CN103172749B - 一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备 - Google Patents
一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103172749B CN103172749B CN201310038763.0A CN201310038763A CN103172749B CN 103172749 B CN103172749 B CN 103172749B CN 201310038763 A CN201310038763 A CN 201310038763A CN 103172749 B CN103172749 B CN 103172749B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cct
- vaccine
- swine fever
- african swine
- protein engineering
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 76
- 208000007407 African swine fever Diseases 0.000 title claims abstract description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 66
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 56
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 15
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 241000701386 African swine fever virus Species 0.000 abstract description 36
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 abstract description 17
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 abstract description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 241001248531 Euchloe <genus> Species 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract 1
- 101710142252 Protein P54 Proteins 0.000 abstract 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 abstract 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 abstract 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 49
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 102100021409 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX17 Human genes 0.000 description 17
- 101800000958 Reverse transcriptase/ribonuclease H Proteins 0.000 description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 16
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 14
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 14
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 14
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 14
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 10
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 10
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 9
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 9
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 9
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 9
- 230000036541 health Effects 0.000 description 9
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 5
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- -1 1 μ l Substances 0.000 description 4
- 102100033458 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 4 Human genes 0.000 description 4
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 4
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000009781 safety test method Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 3
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 3
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101000933967 Pseudomonas phage KPP25 Major capsid protein Proteins 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 2
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 2
- 239000000568 immunological adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000005498 polishing Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 101100493713 Caenorhabditis elegans bath-45 gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102100040565 Dynein light chain 1, cytoplasmic Human genes 0.000 description 1
