CN104630215A - 与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁系列分子标记及获取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程领域，提供与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁系列分子标记及获取方法。所述分子标记具有序列表中的SEQ ID NO:1～8的至少一个的核苷酸碱基序列。所述获取方法包括：供试材料选取、甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位、与目标性状连锁的SNP/Indel位点的获取、与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取等步骤，获得与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记。本发明利用上述分子标记进行抗白粉病品种早期筛选鉴定，可以大大缩短育种周期，提高育种效率，具有重要的理论及实践意义。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列分子标记及其获取方法。
背景技术
甜瓜(Cucumis melo L.)是葫芦科甜瓜属一种重要水果型蔬菜作物，国内外栽培普遍；甜瓜是我国高端农业的优势作物，对农民增收与农业结构调整有着重要意义。白粉病是一种严重危害甜瓜生产的世界性病害，从苗期至收获期均可发生。白粉病主要危害甜瓜的叶片，也侵染叶柄和茎蔓，可导致植株光合能力下降，引起早衰甚至死亡，严重影响甜瓜的产量和品质。近年来，随着生产的规模化和商品化程度的提高，白粉病迅速蔓延，已成为国内外甜瓜等瓜类作物绿色生产的主要障碍。
引起甜瓜白粉病的病原菌主要有单囊壳白粉菌(Podosphaera xanthii)和二孢白粉菌(Golovinomyces cichoracearum)，其中以单囊壳白粉菌(P.xanthii)占主导。甜瓜白粉病菌生理小种多，分化快，仅P.xanthii常见生理小种就多达7个，包括0、1、2US、2F、3、4、5，其中P.xanthii 2F是国内大部分地区的优势生理小种(程鸿，我国甜瓜白粉病研究进展及生理小种的初步鉴定，长江蔬菜，2011(18):1-5)，因此开展针对甜瓜白粉病P.xanthii 2F生理小种的抗病基因研究将是解决甜瓜白粉病的首要突破口。中国专利申请“与甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F紧密连锁的特异性片段及其获得方法”(申请号：200710178022.7)中，公开了一种与甜瓜白粉病抗性基因PM-2F紧密连锁的特异片段，其具有序列表中SEQID NO:1～4所述的DNA序列；获得的SSR特异片段具有重复性好,标记稳定可靠,便于统计等优点。2008年，张海英等以高抗白粉病菌P.xanthii 2F的日本网纹甜瓜自交系K7-1与感病哈密瓜自交系K7-2为亲本构建了包含106个株系的RILs群体，遗传分析发现K7-1对P.xanthii 2F的抗性由单显性基因Pm-2F控制，筛选得到了与Pm-2F连锁的分子标记CMBR8(对应于专利申请200710178022.7中的SSR509)和CMBR120(对应于专利申请200710178022.7中的SSR510)，连锁距离分别为1cm和3cm(张海英，甜瓜白粉病抗性基因Pm-2F的遗传特性及其紧密连锁的特异片段，园艺学报，2008，35(12)1773-1780)。但由于标记连锁分析所用群体较小、标记与目标基因的遗传距离相对较远等问题，使得这两个标记应用于甜瓜抗白粉病辅助育种还有一定的局限性。
因此，在目前的科研和实践中，开发与Pm-2F更紧密连锁的分子标记，将有助于应用分子标记辅助选育抗白粉病生理小种P.xanthii 2F的甜瓜品种，同时也为克隆Pm-2F基因奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列标记及其获得方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列分子标记，具有序列表中的SEQ ID NO:1～8的至少一个的核苷酸碱基序列。
本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：
与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列分子标记的获取方法，包括如下步骤：
供试材料选取步骤：选取供试材料；
甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位步骤：
对所述供试材料进行苗期抗病接种鉴定，得到抗、感池材料；再利用集团混合分析法，提取所述抗感池材料的基因组DNA，构建抗感DNA池；
再通过PCR扩增反应，对黄瓜高密度遗传图谱中的SSR标记进行筛选，获取与目标性状连锁的SSR标记；
再对所述与目标性状连锁的SSR标记进行遗传连锁分析，初步定位目标基因Pm-2F；
与目标性状连锁的SNP/Indel位点的获取步骤：
在所述Pm-2F基因初步定位区间设计引物，在甜瓜抗感亲本与所述抗感DNA池中进行PCR扩增反应，测序后再经序列比对获取所述与目标性状连锁的SNP/Indel位点；
与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤：
针对所述与目标性状连锁的SNP/Indel位点分别设计CAPS/Indel标记，在验证材料中验证所述候选SNP/Indel位点，获得与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记。
进一步地，所述甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位步骤中，所述与目标性状连锁的SSR标记，具有序列表中SEQ ID NO：9～14的至少一个的核苷酸碱基序列，其中：
序列表中SEQ ID NO:9为引物SSR02733对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:10为引物SSR02733对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:11为引物SSR02734对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:12为引物SSR02734对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列。
序列表中SEQ ID NO:13为引物CS27对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:14为引物CS27对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列。
优选地，所述甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位步骤中，用于PCR扩增所述SSR标记的引物的核苷酸碱基序列为：
