CN103882032B - 黄瓜枯萎病抗病基因Foc‑4及其编码蛋白和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄瓜枯萎病抗病基因Foc‑4及其编码蛋白和应用。该基因为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明提供的抗病基因Foc‑4具有重要的应用价值,可根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记或其紧密连锁标记,用这些标记可鉴定黄瓜及后代植株的基因型,用于分子标记辅助选择育种,从而提高育种效率;另外,本发明的黄瓜枯萎病抗病基因Foc‑4还可以用于选育黄瓜黑星病抗病品种。
Description
技术领域
本发明属于基因序列和应用领域,具体涉及黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4及其编码蛋白和应用。
背景技术
黄瓜(Cucumis Sativus.L)在世界上广泛栽培,中国是世界上黄瓜栽培面积最大、总产量最高的国家。
黄瓜枯萎病(Fusarium Wilt),又名萎蔫病、蔓割病、死秧病,是一种由土壤传染,从根或根颈部侵入,在维管束内寄生的***性病害(导管型枯萎病),是黄瓜生产上较难防治的三大病害之一,常造成较大损失,是目前世界各地黄瓜,特别是温室和其他保护地黄瓜的主要土传病害,该病菌在土壤、病株残体及未腐熟的农家肥中或附着在种子上越冬,成为翌年初侵染源,可借助雨水、灌溉水等进行远距离传播,一般年份可使黄瓜产量损失25%-35%,严重发病时可使黄瓜绝产。枯萎病采用化学防治效果不理想,不仅使生产投入增加且会造成环境安全隐患,倒茬嫁接虽常用于防控但增添技术困难和劳动成本。因此选育抗病品种是解决枯萎病危害的最佳途径。
黄瓜枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌黄瓜专化型(Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen.),属半知菌类真菌。病菌产生大小两种类型分生孢子,大型分生孢子纺锤形或镰刀形,无色透明,顶细胞圆锥形,有的微呈钩状,基部倒圆锥截形或足细胞,具隔膜1~3个。小型分生孢子多生于气生菌丝中,椭圆形或腊肠形,无色透明,无隔膜。厚垣孢子表面光滑,黄褐色。因各地菌株间致病性不同,可以区分出不同生理小种,国外有生理小种1号、2号和3号,我国黄瓜枯萎病菌的致病性与国外不同,命名为生理小种4号。
克隆基因是寻找与目标性状连锁的分子标记最重要的应用之一。图位克隆(Map-based cloning)是利用分子遗传图谱,把目标性状和分子标记通过遗传连锁作图联系起来,把目标基因定位在与之连锁非常紧密的侧翼标记之间;也可以用群体分离分析法(BSA法)或近等基因系法得到与目标基因连锁的分子标记,然后利用作图群体把该分子标记定位到图谱上。从而由这些标记去筛选大片段DNA文库,鉴定出与标记有关的克隆,继之以亚克隆和染色体步移(Chromosome walking)形式获得含有目的基因的克隆片段,最终再辅之以转化和互补测验加以验证(王永飞,2001)。目前,运用基于图位克隆技术已分离到了大量的植物基因,尤其是与抗病有关的基因(Zeng ZB,1994;易小麦,1998),但未见有关黄瓜枯萎病生理小种4的抗病基因被成功分离克隆的报道。
发明内容
针对现有技术的缺陷,本发明的目的之一在于提供一种黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4。
本发明的目的之二在于提供一种上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的遗传标记。
本发明的目的之三在于提供用于扩增上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的一对引物。
本发明的目的之四在于提供一种上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的cDNA序列。
本发明的目的之五在于提供一种上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的编码蛋白。
本发明的目的之六在于提供一种上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4及遗传标记的应用。
为了实现上述目的,本发明采用了以下技术方案:
黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4,(a)为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列,(b)为与序列表中SEQ ID NO:1所示序列90%以上同源性且具有与序列表中SEQ ID NO:1所示序列相同功能的核苷酸序列。