- 101710096197 Dynein light chain 1, cytoplasmic Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000701377 Iridoviridae Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101000957149 Paramecium bursaria Chlorella virus 1 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000208966 Polygala Species 0.000 description 1
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N Senegenin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@](C)(C(O)=O)[C@@H]2CC[C@@]3(C)C(CC[C@]4(CCC(C[C@H]44)(C)C)C(O)=O)=C4[C@@H](CCl)C[C@@H]3[C@]21C CWHJIJJSDGEHNS-MYLFLSLOSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M ampicillin sodium Chemical compound [Na+].C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C([O-])=O)(C)C)=CC=CC=C1 KLOHDWPABZXLGI-YWUHCJSESA-M 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 102000013035 dynein heavy chain Human genes 0.000 description 1
- 108060002430 dynein heavy chain Proteins 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002633 protecting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000009871 tenuigenin Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备。所述疫苗含有非洲猪瘟病毒ASFV主要稳定结构蛋白P72，膜结构蛋白P54，以及红细胞凝集素的T细胞表位多肽以及纯化标签。本疫苗生产制备工艺稳定，适合大规模生产。经过靶动物仔猪和小白鼠动物实验表明，本发明所述的非洲猪瘟蛋白工程疫苗具有使用的安全性，且疫苗能够诱导显著的细胞免疫反应及体液免疫反应。
Description
技术领域
本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备。具体地，利用基因重组技术，将非洲猪瘟重要结构蛋白P72、P54以及红细胞凝集素HA多个T细胞表位和纯化标签串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵，纯化、乳化工艺制备，得到具有细胞免疫和体液免疫效果的非洲猪瘟蛋白工程疫苗，用于非洲猪瘟疫情的防控。
背景技术
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒ASFV引起的猪的一种急性、热性传染性疫病。国际兽医局将其列为A类动物疫病，我国已将此病规定为一类动物传染病。ASFV是一个复杂的二十面体病毒，其特征与虹彩病毒科和痘病毒科的成员相似。ASFV为双股线性DNA基因组，根据病毒株的不同其大小为170～190 kb（Blasco等，1989；Tabares等，1980）。ASFV是一种非常复杂的病毒，基因组共有150多个开放阅读框，共编码100多种多肽，在不同的实验室所得到的结果有一定差异。ASFV病毒可以编码34种以上的结构蛋白，虽然病毒的结构蛋白很多，但是证实具有抗原性的蛋白仅有几种，Tabares(1980) 等发现6种，VP72，VP162，VP146，VP54，VP34，VP23.5，其中p72、p54、p30和p12，具有良好的抗原性。P72是一个主要的衣壳蛋白，占整个病毒粒子总蛋白的32%，国外研究表明，不同区域的ASFV 病毒诱导产生的P72抗体的相应抗原表位都相当保守，而且抗原性很稳定，常被用来作为血清学检测和免疫制剂。膜结构蛋白P54由D183L基因编码，含有一段跨膜区域，主要集中在衍生的内质网膜处，其与轻链细胞质动力蛋白DLC8存在特殊的交叉反应，并在细胞内摄作用及病毒加工过程中其重要作用。感染病毒后复制早期，病毒可激活细胞凋亡蛋白酶，诱发细胞脱噬作用。
ASFV有很好的抗原性，在感染期间能诱导产生高水平的特异性抗体。在感染后4d能检测到IgM，感染后6～8 d能检测到IgG (Sanchez- Vizcaíno等，1979)。并且初次感染后血清中的抗体能维持很长一段时间。抗ASFV的抗体能延迟临床症状的出现，减轻病毒血症，并能保护感染猪不会死亡(Onisk等，1994；Schlafer等，1984)。早期的实验表明实验感染和自然感染ASFV的猪血清中没有中和抗体。然而，康复猪用***疫苗免疫时能产生正常水平的中和抗体，该实验证明了ASFV对体液免疫反应不存在负面影响(De Boer，1967)。其他学者(Ruiz Gonzalvo等，1986)也证明不同的ASFV分离株大部分能被恢复期血清中和，但总有10%的ASFV不能被中和。另外，Gomez-Puertas等(1996)报道，恢复期猪血清中的ASFV抗体能有效地中和感染易感细胞之前或之后的ASFV。然而，现在还不能证明ASFV的特异性抗体完全符合经典的病毒中和试验；另一方面，来自康复猪的细胞毒性T淋巴细胞能杀死感染ASFV的巨噬细胞(Martins和Leitao，1994)，这表明细胞介导的免疫反应可能是保护性免疫反应的重要组成部分。
尽管研究人员已经对ASFV 的生物学知识已经有了深入的了解，但目前还无法治疗ASF，也没有有效的疫苗来预防ASF。自从1963年第一个ASF弱毒疫苗在葡萄牙应用以来(Manso Ribeiro等，1963)，人们做了许多努力以期制备满意的疫苗。灭活疫苗不能产生任何保护作用。弱毒活疫苗能使一些猪免受同源ASFV毒株的感染，但是这些猪部分会成为病毒携带者或出现慢性病变，当大规模使用弱毒活疫苗时，这种可能性会增加(Manso Ribeiro 等，1963；Sanchez Botija，1963)。其他研究表明，抗同源或一些异源ASFV毒株的猪血清能抑制（体外）与异源毒株相关但与异源毒株不同的毒株对细胞的感染(Ruiz Gonzalvo等，1986)。近年来的发现表明，针对ASFV蛋白p30、p54和p72的中和抗体不足以产生抗体介导的免疫保护( Neilan 等，2004)。
以往的疫苗均是以灭活疫苗和弱毒疫苗为基础进行尝试，但效果均不理想。未来进一步开发以特异性靶向基因剔除（如编码入侵宿主防御***的基因）为目标的安全性好和效力高的重组弱毒疫苗可能会产生较好的效果。尽管分子生物学技术已经成功应用于界定体内ASFV 相关毒力因子，但时至今日，由于其残余的毒力，仍没有证据表明合格的重组弱毒疫苗开发成功。研究人员（Jordi M. Argilaguet等，2012）基于成功诱导免疫反应抗原特性，开发了DNA 疫苗，但是免疫后仅能诱导部分保护。