SSR引物SSR02733：
上游引物序列：5’-TTGTTAGGTAAGCCATGCCC-3’,
下游引物序列：5’-TTTGCCTGAGGAAGAATCTGA-3’；
SSR引物SSR02734：
上游引物序列：5’-TGTTGTTGGACCCCTTCAAT-3’,
下游引物序列：5’-TGTCAAAGGAGGAGGTGGAG-3’；
SSR引物CS27：
上游引物序列：5’-GCTGAGTTATGGGGAAAGCA-3’,
下游引物序列：5’-ATGTTGTTGGACCCCTTCAA-3’。
优选地，所述甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位步骤中，用于所述SSR标记的PCR扩增反应程序为：
阶段1：94℃预变性3min；阶段2：94℃20s，55℃20s，72℃30s，共循环30次；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保持。
进一步地，所述与目标性状连锁的SNP/Indel位点的获取步骤中，所述PCR扩增反应得到的抗病材料和感病材料特异性扩增的序列，具有序列表中SEQ IDNO:15～22中至少一个的核苷酸碱基序列，其中：
序列表中SEQ ID NO:15为引物Cum-1对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:16为引物Cum-1对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:17为引物Cum-2对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:18为引物Cum-2对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:19为引物Mel-1对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:20为引物Mel-1对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:21为引物Cum-3对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:22为引物Cum-3对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列。
优选地，所述与目标性状连锁的SNP/Indel位点的获取步骤中，用于扩增所述抗病和感病材料特异性扩增的序列的引物的核苷酸碱基序列为：
Cum-1引物：
上游引物序列：5’-GTACAAGAGTTCTGCTGTGAAGGA-3’，
下游引物序列：5’-TTGAATCTCATTTTTCTGTTGCAT-3’；
Cum-2引物：
上游引物序列：5’-ATCTTCGAACATCATCTTTGAC-3’，
下游引物序列：5’-ATCCCAAATCTCCAATATCG-3’；
Mel-1引物：
上游引物序列：5’-CGAGTCTTCTTCTTCCAAATATCC-3’，
下游引物序列：5’-GAAAGATTCATAGGAGAACTCGTCC-3’；
Cum-3引物：
上游引物序列：5’-CACACAGTGGACAACAGTACAT-3’，
下游引物序列：5’-AAGATTGATTGACGATTGATTG-3’。
进一步地，所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列标记的获取步骤中，用于PCR扩增所述CAPS标记的引物的核苷酸碱基序列为：
CAPS引物CAPS-Dde I：
上游引物序列：5’-GCCCAACCTTCAACTCGATA-3’,
下游引物序列：5’-TTGAATCTCATTTTTCTGTTGCAT-3’；
CAPS引物CAPS-Hph I：
上游引物序列：5’-CAGTAGGGACACACAACC-3’,
下游引物序列：5’-TATGCCATACGCTAATGT-3’；
进一步地，所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中，用于所述CAPS标记的PCR扩增反应程序为：
阶段1：94℃预变性3min；阶段2：94℃20s，Tm值20s，72℃30s，共循环30次；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保持；其中CAPS标记Tm值为：CAPS-Dde I：57℃、CAPS-Hph I：55℃；
进一步地，所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中，所述标记CAPS-Dde I的内切酶为Dde I限制性内切酶，所述标记CAPS-Hph I的内切酶为Hph I限制性内切酶；
所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中，标记CAPS-Dde I酶切位点为：GCACT，标记CAPS-Hph I酶切位点为：GGTGA；
所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列标记的获取步骤中，所述酶切反应条件为：
阶段1：37℃酶切12～16h；阶段2：65℃酶变性20min；阶段3：4℃保持。
进一步地，所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中，用于PCR扩增所述Indel标记引物的核苷酸碱基序列为：
Indel引物Indel01：
上游引物序列：5’-GTCCACAGCAATCCAAGCTC-3’,
下游引物序列：5’-CGAGTCTTCTTCTTCCAAATATCC-3’。
Indel引物Indel02：
上游引物序列：5’-GTGTGTGTGTGCAGAAATGGA-3’,
下游引物序列：5’-ATGGAACAACCTCCATCTGC-3’。
进一步地，所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中，用于所述Indel标记的PCR扩增反应程序为：
阶段1：94℃预变性3min；阶段2：94℃20s，Tm值20s，72℃30s，共循环30次；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保持；其中，分子标记Tm值为：Indel01：58℃，Indel02：57℃。
进一步地，所述供试材料选取步骤中，所述供试材料包括：
抗感亲本：父本K7-1，为典型的高抗白粉病菌生理小种P.xanthii 2F的日本类型甜瓜材料；母本K7-2，为典型的高感白粉病菌生理小种P.xanthii 2F新疆哈密瓜材料；
以所述抗感亲本进行杂交获取的F1代群体；
以所述F1代群体自交获得的F2代分离群体。
本发明的有益效果为：