本发明涉及的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4是利用抗感遗传群体进行精细定位克隆获得的。本发明选择经典抗病材料WI2757和重要骨干亲本感病材料津研二号,构建RILs-F8、F2:3和F2遗传群体,对抗病基因进行初步定位和精细定位,抗枯萎病基因精细定位在2号染色体的25kb区间范围内,该区间仅存在2个基因,经过NCBI Blast在线比对分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/),第1个基因为TIR NB-ARC抗病基因,第2个基因为bHLH96-like的转录因子相关基因。众所周知,TIR NB-ARC基因具有保守结构域是典型的NBS-LRR类抗病基因,因此推测该TIR NB-ARC基因是抗枯萎病的重要候选基因Foc-4,其DNA序列是通过对精细定位区间内的基因序列进行测序获得的。
上述SEQ ID NO:1所示的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的遗传标记,感病基因的第3530位的碱基G突变为碱基A。
用于扩增上述SEQ ID NO:1所示黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的一对引物,分别具有序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
本发明根据已公布的黄瓜基因组9930和GY14序列信息,结合利用Softberry在线预测软件FGENESH(http://sunl.softberry.com/)预测基因结构,并根据预测结果的起始和终止编码序列,设计基因全长扩增引物一对分别为:序列表中SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列,分别利用抗/感材料基因组DNA进行PCR扩增,获得抗/感材料中基因Foc-4的DNA全长序列SEQ ID NO:1(抗病材料)和SEQ ID NO:2(感病材料),全长4677bp,并对抗感材料中的两个基因DNA序列进行对比和分析,Foc-4DNA序列在抗/感材料中存在一个SNP位点,即在该基因的第3530位,感病材料的碱基为G,抗病材料的碱基为A,其可以应用于开发抗枯萎病分子标记。
上述SEQ ID NO:1所示黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的cDNA序列为序列表中SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列。
本发明涉及的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4cDNA(mRNA)序列是利用全长引物SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8作为上下游引物以抗/感材料的总RNA反转录后第一链作为模板进行PCR扩增获得的抗/感材料中的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的cDNA,在抗/感材料中的基因Foc-4的cDNA(mRNA)序列全长分别为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4,利用Softberry在线预测Foc-4序列,获得cDNA结构,并绘制Foc-4基因的结构示意图(参见图1)。通过SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4序列的对比,黄瓜抗枯萎病基因Foc-4的cDNA(mRNA)在抗/感材料中存在可变剪切差异,导致Foc-4的cDNA在感病材料中的第5外显子比在抗病材料中大270bp,推测由于该可变剪切的存在导致基因重要结构域发生改变,从而导致TIR NB-ARC基因的抗病性发生变化。
上述SEQ ID NO:1所示黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的编码蛋白为序列表中的SEQID NO:5所示的氨基酸序列。
本发明涉及的黄瓜枯萎病抗病基因氨基酸序列是利用Foc-4基因在抗/感材料中的cDNA(mRNA)序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4,分别经过softberry在线预测软件翻译获得抗/感材料中FOC-4氨基酸(蛋白)序列SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6,并对抗/感材料中的FOC-4氨基酸序列进行比对分析,FOC-4在抗/感病材料中存在90aa的差异,推测该差异导致抗病结构域发生改变,从而导致TIR NB-ARC基因的抗病性发生变化。
