CN103882032B - 黄瓜枯萎病抗病基因Foc‑4及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种黄瓜枯萎病抗病基因Foc‑4及其编码蛋白和应用。该基因为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明提供的抗病基因Foc‑4具有重要的应用价值，可根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记或其紧密连锁标记，用这些标记可鉴定黄瓜及后代植株的基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种效率；另外，本发明的黄瓜枯萎病抗病基因Foc‑4还可以用于选育黄瓜黑星病抗病品种。

Description

黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于基因序列和应用领域，具体涉及黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4及其编码蛋白和应用。

背景技术

黄瓜(Cucumis Sativus.L)在世界上广泛栽培，中国是世界上黄瓜栽培面积最大、总产量最高的国家。

黄瓜枯萎病(Fusarium Wilt)，又名萎蔫病、蔓割病、死秧病，是一种由土壤传染，从根或根颈部侵入，在维管束内寄生的***性病害(导管型枯萎病)，是黄瓜生产上较难防治的三大病害之一，常造成较大损失，是目前世界各地黄瓜，特别是温室和其他保护地黄瓜的主要土传病害，该病菌在土壤、病株残体及未腐熟的农家肥中或附着在种子上越冬，成为翌年初侵染源，可借助雨水、灌溉水等进行远距离传播，一般年份可使黄瓜产量损失25％-35％，严重发病时可使黄瓜绝产。枯萎病采用化学防治效果不理想，不仅使生产投入增加且会造成环境安全隐患，倒茬嫁接虽常用于防控但增添技术困难和劳动成本。因此选育抗病品种是解决枯萎病危害的最佳途径。

黄瓜枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen.)，属半知菌类真菌。病菌产生大小两种类型分生孢子，大型分生孢子纺锤形或镰刀形，无色透明，顶细胞圆锥形，有的微呈钩状，基部倒圆锥截形或足细胞，具隔膜1～3个。小型分生孢子多生于气生菌丝中，椭圆形或腊肠形，无色透明，无隔膜。厚垣孢子表面光滑，黄褐色。因各地菌株间致病性不同，可以区分出不同生理小种，国外有生理小种1号、2号和3号，我国黄瓜枯萎病菌的致病性与国外不同，命名为生理小种4号。

克隆基因是寻找与目标性状连锁的分子标记最重要的应用之一。图位克隆(Map-based cloning)是利用分子遗传图谱，把目标性状和分子标记通过遗传连锁作图联系起来，把目标基因定位在与之连锁非常紧密的侧翼标记之间；也可以用群体分离分析法(BSA法)或近等基因系法得到与目标基因连锁的分子标记，然后利用作图群体把该分子标记定位到图谱上。从而由这些标记去筛选大片段DNA文库，鉴定出与标记有关的克隆，继之以亚克隆和染色体步移(Chromosome walking)形式获得含有目的基因的克隆片段，最终再辅之以转化和互补测验加以验证(王永飞，2001)。目前，运用基于图位克隆技术已分离到了大量的植物基因，尤其是与抗病有关的基因(Zeng ZB，1994；易小麦，1998)，但未见有关黄瓜枯萎病生理小种4的抗病基因被成功分离克隆的报道。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4。

本发明的目的之二在于提供一种上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的遗传标记。

本发明的目的之三在于提供用于扩增上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的一对引物。

本发明的目的之四在于提供一种上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的cDNA序列。

本发明的目的之五在于提供一种上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的编码蛋白。

本发明的目的之六在于提供一种上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4及遗传标记的应用。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4，(a)为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，(b)为与序列表中SEQ ID NO:1所示序列90％以上同源性且具有与序列表中SEQ ID NO:1所示序列相同功能的核苷酸序列。