ASF抗体调节要求多个针对许多不同病毒蛋白的反应，有些可能涉及病毒中和反应。也可能是一些尚未发现的中和表位在保护中发挥了重要作用。HA为红细胞凝集素，能够在体外缺少ASFV 的情况下产生对红血球的凝集反应（Ruiz-Gonzalvo, F，1993）。使用非纯化的HA 免疫靶动物，可以抵抗同源病毒的感染（Ruiz-Gonzalvo, F，1993）。ASFV基因组结构分析表明基因之一与T细胞粘附受体相似的序列CD2，这个蛋白直接参与红细胞吸附现象，而ASFV感染免疫细胞亦会诱导此现象（Borca, M. V.等，1994），研究人员认为CD2与HA为同一蛋白。研究表明HA蛋白是病毒粒子的次要组件，而且只能通过HA蛋白的高抗体滴度才能检测到。电镜扫描研究表明（Quintero, J. C等，1986），病毒粒子粘附后并不穿透红血球，而是通过一个通道连接在表面外层．HA可以调节这种粘附作用，用这种方式，病毒粒子侵染免疫***，这可以解释为什么ASFV感染后幸存猪都要经历一个漫长的病毒血症阶段。众多研究表明ASFV HA含有诱导感染抑制的表位，血凝抑制可能会不同（Blasco, R.等1989；Carrascosa, A. L等1987；del Val, M等1986）。F. Ruiz-Gonzalvo（1996）等的研究结果也表明抗体调节机制可能有助于抵抗疾病，HA似乎是部分免疫保护抗体的目标。但是HA并非真正的抗原（Ruiz-Gonzalvo, F，1993），可能它对于接种较高剂量重组蛋白从而产生较好的保护效果或者提高抗原提呈给免疫***是必须的。
发明内容
本发明根据已分离的非洲猪瘟病毒保守结构蛋白P72，膜结构蛋白P54与红细胞凝集素HA 的多个T细胞表位联合后与纯化标签串联，在大肠杆菌中实现表达，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的蛋白工程疫苗。本发明提供的疫苗制备方法可保证疫苗能够激发有效的细胞免疫及体液免疫，能够用于预防非洲猪瘟流行。
本发明的目的之一在于提供了一种新的能用于预防非洲猪瘟的疫苗多肽及其疫苗组合物。
本发明的目的之二在于提供了所述蛋白工程疫苗的构建及获得方法。
本发明的目的之三在于提供了能够表达所述非洲猪瘟蛋白工程疫苗的基因工程菌株。
本发明的目的之四在于提供了所述非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备方法。
本发明的目的之五在于提供了所述蛋白工程疫苗在免疫靶动物体内能够诱发有效的细胞免疫及体液免疫反应。
在第一方面，本发明提供了一种用于非洲猪瘟预防的疫苗多肽及其组合物。其含有非洲猪瘟保守结构P72和膜蛋白P54，同时，由于红细胞凝集素HA 能够诱导有效的细胞免疫反应，因此，我们利用分子生物学软件分析HA 蛋白的T细胞表位，将获得表位与结构蛋白串联，获得完整的具有细胞免疫和体液免疫效果的非洲猪瘟蛋白工程疫苗蛋白。所述蛋白工程疫苗包括主要结构蛋白以及HA T细胞免疫表位串联到一起所形成的蛋白或多肽或药学上可接受的盐以及多肽、蛋白所需要的载体。串联可以通过遗传工程方法进行，蛋白工程疫苗中除了含有主要结构蛋白和红细胞凝集素T细胞免疫表位外，还包含非免疫活性物质。所述非免疫活性物质为各个多肽的连接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有纯化标签、接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和***反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。
在第二方面，本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明第一方面所述的非洲猪瘟疫苗多肽。本发明中核苷酸可以是RNA形式，DNA 形式，通过人工合成方式合成蛋白工程疫苗基因片段，经过基因工程操作，将基因片段克隆入载体，转化入大肠杆菌，筛选、发酵、纯化后获得猪瘟疫苗多肽。在本发明中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：PCR、限制性内切酶酶切，连接等。核酸设计5’端和3’端均加入酶切位点，所述的基因操作技术为本领域技术人员所熟知。
在第三方面，本发明提供了一种载体，其除了含有本发明第二方面所述的编码非洲猪瘟蛋白工程疫苗氨基酸的核苷酸分子，还含有与该核苷酸序列可操作的连接，在原核细胞表达（转录和翻译）所需的表达控制元件。最基本的表达控制元件包括启动子、转录终止子、增强子，选择性标记等，这些调控元件为本领域所熟知。在一优选实施方案中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体。
在第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的载体。宿主细胞经转化或转染含有本发明所述编码蛋白的基因序列，而后经检测具有良好的的遗传和表达稳定性后，可用于发酵表达生产所需的非洲猪瘟蛋白工程疫苗。
在第五方面，本发明提供了一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备方法，其包括以下步骤：工程菌发酵表达蛋白工程疫苗多肽，经过粗纯化与精细纯化工艺以及后续乳化工艺，获得所需要的多肽。其中涉及的方法包括但不限制于菌体破碎、包涵体洗涤、离心、变性、亲和层析、疏水层析、复性、乳化等。本发明中涉及的制备方法为本领域技术人员所熟知。
在第六方面，本发明提供了一种用于预防非洲猪瘟的疫苗，其包括本发明第一方面所述的多肽以及药学上可接受的载体。本发明所述的药学上可接受的载体为免疫增强剂或免疫佐剂，优选免疫佐剂为50V2佐剂。
在第七方面，本发明提供了第六方面所述的蛋白工程疫苗的应用。疫苗可以一定有效剂量肌肉注射，皮内或皮下注射免疫动物，能够激发机体的体液免疫和细胞免疫反应。
另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其他具有实质性特点的方面对本领域的普通技术人来说是显而易见的。此外，本发明亦使用了公开文献，他们的全文内容均纳入本文进行参考。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书说界定的本发明范围。
图1 为含有非洲猪瘟蛋白工程疫苗蛋白编码基因的表达载体pRSETB-ASFV(P72/54)-HA示意图。
图 2为限制性内切酶琼脂糖凝胶电泳图，其中lane1为DNA marker，由上至下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；lane2为pRSETB-ASFV(P72/54)-HA质粒双酶切图；lane3为pRSETB-ASFV(P72/54)-HA完整质粒；lane4为阴性对照。
图3为工程菌菌种诱导表达后SDS-PAGE分析结果，其中lane1为pRSETB–ASFV (P72/54)-HA/ BL21（DE3，Plys）工程菌诱导表达（箭头所指为目标蛋白）；lane2为蛋白marker，由上至下依次为97.2KD、66.4KD、44.3KD、29.0KD、20.1KD、14.3KD；lane3为未诱导表达阴性对照菌。
图4为纯化蛋白WESTERNBLOT 印记结果，其中1为预染蛋白分子量marker，由上至下依次为：95KD、72KD、55KD、43KD、34KD、26KD；2为纯化的疫苗蛋白；3为阴性对照。
图5 首免、二免、三免后14天抗体检测结果
图6 IFNγ-ELISPOT 检测结果
具体实施方式
实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐述本发明，但并不构成对本发明范围的限制，依据本说明书的诸多变化为本领域的技术人员所熟知。
实施例一非洲猪瘟蛋白工程疫苗框架的设计思路
