CN105132590B

CN105132590B - 一种牛传染性鼻气管炎病毒的lamp可视化检测方法

Info

Publication number: CN105132590B
Application number: CN201510665837.2A
Authority: CN
Inventors: 冯蒙; 于瑞嵩; 董世娟; 朱睿; 李震; 胡瑞丽
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-10-15
Filing date: 2015-10-15
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2035-10-15
Also published as: CN105132590A

Abstract

本发明涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒的LAMP可视化检测方法。具体而言，本发明提供选自SEQ ID NO:1－6的引物序列，或引物组合物。本发明还提供一种检测试剂盒及检测牛传染性鼻气管炎病毒的方法。采用本发明的引物、方法和/或试剂盒可快速、方便、特异、灵敏、经济、可视化地检测牛鼻拭子、血液或其它组织中IBRV，为基层现场检测提供便利。

Description

一种牛传染性鼻气管炎病毒的LAMP可视化检测方法

技术领域

本发明涉及牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）的分子生物学检测技术，具体而言，本发明涉及一种牛传染性鼻气管炎病毒的LAMP可视化检测方法。

背景技术

牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV），现称为牛疱疹病毒I型（BHV-1），是疱疹病毒科疱疹病毒甲亚科成员。病毒呈球形，带囊膜，成熟粒子直径约150-220nm，主要由核酸芯髓、衣壳和囊膜3部分组成，包含基因组的核衣壳为立体对称的正二十面体，周围为一层含脂质的囊膜，其基因组可编码约70个蛋白质，gB，gC，gD和gE四个主要精蛋白基因存在于囊膜内，gB蛋白包含2个T细胞抗原表位、3个B细胞抗原表位,是IBHV主要抗原决定簇区之一，且所有的疱疹病毒科gB基因都具有高度保守性和同源性，可利用其分析不同疱疹病毒之间的进化关系。

自发现以来，各大洲具有发病报道，几乎所有国家的牛群中都能检测到IBRV抗体，IBRV的组织嗜性广，能侵害牛的呼吸***，神经***，生殖***，眼角膜和消化***，对牛造成无法恢复的损失。

目前检测IBRV的最简单快速和最灵敏的方法是PCR，通过扩增IBRV的特异性保守片段来确定检测结果。IBRV基因组能够重组到分化极慢的神经细胞中，随着宿主细胞的DNA同时复制形成潜伏感染，此时无法用分离毒株的方法确定，因此PCR对潜伏感染很有说服力，国外诊断IBRV大多使用ELISA方法，这些方法存在操作繁杂费时等缺点。由于缺乏实验室专业仪器、设备及专业人员，PCR或ELISA均很难在基层牛场应用，因此迫切需要一种敏感、特异和简便的IBRV检测的新技术。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是Notomi等在2000年发明的一种等温扩增技术，其标准方法是针对靶基因的6个特定区域设计2对特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）在恒温（65℃）条件下保温约一小时，即可完成大量核酸的扩增，凝胶电泳显示特征性梯状条带，2002年Nagamine等通过增加一对环引物，大大提高了扩增效率，使反应时间节省近一半。LAMP法是新型的基因扩增法，具有快速、方便、特异性好、灵敏度高、成本低等优点，不需要昂贵的仪器设备，仅水浴锅就可以检测，适合现场使用，这些年来，国内外已将该技术运用于多个领域，但目前均未见该技术用于检测IBRV。

LAMP技术虽然简便灵敏，但扩增产物的检测及由此带来的气溶胶污染造成的假阳性限制了该技术的推广，因此LAMP产物的易检测性是该技术诞生后的一个热点。

发明内容

本发明的目的是建立一种快速、方便、特异、灵敏、经济的用于检测牛鼻拭子、血液或其它组织中IBRV的LAMP可视化检测方法和检测试剂盒，为基层现场检测提供便利。

本发明利用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术，通过3对特异性引物，基于金属指示剂——羟基萘酚蓝（HNB），从颜色上显示反应体系Mg²⁺浓度的变化，从而实现检测IBRV的可视化。