本发明涉及的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4是利用抗感遗传群体进行精细定位克隆获得的。本发明选择经典抗病材料WI2757和重要骨干亲本感病材料津研二号，构建RILs-F₈、F_2：3和F₂遗传群体，对抗病基因进行初步定位和精细定位，抗枯萎病基因精细定位在2号染色体的25kb区间范围内，该区间仅存在2个基因，经过NCBI Blast在线比对分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，第1个基因为TIR NB-ARC抗病基因，第2个基因为bHLH96-like的转录因子相关基因。众所周知，TIR NB-ARC基因具有保守结构域是典型的NBS-LRR类抗病基因，因此推测该TIR NB-ARC基因是抗枯萎病的重要候选基因Foc-4，其DNA序列是通过对精细定位区间内的基因序列进行测序获得的。

上述SEQ ID NO:1所示的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的遗传标记，感病基因的第3530位的碱基G突变为碱基A。

用于扩增上述SEQ ID NO:1所示黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的一对引物，分别具有序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。

本发明根据已公布的黄瓜基因组9930和GY14序列信息，结合利用Softberry在线预测软件FGENESH(http://sunl.softberry.com/)预测基因结构，并根据预测结果的起始和终止编码序列，设计基因全长扩增引物一对分别为：序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列，分别利用抗/感材料基因组DNA进行PCR扩增，获得抗/感材料中基因Foc-4的DNA全长序列SEQ ID NO:1(抗病材料)和SEQ ID NO:2(感病材料)，全长4677bp，并对抗感材料中的两个基因DNA序列进行对比和分析，Foc-4DNA序列在抗/感材料中存在一个SNP位点，即在该基因的第3530位，感病材料的碱基为G，抗病材料的碱基为A，其可以应用于开发抗枯萎病分子标记。

上述SEQ ID NO:1所示黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的cDNA序列为序列表中SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列。

本发明涉及的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4cDNA(mRNA)序列是利用全长引物SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8作为上下游引物以抗/感材料的总RNA反转录后第一链作为模板进行PCR扩增获得的抗/感材料中的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的cDNA，在抗/感材料中的基因Foc-4的cDNA(mRNA)序列全长分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，利用Softberry在线预测Foc-4序列，获得cDNA结构，并绘制Foc-4基因的结构示意图(参见图1)。通过SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4序列的对比，黄瓜抗枯萎病基因Foc-4的cDNA(mRNA)在抗/感材料中存在可变剪切差异，导致Foc-4的cDNA在感病材料中的第5外显子比在抗病材料中大270bp，推测由于该可变剪切的存在导致基因重要结构域发生改变，从而导致TIR NB-ARC基因的抗病性发生变化。

上述SEQ ID NO:1所示黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的编码蛋白为序列表中的SEQID NO:5所示的氨基酸序列。

本发明涉及的黄瓜枯萎病抗病基因氨基酸序列是利用Foc-4基因在抗/感材料中的cDNA(mRNA)序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，分别经过softberry在线预测软件翻译获得抗/感材料中FOC-4氨基酸(蛋白)序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，并对抗/感材料中的FOC-4氨基酸序列进行比对分析，FOC-4在抗/感病材料中存在90aa的差异，推测该差异导致抗病结构域发生改变，从而导致TIR NB-ARC基因的抗病性发生变化。

上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4在选育黄瓜枯萎病抗病品种中的应用。

上述遗传标记在选育黄瓜枯萎病抗病品种中的应用。

上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4在选育黄瓜黑星病抗病品种中的应用。

上述遗传标记在选育黄瓜黑星病抗病品种中的应用。

本发明具有如下有益效果：

本发明利用图位克隆和正向遗传学方法，对黄瓜枯萎病生理小种4的抗病基因Foc-4进行精细定位和克隆，获得黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4，并研究该基因在抗/感病材料中的核酸序列和氨基酸序列进行分析和比对，获得黄瓜抗枯萎病基因Foc-4在抗/感病材料中差异和多态性分析，并验证了该枯萎病抗病基因Foc-4的功能。本发明提供的抗病基因Foc-4具有重要的应用价值，可根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记或其紧密连锁标记，包括但不限于SNP(单核苷酸多态)、InDel(***缺失多态)、RFLP(限制性内切酶长度多态)、CAP(切割扩增片段多态)，用这些标记可鉴定黄瓜及后代植株的基因型，用于分子标记辅助选择育种，从而提高育种效率；另外，本发明的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4还可以用于选育黄瓜黑星病抗病品种。