综合非洲猪瘟病毒的生物学特性，本发明利用DNAStar及ANTHEPROT软件对其红细胞凝集素HA进行的亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和Garnier-Robson的二级结构进行分析，预测可能的细胞免疫表位，并将主要保守结构蛋白P72，膜蛋白P54与T细胞表位串联，作为蛋白工程疫苗的骨架结构该疫苗的总体结构为：P72-P54-HA。
实施例二大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建
实施例一中设计好的多肽编码核苷酸由上海英俊生物技术公司合成，P72-P54-HA基因片段两端分别设计了EcoR I（5’端）和HindIII（3’端）限制性内切酶位点。上海英俊生物技术公司把片段合成后克隆到pMD18T载体上，提取质粒并测序正确后，将重组质粒命名为pMD18T-ASFV(P72/54)-HA，将含有重组质粒的大肠杆菌寄回本公司。
将含有pMD18T-ASFV(P72/54)-HA重组质粒的大肠杆菌菌株接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡过夜培养，次日按照Qiagen质粒提取试剂盒使用手册。将质粒使用相应的限制性内切酶进行处理，大肠杆菌表达载体选用pharmacia biotech 公司的pRSETB 质粒，使用限制性内切酶EcoRI和HindIII处理，酶切条件：10μl反应体系，体系内加入2μl质粒，限制性内切酶为5个活性单位（New England biolabs），加入10×缓冲液1μl，去离子水补齐，37℃酶切1.5小时。酶切结束后加入1μl200mM EDTA终止反应。在1%琼脂糖凝胶电泳中，电泳30分钟。紫外灯下将2.9kb pRSETB质粒、1039bp的ASFV(P72/54)-HA片段，按照Qiagen 公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体：片段1：2-3的比例将蛋白工程疫苗核苷酸片段和表达载体混合，反应体系15μl，由T4 DNA 连接酶进行连接，16℃连接过夜，获得重组质粒命名为pRSETB-ASFV(P72/54)-HA（见图1），转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）pLysS。
感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞的制备：取一大肠杆菌BL21(DE3)单菌落于2ml LB 培养基中，37℃，200rpm速度振荡培养12-16小时，取1ml培养物接种于100mlLB 培养基中，37℃，200rpm速度培养3小时；将菌液冰浴2小时，然后2500g，低温离心20分钟，收集菌体；加入100ml冰冷的Trituration缓冲液（100mmol/L CaCl2，70mmol/L MgCl2，40mmol/L 醋酸钠，PH5.5），混匀，置冰浴45分钟，1800g 低温离心15分钟，弃上清，加入10ml冰冷Trituration缓冲液悬浮细胞，按每份200μl分装，-70℃保存备用。
转化：将200μl感受态细胞置冰上融化，然后加入3μlDMSO，混匀，加入2μl链接反应液，再次混匀，置冰上30分钟，42℃ 45秒，然后迅速放回冰浴1.5分钟，加入2mlLB 培养液，37℃，200rpm 振荡培养1小时，4000g 低温离心10秒钟弃上清，用200μlLB 培养基重悬菌体；将菌液铺于含有氨苄青霉素抗性的LB 琼脂培养板上，涂匀，室温放置30分钟，倒置于37℃恒温箱中培养12-16小时。筛选平板上的克隆，提取质粒，EcoR I和HindIII双酶切，可以切出相应非洲猪瘟蛋白工程疫苗基因大小的片段初步确定为阳性克隆见图2。
诱导表达：即将阳性克隆过夜培养，次日早上按1：100转接，培养3小时后，加入0.5mM IPTG，继续培养3小时，制备样品； 常规SDS-PAGE 检测目的蛋白表达情况——在42.9KD分子量处，见到特异性条带为正确克隆； 取正确克隆，放大培养，SDS-PAGE证实表达正确后，将目标蛋白纯化后使用常规western-blot 进一步证实其表达准确性，见图3，图4；将获得的菌种委托北京三博远志生物技术有限责任公司进行测序。经过上述构建及鉴定程序后，可挑选测序正确的阳性克隆作为工程菌进行原始种子库的建立及菌种保藏，菌种命名为pRSETB–ASFV (P72/54)-HA/ BL21（DE3，Plys）。
实施例三工程菌的发酵、纯化与乳化
发酵 取生产用基础种子库菌种，开启后划种培养基(LB+Amp)平板2～3块，培养后挑取平板中典型集落8～10个，分别培养后保存，然后分别进行非洲猪瘟蛋白工程疫苗融合蛋白表达量测定，重复三次，选其中非洲猪瘟蛋白工程疫苗融合蛋白表达量最高的一份供生产制备种子液用，其表达量应符合原始菌种库的表达量。挑取单菌接种于试管LB液体培养基中，在摇床中37℃培养震荡12小时。将试管中的菌以1:100的接种量接入摇瓶，37℃遥床培养至OD600=3，即可以按10%比例接种发酵罐。发酵用培养基为改造的LB培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素，对发酵罐进行溶氧和pH值的校正，进行实罐灭菌。降温至37℃时，调整转数至300rpm，标定pH及溶氧(OD)零点。发酵温度为37.0±0.1℃，根据工程菌生长情况到后期可适当调整温度，并作必要的培养基成分添加，溶氧控制在20%左右，pH控制在7.0，接种后培养菌体OD600=1.0～1.2时流加补料500ml，补料后1小时加入IPTG (终浓度为1mM)诱导表达，连续诱导6个小时后发酵结束，取样做SDS-PAGE检定表达情况。
纯化 将收集到的菌体，每100g用包含体洗液Ⅰ（1％Triton X-100， 20mMTris-cl PH8.0）混悬后进行超声，2000W超声裂解1小时。包含体沉淀用 8M尿素，0.3%β-ME，20mM Tris-cl （pH=8.00）混匀，室温搅拌4小时，8000rpm低温离心30min，弃去沉淀。上清液保留，并用BCA protein assay kit商品化试剂盒（PIERCE）检测蛋白浓度。采用稀释复性法将变性蛋白复性，蛋白终浓度为100μg/ml。复性液采用Tris(PH8.0)缓冲体系，加入0.3M 精氨酸，4℃搅拌复性48小时。复性液用pH=8.0的20mM 磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，20mM咪唑，平衡上亲和层析柱，用pH=8.0的20mM 磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，0.5M咪唑洗脱；再用1.5M(NH4)2SO4、100mM EDTA、pH=8.5的10mM Na2HPO4平衡上疏水层析柱，再平衡，用pH=8.5的10mM Na2HPO4洗脱，即得非洲猪瘟蛋白工程疫苗半成品原液。做SDS-PAGE以及WESTERNBLOT印记确定纯化产物为目标蛋白。
乳化 将纯化的半成品用灭菌的PBS稀释至200μg /ml。取法国赛比克公司50V2佐剂经121℃，灭菌15分钟，备用。按油相：水相 = 50：50的比例配制，先将油相加入乳化缸内，开动搅拌机以80-100r/min的速度缓慢搅拌，缓缓加入水相，加完后再搅拌2min，然后以5500 r/min高速循环乳化9min，制成油包水单相疫苗。
实施例四 重组非洲猪瘟蛋白工程疫苗安全性试验
材料
疫苗：重组非洲猪瘟蛋白工程疫苗，批号20120301,20120302,20120303。
试验动物 (1) 18-22g小白鼠17只，购自青岛市药检所，30日龄，三元杂交断奶仔猪8头，城阳区红岛镇大西洋村生猪养殖场提供。
方法
疫苗对小白鼠的安全性