具体而言，本发明第一方面提供一种选自以下的引物序列：

CGAGCACACCAGCTACTCG（SEQ ID NO:1）；

TCTCGCAGCATTTCGTCC（SEQ ID NO:2）；

AGACCGGCTCCTTGAGGCGCGGAGCGCTTCCAGCA（SEQ ID NO:3）；

CGCGGAACTTTTTGCGTACACAGCCAGCGAGCACACGT（SEQ ID NO:4）；

TCGCGCTTGTAGTAGCCCTC（SEQ ID NO:5）；和

TGGGTGCCCAAGCGCAAA（SEQ ID NO:6）。

本发明第二方面提供一种组合物，该组合物含有以下引物对中的至少一对：

（1）CGAGCACACCAGCTACTCG（SEQ ID NO:1）；和

TCTCGCAGCATTTCGTCC（SEQ ID NO:2）；

（2）AGACCGGCTCCTTGAGGCGCGGAGCGCTTCCAGCA（SEQ ID NO:3）；和

CGCGGAACTTTTTGCGTACACAGCCAGCGAGCACACGT（SEQ ID NO:4）；和

（3）TCGCGCTTGTAGTAGCCCTC（SEQ ID NO:5）；和

TGGGTGCCCAAGCGCAAA（SEQ ID NO:6）。

在一个具体实施例中，所述引物组合物含有全部三对引物对。

在一个具体实施例中，引物组合物中，每对引物对中两条引物的量相同。

在一个具体实施例中，所述引物组合物含有全部三对引物对，且引物对（1）、（2）和（3）的浓度比为1～5：6～12：2～6，例如1～3：7～9：3～5。

在一个具体实施例中，引物对（1）、（2）和（3）的浓度比为1：8：4。

本发明第三方面提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒含有本发明所述的引物，尤其是所述引物组合物。

在一个具体实施例中，所述检测试剂盒还含有运行环介导等温扩增所需的试剂。

在一个具体实施例中，所述检测试剂盒含有等温扩增缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、MgSO₄溶液、甜菜碱溶液、引物、金属指示剂和DNA聚合酶。

在一个具体实施例中，所述金属指示剂是羟基萘酚蓝。

本发明第四方面提供一种检测牛传染性鼻气管炎病毒的方法，该方法采用环介导等温扩增技术扩增从牛组织中提取到的核酸，且扩增体系中含有金属指示剂，经由对比阴性对照的颜色而判断样品中是否存在牛传染性鼻气管炎病毒，其中，若样品检测结果与该阴性对照相比颜色发生改变，则表明该样品中存在牛传染性鼻气管炎病毒。

在一个具体实施例中，扩增中使用到传染性鼻气管炎病毒gB蛋白基因的特异性引物，尤其是gB蛋白基因保守区的特异性引物。

在一个具体实施例中，所述特异性引物选自以下引物对中的至少一对：

（1）CGAGCACACCAGCTACTCG（SEQ ID NO:1）；和

TCTCGCAGCATTTCGTCC（SEQ ID NO:2）；

（2）AGACCGGCTCCTTGAGGCGCGGAGCGCTTCCAGCA（SEQ ID NO:3）；和

CGCGGAACTTTTTGCGTACACAGCCAGCGAGCACACGT（SEQ ID NO:4）；和

（3）TCGCGCTTGTAGTAGCCCTC（SEQ ID NO:5）；和

TGGGTGCCCAAGCGCAAA（SEQ ID NO:6）。

在一个具体实施例中，所述阴性对照为不含从牛组织中提取到的核酸的扩增体系。

在一个具体实施例中，所述阴性对照含有相同的扩增体系组分，但使用DEPC水代替核酸样品。

在一个具体实施例中，所述扩增体系含有等温扩增缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、MgSO₄溶液、甜菜碱溶液、引物、金属指示剂和DNA聚合酶。

在一个具体实施例中，所述DNA聚合酶是具有链置换作用的DNA聚合酶。

在一个具体实施例中，所述DNA聚合酶是Bst DNA聚合酶。

在一个具体实施例中，所述金属指示剂是羟基萘酚蓝。

在一个具体实施例中，所述方法还包括阳性对照，所述阳性对照为含细胞培养株IBRV的DNA的扩增体系；扩增前，阴性对照和阳性对照管均呈紫色；扩增后，阳性对照管呈天蓝色，阴性对照管颜色不变，则判定检测结果可靠。