1、本发明采用BSA法，利用甜瓜-黄瓜比较基因组结合黄瓜高密度遗传连锁图谱，筛选与目标性状连锁的分子标记，对甜瓜抗白粉病基因Pm-2F进行初步定位；根据初步定位区间对应黄瓜同源区段的基因组信息和甜瓜EST信息设计引物，扩增甜瓜抗、感亲本和抗、感池序列，比对获取与目的性状完全符合的候选SNP/Indel位点；再根据与性状连锁的候选SNP/Indel位点分别设计CAPS/Indel标记，结合F2代分离群体验证分析及自然群体验证分析，获取与目的性状紧密连锁的标记，确认所述系列SNP/Indel位点与目的性状的紧密连锁程度；利用上述分子标记进行抗白粉病品种早期筛选鉴定，可以大大缩短育种周期，提高育种效率，具有重要的理论及实践意义。
2、本发明中的大部分工作，是在甜瓜参考基因组还没公布(甜瓜基因组于2012年公布)的情况下进行的。本发明通过甜瓜-黄瓜比较基因组法，利用黄瓜基因组序列信息开发出了一系列与Pm-2F基因紧密连锁的分子标记，这为利用比较基因组通过已测序模式植物基因组开发近缘物种的分子标记提供了新的思路与方法。
附图说明
图1为引物SSR02734、SSR02733、CS27对抗感亲本、F1代和抗、感DNA池的PCR扩增结果图。
图2为甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位结果图。
图3为引物CAPS-Dde I对F2分离群体部分单株的PCR扩增及Dde I酶切结果图。
图4为引物CAPS-Hph I对F2分离群体部分单株的PCR扩增及Hph I酶切结果图。
图5为引物Indel01对F2分离群体部分单株的PCR扩增结果图。
图6为引物Indel02对F2分离群体部分单株的PCR扩增结果图。
图7为甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的精细定位结果图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。
根据本发明的第一个方面，本发明提供了与甜瓜抗白粉基因Pm-2F紧密连锁的系列CAPS/Indel标记，其具有序列表中SEQ ID NO:1～8中至少一个的核苷酸碱基序列。
其中，
序列表中SEQ ID NO:1为引物CAPS-Dde I对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:2为引物CAPS-Dde I对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:3为引物CAPS-Hph I对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:4为引物CAPS-Hph I对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:5为引物Indel01对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:6为引物Indel01对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:7为引物Indel02对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:8为引物Indel02对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列。
根据本发明的第二个方面，本发明提供了上述与甜瓜抗白粉基因Pm-2F紧密连锁的系列分子标记的获取方法，
该获取方法包括以下步骤：
(1)、供试材料的选取：
供试材料包括父本、母本、F1代群体、RILs群体、F2代分离群体；
父本为：K7-1，为典型的高抗白粉病菌生理小种P.xanthii 2F的日本类型甜瓜材料；
母本为：K7-2，为典型的高感白粉病菌生理小种P.xanthii 2F新疆哈密瓜材料；
F1代为：以上述父本和母本为亲本进行杂交获取的F1代群体；
RILs群体为：该F1代自交8代获得的RILs群体，其中包括58个抗病株系和48个感病株系。
F2群体为：以F1代自交获得的2200株F2代分离群体；
以上供试材料均来源于北京市农林科学院蔬菜研究中心西甜瓜种质资源库。
(2)、甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位：
对供试材料进行苗期抗病接种鉴定，得到抗、感池材料，再利用集团混合分析法(Bulked Segregating Analysis，BSA)，提取基因组DNA，构建抗、感DNA池；之后通过PCR扩增反应，对黄瓜高密度遗传图谱中的SSR标记进行筛选，获取与目标性状连锁的标记；再结合RILs群体表型鉴定结果和连锁标记分析结果，利用Joinmap4.0软件进行遗传连锁分析，初步定位目标基因-抗白粉病Pm-2F基因。
具体步骤如下：
①、将供试材料进行苗期抗病接种鉴定；
(a)、将上述供试材料中的父本、母本、F1代群体各取30粒种子播种，RILs群体每个株系取15粒种子，F2代分离群体取2200粒种子播种，定植于北京市农林科学院蔬菜研究中心日光温室；
(b)、白粉病病原菌分离纯化及接种菌源制备：
从北京市农林科学院蔬菜研究中心四季青农场收集的白粉病菌，采用孢子悬浮液喷雾法接种于白粉病生理小种鉴定的13个鉴别寄主上(PI 124112、PMR45、PMR 6、PI 124111、Top mark、Védrantais、WMR 29、Nantais Oblong、Edisto47、PI 414723、PMR 5、Iran H和MR 1)，根据鉴别寄主的抗感反应确定白粉病病原菌的生理小种为P.xanthii 2F，利用单孢培养技术进行白粉病菌P.xanthii 2F分离纯化，将纯化后的白粉病病原菌接种于西葫芦幼苗进行扩繁；
用灭菌后的毛笔将扩繁白粉病西葫芦病叶上的孢子刷到盛有无菌蒸馏水的烧杯中，所有孢子悬浮液用干净的纱布过滤去除杂质，用吸管吸取少量的孢子悬浮液，滴在血球计数板上计数，将接种菌液浓度调整至2.0×105个孢子/mL；
(c)、苗期抗病接种鉴定：父本、母本、甜瓜白粉病生理小种13份鉴别寄主、F1代群体各取30粒种子，RILs群体每个株系取15粒种子，F2代分离群体取2200粒种子；将上述的种子浸种、消毒后置于28℃恒温培养箱中催芽18h，随后播种于装有灭菌营养土穴盘中；待子叶展平后，采用孢子悬浮液喷雾接种P.xanthii 2F，接种12至15d充分发病后开始调查父本、母本、F1、RILs和F2群体单株的抗感反应；
(d)、苗期抗病接种鉴定的分级标准：抗病性鉴定采用甜瓜苗期病情鉴定的6级分级标准；整株没有任何病斑的为0级；仅子叶有很少量病斑(少于20％)为1级；仅子叶有较多病斑(21％-50％)或子叶有病斑，茎上有很少量病斑为2级；子叶有很多病斑(51％-70％)，茎上有少量病斑(21％-50％)为3级；子叶和茎上布满病斑或子叶和茎上布满病斑(大于71％)，真叶有病斑(少于20％)为4级；整株均布满白粉或植株因感病而死为5级；抗感确定采用病情指数(PDI)来确定(Zhanghaiying，Sources of resistance to race 2WF powdery mildew in US watermelon plantintroductions.HortSci 46(10):1349–1352)，即抗病：0<PDI≤40；中间型：40<PDI<60；感病：60≤PDI；其中，PDI按照如下公式计算：
PDI＝[Σ(s×n)/(N×S)]×100