皮下注射小白鼠，每只注射0.5ml，每批疫苗注射5只，共注射15只小白鼠。同时设定2只阴性对照，每只皮下注射生理盐水50V2乳剂0.5ml。连续观察10天，观测小白鼠的健康状况。
疫苗对仔猪的安全性
仔猪共分为三个批次组和空白对照组，每组2头。批次组耳后肌肉注射研发中心提供的非洲猪瘟蛋白工程疫苗2ml/头，空白对照组耳后肌肉注射生理盐水50V2乳剂2ml/头。连续观察10天，观测仔猪的健康状况。
结果
疫苗对小白鼠的安全性试验
结果见表1，免疫组与对照组一致，无死亡发生，无任何临床不良症状出现，可见重组非洲猪瘟蛋白工程疫苗对小白鼠是安全的。
表1 疫苗对小白鼠的安全性试验结果
| 组别 | 动物数量 | 体温 | 食欲 | 健康状况 | 死亡数量 |
| 20120301 | 5 | 正常 | 正常 | 健康状况良好 | 0 |
| 20120302 | 5 | 正常 | 正常 | 健康状况良好 | 0 |
| 20120303 | 5 | 正常 | 正常 | 健康状况良好 | 0 |
| 对照 | 2 | 正常 | 正常 | 健康状况良好 | 0 |
疫苗对仔猪的安全性试验
结果见表2，所有蛋白工程疫苗免疫的共15头断奶仔猪，体温和食欲均正常，没有出现任何临床异常现象，试验结束后，15头仔猪均健活。免疫组与对照组一致，重组非洲猪瘟蛋白工程疫苗对断奶仔猪是安全的。
表2疫苗对仔猪的安全性试验结果
| 组别 | 动物数量 | 体温 | 食欲 | 健康状况 | 死亡数量 |
| 20120301 | 2 | 正常 | 正常 | 健康状况良好 | 0 |
| 20120302 | 2 | 正常 | 正常 | 健康状况良好 | 0 |
| 20120303 | 2 | 正常 | 正常 | 健康状况良好 | 0 |
| 对照 | 2 | 正常 | 正常 | 健康状况良好 | 0 |
实施例五重组蛋白工程疫苗的体液免疫及细胞免疫检测
材料
疫苗 重组非洲猪瘟蛋白工程疫苗，批号20120301,20120302,20120303。
试验动物 30日龄仔猪，20头，每组5头。
方法
免疫 将20头仔猪随机分为四组，空白对照组及三个疫苗免疫组。空白对照组免疫PBS乳化液，疫苗免疫组接种非洲猪瘟蛋白工程疫苗，疫苗浓度为100μg /ml。免疫组，每头免疫1ml，28天、56天之后分别加强一次。
抗体检测 猪血清中的特异性抗体通过传统的ELISA方法检测。包被抗原为表达纯化的P54蛋白。将包被抗原用包被稀释液CBS（PH9.6）稀释至1μg /ml，4℃过夜；5%BSA封闭，37℃，1hr；将采集的试验猪血清，按照1:200倍稀释后，加入96-well 板，37℃，1hr；加入辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃，1hr；加入底物，室温避光反应，10min；加入终止液后，在450nm读数。
猪IFNγ-ELISPOT 的检测
猪的外周血单核细胞PBMC通过全血密度梯度离心获得。RPMI 1640培养基加入10%胎牛血清，50000IU/L 青霉素，50mg/l 链霉素，培养PBMC。PBMC 中ASFV IFNγ 分泌细胞的频率用ELISPOT进行分析。细胞因子mAbs 为商业化产品（Swine IFNc Cytoset; Biosource Europe），96孔板使用8.3μg /ml IFNγ 捕捉抗体包被过夜，洗板后，用0.5%BSA封闭，37℃，1hr。封闭液倾倒后，立即加入每孔5×105PBMC，适当的刺激培养，加入表达的疫苗蛋白10μg /ml，同时PBS 作对照。5% CO237℃孵育20小时后，移除细胞，加入生物素标记的检测抗体2.5μg /ml，37℃，1hr，然后加入链霉抗生物素蛋白过氧化物酶（1hr）和TMB。对照同样处理。
结果
抗体 所有免疫猪分别在首免、二免、三免后，14天分别采集血样，分离血清进行ELISA特异性抗体检测（见图5）。与对照猪相比，所有蛋白工程苗免疫猪均可检测到特异性抗体，统计学分析表明，免疫组与对照组相比，一免后免疫组抗体水平有所升高，但不明显，二免、三免后与对照组差异极显著（P＜0.01）。
IFNγ-ELISPOT 的检测结果
见图6，体外刺激后，对照组的IFNγ分泌细胞数量不足10，而重组非洲猪瘟蛋白工程疫苗免疫组能够诱导特异性的T细胞反应，每106PBMC含有的IFNγ分泌细胞数量明显高于对照组，且差异极显著（P＜0.01），见图6。
综合抗体检测结果和IFNγ-ELISPOT检测结果，说明本发明所提供的非洲猪瘟蛋白工程疫苗，能够诱导显著的体液免疫反应和细胞免疫反应。
<110> 青岛红桥明勤生物科技有限公司
<120> 一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备
<160> 8（总序列数）
<210> 1
<211> 1045
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 非洲猪瘟蛋白工程疫苗DNA编码序列
<222> （1）…（1045）
<400>
gaa ttc tat cct cgt cat tat ggt gaa tgt agt agt cgt aaa aaa aaa gct gct gct gct att gaa gaa gaa gat att caa ttt att aat cct tat caa gat caa caa tgg gct gaa gtt act cct caa cct ggt act agt aaa cct gct ggt gct act act gct agt gct ggt aaa cct gtt act ggt cgt cct gct act aat cgt cct gct act aat aaa cct gtt act gat aat cct gtt act gat gct cct gct cat cct act gaa cct tat att gaa aat ctt cgt caa cgt aat act tat act cat aaa gat ctt gaa ggt ggt cct cgt gtt gat tgt cgt tgt ggt gat aaa ttt cct agt aaa ttt tgt tac ggt ggt aat gct att aaa act cct gat gat cct ggt gct ctt aaa cct cgt gaa gaa tat caa cct agt ggt cat att aat gtt agt cgt gct cgt gaa tgg gat act gat tat ggt agt ggt tat tat gat aat aat cgt agt aat aaa aat aat aat ggt act aat gtt aat gat act aat ggt gat att aat gat act aat ggt gat att att cgt cgt aaa cgt aaa aaa cat gtt gaa gaa att gaa agt cct cct cct agt gaa agt aat gaa gaa gat att agt cat gat gat act act agt att cat gaa cct agt cct cgt gaa cct ctt ctt cct aaa cct tat agt cgt tat caa tat aat act cct att tat tat atg cgt cct agt act caa cct ctt aat cct ttt cct ctt cct aaa cct tgt cct cct cct aaa cct tgt cct cct cct aaa cct tgt cct cct cct aaa cct tgt cct cct cct aaa cct tgt agt cct cct aaa cct tgt cgt cct cct aaa cct tgt cct cct cct aaa cct tgt cct cct cct aaa cct tgt cct cct cct aaa cct tgt cct cct tcc aaa cct tgt cct agt cct caa agt tat agt cct cct aaa cct ctt cct taa gct t
