越明显。人参皂苷Rg3处理组在浓度为l mg/ml时的细胞抑制率为3.84%,此浓度下的细胞存活率为96.16%(>95%),由此可知人参皂苷的TC0为lmg/ml。阳性对照药拉米夫定处理组在浓度为lmg/ml时的细胞抑制率为4.68%,此浓度下的细胞存活率为95.32%(>95%),拉米夫定的TC0为lmg/ml。在实验设计的浓度范围内,没有出现≥50%的细胞抑制率,因此无法按Reed-Meuench法精确计算人参皂苷Rg3和拉米夫定的TC50,根据结果显示只能大致估算为>l0mg/ml。人参皂苷Rg3、拉米夫定的细胞毒性测定结果见表1。
表1 人参皂苷Rg3在HepG22.2.15细胞培养中的毒性
3.2人参皂苷Rg3对HBsAg、HBeAg的抑制作用
不同浓度人参皂苷Rg3、拉米夫定处理组培养9d收集细胞上清液,ELISA法测HbsAg、HBeAg水平,结果显示人参皂苷Rg3对HBSAg、HBeAg均有抑制作用,且随着人参皂苷Rg3浓度的增加,其抑制作用增强,抑制率增加,显示出一定的量效关系。不同浓度人参皂苷Rg3、拉米夫定在HepG22.2.15细胞培养中对HbsAg、HBeAg的抑制作用结果见表2、3、4所示。
统计学分析显示,试验药物人参皂苷Rg3除最低浓度0.0001mg/ml外,其它浓度组与细胞对照组相比均有显著性差异(P<0.05);同浓度的人参皂苷Rg3组与拉米夫定组相比,仅有最低浓度0.0001mg/ml对HBsAg的抑制作用显示显著性差异(P<0.05),而其它浓度对HBSAg的抑制作用无显著性差异(P>0.05);两者对HBeAg的抑制作用亦无显著性差异(P>0.05)。人参皂苷Rg3对HbsAg、HBeAg的IC50,分别为0.498mg/ml和0.402mg/ml,sI分别为>19.73和>23.79;拉米夫定对HbsAg、HBeAg的IC50,分别为0.061mg/ml和0.237mg/ml,sI分别为>160.45和>44.37。结果表明人参皂苷Rg3可以有效抑制HBSAg、HBeAg的分泌,且人参皂苷Rg3对HBeAg的抑制效果优于HbsAg。
表2 人参皂苷Rg3在HepG22.2.15细胞培养中对HBsAg的抑制作用
*用药组与对照组比较P<0.05,**同浓度人参皂苷Rg3与拉米夫定比较P<0.05
表3 人参皂苷Rg3在HepG22.2.15细胞培养中对HBeAg的抑制作用
*用药组与对照组比较P<0.05
表4 人参皂苷Rg3在HepG22.2.15细胞培养中对HBsAg、HBeAg的Ic50和sI测定值
人参皂苷Rg3在HepG22.2.15细胞培养中对HBsAg、HBeAg的抑制作用,结果显示人参皂苷Rg3在无毒浓度下设定的5个浓度中,除最低浓度(0.0001mg/ml)外,其它各浓度组与细胞对照组相比均显示明显的抑制作用,且随着浓度的增加,其抑制作用增强,抑制率增加,显示出一定的量效关系。
Claims (10)
1.20(R)-人参皂苷Rg3在制备用于缓解或/和***的药物或保健品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征是所述药物由20(R)-人参皂苷Rg3和药学上可接受的载体组成。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征是所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、霜剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂形式存在。
4.根据权利要求1或2所述的应用,其特征是所述的20(R)-人参皂苷Rg3的含量≥1%。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征是所述所述的20(R)-人参皂苷Rg3的含量为1%~98%。
6.一种缓解或/和***疾病的药物或保健品,其特征是含有20(R)-人参皂苷Rg3。
7.根据权利要求6所述的药物或保健品,其特征是所述20(R)-人参皂苷Rg3的重量与所述药物或保健品的总重量之比为0.01~10:100。
8.根据权利要求6所述的药物或保健品,其特征是所述的20(R)-人参皂苷Rg3的含量为≥1%。
9.根据权利要求8所述的药物或保健品,其特征是所述的20(R)-人参皂苷Rg3的含量为1%~98%。
10.根据权利要求6所述的药物或保健品,其特征是还包括丹参提取物、猪苓提取物、黄芩提取物、甘草提取物、黄芪提取物、党参提取物、白术提取物、太子参提取物、首乌提取物、银杏提取物、黑芝麻提取物、生姜提取物、葡萄子提取物、石榴子提取物、植物精油、熊果苷、维生素C及其衍生物或维生素E及其衍生物的一种或多种。
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