在上式中Σ为总和公式；s为各病情级别代表数值；n为各病情级别病株；N为总调查株数；S为最高病情级别代表值；
F2群体单株的抗感根据病情分级确定，其中0、1、2为抗病，3、4、5为感病；
②、利用集团混合分析法(Bulked Segregating Analysis，BSA)，提取抗、感池材料的基因组DNA，构建抗、感DNA池；
再利用甜瓜-黄瓜比较基因组学找出Pm-2F基因连锁标记CMBR8和CMBR120对应黄瓜同源区段，筛选对应的黄瓜染色体区段高密度遗传图谱中的SSR标记，获取与目标性状连锁的SSR标记；
具体操作如下：
(a)、抗、感池材料的基因组DNA提取：
DNA提取参照Murry等(1980)的方法(Murray M,Thompson W F.Rapidisolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucl Acid Res,1980,8:668-673.)的基础上改进而成；具体步骤如下：
ⅰ.取抗、感池材料的叶片1.5克，在液氮中研磨成粉末，再加入9ml 2％CTAB提取液(2％CTAB，1.4mM NaCl，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTApH8.0，1％PVP-40，0.2％β-巯基乙醇)，混匀，于65℃水浴1小时，得到混合物A；
ⅱ.将混合物A停止水浴，加入1/3体积的5M的醋酸钾溶液，混匀，冰浴20分钟；再加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)抽提两次，得到上清液A；
ⅲ.向上清A中加入2/3体积异丙醇用来沉淀DNA；再用洗涤缓冲液(76％乙醇，10mM乙酸铵)洗涤一次，吹干，再加TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH7.4)溶解，得到溶液A；
ⅳ.向溶液A中加入RNase A，使其终浓度达100μg/ml，再混匀37℃水浴1小时；再用等体积氯仿/异戊醇(24：1)抽提一次，得到上清液B；
ⅴ.向取上清液B中加入1/2体积7.5M醋酸铵、2倍体积无水乙醇，得到DNA沉淀；
ⅵ.用70％乙醇洗涤DNA沉淀，吹干，加适量ddH2O溶解DNA，得到抗、感池材料基因组DNA；
再用紫外分光光度计(Shimadzu UV-1201，日本)以OD260值测定供试材料基因组DNA的浓度，再用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测抗、感池材料基因组DNA的提取质量；
(b)、抗、感DNA池的构建：
抗、感DNA池是取10株纯合抗病(病情指数为0级)单株DNA混合成抗病DNA池，取10株纯合感白粉病(病情指数为5级)单株DNA混合成感病DNA池；
(c)、利用甜瓜-黄瓜比较基因组，找出与Pm-2F基因连锁的分子标记CMBR8和CMBR120对应黄瓜基因组同源区域，筛选对应黄瓜染色体区段高密度遗传图谱中的SSR标记，获得与目标性状连锁的SSR分子标记：
SSR引物SSR02733的序列如下：
上游引物序列：5’-TTGTTAGGTAAGCCATGCCC-3’,
下游引物序列：5’-TTTGCCTGAGGAAGAATCTGA-3’；
所述SSR引物SSR02734的序列如下：
上游引物序列：5’-TGTTGTTGGACCCCTTCAAT-3’,
下游引物序列：5’-TGTCAAAGGAGGAGGTGGAG-3’；
所述SSR引物CS27的序列如下：
上游引物序列：5’-GCTGAGTTATGGGGAAAGCA-3’,
下游引物序列：5’-ATGTTGTTGGACCCCTTCAA-3’；
所述SSR标记选用的引物由上海生工公司北京合成部合成；
(d)、利用SSR标记通过PCR扩增反应对甜瓜亲本和抗、感DNA池进行筛选：
PCR反应体系(15μL)中含有：1.5μL含15mM MgCl2的10×Buffer；0.5μL浓度为2.0mM的dNTPs；0.5U Taq DNA聚合酶；1.0μL浓度为10uM PCR上、下游混合引物；20ng模板DNA；ddH2O补足到15μL；Taq DNA聚合酶及反应缓冲液购自TaKaRa公司；dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司；
PCR扩增反应程序为：阶段1：94℃预变性3min；阶段2：94℃20s，55℃20s，72℃30s，共循环30次；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保持；其中PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti 96 well Thermal Cycler；
PCR扩增产物的检测：扩增产物15μl，加入3μl上样缓冲液(6×LoadingBuffer)，移液器混匀后取3μl点入8％的聚丙烯酰胺凝胶中；140V/500mA电泳，时间为90min；电泳结果如图1所示；
其中，8％聚丙烯酰胺胶配方为：
dd H2O：10mL；10×TBE：2mL；20％Acr-Bis：8mL；Temed：20μL；10％APS：200μL；
缓冲液为：1×TBE电极缓冲液；电泳仪为：购自JY600电泳仪(JINGYI公司)；
银染显现扩增产物后，对电泳谱带进行分析；来自父本K7-1的纯合带型记为“a”，来自母本K7-2的纯合带型记为“b”，杂合带型记为“h”，模糊不清或者丢失的带记为“-”；
与甜瓜抗白粉基因Pm-2F连锁的系列SSR标记，具有序列表中SEQ IDNO:9～14的核苷酸碱基序列，其中：
序列表中SEQ ID NO:9为引物SSR02733对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:10为引物SSR02733对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:11为引物SSR02734对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:12为引物SSR02734对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:13为引物CS27对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:14为引物CS27对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
③、利用Joinmap4.0软件对RILs群体株系表型和连锁标记进行遗传连锁分析，初步定位抗白粉病Pm-2F基因。
(3)、与目标性状连锁的SNP/Indel位点的获取：利用甜瓜-黄瓜比较基因组，找到初步定位抗白粉病Pm-2F基因区间对应的黄瓜基因组区域，根据黄瓜基因组和甜瓜EST信息设计引物，在甜瓜抗感亲本与抗感DNA池中进行扩增、测序，得到抗病和感病材料特异性扩增的序列，具有序列表中SEQ ID NO:15～22的核苷酸碱基序列，其中：
序列表中SEQ ID NO:15为引物Cum-1对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:16为引物Cum-1对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:17为引物Cum-2对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:18为引物Cum-2对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:19为引物Mel-1对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:20为引物Mel-1对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:21为引物Cum-3对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:22为引物Cum-3对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
再经序列比对获取与目标性状连锁的SNP/Indel位点(即为候选位点)。
具体步骤如下：
①、以甜瓜亲本的基因组DNA与抗、感DNA池为模板，进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；甜瓜亲本和抗、感DNA池的基因组DNA提取方法参见步骤(2)；PCR扩增反应选用的引物是根据黄瓜同源区域序列信息和甜瓜EST信息设计的，由上海生工公司北京合成部合成；其中，PCR扩增反应选用的引物序列如下：
Cum-1引物(对应CAPS-Dde I标记长片段序列扩增)：
上游引物序列：5’-GTACAAGAGTTCTGCTGTGAAGGA-3’，
下游引物序列：5’-TTGAATCTCATTTTTCTGTTGCAT-3’；
Cum-2引物(对应CAPS-Hph I标记长片段序列扩增)：
上游引物序列：5’-ATCTTCGAACATCATCTTTGAC-3’，
下游引物序列：5’-ATCCCAAATCTCCAATATCG-3’；
Mel-1引物(对应Indel01标记长片段序列扩增)：
上游引物序列：5’-CGAGTCTTCTTCTTCCAAATATCC-3’，
下游引物序列：5’-GAAAGATTCATAGGAGAACTCGTCC-3’；
Cum-3引物(对应Indel02标记长片段序列扩增)：
上游引物序列：5’-CACACAGTGGACAACAGTACAT-3’，
下游引物序列：5’-AAGATTGATTGACGATTGATTG-3’；
上述引物进行PCR扩增的反应体系(25μL)中含有：2.5μL含15mM MgCl2的10×Buffer；1.0μL浓度为2.5mM的dNTPs；1U Taq DNA聚合酶；2.0μL浓度为10uM PCR上、下游混合引物；50ng模板DNA；ddH2O补足到25μL；Taq DNA聚合酶及反应缓冲液购自TaKaRa公司；dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司；
PCR扩增反应程序为：阶段1：94℃预变性3min；阶段2：94℃20s，Tm值30s，72℃1min，共循环30次；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保持；其中系列标记Tm值：Cum-1：53℃、Cum-2：54℃、Mel-1-3：58℃、Cum-3：52℃；其中PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti 96 well ThermalCycler；
再将上述PCR扩增产物25μL与载样缓冲液(6×Loading Buffer，北京全式金生物技术有限公司)4μL混匀，再加入1.0％的琼脂糖凝胶中，180V/90A进样，90V/100A电泳；其中，琼脂糖为：Agarose RA(购自amresco公司)；缓冲液为：1×TAE缓冲液；电泳仪为购自JINGYI公司的JY600电泳仪；
②、PCR产物的检测回收与特异性扩增序列的获得：
将PCR扩增产物进行纯化处理后与pEASY-T1载体进行连接反应，得到重组质粒；再将重组质粒转入感受态细胞，再进行筛选、检测、测序，得到特异性扩增序列；
具体步骤如下：
(a)、用刀片将特异性扩增条带切下，分别放入标记好的2.0ml离心管中，用购自北京全式金生物技术有限公司的切胶回收纯化试剂盒EasyPure Quick GelExtraction Kit对产物进行回收纯化，操作方法详见产品说明书，得到纯化后的扩增产物；
(b)、将纯化后的扩增产物与pEASY-T1载体连接反应，得到重组质粒；该连接反应采用北京全式金生物技术有限公司的pEASY-T1Cloning Kit试剂盒；
(c)、将重组质粒转入感受态细胞，再进行筛选、检测、测序，得到特异性扩增序列；
具体操作如下：
将重组质粒转入购自北京全式金生物技术有限公司的Trans-T1感受态细胞中，再在SOC液体培养基中，37℃、200rpm/min的条件下培育1h后，将菌液均匀涂抹于预先涂抹了IPTG(8μL，500mM)、X-gal(40μL，20mg/ml)的LB/Amp+(100ug/ml)固体培养基中，在37℃条件下培养过夜；之后用10μL枪头挑取呈白色的单菌落加入1ml LB/Amp+(100ug/ml)液体培养基中，在37℃、200rpm/min下培育8h后，取1μL利用通用引物M13进行菌液PCR检测，若为阳性克隆则将对应菌液送北京诺赛基因组研究中心有限公司测序；其中菌液PCR所用的M13引物由上海生工公司北京合成部合成，DNA聚合酶为Easytaq DNAPolymerase；
③、与目标性状连锁的SNP/Indel位点的获得：
利用DNAMAN软件对测序所得的特异性扩增序列进行分析比对，结合表型鉴定结果，得到与目标性状连锁的SNP/Indel位点(即候选位点)。
(4)、针对上述与目标性状连锁的SNP/Indel位点，分别设计CAPS/Indel标记，在验证材料中验证与目标性状连锁的SNP/Indel位点，获得与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记。
验证材料包括：上述F2代分离群体(包括2200个单株)和自然群体；该自然群体为：120份甜瓜种质资源，其中包括新疆地方甜瓜种质资源96份、从国外引进的典型西亚-欧美类型甜瓜资源20份以及其它对照材料4份；该自然群体中，包括Perlita、Mainstream、TAMUvalde、Saticoy、PMR honeydew、Ogen-op、Piel de sapo和Munger's 339等13份抗病材料，和Hale’s Best Jumbo、Crenshaw、Juan Canavy、Turkey variety、Im16purcedo、Lorta和Mirella RZ等107份感病材料；以上验证材料均来源于北京农林科学院蔬菜研究中心西甜瓜种质资源库。
验证步骤如下：
①、以验证材料基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
验证材料基因组DNA的提取方法参见步骤(2)；
所用CAPS/Indel标记引物由上海生工公司北京合成部合成；
CAPS/Indel标记引物的序列如下：