<210> 2
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工设计
<220>
<221> 非洲猪瘟蛋白工程疫苗氨基酸序列
<222> （1）…（344）
<400>
YPRHYGECSSRKKKAAAAIEEEDIQFINPYQDQQWAEVTPQPGTSKPAGATTASAGKPVTGRPATNRPATNKPVTDNPVTDAPAHPTEPYIENLRQRNTYTHKDLEGGPRVDCRCGDKFPSKFCYGGNAIKTPDDPGALKPREEYQPSGHINVSRAREWDTDYGSGYYDNNRSNKNNNGTNVNDTNGDINDTNGDIIRRKRKKHVEEIESPPPSESNEEDISHDDTTSIHEPSPREPLLPKPYSRYQYNTPIYYMRPSTQPLNPFPLPKPCPPPKPCPPPKPCPPPKPCPPPKPCSPPKPCRPPKPCPPPKPCPPPKPCPPPKPCPPSKPCPSPQSYSPPKPLP
<221> 非洲猪瘟病毒结构蛋白P72氨基酸序列
<222>（1）…（106）
<220>
<221> 非洲猪瘟结构蛋白P54氨基酸序列
<222> （109）…（163）
<220>
<221> 非洲猪瘟红细胞凝集素HA T细胞串联表位
<222>（167）…（344）
<220>
<210> 3
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 非洲猪瘟病毒结构蛋白P72氨基酸序列DNA 编码序列
<222>（1）…（318）
<400>
tat cct cgt cat tat ggt gaa tgt agt agt cgt aaa aaa aaa gct gct gct gct att gaa gaa gaa gat att caa ttt att aat cct tat caa gat caa caa tgg gct gaa gtt act cct caa cct ggt act agt aaa cct gct ggt gct act act gct agt gct ggt aaa cct gtt act ggt cgt cct gct act aat cgt cct gct act aat aaa cct gtt act gat aat cct gtt act gat gct cct gct cat cct act gaa cct tat att gaa aat ctt cgt caa cgt aat act tat act cat aaa gat ctt gaa
<210> 4
<211> 106
<212> polypeptide
<213> 人工设计
<220>
<221> 非洲猪瘟病毒结构蛋白P72氨基酸序列
<222> （1）…（106）
<400>
YPRHYGECSSRKKKAAAAIEEEDIQFINPYQDQQWAEVTPQPGTSKPAGATTASAGKPVTGRPATNRPATNKPVTDNPVTDAPAHPTEPYIENLRQRNTYTHKDLE
<210> 5
<211> 165
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 非洲猪瘟膜结构蛋白P54氨基酸DNA 编码序列
<222>（1）…（165）
<400>
cct cgt gtt gat tgt cgt tgt ggt gat aaa ttt cct agt aaa ttt tgt tac ggt ggt aat gct att aaa act cct gat gat cct ggt gct ctt aaa cct cgt gaa gaa tat caa cct agt ggt cat att aat gtt agt cgt gct cgt gaa tgg gat act gat tat
<210> 6
<211> 55
<212> polypeptide
<213> 人工设计
<220>
<221> 非洲猪瘟膜结构蛋白P54氨基酸
<222> （1）…（55）
<400>
PRVDCRCGDKFPSKFCYGGNAIKTPDDPGALKPREEYQPSGHINVSRAREWDTDY
<210> 7
<211> 534
<212> DNA
<213> 人工合成
<220>
<221> 非洲猪瘟红细胞凝集素HA T细胞串联表位DNA编码序列
<222>（1）…（534）
<400>
tat tat gat aat aat cgt agt aat aaa aat aat aat ggt act aat gtt aat gat act aat ggt gat att aat gat act aat ggt gat att att cgt cgt aaa cgt aaa aaa cat gtt gaa gaa att gaa agt cct cct cct agt gaa agt aat gaa gaa gat att agt cat gat gat act act agt att cat gaa cct agt cct cgt gaa cct ctt ctt cct aaa cct tat agt cgt tat caa tat aat act cct att tat tat atg cgt cct agt act caa cct ctt aat cct ttt cct ctt cct aaa cct tgt cct cct cct aaa cct tgt cct cct cct aaa cct tgt cct cct cct aaa cct tgt cct cct cct aaa cct tgt agt cct cct aaa cct tgt cgt cct cct aaa cct tgt cct cct cct aaa cct tgt cct cct cct aaa cct tgt cct cct cct aaa cct tgt cct cct tcc aaa cct tgt cct agt cct caa agt tat agt cct cct aaa cct ctt cct
<210> 8
<211> 178
<212> polypeptide
<213> 人工设计
<220>
<221> 非洲猪瘟红细胞凝集素HA T细胞串联表位氨基酸序列
<222> （1）…（178）
<400>
YYDNNRSNKNNNGTNVNDTNGDINDTNGDIIRRKRKKHVEEIESPPPSESNEEDISHDDTTSIHEPSPREPLLPKPYSRYQYNTPIYYMRPSTQPLNPFPLPKPCPPPKPCPPPKPCPPPKPCPPPKPCSPPKPCRPPKPCPPPKPCPPPKPCPPPKPCPPSKPCPSPQSYSPPKPLP
Claims (6)
1.一种非洲猪瘟多表位融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述融合蛋白。
3.一种载体，其含有权利要求2所述的核酸分子。
4.一种宿主细胞，其含有权利要求3所述的载体。
5.权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于编码核酸序列如SEQ ID No.1所示。