附图说明

图1是黄瓜枯萎病基因精细定位区间基因Foc-4结构示意图。图1(A)和图1(B)分别为抗/感材料中基因Foc-4的结构示意图，抗病Foc-4基因在抗/感材料中的第5外显子的大小存在差异。(Foc-4基因在染色体基因组上是反向***的，因此图中显示的第3外显子实际为Foc-4基因的第5外显子)。

图2是黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4定位连锁图谱，其中左图为黄瓜枯萎病基因初定位示意图，中图为枯萎病抗病基因精细定位示意图，右图为25kb区间范围内基因分布情况及基因注释。

图3是Foc-4基因SNP分子标记酶切验证结果示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，但本发明并不限于此。

实施例1：黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的获得

一、黄瓜枯萎病生理小种4的抗病基因Foc-4初步定位和精细定位

具体的定位方法包括以下步骤：

A、黄瓜枯萎病抗病基因定位研究亲本及遗传群体：

分别选择WI2757(父本)和津研二号(母本)为抗感亲本，构建90个RIL-F₈株系，130株的F_2:3群体和超过2000株的F₂大群体。其中，父本WI2757和母本津研二号购自北京市农作物种质资源库。

B、黄瓜枯萎病抗病基因定位研究病情指数调查：

将亲本及各群体的种子用纱布包裹，温汤浸种，28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中，在空调温室育苗，育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土。

供试菌种黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum Owen.)生理小种4号是通过黄仲生等的中国黄瓜枯萎病菌生理小种鉴定及防治文献(中国黄瓜枯萎病菌生理小种鉴定及防治，华北农学报，1994，9(4)：81-86)中记载的方法分离获得。采用翁祖信等(黄瓜枯萎病抗病性鉴定方法研究—胚根接种法，中国蔬菜,1985年02期)的方法制备黄瓜枯萎病菌液，血球计数板测定孢子浓度。采用浸根接种法:当黄瓜幼苗子叶展平时，拔出幼苗，用水洗净根部，在1×10⁶～5×10⁶个孢子/mL的接种液中浸根，然后栽入装有灭菌营养土的塑料营养钵(规格6.5cm×6.5cm)中，在温室中培养。白天维持在24～28℃，夜间在16～20℃。3次重复，每次重复30株。

按上述方法接种后7～10d进行病情调查。病情分级标准为：0级：无症状；1级：1片子叶黄化；2级：2片子叶黄化或萎蔫；3级：1片真叶轻度萎蔫；4级：1～2片真叶明显萎蔫；5级：全株严重萎蔫或枯死。其中2以下为抗病，3以上为感病类型。

对亲本及各群体的病情进行精确统计。

C、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的初步定位：

利用Cavagnaro等(Genome-wide characterization of simple sequencerepeats in cucumber,BMC Genomics,2010)发表的黄瓜高密度遗传图引物信息，结合90个RIL-F₈株系和130株的F_2:3群体病情指数的精确统计，对亲本和RIL群体进行分子标记分析，编码采集亲本及RILs群体各单株基因型数据。母本基因型记为A，父本的基因型记为B，F₁杂合基因型记为H，模糊或缺失数据记为U。用χ²test对数据进行比例适合性检验分析，采用JoinMap 4.0软件(Stam 1993；Van Ooijen 2001)构建连锁图谱(参见图2)，设置软件LOD阀值为4.0以及选取Kosambi公式(Kosambi 1944)，将黄瓜抗枯萎病基因初步定位在2号染色体的分子标记UW017820和UW084909之间的160kb区间内(参见图2)，根据Li等(RNA-Seqimproves annotation of protein-coding genes in the cucumber genome,BMCgenomics,2011)对黄瓜基因组的注释并通过Softberry在线软件进行预测，该区间存在一个由多个NBS-LRR抗病基因组成的NBS-LRR串联抗病基因(NBS-LRR为抗病基因保守结构域)，难以预测和选择候选基因，所以需要进一步扩大群体进行精细定位研究。

D、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的精细定位：

经过构建超过2000株的F₂大群体继续对抗枯萎病基因进行精细定位，同时，本实验室对所用抗感亲本进行了基因组重测序，经过生物信息比对分析，在双亲间开发了79560个Indel和108727个SNP分子标记，在初定位区间的160kb范围内选择设计了14对Indel分子标记(参见表1)进行群体分析，经过验证后利用这14对Indel标记对抗枯萎病基因进行了精细定位研究，其中引物的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，同样利用JoinMap4.0软件进行遗传连锁作图分析，最终在2000株的F₂大群体将抗枯萎病基因精细定位到分子标记UW017805和Indel2027634的25kb的范围内，在精细定位区间内近2300株的试验材料中存在1个交换单株。

采用上述14对Indel分子标记进行精细定位时的各PCR反应体系(10μL)如下：25ng模板DNA，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.2mM的dNTP mix；0.5U Taq DNA聚合酶，1×PCRBuffer(Fermentas)2μL，ddH2O补足到10μL。

PCR反应程序为：阶段1：95℃预变性3min；阶段2：94℃30s，60℃1min，72℃1min，退火温度每个循环降1℃，共8个循环；阶段3：94℃30s，53℃30s，72℃1min，共32个循环；阶段4：72℃延伸5min；阶段5:4℃保存；其中，PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti96well Thermal Cycler。

表1 用于精细定位的14对Indel分子标记引物信息

E、抗枯萎病基因预测分析：

在精细定位的25kb区间内，有2个基因，经过NCBI Blast在线比对分析，第1个基因为TIR NB-ARC抗病基因，第2个基因为bHLH96-like的转录因子相关基因。TIRNB-ARC是NBS-LRR类抗病基因中常见的保守结构域，因此定位该TIR NB-ARC基因是抗枯萎病的重要候选基因Foc-4。精细定位的结果排除了初定位区间中NBS-LRR串联抗病基因的干扰。Foc-4基因在抗/感材料间存在一个SNP，在基因的第3530位，抗病基因碱基为A，而感病基因碱基为G。推测该SNP可能导致抗病力的改变，可用于开发抗枯萎病紧密连锁分子标记，该TIR NB-ARC基因为枯萎病的抗病候选基因。

二、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4全长DNA序列的获得

A、供试材料：

所述的供试材料为抗病材料WI2757，以感病材料津研二号作为对照。

B、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的DNA全长的扩增：

黄瓜基因组DNA的提取采用CTAB法，以供试抗/感材料基因组DNA为模板，利用Foc-4基因全长扩增上下游引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8进行基因全长PCR扩增，经过序列拼接分别得到Foc-4基因在抗/感材料上的基因全长SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，全长均计4677bp。利用DNAMAN软件对抗/感材料的Foc-4基因全长进行比对分析，发现在抗/感材料间Foc-4基因的第3530位存在一个SNP，抗病材料中碱基为A，而感病材料中碱基为G。该SNP可做为抗枯萎病紧密连锁的分子标记，应用于世界范围内的黄瓜枯萎病抗病育种。

所述的PCR扩增反应的反应体系(20μL)中含有：25ng模板DNA，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.2mM的dNTP mix；0.5U Taq DNA聚合酶，1×PCR Buffer(Fermentas)2μL，ddH₂O补足到20μL。

所述的PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃30s，60℃1min，72℃4min，共42个循环；72℃延伸10min；PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti 96wellThermalCycler。

所述的扩增产物用灭菌的去离子水稀释至80μL，放入Caliper核酸自动分析仪进行分析。

上下游引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，DNA全长序列的PCR产物测序和序列拼接均在上海生工公司进行合成和分析。测序结果表明黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的全长DNA序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，共4677bp。

实施例2：黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4cDNA和蛋白序列鉴定分析

一、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的cDNA(mRNA)全长扩增：

利用抗感亲本材料WI2757和津研二号，分别选取幼嫩叶片组织提取总RNA，进行反转录合成mRNA的第一链(cDNA)，以该mRNA第一链为模板利用Foc-4基因的全长扩增上下游引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8进行PCR扩增，分别获取抗/感材料中的cDNA(mRNA)序列全长SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。利用DNAMAN软件对抗/感材料的Foc-4基因全长进行比对分析，发现在抗/感材料间Foc-4基因cDNA序列发生可变剪切，表现为在第5外显子上存在270bp的大小差异，参见图1。与感病材料相比，抗病材料的cDNA序列在1915-2184bp间表现为缺失。推测由于该可变剪切的存在导致基因重要结构域发生改变，从而导致TIR NB-ARC基因的抗病性发生变化。

所述的RNA提取、反转录试剂盒均购自Fermentas公司。

所述的PCR扩增反应的反应体系(50μL)中含有：25ng模板DNA，0.5μM上游引物，0.5μM下游引物，0.2mM的dNTP mix；0.5U Taq DNA聚合酶，1×PCR Buffer(Fermentas)5μl，ddH₂O补足到50μl。

所述的PCR反应程序为：95℃预变性3min；94℃30s，60℃1min，72℃2min，共40个循环；72℃延伸7min；PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti 96well ThermalCycler。

所述的Foc-4基因cDNA序列的PCR产物测序和序列拼接均在上海生工公司进行分析，其中抗病材料中的Foc-4基因的cDNA序列如SEQ ID NO:3所示，感病材料中的Foc-4基因的cDNA序列如SEQ ID NO:4。

二、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的编码蛋白的序列分析：

本发明涉及的黄瓜枯萎病抗病基因氨基酸序列是利用Foc-4基因在抗/感材料中的cDNA(mRNA)序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，分别经过softberry在线预测软件翻译而获得的，抗/感材料中FOC-4氨基酸(蛋白)序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，并利用DNAMAN软件氨基酸序列在抗/感材料中进行比对分析，发现FOC-4蛋白在抗/感病材料中存在90aa的差异，抗病材料的FOC-4氨基酸序列相对感病材料，在638-727aa间表现为缺失。因此推测该差异导致抗病结构域发生改变，从而导致TIRNB-ARC基因的抗病性发生变化。

实施例3：抗病基因Foc-4的功能验证及在选育黄瓜枯萎病抗病品种中应用

一、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的功能验证

1、待测材料：以WI2757和GY 14为亲本，构建F₂遗传群体，从中随机选取100个单株进行枯萎病抗病鉴定和测序。其中，父本WI2757和母本GY 14购自北京市农作物种质库。

2、将上述待测材料的种子用纱布包裹，温水浸种，28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中，在空调温室育苗，育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土，然后采用CTAB法从幼苗中提取各待测材料的基因组DNA，并以各基因组DNA为模板，利用上下游引物SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8进行Foc-4基因全长PCR扩增，然后将PCR产物测序并进行序列拼接，最终确认上述100份待测材料中有27株幼苗具有SEQ ID NO:1所示的Foc-4基因。所述PCR扩增参见实施例1第二部分。

3、对具有SEQ ID NO:1所示的Foc-4基因的幼苗进行枯萎病抗性检测

采用实施例1第一部分步骤B的方法对上述30株具有SEQ ID NO:1所示的Foc-4基因的黄瓜材料进行田间枯萎病抗性检测。

通过病情统计分析发现，上述具有SEQ ID NO:1所示的Foc-4基因的黄瓜苗中，病情均在2级以下，其中9株0级，10株1级、8株2级，由此说明，fox-4基因的存在与黄瓜抗枯萎病性状具有一致性。

二、遗传标记在选育黄瓜枯萎病抗病品种中应用

本发明利用实施例1得到的Foc-4基因在抗感材料中的SNP位点，依据dCAPs引物在线设计网站http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html，开发设计与抗/感枯萎病紧密连锁的dCAPs分子标记，其中正向和反向扩增引物分别为：SEQ ID NO:9(GATATGTTACAGTACTGTACCCAGTCGA)和SEQ ID NO:10(CTAGTAGTGTTAAGGGCTTTGAGCAGTT)。通过该引物对双亲材料(抗病材料WI2757和感病材料津研二号)进行PCR扩增，并结合SalI内切酶对PCR产物酶切，分别获得抗/感病特异条带，其中抗病条带为164bp，而感病条带为134bp。

本部分的PCR反应体系和程序参照实施例1第一部分的步骤D；酶切体系(20μL)中含有：10×NEB缓冲液2μl，PCR扩增产物10μl，100×BSA 0.2μL，内切酶SalI 0.5μL，灭菌双蒸水补足到20μL。酶切反应程序为：阶段1：37℃温育10h；阶段2：65℃20min失活；阶段3：4℃保存。

利用该dCAPs分子标记对实施例1的90个RIL-F₈株系、130株F_2:3群体株系和2000株F₂遗传群体中的黄瓜材料进行PCR和SalI酶切分析，并考察酶切结果与抗病表型(抗病表型检测参见实施例1的第一部分步骤B)的关系，发现Foc-4基因中的dCAPs分子标记与2220株黄瓜材料抗病表型紧密连锁，一致性达100％，达到共分离的水平，其酶切图参见图3。

上述内容充分证实了Foc-4基因及根据其SNP开发的dCAPs分子标记能够应用于枯萎病抗/感病筛选和分子辅助育种研究。

实施例4：不同遗传背景黄瓜材料抗/感枯萎病Foc-4基因的应用分析

一、为了充分验证Foc-4基因和其SNP的分子标记在不同遗传背景中的贡献率，本发明选择了10个材料，经过田间枯萎病生理小种4号抗病鉴定(抗病鉴定方法参见实施例1的第一部分步骤B)，发现5个抗枯萎病、5个感枯萎病(感病材料有：感病亲本津研二号，COOLGREEN MR 97232、GY 13、长春密刺和黄瓜测序材料9930；抗病材料有：抗病亲本WI2757，M 21、COUNTY FAIR F1、BANNA HUANGGUA、CUCUMIS HARDWICKII)，这10个材料均购自北京市农作物种质库。

本研究对10份黄瓜材料进行基因组重测序，经过生物信息比对分析，研究了包括抗/感亲本和黄瓜基因组测序材料9930在内的共10个材料Foc-4基因变异情况，发现Foc-4基因材料在不同抗感材料中的基因型因其遗传背景而异，Foc-4基因不仅在多个遗传背景材料中存在SNP大量变异，同时也存在大量Indel(***缺失)变异，参见表2。Foc-4基因的Indel和SNP变异在10个抗/感病材料中的基因型和表型存在一致性。

其中抗病材料WI2757，M 21和COUNTY FAIR F1中SNP5在抗病作用中发挥重要作用；而Foc-4基因在BANNA HUANGGUA和CUCUMIS HARDWICKII材料中因为Indel1-Indel3和SNP1-4，SNP6-13等变异，变成Foc-4基因的同源基因，同源率均约为99.6％，但仍具有枯萎病抗病性。

所述的基因组重测序和生物信息方法与实施例1中所用方法一致。

在下面的表2中，灰底表示INDEL和SNP变异，其中I：GTTTTTGTTTT表示此处存在11个碱基的***；D：TATATA表示此处存在6碱基缺失；SNP直接以变异碱基标识。

表2

二、BANNA HUANGGUA材料中抗病基因Foc-4的功能验证

BANNA HUANGGUA材料中抗病基因Foc-4与SEQ ID NO:1所示的Foc-4基因的区别之处均列于表2中，其他位点的核苷酸序列均相同。

1、待测材料：以BANNA HUANGGUA和津研二号为亲本，构建F2遗传群体，从中随机选取80个单株进行以下实验。其中，父本BANNA HUANGGUA和母本津研二号购自北京市农作物种质库。