在一个具体实施例中，所述方法包括：

（a）提供提取自牛组织的核酸；

（b）使所述核酸与含等温扩增缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、MgSO₄溶液、甜菜碱溶液、引物、金属指示剂和具有链置换作用的DNA聚合酶的扩增体系混合，获得样品混合物；作为阴性对照，用DEPC水替换所述核酸，与所述扩增体系混合；作为阳性对照，使用细胞培养株IBRV的DNA替换所述核酸，与所述扩增体系混合；

（c）使步骤（b）所得样品混合物、阴性对照和阳性对照在63～67℃保温35～45分钟，然后在78～82℃保温15～25分钟，终止反应，从而完成扩增；和

（d）对比扩增后阴性对照和阳性对照的颜色，在颜色发生改变的情况下，表明检测结果可靠，在此基础上将样品颜色与阴性对照的颜色进行比较，若颜色发生变化，指示存在牛传染性鼻气管炎病毒。

附图说明

图1显示，反应后，阳性对照管呈天蓝色，阴性对照管颜色为紫色。

图2显示琼脂糖凝胶电泳验证的结果。其中1－7为检测到的阳性样品的电泳结果，“阴”为阴性对照，“阳”为阳性对照，M为DL2000 marker。

图3A－3C显示IBRV的LAMP敏感性试验结果。其中图3A显示普通PCR的结果，图3B显示套式PCR的结果，图3C显示LAMP的结果。各图中，1－5的质粒浓度分别为4、41、414、4140和41400拷贝/μL，“阴”为阴性对照，“阳”为阳性对照，M为DL2000 marker。

图4A－4B显示IBRV的LAMP特异性试验结果。其中图4A显示电泳结果；图4B显示可视化结果。两图中，1－3分别为PRV、VSV的DNA以及BVDV的cDNA，“阴”为阴性对照，“阳”为阳性对照，M为DL2000 marker。图4B中，标识为“阳”的试管中的液体呈天蓝色，标识为“阴”及“1”、“2”和“3”的试管均呈紫色。

具体实施方式

本发明从牛组织，例如鼻拭子、血液或其它组织中提取核酸，利用LAMP技术，根据IBRV-gB基因的保守序列设计3对引物，利用具有链置换作用的Bst DNA聚合酶进行靶序列的识别和延伸，对待测靶序列进行超指数扩增，并在反应体系中添加碱土金属离子指示剂羟基萘酚蓝（HNB），由于反应副产物焦磷酸根离子和反应体系中的Mg²⁺生成焦磷酸镁沉淀，不断消耗游离Mg²⁺，反应前后的颜色显著改变，从而使IBRV的检测可视化。

可采取本领域已知的各种技术手段从牛组织中提取核酸。例如，实施例1给出了从牛鼻拭子提取核酸的一个具体实例。牛组织可以包括牛的各种组织，包括但不限于血液、肌肉、毛发等，也包括例如唾液或其它体液。从便于现场检测而言，优选使用牛鼻拭子。

获得所述核酸样品后，可加入到适用于LAMP技术扩增的扩增体系中。该扩增体系通常含有等温扩增缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、MgSO₄溶液、甜菜碱溶液、引物、金属指示剂和DNA聚合酶等。

DNA聚合酶优选是具有链置换作用的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶。

引物优选是传染性鼻气管炎病毒gB蛋白基因的特异性引物，尤其是gB蛋白基因保守区的特异性引物。本发明一个具体实施例中使用到选自以下引物对中的至少一对的特异性引物：

（1）CGAGCACACCAGCTACTCG（SEQ ID NO:1）；和

TCTCGCAGCATTTCGTCC（SEQ ID NO:2）；

（2）AGACCGGCTCCTTGAGGCGCGGAGCGCTTCCAGCA（SEQ ID NO:3）；和

CGCGGAACTTTTTGCGTACACAGCCAGCGAGCACACGT（SEQ ID NO:4）；和

（3）TCGCGCTTGTAGTAGCCCTC（SEQ ID NO:5）；和

TGGGTGCCCAAGCGCAAA（SEQ ID NO:6）。

优选的是，使用全部三对引物进行LAMP扩增。

扩增体系中，每对引物对中两条引物的量相同。在使用全部三对引物时，引物对（1）、（2）和（3）的浓度比为1～3：6～12：2～6，例如1～3：7～9：3～5。在优选实施例中引物对（1）、（2）和（3）的浓度比为1：8：4。

金属指示剂优选是羟基萘酚蓝。

扩增体系中使用到的等温扩增缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、MgSO₄溶液和甜菜碱溶液均为本领域常规的试剂。例如，dNTP包括dATP、dCTP、dGTP和dTTP。

扩增体系中各试剂的用量可根据本领域常规技术予以确定。例如，作为25μL扩增体系的例子，可含有：约2.5μL的等温扩增缓冲液、约3.5μL的dNTP、约1.5μL的MgSO₄、约1.0μL的甜菜碱、约6.0μL的引物、约1.0μL的HNB、约1.0μL的DNA聚合酶、约1.0μL的核酸样品以及余量的水。当然，在各组分的浓度（或DNA聚合酶的酶活）不同时，各组分的含量可做相应增减，这都可由本领域技术人员根据实际情况予以确定。

扩增可如下进行：在63～67℃（例如约65℃）保温35～45分钟（例如约40分钟），然后在78～82℃（例如约80℃）保温15～25分钟（例如约20分钟），然后终止反应。

检测过程中还提供阴性对照和任选的阳性对照。阴性对照中用DEPC水代替核酸样品，其它扩增体系的成分不变。阳性对照组成的组成为用细胞培养株IBRV的DNA代替核酸样品，其它扩增体系的成分不变。

通常，扩增前，阴性对照和阳性对照管均呈紫色；扩增后，阳性对照管呈天蓝色，阴性对照管颜色不变，则判定检测结果可靠。扩增完成后，将样品试管的颜色与阴性对照相比，若颜色发生改变即可确定其为阳性，否则为阴性。

本发明也提供一种试剂盒，该试剂盒含有等温扩增缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、MgSO₄溶液、甜菜碱溶液、引物、金属指示剂和DNA聚合酶。试剂盒中的各成分可以是单独包装，也可以以任意混合物的形式提供。试剂盒将用于LAMP扩增，因此，试剂盒中各试剂的浓度应能满足LAMP扩增的要求。例如，在一个具体实施例中，等温扩增缓冲液可以是5X～10X等温扩增缓冲液，dNTP的浓度为8～10mM，MgSO₄的浓度为80～120mM，甜菜碱的浓度为3.5～4.5M，和HNB的浓度为2.0～4.0mM。DNA聚合酶可以使用本领域已知的具有链置换活性的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶。

示例性的等温扩增缓冲液含有由Tris-HCl、(NH₄)₂S0₄、MgS0₄和Tween-20。例如，本文所用10X等温扩增缓冲液含有：200mM Tris-HCl (pH 8.8 @ 25℃)，500mM KCl，100mM(NH₄)₂S0₄，20mM MgS0₄，1.0% Tween-20。

采用本发明的引物、方法和/或试剂盒可快速、方便、特异、灵敏、经济、可视化地检测牛鼻拭子、血液或其它组织中IBRV，为基层现场检测提供便利。

以下将以具体实施例的方式描述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非限制本发明的保护范围。实施例中所用到的方法、原料和试剂，除非另有说明，否则均是本领域常规使用的方法、原料和试剂。

实施例1：牛传染性鼻气管炎病毒的LAMP可视化检测方法的建立

（1）反应用试剂的制备

1）IBRV LAMP引物设计

根据Genbank公布的IBRV-gB基因，Megalign分析比对后，选择其保守区域，设计3对特异性引物，序列如下：

2）反应体系中溶液的配置

Bst 2.0 DNA 聚合酶购自NEB公司，10X等温扩增缓冲液和100mM MgSO₄均随酶附送。混合引物为FIP/BIP:LF/LB:F3/B3按浓度比为40μM:20μM:5μM 等量混合的引物。溶液均用DEPC水配置。配置体系过程置于冰上完成。

10X等温扩增缓冲液：200mM Tris-HCl (pH 8.8 @ 25℃)，500mM KCl，100mM(NH₄)₂S0₄，20mM MgS0₄，1.0% Tween-20。