6.一种用于非洲猪瘟的疫苗，其包括权利要求1所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310038763.0A CN103172749B (zh) | 2013-02-01 | 2013-02-01 | 一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310038763.0A CN103172749B (zh) | 2013-02-01 | 2013-02-01 | 一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103172749A CN103172749A (zh) | 2013-06-26 |
| CN103172749B true CN103172749B (zh) | 2014-10-08 |
Family
ID=48632987
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310038763.0A Active CN103172749B (zh) | 2013-02-01 | 2013-02-01 | 一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103172749B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021210924A1 (ko) * | 2020-04-14 | 2021-10-21 | (주)플럼라인생명과학 | 아프리카돼지열병 백신 조성물 |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103952401A (zh) * | 2014-02-28 | 2014-07-30 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 克隆表达优化的非洲猪瘟vp72基因引物序列、基因、核酸疫苗及构建方法 |
| GB201410971D0 (en) | 2014-06-19 | 2014-08-06 | Pirbright Inst The | Vaccine |
| CN104497136B (zh) * | 2014-12-05 | 2017-10-31 | 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 | 非洲猪瘟病毒基因ii型毒株单克隆抗体及制备方法和应用 |
| CN106526181A (zh) * | 2016-11-22 | 2017-03-22 | 无锡艾科瑞思产品设计与研究有限公司 | 一种猪瘟病毒的快速检测方法 |
| CN108148138B (zh) * | 2017-12-14 | 2020-05-05 | 石河子大学 | 非洲猪瘟病毒多表位融合诊断抗原及其制备方法和用途 |
| KR20210092762A (ko) * | 2018-11-15 | 2021-07-26 | 캔사스 스테이트 유니버시티 리서치 파운데이션 | 아프리카 돼지 열병 바이러스에 대한 면역원성 조성물 |
| CN111658768A (zh) * | 2019-03-08 | 2020-09-15 | 浙江海隆生物科技有限公司 | 一种非洲猪瘟的多组分亚单位疫苗及其制备方法和应用 |
| WO2020251284A1 (ko) * | 2019-06-12 | 2020-12-17 | 연세대학교 원주산학협력단 | 아프리카 돼지 열병 바이러스 유래 p72, p104, p205 단백질 절편 및 이의 용도 |
| CN112444626B (zh) * | 2019-08-30 | 2023-09-12 | 洛阳普泰生物技术有限公司 | 一种非洲猪瘟病毒抗体elisa检测试剂盒及其制备方法 |
| CN111018996A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-04-17 | 河南省生物工程技术研究中心 | 一种非洲猪瘟中和表位亚单位疫苗 |
| CN110760006B (zh) * | 2019-10-31 | 2023-09-29 | 河南省生物工程技术研究中心 | 一种非洲猪瘟免疫***靶向基因工程疫苗 |
| CN111018995A (zh) * | 2019-10-31 | 2020-04-17 | 河南省生物工程技术研究中心 | 一种非洲猪瘟b、t细胞表位串联融合疫苗 |
| CN111254103B (zh) * | 2019-11-19 | 2023-06-02 | 河南省生物工程技术研究中心 | 一种非洲猪瘟基因工程疫苗高密度发酵补料培养基及发酵工艺 |
| CN110862435B (zh) * | 2019-12-05 | 2021-09-24 | 中国农业大学 | 非洲猪瘟ctl表位多肽及其应用 |
| CN113388040B (zh) * | 2020-03-13 | 2022-08-09 | 普莱柯生物工程股份有限公司 | 非洲猪瘟病毒嵌合蛋白、疫苗组合物、制备方法及其应用 |
| CN111363016A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-07-03 | 中国农业大学 | 一种非洲猪瘟免疫抗原及其制备方法和应用 |
| CN113150079B (zh) * | 2021-01-21 | 2021-12-31 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种真核表达的非洲猪瘟病毒p72抗原及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102101889A (zh) * | 2009-12-16 | 2011-06-22 | 中国农业科学院饲料研究所 | 一种非洲猪瘟病毒vp73基因的原核表达蛋白及其制备方法 |
| CN101818129B (zh) * | 2010-04-23 | 2011-11-02 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 一种分泌抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其所分泌的单克隆抗体 |
| CN101831407B (zh) * | 2010-04-23 | 2012-06-06 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 抗非洲猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其所分泌的单克隆抗体 |
-
2013
- 2013-02-01 CN CN201310038763.0A patent/CN103172749B/zh active Active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021210924A1 (ko) * | 2020-04-14 | 2021-10-21 | (주)플럼라인생명과학 | 아프리카돼지열병 백신 조성물 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103172749A (zh) | 2013-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103172749B (zh) | 一种非洲猪瘟蛋白工程疫苗的制备 | |
| CN104248762B (zh) | 一种猪流行性腹泻疫苗组合物及其制备方法和应用 | |