上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4在选育黄瓜枯萎病抗病品种中的应用。
上述遗传标记在选育黄瓜枯萎病抗病品种中的应用。
上述黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4在选育黄瓜黑星病抗病品种中的应用。
上述遗传标记在选育黄瓜黑星病抗病品种中的应用。
本发明具有如下有益效果:
本发明利用图位克隆和正向遗传学方法,对黄瓜枯萎病生理小种4的抗病基因Foc-4进行精细定位和克隆,获得黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4,并研究该基因在抗/感病材料中的核酸序列和氨基酸序列进行分析和比对,获得黄瓜抗枯萎病基因Foc-4在抗/感病材料中差异和多态性分析,并验证了该枯萎病抗病基因Foc-4的功能。本发明提供的抗病基因Foc-4具有重要的应用价值,可根据所述基因序列信息产生特异性的分子标记或其紧密连锁标记,包括但不限于SNP(单核苷酸多态)、InDel(***缺失多态)、RFLP(限制性内切酶长度多态)、CAP(切割扩增片段多态),用这些标记可鉴定黄瓜及后代植株的基因型,用于分子标记辅助选择育种,从而提高育种效率;另外,本发明的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4还可以用于选育黄瓜黑星病抗病品种。
附图说明
图1是黄瓜枯萎病基因精细定位区间基因Foc-4结构示意图。图1(A)和图1(B)分别为抗/感材料中基因Foc-4的结构示意图,抗病Foc-4基因在抗/感材料中的第5外显子的大小存在差异。(Foc-4基因在染色体基因组上是反向***的,因此图中显示的第3外显子实际为Foc-4基因的第5外显子)。
图2是黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4定位连锁图谱,其中左图为黄瓜枯萎病基因初定位示意图,中图为枯萎病抗病基因精细定位示意图,右图为25kb区间范围内基因分布情况及基因注释。
图3是Foc-4基因SNP分子标记酶切验证结果示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明,但本发明并不限于此。
实施例1:黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的获得
一、黄瓜枯萎病生理小种4的抗病基因Foc-4初步定位和精细定位
具体的定位方法包括以下步骤:
A、黄瓜枯萎病抗病基因定位研究亲本及遗传群体:
分别选择WI2757(父本)和津研二号(母本)为抗感亲本,构建90个RIL-F8株系,130株的F2:3群体和超过2000株的F2大群体。其中,父本WI2757和母本津研二号购自北京市农作物种质资源库。
B、黄瓜枯萎病抗病基因定位研究病情指数调查:
将亲本及各群体的种子用纱布包裹,温汤浸种,28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中,在空调温室育苗,育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土。
供试菌种黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum Owen.)生理小种4号是通过黄仲生等的中国黄瓜枯萎病菌生理小种鉴定及防治文献(中国黄瓜枯萎病菌生理小种鉴定及防治,华北农学报,1994,9(4):81-86)中记载的方法分离获得。采用翁祖信等(黄瓜枯萎病抗病性鉴定方法研究—胚根接种法,中国蔬菜,1985年02期)的方法制备黄瓜枯萎病菌液,血球计数板测定孢子浓度。采用浸根接种法:当黄瓜幼苗子叶展平时,拔出幼苗,用水洗净根部,在1×106~5×106个孢子/mL的接种液中浸根,然后栽入装有灭菌营养土的塑料营养钵(规格6.5cm×6.5cm)中,在温室中培养。白天维持在24~28℃,夜间在16~20℃。3次重复,每次重复30株。
按上述方法接种后7~10d进行病情调查。病情分级标准为:0级:无症状;1级:1片子叶黄化;2级:2片子叶黄化或萎蔫;3级:1片真叶轻度萎蔫;4级:1~2片真叶明显萎蔫;5级:全株严重萎蔫或枯死。其中2以下为抗病,3以上为感病类型。
对亲本及各群体的病情进行精确统计。
C、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的初步定位:
利用Cavagnaro等(Genome-wide characterization of simple sequencerepeats in cucumber,BMC Genomics,2010)发表的黄瓜高密度遗传图引物信息,结合90个RIL-F8株系和130株的F2:3群体病情指数的精确统计,对亲本和RIL群体进行分子标记分析,编码采集亲本及RILs群体各单株基因型数据。母本基因型记为A,父本的基因型记为B,F1杂合基因型记为H,模糊或缺失数据记为U。用χ2test对数据进行比例适合性检验分析,采用JoinMap 4.0软件(Stam 1993;Van Ooijen 2001)构建连锁图谱(参见图2),设置软件LOD阀值为4.0以及选取Kosambi公式(Kosambi 1944),将黄瓜抗枯萎病基因初步定位在2号染色体的分子标记UW017820和UW084909之间的160kb区间内(参见图2),根据Li等(RNA-Seqimproves annotation of protein-coding genes in the cucumber genome,BMCgenomics,2011)对黄瓜基因组的注释并通过Softberry在线软件进行预测,该区间存在一个由多个NBS-LRR抗病基因组成的NBS-LRR串联抗病基因(NBS-LRR为抗病基因保守结构域),难以预测和选择候选基因,所以需要进一步扩大群体进行精细定位研究。
D、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的精细定位:
经过构建超过2000株的F2大群体继续对抗枯萎病基因进行精细定位,同时,本实验室对所用抗感亲本进行了基因组重测序,经过生物信息比对分析,在双亲间开发了79560个Indel和108727个SNP分子标记,在初定位区间的160kb范围内选择设计了14对Indel分子标记(参见表1)进行群体分析,经过验证后利用这14对Indel标记对抗枯萎病基因进行了精细定位研究,其中引物的合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成,同样利用JoinMap4.0软件进行遗传连锁作图分析,最终在2000株的F2大群体将抗枯萎病基因精细定位到分子标记UW017805和Indel2027634的25kb的范围内,在精细定位区间内近2300株的试验材料中存在1个交换单株。
采用上述14对Indel分子标记进行精细定位时的各PCR反应体系(10μL)如下:25ng模板DNA,0.5μM上游引物,0.5μM下游引物,0.2mM的dNTP mix;0.5U Taq DNA聚合酶,1×PCRBuffer(Fermentas)2μL,ddH2O补足到10μL。
PCR反应程序为:阶段1:95℃预变性3min;阶段2:94℃30s,60℃1min,72℃1min,退火温度每个循环降1℃,共8个循环;阶段3:94℃30s,53℃30s,72℃1min,共32个循环;阶段4:72℃延伸5min;阶段5:4℃保存;其中,PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti96well Thermal Cycler。
表1 用于精细定位的14对Indel分子标记引物信息
E、抗枯萎病基因预测分析:
在精细定位的25kb区间内,有2个基因,经过NCBI Blast在线比对分析,第1个基因为TIR NB-ARC抗病基因,第2个基因为bHLH96-like的转录因子相关基因。TIRNB-ARC是NBS-LRR类抗病基因中常见的保守结构域,因此定位该TIR NB-ARC基因是抗枯萎病的重要候选基因Foc-4。精细定位的结果排除了初定位区间中NBS-LRR串联抗病基因的干扰。Foc-4基因在抗/感材料间存在一个SNP,在基因的第3530位,抗病基因碱基为A,而感病基因碱基为G。推测该SNP可能导致抗病力的改变,可用于开发抗枯萎病紧密连锁分子标记,该TIR NB-ARC基因为枯萎病的抗病候选基因。
二、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4全长DNA序列的获得
A、供试材料:
所述的供试材料为抗病材料WI2757,以感病材料津研二号作为对照。
B、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的DNA全长的扩增:
黄瓜基因组DNA的提取采用CTAB法,以供试抗/感材料基因组DNA为模板,利用Foc-4基因全长扩增上下游引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8进行基因全长PCR扩增,经过序列拼接分别得到Foc-4基因在抗/感材料上的基因全长SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2,全长均计4677bp。利用DNAMAN软件对抗/感材料的Foc-4基因全长进行比对分析,发现在抗/感材料间Foc-4基因的第3530位存在一个SNP,抗病材料中碱基为A,而感病材料中碱基为G。该SNP可做为抗枯萎病紧密连锁的分子标记,应用于世界范围内的黄瓜枯萎病抗病育种。
所述的PCR扩增反应的反应体系(20μL)中含有:25ng模板DNA,0.5μM上游引物,0.5μM下游引物,0.2mM的dNTP mix;0.5U Taq DNA聚合酶,1×PCR Buffer(Fermentas)2μL,ddH2O补足到20μL。
所述的PCR反应程序为:95℃预变性3min;94℃30s,60℃1min,72℃4min,共42个循环;72℃延伸10min;PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti 96wellThermalCycler。
所述的扩增产物用灭菌的去离子水稀释至80μL,放入Caliper核酸自动分析仪进行分析。
上下游引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8,DNA全长序列的PCR产物测序和序列拼接均在上海生工公司进行合成和分析。测序结果表明黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的全长DNA序列如序列表中SEQ ID NO:1所示,共4677bp。
实施例2:黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4cDNA和蛋白序列鉴定分析
一、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的cDNA(mRNA)全长扩增:
利用抗感亲本材料WI2757和津研二号,分别选取幼嫩叶片组织提取总RNA,进行反转录合成mRNA的第一链(cDNA),以该mRNA第一链为模板利用Foc-4基因的全长扩增上下游引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8进行PCR扩增,分别获取抗/感材料中的cDNA(mRNA)序列全长SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。利用DNAMAN软件对抗/感材料的Foc-4基因全长进行比对分析,发现在抗/感材料间Foc-4基因cDNA序列发生可变剪切,表现为在第5外显子上存在270bp的大小差异,参见图1。与感病材料相比,抗病材料的cDNA序列在1915-2184bp间表现为缺失。推测由于该可变剪切的存在导致基因重要结构域发生改变,从而导致TIR NB-ARC基因的抗病性发生变化。
所述的RNA提取、反转录试剂盒均购自Fermentas公司。
所述的PCR扩增反应的反应体系(50μL)中含有:25ng模板DNA,0.5μM上游引物,0.5μM下游引物,0.2mM的dNTP mix;0.5U Taq DNA聚合酶,1×PCR Buffer(Fermentas)5μl,ddH2O补足到50μl。
所述的PCR反应程序为:95℃预变性3min;94℃30s,60℃1min,72℃2min,共40个循环;72℃延伸7min;PCR仪为购自Applied Biosystems公司的Veriti 96well ThermalCycler。
所述的Foc-4基因cDNA序列的PCR产物测序和序列拼接均在上海生工公司进行分析,其中抗病材料中的Foc-4基因的cDNA序列如SEQ ID NO:3所示,感病材料中的Foc-4基因的cDNA序列如SEQ ID NO:4。
二、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的编码蛋白的序列分析:
本发明涉及的黄瓜枯萎病抗病基因氨基酸序列是利用Foc-4基因在抗/感材料中的cDNA(mRNA)序列SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4,分别经过softberry在线预测软件翻译而获得的,抗/感材料中FOC-4氨基酸(蛋白)序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示,并利用DNAMAN软件氨基酸序列在抗/感材料中进行比对分析,发现FOC-4蛋白在抗/感病材料中存在90aa的差异,抗病材料的FOC-4氨基酸序列相对感病材料,在638-727aa间表现为缺失。因此推测该差异导致抗病结构域发生改变,从而导致TIRNB-ARC基因的抗病性发生变化。
实施例3:抗病基因Foc-4的功能验证及在选育黄瓜枯萎病抗病品种中应用