（2）病毒核酸提取

的方法，采用AxyPrep基因组DNA小量试剂盒提取奶牛鼻拭子样品核酸，按照如下步骤进行：

1）取奶牛鼻拭子样品加入适量PBS缓冲液，充分振荡后，吸取350μL液体。

2）加入0.8μL Rnase A，漩涡振荡15s，室温静置1min。

3）加入150μL Buffer C-L和8μL Proteinase K。立即漩涡振荡1min混合均匀。短暂离心后，将离心管置56℃水浴10min。

4）加入350μL Buffer P-D，漩涡振荡30s混合均匀，12000×g离心10min。

5）将DNA制备管置于2mL离心管中，将步骤4中的混合液移至制备管中，12000×g离心1min。

6）弃滤液，将制备管置回到原来的2mL离心管中，加入500μL Buffer W1，12000×g离心1min。

7）弃滤液，将制备管置回到原来的2mL离心管中，加入700μL Buffer W2，12000×g离心1min，以同样的方法，用700μL Buffer W2再洗涤一次。

8）弃滤液，将制备管置回到原来的2mL离心管中，12000×g离心1min。

9）将DNA制备管置于另一洁净的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加100μLEluent，室温静置1min，12000×g离心1min洗脱DNA。

（3）反应进行

按（1）2）反应体系中溶液的配置，在200μL PCR管中混合均匀，设置阴阳性对照，置于65℃水浴锅或金属浴中保温40分钟，80℃20分钟后终止反应。

阴性对照组成：反应体系中，用DEPC水代替样品，其它组成不变。

阳性对照组成：反应体系中，用细胞培养株IBRV的DNA代替样品，其它组成不变。

（4）结果判定

反应前，阴阳对照管均呈紫色；反应后，阳性对照管呈天蓝色，阴性对照管颜色不变，可认为结果可靠。见附图1。

在结果可靠的情况下，将所检测样品的反应管与阴性对照作比较，颜色改变即可确定其为阳性，否则为阴性。

实施例2：牛传染性鼻气管炎病毒的LAMP可视化检测方法的验证

对实施例1的检测结果实施以下验证，用以证明本发明LAMP可视化检测方法的准确性、敏感性、特异性以及可靠性。

（1）琼脂糖凝胶电泳验证

LAMP反应结束后，取阴阳对照扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，80v电泳55分钟后凝胶成像***观察，阳性对照出现预期条带—LAMP反应特异的梯状条带，阴性对照只有＜100bp的引物聚集物条带。结果见附图2。

（2）IBRV的LAMP敏感性试验

构建含有本发明中LAMP反应扩增靶序列的阳性质粒：用PCR方法扩增IBRV-gB基因的某段含有LAPM法检测的、保守的靶序列，将扩增得到的PCR产物纯化后与blunt载体连接，然后将连接后的产物转化至大肠杆菌top10菌株，转化成功后用LB培养基大量增殖，试剂盒提取其质粒并测序鉴定，经序列比对确认质粒中的***序列与靶序列一致即可。

成功构建含有本发明中LAMP反应扩增靶序列的阳性质粒后，测定其浓度，并根据质粒基因组大小，计算得到其拷贝数，DEPC水稀释至其每微升拷贝数分别为41400，4140，414，41和4，分别做LAPM试验和PCR试验，比较其灵敏度。PCR反应的引物为该质粒***序列的特异性引物。

结果：由肉眼观察LAMP反应管颜色变化，并结合凝胶电泳成像结果验证，从图3可以看出，本发明的LAMP试验检测限为4个拷贝数的质粒，而普通PCR试验检测限为414个拷贝数的质粒，LAMP反应灵敏度比普通PCR高100倍，而与套式PCR灵敏度相当。

（3）IBRV的LAMP特异性试验

分别用经过PCR或RT-PCR鉴定过的细胞培养株PRV、VSV中提取的DNA及BVDV中的cDNA作为IBRV的LAMP反应的模板，细胞培养株IBRV的DNA作为阳性对照、DEPC水作为阴性对照，然后按实施例1进行LAMP反应。

结果：肉眼观察反应管颜色变化，并结合凝胶电泳成像结果验证，从图4可以看出，上述三种病毒与IBRV的LAPM方法均无交叉反应。

（4）IBRV的LAMP临床样品检测试验

对40份经套式PCR检测过的奶牛鼻拭子样品抽提的核酸，按照本发明所建立的IBRV LAMP方法进行临床样品检测，并与套式PCR结果比较。

结果：套式PCR检测结果为11份阴性，29份阳性，阳性率为75.0%，而LAMP方法检测结果也为11份阴性，29份阳性，阳性率也为75.0%，且相应的样品检测结果均一致，由此也显示了本发明检测的可靠性。