CAPS引物CAPS-Dde I：
上游引物序列：5’-GCCCAACCTTCAACTCGATA-3’,
下游引物序列：5’-TTGAATCTCATTTTTCTGTTGCAT-3’；
CAPS引物CAPS-Hph I：
上游引物序列：5’-CAGTAGGGACACACAACC-3’,
下游引物序列：5’-TATGCCATACGCTAATGT-3’；
Indel引物Indel01：
上游引物序列：5’-GTCCACAGCAATCCAAGCTC-3’,
下游引物序列：5’-CGAGTCTTCTTCTTCCAAATATCC-3’；
Indel引物Indel02：
上游引物序列：5’-GTGTGTGTGTGCAGAAATGGA-3’,
下游引物序列：5’-ATGGAACAACCTCCATCTGC-3’；
CAPS/Indel引物进行PCR扩增反应体系(15μL)中含有：1.5μL含15mMMgCl2的10×Buffer；0.5μL浓度为2.5mM的dNTPs；0.5U Taq DNA聚合酶；1.0μL浓度为10uM PCR上、下游混合引物；20ng模板DNA；ddH2O补足到15μL；TransStart Taq DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司，dNTPs购自TaKaRa公司；
PCR扩增反应程序为：阶段1：94℃预变性3min；阶段2：94℃20s，Tm值20s，72℃30s，共循环30次；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保持；其中，引物的Tm值为：CAPS-Dde I：57℃、CAPS-Hph I：55℃、Indel01：58℃、Indel02：57℃；其中，PCR仪为Applied Biosystems公司的Veriti 96 well ThermalCycler；
②、将该PCR扩增产物进行酶切反应，得到酶切产物；
酶切反应的反应体系10μL中含有：1.0μL 10×Buffer，0.5μL限制内切酶，3μLPCR产物，5.5μL H2O；Dde I和Hph I限制内切酶购自Fermantas公司；
酶切反应程序为：37℃酶切12～16h后65℃变性20min，4℃保存，其中PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti 96 well Thermal Cycler，标记CAPS-Dde I酶切位点为：GCACT，标记CAPS-Hph I酶切位点为：GGTGA。
以上步骤中的验证结果与分析如下：
1、甜瓜抗白粉病基因Pm-2F遗传规律分析
步骤(2)的步骤①中，对抗病亲本K7-1(父本)、感病亲本K7-2(母本)、F1群体的单株、RILs和F2代分离群体进行苗期抗病接种鉴定，按照甜瓜白粉病病情分级标准调查每个单株的发病级数。结果表明，K7-1、K7-2和F1代群体的病情指数分别表现为抗病、感病、抗病，说明甜瓜K7-1对白粉病生理小种P.xanthii 2F的抗性是由显性单基因控制。而K7-2×K7-1的F2代分离群体的抗病鉴定结果表明2200个单株中有1673个抗病单株和527个感病单株，卡平方比例适合性检验F2群体满足抗感比例为3:1的分离规律(χ2＝1.28，P＝0.26)。综合双亲、F1和F2群体2200个单株的苗期抗病鉴定结果，甜瓜K7-1对白粉病生理小种P.xanthii 2F的抗性是由显性单基因Pm-2F控制。上述RILs群体中各株系的鉴定结果与张海英等(2008)RILs群体鉴定结果一致。
2、甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位分析
步骤(2)的步骤②中，根据K7-2×K7-1的F2分离群体苗期抗病鉴定结果，各取10个纯合抗、感单株DNA混合构建抗感基因池。采用集团混合分析法(Bulked Segregating Analysis，BSA)，利用CMBR8和CMBR120对应黄瓜染色体同源区段，黄瓜高密度遗传图谱1号染色体上的136对SSR标记进行多态性筛选，获得与目的性状连锁的SSR标记。
分析结果显示，SSR引物SSR02733、SSR02734和CS27扩增条带与目的性状连锁。如图1所示，图1为SSR02733、SSR02734和CS27对抗感亲本、F1代和抗感池的PCR扩增结果(图1中，P1：K7-1；P2：K7-2；F1：K7-2×K7-1；BR：抗病基因池；Bs：感病基因池)。
步骤(2)的步骤③中，利用Joinmap 4.0软件对上述与目标性状连锁的标记进行遗传连锁分析，SSR02733、SSR02734和CS27位于目标基因同侧，与目的基因的遗传距离分别为0.5、0.5和1.3cM，如图2所示，图2为甜瓜抗白粉病基因Pm-2F初步定位遗传图谱。
3、与目标性状连锁的SNP/Indel位点获取
步骤(3)中，根据初步定位结果Pm-2F基因两侧翼标记SSR02734和CMBR8对应的黄瓜基因组区间序列信息和甜瓜EST信息进行引物设计，在甜瓜亲本中和抗、感池中进行PCR扩增、测序，序列比对发现Cum1扩增序列在抗、感材料中存在AC-GT碱基突变位点；Cum2扩增序列在抗、感材料中存在T-C碱基突变位点，Mel-1扩增序列在抗、感材料中存在ACT…A 4个碱基***缺失突变，Cum3扩增序列在抗、感材料中存在GCGGCG 6个碱基***缺失突变，下一步针对这些突变位点分别设计CAPS/Indel标记。
4、F2代分离群体及自然群体材料基因型验证分析
(1)、F2代分离群体基因型验证分析
步骤(4)中，通过引物CAPS-Dde I、CAPS-Hph I对双亲、F2分离群体2200个单株进行PCR扩增，再利用DNA限制内切酶Dde I和Hph I进行酶切其结果显示：
引物CAPS-Dde I PCR扩增后再利用限制内切酶Dde I酶切，在1673个表型鉴定结果为抗病的单株中，1665个单株的基因型检测结果均显示为抗病带型，8个抗病株的检测结果显示与表型结果不符，表明该抗病单株为交换株；在527个表型鉴定结果为感病的单株中，有521个单株基因型鉴定结果为感病带型，6个感病株检测结果显示与表型结果不符，表明该感病单株为交换株；因此，2200个F2群体单株中共有14个交换单株。参见图3，P1泳道：K7-1；P2泳道：K7-2；1-16泳道：K7-2×K7-1的F2部分单株，其中泳道4、5、6、11、13、14、16为纯合抗病带型，泳道1、2、3、7、8、9、10、12、15为纯合感病带型。
引物CAPS-Hph I PCR扩增后再利用限制内切酶Hph I酶切，在1673个表型鉴定结果为抗病的单株中，1668个单株的基因型检测结果均显示为抗病带型，5个抗病株检测结果显示与表型结果不符，表明该抗病单株为交换株；在527个表型鉴定结果为感病的单株中，有522个单株基因型鉴定结果为感病带型，5个感病株检测结果显示与表型结果不符，表明该感病单株为交换株；因此，2200个F2群体单株中共有10个交换单株。参见图4，P1泳道：K7-1；P2泳道：K7-2；1-16泳道：K7-2×K7-1的F2部分单株，其中4、5、6、14、16为纯合抗病带型，1-3、7-13、15为杂合抗病带型。
通过引物Indel01、Indel02对双亲、F2代分离群体(该群体包括2200个单株)进行PCR扩增，结果显示：
引物Indel01的PCR扩增中，1673个抗病单株基因型鉴定结果均为抗病带型；527个感病单株基因型鉴定结果均为感病带型；因此，2200个F2单株基因型分析结果与表型鉴定结果完全符合。参见图5，P1泳道：K7-1；P2泳道：K7-2；1-16泳道：K7-2×K7-1的F2部分单株，其中1、2、4、5、13为纯合抗病带型，3、6、9、10、11、12、14、15为杂合抗病带型，7、8、16为纯合感病带型。
引物Indel02的PCR扩增中，在1673个表型鉴定结果为抗病的单株中，1670个单株的基因型检测结果均显示为抗病带型，3个抗病株检测结果显示与表型结果不符，表明该抗病单株为交换株；在527个表型鉴定结果为感病的单株中，有526个单株基因型鉴定结果为感病带型，1个感病株检测结果显示与表型结果不符，表明该感病单株为交换株；因此，2200个F2群体单株中共有4个交换单株。参见图6，P1泳道：K7-1；P2泳道：K7-2；1-16泳道：K7-2×K7-1的F2部分单株，其中1、2、3、5、7-13为杂合抗病带型，4、6、14、15、16为纯合抗病带型。
利用Joinmap 4.0软件分析上述标记与目标性状的连锁关系，结果如图7所示，标记CAPS-Hph I、Indel02、CAPS-Dde I与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F呈连锁关系，其连锁距离分别为0.26cM、0.12cM和0.35cM；Indel01标记与Pm-2F基因呈现共分离，两侧翼标记Indel02和CAPS-Dde I将Pm-2F基因定位在0.47cM的范围内。
(2)、自然群体基因型验证分析
为进一步验证上述标记与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的连锁关系，将上述自然群体中的120份甜瓜种质资源材料进行验证，其中有13个抗病品种和107个感病品种。
引物CAPS-Dde I PCR扩增后再利用限制内切酶Dde I酶切，120份甜瓜种质资源材料中，10份材料结果与田间抗病表型不符，其符合率91.6％。
引物CAPS-Hph I PCR扩增后再利用限制内切酶Hph I酶切，120份甜瓜种质资源材料中，8份材料结果与田间抗病表型不符，其符合率93.3％。
引物Indel01的PCR扩增中，120份甜瓜种质资源材料中分子标记检测基因型与田间表型完全吻合。
引物Indel02的PCR扩增中，120份甜瓜种质资源材料中，3份材料结果与田间抗病表型不符，其符合率97.5％。
上述验证结果进一步证实了所述标记CAPS-Hph I、Indel02、CAPS-Dde I与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的紧密连锁关系，标记Indel01与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F呈现共分离，是基因特异性的分子标记；上述标记可以有效地运用于甜瓜抗白粉病分子辅助育种，在鉴定甜瓜抗白粉病方面具有较高的利用价值。
本发明中，所采用的试剂和仪器均为市场常规产品。
显然，本发明的上述实施方式仅仅是为清楚地说明本发明所做的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列分子标记，其特征在于：所述分子标记具有序列表中的SEQ ID NO:1～8的至少一个的核苷酸碱基序列。
2.权利要求1所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列分子标记的获取方法，其特征在于：该获取方法包括如下步骤：
供试材料选取步骤：选取供试材料；
甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位步骤：
对所述供试材料进行苗期抗病接种鉴定，得到抗感池材料；再利用集团混合分析法，提取所述抗感池材料的基因组DNA，构建抗感DNA池；
再通过PCR扩增反应，对黄瓜高密度遗传图谱中的SSR标记进行筛选，获取与目标性状连锁的SSR标记；
再对所述与目标性状连锁的SSR标记进行遗传连锁分析，初步定位目标基因Pm-2F；
与目标性状连锁的SNP/Indel位点的获取步骤：
在所述Pm-2F基因初步定位区间设计引物，在甜瓜抗感亲本与所述抗感DNA池中进行PCR扩增反应，测序后再经序列比对获取所述与目标性状连锁的SNP/Indel位点；
与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤：
针对所述与目标性状连锁的SNP/Indel位点分别设计CAPS/Indel标记，在验证材料中验证所述候选SNP/Indel位点，获得与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记。
3.根据权利要求2所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列分子标记获取方法，其特征在于：
所述甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位步骤中，所述与目标性状连锁的SSR标记，具有序列表中SEQ ID NO：9～14的至少一个的核苷酸碱基序列，其中：
序列表中SEQ ID NO:9为引物SSR02733对抗病材料特异性扩增的核苷酸 碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:10为引物SSR02733对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:11为引物SSR02734对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:12为引物SSR02734对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列。
序列表中SEQ ID NO:13为引物CS27对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:14为引物CS27对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列。
优选地，所述甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位步骤中，用于PCR扩增所述SSR标记的引物的核苷酸碱基序列为：
SSR引物SSR02733：
上游引物序列：5’-TTGTTAGGTAAGCCATGCCC-3’,
下游引物序列：5’-TTTGCCTGAGGAAGAATCTGA-3’；
SSR引物SSR02734：
上游引物序列：5’-TGTTGTTGGACCCCTTCAAT-3’,
下游引物序列：5’-TGTCAAAGGAGGAGGTGGAG-3’；
SSR引物CS27：
上游引物序列：5’-GCTGAGTTATGGGGAAAGCA-3’,
下游引物序列：5’-ATGTTGTTGGACCCCTTCAA-3’。
优选地，所述甜瓜抗白粉病基因Pm-2F的初步定位步骤中，用于所述SSR标记的PCR扩增反应程序为：
阶段1：94℃预变性3min；阶段2：94℃20s，55℃20s，72℃30s，共循环30次；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保持。
4.根据权利要求2所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列分子标记获取方法，其特征在于：
所述与目标性状连锁的SNP/Indel位点的获取步骤中，所述PCR扩增反应得到的抗病材料和感病材料特异性扩增的序列，具有序列表中SEQ ID NO:15～22中至少一个的核苷酸碱基序列，其中：
序列表中SEQ ID NO:15为引物Cum-1对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:16为引物Cum-1对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:17为引物Cum-2对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:18为引物Cum-2对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:19为引物Mel-1对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:20为引物Mel-1对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:21为引物Cum-3对抗病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列；
序列表中SEQ ID NO:22为引物Cum-3对感病材料特异性扩增的核苷酸碱基序列。
优选地，所述与目标性状连锁的SNP/Indel位点的获取步骤中，用于扩增所述抗病和感病材料特异性扩增的序列的引物的核苷酸碱基序列为：
Cum-1引物：
上游引物序列：5’-GTACAAGAGTTCTGCTGTGAAGGA-3’，
下游引物序列：5’-TTGAATCTCATTTTTCTGTTGCAT-3’；
Cum-2引物：
上游引物序列：5’-ATCTTCGAACATCATCTTTGAC-3’，
下游引物序列：5’-ATCCCAAATCTCCAATATCG-3’；
Mel-1引物：
上游引物序列：5’-CGAGTCTTCTTCTTCCAAATATCC-3’，
下游引物序列：5’-GAAAGATTCATAGGAGAACTCGTCC-3’；
Cum-3引物：
上游引物序列：5’-CACACAGTGGACAACAGTACAT-3’，
下游引物序列：5’-AAGATTGATTGACGATTGATTG-3’。
5.根据权利要求2所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列分子 标记的获取方法，其特征在于：
所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列标记的获取步骤中，用于PCR扩增所述CAPS标记的引物的核苷酸碱基序列为：
CAPS引物CAPS-Dde I：
上游引物序列：5’-GCCCAACCTTCAACTCGATA-3’,
下游引物序列：5’-TTGAATCTCATTTTTCTGTTGCAT-3’；
CAPS引物CAPS-Hph I：
上游引物序列：5’-CAGTAGGGACACACAACC-3’,
下游引物序列：5’-TATGCCATACGCTAATGT-3’。
6.根据权利要求5所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列分子标记的获取方法，其特征在于：
所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中，用于所述CAPS标记的PCR扩增反应程序为：
阶段1：94℃预变性3min；阶段2：94℃20s，Tm值20s，72℃30s，共循环30次；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保持；其中CAPS标记Tm值为：CAPS-Dde I：57℃、CAPS-Hph I：55℃。
7.根据权利要求6所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列分子标记的获取方法，其特征在于：
所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中，标记CAPS-Dde I的内切酶为Dde I限制性内切酶，标记CAPS-Hph I的内切酶为Hph I限制性内切酶；
所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中，所述标记CAPS-Dde I酶切位点为：GCACT，所述标记CAPS-Hph I酶切位点为：GGTGA；
所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列标记的获取步骤中，所述酶切反应条件为：
阶段1：37℃酶切12～16h；阶段2：65℃酶变性20min；阶段3：4℃保持。
8.根据权利要求2所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取方法，其特征在于：
所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中，用于PCR扩增所述Indel标记引物的核苷酸碱基序列为：
Indel引物Indel01：
上游引物序列：5’-GTCCACAGCAATCCAAGCTC-3’,
下游引物序列：5’-CGAGTCTTCTTCTTCCAAATATCC-3’。
Indel引物Indel02：
上游引物序列：5’-GTGTGTGTGTGCAGAAATGGA-3’,
下游引物序列：5’-ATGGAACAACCTCCATCTGC-3’。
9.根据权利要求8所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列分子标记的获取方法，其特征在于：
所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的分子标记的获取步骤中，用于所述Indel标记的PCR扩增反应程序为：
阶段1：94℃预变性3min；阶段2：94℃20s，Tm值20s，72℃30s，共循环30次；阶段3：72℃延伸10min；阶段4：4℃保持；其中，分子标记Tm值为：Indel01：58℃，Indel02：57℃。
10.根据权利要求2所述与甜瓜抗白粉病基因Pm-2F紧密连锁的系列分子标记的获取方法，其特征在于：
所述供试材料选取步骤中，所述供试材料包括：
抗感亲本：父本K7-1，为典型的高抗白粉病菌生理小种P.xanthii 2F的日本类型甜瓜材料；母本K7-2，为典型的高感白粉病菌生理小种P.xanthii 2F新疆哈密瓜材料；
以所述抗感亲本进行杂交获取的F1代群体；
以所述F1代群体自交获得的F2代分离群体。
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