一、黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的功能验证
1、待测材料:以WI2757和GY 14为亲本,构建F2遗传群体,从中随机选取100个单株进行枯萎病抗病鉴定和测序。其中,父本WI2757和母本GY 14购自北京市农作物种质库。
2、将上述待测材料的种子用纱布包裹,温水浸种,28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中,在空调温室育苗,育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土,然后采用CTAB法从幼苗中提取各待测材料的基因组DNA,并以各基因组DNA为模板,利用上下游引物SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8进行Foc-4基因全长PCR扩增,然后将PCR产物测序并进行序列拼接,最终确认上述100份待测材料中有27株幼苗具有SEQ ID NO:1所示的Foc-4基因。所述PCR扩增参见实施例1第二部分。
3、对具有SEQ ID NO:1所示的Foc-4基因的幼苗进行枯萎病抗性检测
采用实施例1第一部分步骤B的方法对上述30株具有SEQ ID NO:1所示的Foc-4基因的黄瓜材料进行田间枯萎病抗性检测。
通过病情统计分析发现,上述具有SEQ ID NO:1所示的Foc-4基因的黄瓜苗中,病情均在2级以下,其中9株0级,10株1级、8株2级,由此说明,fox-4基因的存在与黄瓜抗枯萎病性状具有一致性。
二、遗传标记在选育黄瓜枯萎病抗病品种中应用
本发明利用实施例1得到的Foc-4基因在抗感材料中的SNP位点,依据dCAPs引物在线设计网站http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html,开发设计与抗/感枯萎病紧密连锁的dCAPs分子标记,其中正向和反向扩增引物分别为:SEQ ID NO:9(GATATGTTACAGTACTGTACCCAGTCGA)和SEQ ID NO:10(CTAGTAGTGTTAAGGGCTTTGAGCAGTT)。通过该引物对双亲材料(抗病材料WI2757和感病材料津研二号)进行PCR扩增,并结合SalI内切酶对PCR产物酶切,分别获得抗/感病特异条带,其中抗病条带为164bp,而感病条带为134bp。
本部分的PCR反应体系和程序参照实施例1第一部分的步骤D;酶切体系(20μL)中含有:10×NEB缓冲液2μl,PCR扩增产物10μl,100×BSA 0.2μL,内切酶SalI 0.5μL,灭菌双蒸水补足到20μL。酶切反应程序为:阶段1:37℃温育10h;阶段2:65℃20min失活;阶段3:4℃保存。
利用该dCAPs分子标记对实施例1的90个RIL-F8株系、130株F2:3群体株系和2000株F2遗传群体中的黄瓜材料进行PCR和SalI酶切分析,并考察酶切结果与抗病表型(抗病表型检测参见实施例1的第一部分步骤B)的关系,发现Foc-4基因中的dCAPs分子标记与2220株黄瓜材料抗病表型紧密连锁,一致性达100%,达到共分离的水平,其酶切图参见图3。
上述内容充分证实了Foc-4基因及根据其SNP开发的dCAPs分子标记能够应用于枯萎病抗/感病筛选和分子辅助育种研究。
实施例4:不同遗传背景黄瓜材料抗/感枯萎病Foc-4基因的应用分析
一、为了充分验证Foc-4基因和其SNP的分子标记在不同遗传背景中的贡献率,本发明选择了10个材料,经过田间枯萎病生理小种4号抗病鉴定(抗病鉴定方法参见实施例1的第一部分步骤B),发现5个抗枯萎病、5个感枯萎病(感病材料有:感病亲本津研二号,COOLGREEN MR 97232、GY 13、长春密刺和黄瓜测序材料9930;抗病材料有:抗病亲本WI2757,M 21、COUNTY FAIR F1、BANNA HUANGGUA、CUCUMIS HARDWICKII),这10个材料均购自北京市农作物种质库。
本研究对10份黄瓜材料进行基因组重测序,经过生物信息比对分析,研究了包括抗/感亲本和黄瓜基因组测序材料9930在内的共10个材料Foc-4基因变异情况,发现Foc-4基因材料在不同抗感材料中的基因型因其遗传背景而异,Foc-4基因不仅在多个遗传背景材料中存在SNP大量变异,同时也存在大量Indel(***缺失)变异,参见表2。Foc-4基因的Indel和SNP变异在10个抗/感病材料中的基因型和表型存在一致性。
其中抗病材料WI2757,M 21和COUNTY FAIR F1中SNP5在抗病作用中发挥重要作用;而Foc-4基因在BANNA HUANGGUA和CUCUMIS HARDWICKII材料中因为Indel1-Indel3和SNP1-4,SNP6-13等变异,变成Foc-4基因的同源基因,同源率均约为99.6%,但仍具有枯萎病抗病性。
所述的基因组重测序和生物信息方法与实施例1中所用方法一致。
在下面的表2中,灰底表示INDEL和SNP变异,其中I:GTTTTTGTTTT表示此处存在11个碱基的***;D:TATATA表示此处存在6碱基缺失;SNP直接以变异碱基标识。
表2
二、BANNA HUANGGUA材料中抗病基因Foc-4的功能验证
BANNA HUANGGUA材料中抗病基因Foc-4与SEQ ID NO:1所示的Foc-4基因的区别之处均列于表2中,其他位点的核苷酸序列均相同。
1、待测材料:以BANNA HUANGGUA和津研二号为亲本,构建F2遗传群体,从中随机选取80个单株进行以下实验。其中,父本BANNA HUANGGUA和母本津研二号购自北京市农作物种质库。
2、将上述待测材料的种子用纱布包裹,温水浸种,28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中,在空调温室育苗,育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土,然后采用CTAB法从幼苗中提取各待测材料的基因组DNA,并以各基因组DNA为模板,利用上下游引物SEQID NO:7和SEQ IDNO:8进行Foc-4基因全长PCR扩增,然后将PCR产物测序并进行序列拼接,最终确认上述待测材料中有23株幼苗中具有抗病基因Foc-4。所述PCR扩增参见实施例1(二)。
3、对具有抗病基因Foc-4的幼苗进行枯萎病抗性检测
采用实施例1第一部分步骤B的方法对上述23株初步鉴定具有抗病性的黄瓜材料进行田间枯萎病抗性检测。
通过病情统计分析发现,上述23株初步鉴定具有抗病性的黄瓜材料病情均在2级以下,其中10株0级,8株1级、5株2级,由此说明,Foc-4基因的存在与黄瓜抗枯萎病性状具有一致性。
三、CUCUMIS HARDWICKII材料中抗病基因Foc-4的功能验证
CUCUMIS HARDWICKII材料中抗病基因Foc-4与SEQ ID NO:1所示的Foc-4
基因的区别之处均列于表2中,其他位点的核苷酸序列均相同。
1、待测材料:以CUCUMIS HARDWICKII和津研二号为亲本,构建F2遗传群体,从中随机选取80个单株进行以下实验。其中,母本CUCUMIS HARDWICKII和父本津研二号购自北京市农作物种质库。
2、将上述待测材料的种子用纱布包裹,温水浸种,28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中,在空调温室育苗,育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土,然后采用CTAB法从幼苗中提取各待测材料的基因组DNA,并以各基因组DNA为模板,利用上下游引物SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8进行Foc-4基因全长PCR扩增,然后将PCR产物测序并进行序列拼接,最终确认上述待测材料中有19株幼苗中具有抗病基因Foc-4。所述PCR扩增参见实施例1(二)。
3、对具有抗病基因Foc-4的幼苗进行枯萎病抗性检测
采用实施例1第一部分步骤B的方法对上述19株初步鉴定具有抗病性的黄瓜材料进行田间枯萎病抗性检测。
通过病情统计分析发现,上述19株初步鉴定具有抗病性的黄瓜材料的病情均在2级以下,其中9株0级,7株1级、3株2级,由此说明,Foc-4基因的存在与黄瓜抗枯萎病性状具有一致性。
四、根据Qi等(A genomic variation map provides insights into thegenetic basis of cucumber domestication and diversity,Nature Genetics,2013)报道的黄瓜基因组变异发现,在115份黄瓜材料中Foc-4基因内共有57个SNP位点,100多个Indel变异则更为广泛。经过分析其中部分印度黄瓜的序列,发现Foc-4基因在印度黄瓜材料中发生很大变异,如印度黄瓜Hw1发生了32个SNP,3个INDEL,其序列参见SEQ ID NO:11,与SEQ ID NO:1相比同源性仅为91.4%,与经过田间抗病性鉴定(抗病鉴定方法参见实施例1的第一部分步骤B)发现该印度材料仍具有抗病性,证明与Foc-4基因同源性为91.4%的印度黄瓜材料Foc-4基因具备枯萎病抗病性。
下面对印度黄瓜Hw1中的抗病基因Foc-4的功能验证
1)待测材料:将印度黄瓜Hw1与津研二号作为亲本,构建F2遗传群体,从中随机选取80个单株进行以下实验。其中,母本印度黄瓜Hw1与父本津研二号购自北京市农作物种质库。
2)将上述待测材料的种子用纱布包裹,温水浸种,28℃恒温催芽后播于50孔穴盘中,在空调温室育苗,育苗基质为灭菌的珍珠岩或营养土,然后采用CTAB法从幼苗中提取各待测材料的基因组DNA,并以各基因组DNA为模板,利用上下游引物SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8进行Foc-4基因全长PCR扩增,然后将PCR产物测序并进行序列拼接,最终确认上述待测材料中有34株幼苗中具有抗病基因Foc-4。所述PCR扩增参见实施例1(二)。
3、对具有抗病基因Foc-4的幼苗进行枯萎病抗性检测
采用实施例1第一部分步骤B的方法对上述34株初步鉴定具有抗病性的黄瓜材料进行田间枯萎病抗性检测。
通过病情统计分析发现,上述34株初步鉴定具有抗病性的黄瓜材料的病情均在2级以下,其中15株0级,15株1级、4株2级,由此说明,Foc-4基因的存在与黄瓜抗枯萎病性状具有一致性。
实施例5:黄瓜枯萎病抗病与抗黑星病Ccu基因紧密连锁分析
对实施例1中的90个RIL-F8株系和130株的F2:3群体进行枯萎病和黑星病病情指数的精确统计(其中,枯萎病的病情指数统计参见实施例1第一部分步骤B,黑星病病情指数统计方法如下所述),利用Cavagnaro等发表的黄瓜高密度遗传图引物信息,对亲本和RILs群体进行分子标记分析,并编码采集亲本及RILs群体各单株基因型数据。对比研究黄瓜植株的黑星病和枯萎病病情指数,发现在220份材料中,黑星病和枯萎病的表型仅在编号117和125植株材料中表现不同,编号117黑星病和枯萎病的病情为0和4,编号125黑星病和枯萎病的病情为5和1,其余均一致。这一研究表明枯萎病和黑星病的抗病基因存在紧密连锁关系,但不是同一个基因。
其中,黑星病采用离体子叶点滴法进行苗期人工接种。当黄瓜子叶展平时剪下子叶,用移液枪点滴浓度为1×106~5×106孢子/ml的接种液1滴(约0.02ml)于子叶中央,置于培养皿中保湿,20℃培养箱中培养。接种后7~10d进行抗性评价。
黑星病病情调查与分级标准:
0级:无症状;1级:接种点产生很小坏死斑点;2级:接种点形成未扩展坏死斑;3级:接种点形成扩展坏死斑,扩展斑被黄色晕圈包围;4级:接种点形成扩展斑,且病斑上有大量霉层产生;5级:子叶溃烂。
其中2以下为抗病,3以上为感病类型。
所以,同样采用JoinMap 4.0软件对黑星病抗病基因进行遗传连锁分析,最终把黄瓜抗黑星病基因初步定位在与枯萎病同一个区间范围内(UW017820和UW084909的160kb),参见图2。
总之,根据枯萎病抗病功能基因Foc-4验证结果的可靠性,以及枯萎病和黑星病初定位在同一区间,而且该遗传距离范围仅为0.5cm,区间仅有5个基因。所以,Foc-4基因及其SNP标记能够代表该区间的基因型。同时,在220株黄瓜材料中黑星病的表型和Foc-4基因SNP基因型有218株完全相同,一致率达99%。因此Foc-4基因及其SNP标记与抗黑星病Ccu基因紧密连锁,可以应用Foc-4基因及其SNP标记进行黄瓜抗/感黑星病筛选。
Claims (8)
1.黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4,(a)为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.一种与黄瓜枯萎病相关的遗传标记,所述遗传标记为序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列,其中,第3530位的碱基A是由G突变而成的。
3.权利要求1(a)所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的cDNA序列,为序列表中SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列。
4.权利要求1(a)所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的编码蛋白,为序列表中的SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列。
5.权利要求1所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4或者权利要求3所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4的cDNA在选育黄瓜枯萎病抗病品种中的应用。
6.权利要求2所述的遗传标记在选育黄瓜枯萎病抗病品种中的应用。
7.权利要求1所述的黄瓜枯萎病抗病基因Foc-4在选育黄瓜黑星病抗病品种中的应用。
8.权利要求2所述的遗传标记在选育黄瓜黑星病抗病品种中的应用。
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