虽然以具体实施例的方式阐述了本发明，但应理解，在不偏离本发明精神的情况下，可对本发明上述技术方案作出适当的改动。所有这些改动都应在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于以环介导等温扩增技术检测牛传染性鼻气管炎病毒gB蛋白基因的引物组合物，该引物组合物含有以下引物对：

（1）CGAGCACACCAGCTACTCG（SEQ ID NO:1）；和

TCTCGCAGCATTTCGTCC（SEQ ID NO:2）；

（2）AGACCGGCTCCTTGAGGCGCGGAGCGCTTCCAGCA（SEQ ID NO:3）；和

CGCGGAACTTTTTGCGTACACAGCCAGCGAGCACACGT（SEQ ID NO:4）；和

（3）TCGCGCTTGTAGTAGCCCTC（SEQ ID NO:5）；和

TGGGTGCCCAAGCGCAAA（SEQ ID NO:6）。

2.如权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述引物组合物含有全部三对引物对，每对引物对中两条引物的量相同，且引物对（1）、（2）和（3）的浓度比为1～5：6～12：2～6。

3.如权利要求2所述的引物组合物，其特征在于，引物对（1）、（2）和（3）的浓度比为1～3：7～9：3～5。

4.一种检测试剂盒，所述检测试剂盒含有权利要求1－3中任一项所述的引物组合物。

5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还含有等温扩增缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、MgSO₄溶液、甜菜碱溶液、金属指示剂和DNA聚合酶。

6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述等温扩增缓冲液为10X等温扩增缓冲液，脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为8～10mM，MgSO₄的浓度为80～120mM，甜菜碱的浓度为3.5～4.5M，和所述金属指示剂是羟基萘酚蓝，其浓度为2.0～4.0mM。

7.权利要求1-3中任一项所述的引物组合物在制备用于检测牛传染性鼻气管炎病毒的试剂盒中的用途，所述检测采用环介导等温扩增技术扩增从牛组织中提取到的核酸，且扩增体系中含有金属指示剂，经由对比阴性对照的颜色而判断样品中是否存在牛传染性鼻气管炎病毒，其中，若样品检测结果与该阴性对照相比颜色发生改变，则表明该样品中存在牛传染性鼻气管炎病毒。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述检测具有以下一个或多个特征：

（1）扩增中使用到传染性鼻气管炎病毒gB蛋白基因的特异性引物；

（2）所述阴性对照为不含从牛组织中提取到的核酸的扩增体系；

（3）所述扩增体系含有等温扩增缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、MgSO₄溶液、甜菜碱溶液、引物、金属指示剂和具有链置换作用的DNA聚合酶；

（4）所述检测还包括扩增阳性对照，所述阳性对照为含细胞培养株IBRV的DNA的扩增体系；扩增前，阴性对照和阳性对照管均呈紫色；扩增后，阳性对照管呈天蓝色，阴性对照管颜色不变，则判定检测结果可靠；和

（5）所述扩增包括：在63～67℃保温35～45分钟，然后在78～82℃保温15～25分钟，终止反应，从而完成扩增。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述特异性引物是gB蛋白基因保守区的特异性引物。

10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述阴性对照含有相同的扩增体系组分，但使用DEPC水代替核酸样品。

11.如权利要求7-10中任一项所述的用途，其特征在于，所述检测使用权利要求1-3中任一项所述的引物组合物或权利要求4－6中任一项所述的检测试剂盒进行扩增。

12.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述检测包括：

（a）提供提取自牛组织的核酸；

（b）使所述核酸与含等温扩增缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、MgSO₄溶液、甜菜碱溶液、引物、金属指示剂和具有链置换作用的DNA聚合酶的扩增体系混合，获得样品混合物；作为阴性对照，用DEPC水替换所述核酸，与所述扩增体系混合；作为阳性对照，使用细胞培养株IBRV的DNA替换所述核酸，与所述扩增体系混合；

（d）对比扩增后阴性对照和阳性对照的颜色，在阳性对照颜色发生改变的情况下，表明检测结果可靠，在此基础上将样品颜色与阴性对照的颜色进行比较，若颜色发生变化，指示存在牛传染性鼻气管炎病毒。