2、将上述待测材料的种子用纱布包裹，温水浸种，28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中，在空调温室育苗，育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土，然后采用CTAB法从幼苗中提取各待测材料的基因组DNA，并以各基因组DNA为模板，利用上下游引物SEQID NO:7和SEQ IDNO:8进行Foc-4基因全长PCR扩增，然后将PCR产物测序并进行序列拼接，最终确认上述待测材料中有23株幼苗中具有抗病基因Foc-4。所述PCR扩增参见实施例1(二)。

3、对具有抗病基因Foc-4的幼苗进行枯萎病抗性检测

采用实施例1第一部分步骤B的方法对上述23株初步鉴定具有抗病性的黄瓜材料进行田间枯萎病抗性检测。

通过病情统计分析发现，上述23株初步鉴定具有抗病性的黄瓜材料病情均在2级以下，其中10株0级，8株1级、5株2级，由此说明，Foc-4基因的存在与黄瓜抗枯萎病性状具有一致性。

三、CUCUMIS HARDWICKII材料中抗病基因Foc-4的功能验证

CUCUMIS HARDWICKII材料中抗病基因Foc-4与SEQ ID NO:1所示的Foc-4

基因的区别之处均列于表2中，其他位点的核苷酸序列均相同。

1、待测材料：以CUCUMIS HARDWICKII和津研二号为亲本，构建F₂遗传群体，从中随机选取80个单株进行以下实验。其中，母本CUCUMIS HARDWICKII和父本津研二号购自北京市农作物种质库。

2、将上述待测材料的种子用纱布包裹，温水浸种，28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中，在空调温室育苗，育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土，然后采用CTAB法从幼苗中提取各待测材料的基因组DNA，并以各基因组DNA为模板，利用上下游引物SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8进行Foc-4基因全长PCR扩增，然后将PCR产物测序并进行序列拼接，最终确认上述待测材料中有19株幼苗中具有抗病基因Foc-4。所述PCR扩增参见实施例1(二)。

3、对具有抗病基因Foc-4的幼苗进行枯萎病抗性检测

采用实施例1第一部分步骤B的方法对上述19株初步鉴定具有抗病性的黄瓜材料进行田间枯萎病抗性检测。

通过病情统计分析发现，上述19株初步鉴定具有抗病性的黄瓜材料的病情均在2级以下，其中9株0级，7株1级、3株2级，由此说明，Foc-4基因的存在与黄瓜抗枯萎病性状具有一致性。

四、根据Qi等(A genomic variation map provides insights into thegenetic basis of cucumber domestication and diversit_y，Nature Genetics，2013)报道的黄瓜基因组变异发现，在115份黄瓜材料中Foc-4基因内共有57个SNP位点，100多个Indel变异则更为广泛。经过分析其中部分印度黄瓜的序列，发现Foc-4基因在印度黄瓜材料中发生很大变异，如印度黄瓜Hw1发生了32个SNP，3个INDEL，其序列参见SEQ ID NO:11，与SEQ ID NO:1相比同源性仅为91.4％，与经过田间抗病性鉴定(抗病鉴定方法参见实施例1的第一部分步骤B)发现该印度材料仍具有抗病性，证明与Foc-4基因同源性为91.4％的印度黄瓜材料Foc-4基因具备枯萎病抗病性。

下面对印度黄瓜Hw1中的抗病基因Foc-4的功能验证

1)待测材料：将印度黄瓜Hw1与津研二号作为亲本，构建F₂遗传群体，从中随机选取80个单株进行以下实验。其中，母本印度黄瓜Hw1与父本津研二号购自北京市农作物种质库。

2)将上述待测材料的种子用纱布包裹，温水浸种，28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中，在空调温室育苗，育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土，然后采用CTAB法从幼苗中提取各待测材料的基因组DNA，并以各基因组DNA为模板，利用上下游引物SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8进行Foc-4基因全长PCR扩增，然后将PCR产物测序并进行序列拼接，最终确认上述待测材料中有34株幼苗中具有抗病基因Foc-4。所述PCR扩增参见实施例1(二)。

3、对具有抗病基因Foc-4的幼苗进行枯萎病抗性检测

采用实施例1第一部分步骤B的方法对上述34株初步鉴定具有抗病性的黄瓜材料进行田间枯萎病抗性检测。

通过病情统计分析发现，上述34株初步鉴定具有抗病性的黄瓜材料的病情均在2级以下，其中15株0级，15株1级、4株2级，由此说明，Foc-4基因的存在与黄瓜抗枯萎病性状具有一致性。

实施例5：黄瓜枯萎病抗病与抗黑星病Ccu基因紧密连锁分析

对实施例1中的90个RIL-F8株系和130株的F2:3群体进行枯萎病和黑星病病情指数的精确统计(其中，枯萎病的病情指数统计参见实施例1第一部分步骤B，黑星病病情指数统计方法如下所述)，利用Cavagnaro等发表的黄瓜高密度遗传图引物信息，对亲本和RILs群体进行分子标记分析，并编码采集亲本及RILs群体各单株基因型数据。对比研究黄瓜植株的黑星病和枯萎病病情指数，发现在220份材料中，黑星病和枯萎病的表型仅在编号117和125植株材料中表现不同，编号117黑星病和枯萎病的病情为0和4，编号125黑星病和枯萎病的病情为5和1，其余均一致。这一研究表明枯萎病和黑星病的抗病基因存在紧密连锁关系，但不是同一个基因。

其中，黑星病采用离体子叶点滴法进行苗期人工接种。当黄瓜子叶展平时剪下子叶，用移液枪点滴浓度为1×10⁶～5×10⁶孢子/ml的接种液1滴(约0.02ml)于子叶中央，置于培养皿中保湿，20℃培养箱中培养。接种后7～10d进行抗性评价。

黑星病病情调查与分级标准：

0级：无症状；1级：接种点产生很小坏死斑点；2级：接种点形成未扩展坏死斑；3级：接种点形成扩展坏死斑，扩展斑被黄色晕圈包围；4级：接种点形成扩展斑，且病斑上有大量霉层产生；5级：子叶溃烂。

其中2以下为抗病，3以上为感病类型。

所以，同样采用JoinMap 4.0软件对黑星病抗病基因进行遗传连锁分析，最终把黄瓜抗黑星病基因初步定位在与枯萎病同一个区间范围内(UW017820和UW084909的160kb)，参见图2。

总之，根据枯萎病抗病功能基因Foc-4验证结果的可靠性，以及枯萎病和黑星病初定位在同一区间，而且该遗传距离范围仅为0.5cm，区间仅有5个基因。所以，Foc-4基因及其SNP标记能够代表该区间的基因型。同时，在220株黄瓜材料中黑星病的表型和Foc-4基因SNP基因型有218株完全相同，一致率达99％。因此Foc-4基因及其SNP标记与抗黑星病Ccu基因紧密连锁，可以应用Foc-4基因及其SNP标记进行黄瓜抗/感黑星病筛选。

Claims (8)

1.黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4，(a)为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

2.一种与黄瓜枯萎病相关的遗传标记，所述遗传标记为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其中，第3530位的碱基A是由G突变而成的。

3.权利要求1(a)所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的cDNA序列，为序列表中SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列。

4.权利要求1(a)所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的编码蛋白，为序列表中的SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列。

5.权利要求1所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4或者权利要求3所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的cDNA在选育黄瓜枯萎病抗病品种中的应用。

6.权利要求2所述的遗传标记在选育黄瓜枯萎病抗病品种中的应用。

7.权利要求1所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4在选育黄瓜黑星病抗病品种中的应用。

8.权利要求2所述的遗传标记在选育黄瓜黑星病抗病品种中的应用。