| CN102816246B (zh) | 一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白及其制备方法和用途 | |
| CN104628865B (zh) | 一种伪狂犬表位多肽基因工程疫苗 | |
| CN106279431B (zh) | 一种猪圆环病毒亚单位灭活疫苗 | |
| CN104628871B (zh) | 一种重组法氏囊病蛋白工程疫苗的制备 | |
| CN102210860B (zh) | 一种结核分枝杆菌tb10．4-f1融合蛋白疫苗及制备方法 | |
| CN109021115A (zh) | 一种猪圆环病毒三价亚单位疫苗 | |
| CN104894045B (zh) | 一种共表达***病毒vp1基因与免疫佐剂牛il-6基因的重组乳酸杆菌及其制备方法和应用 | |
| CN102406929B (zh) | 一种共表达分子佐剂加强型二价***蛋白工程疫苗 | |
| CN104804099B (zh) | 一种重组h9n2亚型禽流感加强型多表位疫苗 | |
| CN104726413B (zh) | 一株牛支原体nadh氧化酶的单克隆抗体 | |
| CN103992408A (zh) | 一种蓝耳病蛋白工程疫苗的制备 | |
| CN109053896A (zh) | 一种猪圆环病毒二价基因工程疫苗 | |
| CN102847168B (zh) | 一种预防奶牛乳腺炎的核酸疫苗PV-Fn的设计及其构建 | |
| CN105622760A (zh) | 一种禽传染性支气管炎多表位粘膜免疫疫苗及其应用 | |
| CN105535957A (zh) | 一种***o、a型双价灭活标记疫苗及其制备方法 | |
| CN106397602B (zh) | 一种分子佐剂加强型鸡马立克氏病蛋白工程疫苗 | |
| CN111138553B (zh) | 一种融合蛋白及一种弓形虫亚单位疫苗及其疫苗组合物 | |
| CN107129527A (zh) | 一种马链球菌兽疫亚种保护性抗原hp0623及其制备方法 | |
| CN109517044B (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒基因工程抗原和抗体 | |
| CN102372766B (zh) | 一种o型***多表位疫苗 | |
| CN102212120A (zh) | 甲型副伤寒沙门氏菌PagC亚单位疫苗及其制备方法 | |
| CN107827986B (zh) | 猪O/Mya98和O/PanAsia型***基因工程灭活疫苗 | |
| CN101886084B (zh) | 一种密码子优化的h3ha/xj3-07基因及其核酸疫苗 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: QINGDAO HONGQIAO MINGQIN BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20140819 Owner name: GUANGZHOU PUTAI BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: QINGDAO HONGQIAO MINGQIN BIOTECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20140819 |
|
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 266061 QINGDAO, SHANDONG PROVINCE TO: 510730 GUANGZHOU, GUANGDONG PROVINCE |
|
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20140819 Address after: 510730, 2020, building 35, West Garden Road, Guangzhou economic and Technological Development Zone, Guangdong, Guangzhou Applicant after: GUANGZHOU PUTAI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Applicant after: QINGDAO HONGQIAO MINGQIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 266061 Shandong City, Laoshan Province, Zhuzhou Road, No. 153, high-level personnel entrepreneurship center, building, room 1, unit B702 Applicant before: QINGDAO HONGQIAO MINGQIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 510730, 2020, building 35, West Garden Road, Guangzhou economic and Technological Development Zone, Guangdong, Guangzhou Co-patentee after: QINGDAO MINGQIN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Patentee after: GUANGZHOU PUTAI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 510730, 2020, building 35, West Garden Road, Guangzhou economic and Technological Development Zone, Guangdong, Guangzhou Co-patentee before: QINGDAO HONGQIAO MINGQIN BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Patentee before: GUANGZHOU PUTAI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20180402 Address after: 266061 Shandong City, Laoshan Province, Zhuzhou Road, No. 153, high-level personnel entrepreneurship center, building, room 1, unit B302 Patentee after: QINGDAO MINGQIN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: 510730, 2020, building 35, West Garden Road, Guangzhou economic and Technological Development Zone, Guangdong, Guangzhou Co-patentee before: QINGDAO MINGQIN BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. Patentee before: GUANGZHOU PUTAI BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |