CN104558130B - 抗病相关蛋白及其编码基因与它们在调控植物抗病性中的应用 - Google Patents

抗病相关蛋白及其编码基因与它们在调控植物抗病性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗病相关蛋白及其编码基因与它们在调控植物抗病性中的应用。本发明所提供的蛋白质为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列1的第1‑264位氨基酸的蛋白质；b)将序列表中序列1的第1‑264位氨基酸所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与抗病性相关的蛋白质；c)氨基酸序列是序列1的蛋白质；d)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与抗病性相关的蛋白质。实验证明，本发明的抗病相关蛋白及其编码基因可以用来提高植物的抗病性。

Description

抗病相关蛋白及其编码基因与它们在调控植物抗病性中的 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域中抗病相关蛋白及其编码基因与它们在调控植物抗病性中的应用。
背景技术
棉花是我国重要经济作物，棉纺织品在我国出口贸易中占有举足轻重的地位。黄萎病是棉花的最主要病害，常年发病面积超过300-400万hm2，占整个棉田面积的70％以上，一般减产20％-30％，重病田减产60％-70％甚至绝收，每年因黄萎病造成的损失达100万吨，且棉花发病后纤维品质严重降低。目前我国大面积种植的陆地棉品种(Gossypiumhirsutum)均难以达到高抗黄萎病水平，海岛棉(Gossypium barbadense)虽然抗黄萎病，但因产量低、感枯萎病、需要积温高等无法大面积种植。从1950年起，我国棉花育种家试图将海岛棉抗病基因用杂交育种方法整合到陆地棉中，培育既高抗黄萎病又丰产的品种，但均未实现，刘海洋等(2012)报道在棉花主栽区及区试中的120个品种中，只有1个品种介于抗黄萎病与耐病之间，其余均为耐病或感病品种。
棉花的主要病虫害包括枯萎病、黄萎病和棉铃虫。黄萎病不仅发病面积大，重病面积也在不断增加，尤为强致病力落叶型菌系所造成的危害更具有毁灭性，落叶型菌系中71.9％为强致病力菌。棉花黄萎病自1993年以后时有爆发，2003年我国黄河、长江流域及西部内陆棉区同时大规模爆发棉花黄萎病，2006年冀鲁豫棉区严重发生，重病田面积占种植总面积的70％以上。目前新疆已成为我国棉花主产区，随着膜下滴灌技术的普及，黄萎病发病也在迅速加重。
黄萎病的发生不仅使皮棉减产且严重影响棉花品质。黄萎病的发病程度通常分为0-4级，衡量一个品种的抗病性一般用病情指数来表示：黄萎病情指数在0-10为高抗、11-20为抗病、21-35为耐病，超过35则为感病。棉花发病后单株成铃将大幅度减少，原因是养分供应不足。发病严重时，单株成铃不足正常条件的50％(正常情况单株成铃18个左右)即使不脱落也会显著降低棉花单铃产量。据估计，2003年黄萎病的大爆发导致皮棉减产2.3亿公斤，直接导致经济损失约30亿元。此后每年因黄萎病引起的经济损失都超过10亿元。高抗棉花发病后纤维品质显著降低：一般细度降低20％，强力下降22％，长度减少2毫米。黄萎病在我国由大丽轮枝菌引起，病菌一旦传入会在土壤中存活20年以上，因此黄萎病有棉花“癌症”之称。我国从1972年开始重视黄萎病的研究与防治，但到目前为止尚未得到有效控制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高植物的抗病性。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质。
本发明所提供的蛋白质，其名称为VdAL，是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列1的第1-264位氨基酸的蛋白质；
b)将序列表中序列1的第1-264位氨基酸所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与抗病性相关的蛋白质；
c)氨基酸序列是序列1的蛋白质；
d)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与抗病性相关的蛋白质。
其中，序列1由287个氨基酸组成，序列1的第265-287位氨基酸为FLAG的氨基酸序列。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述b)或d)中的VdAL可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的VdAL的编码基因可通过将序列表中序列2的第1-792位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。上述d)中的VdAL的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
为解决上述技术问题，本发明还提供了与所述VdAL相关的生物材料。
本发明所提供的与所述VdAL相关的生物材料，为下述B1)至B20)中的任一种：
B1)编码所述VdAL的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B9)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
B10)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B11)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B12)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织；
B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物组织；
B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；
B17)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官；
B18)含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B19)含有B3)所述重组载体的转基因植物器官；
B20)含有B4)所述重组载体的转基因植物器官。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)或5)或6)所示的基因：
1)核苷酸序列是序列表中序列2的第1-792位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述VdAL的cDNA分子或DNA分子；
3)在严格条件下与1)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述VdAL的cDNA分子或DNA分子；
4)核苷酸序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；
5)与4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述VdAL的cDNA分子或DNA分子；
6)在严格条件下与4)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述VdAL的cDNA分子或DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列2由864个核苷酸组成，编码序列1所示的氨基酸序列。序列2的第793-864位核苷酸编码序列1的第265-287位氨基酸所示的FLAG；序列2的第1-792位核苷酸编码序列1的第1-264位氨基酸所示的蛋白质。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码VdAL的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的VdAL的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码VdAL且具有VdAL功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1或序列1的第1-264位氨基酸所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，B2)所述的含有编码VdAL的核酸分子的表达盒(VdAL基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达VdAL的DNA，该DNA不但可包括启动VdAL基因转录的启动子，还可包括终止VdAL基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S：来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I985)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。
可用现有的表达载体构建含有所述VdAL基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
上述生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
在本发明的一个实施方式中，VdAL的编码基因(即序列2的第1-792位核苷酸所示的DNA分子)通过含有VdAL的编码基因的表达盒的重组载体导入根癌农杆菌GV3101中。所述重组载体为用序列2的第1-792位核苷酸所示的DNA分子替换pSPT01的Sal I和Kpn I识别位点间的片段得到的重组载体pSPT01-VdAL，pSPT01-VdAL表达序列1所示的VdAL蛋白。
在本发明的另一个实施方式中，VdAL的编码基因(即序列2的第1-792位核苷酸所示的DNA分子)通过含有VdAL的编码基因的表达盒的重组载体导入根癌农杆菌GV3101中。所述重组载体为用序列2的第1-792位核苷酸所示的DNA分子替换pCAMBIA1300-Super的Pst I和Kpn I识别位点间的片段得到的重组载体pCAMBIA1300-Super-VdAL，pCAMBIA1300-Super-VdAL表达序列1所示的VdAL蛋白。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述VdAL或所述生物材料在调控植物抗病性中的应用。
上述应用中，所述植物为双子叶植物和/或单子叶植物。所述双子叶植物可为棉属植物。所述棉属植物可为棉花。所述棉花具体可为中棉所41号。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育抗病性转基因植物的方法。
本发明所提供的一种培育抗病性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入所述VdAL的编码基因得到抗病性高于所述受体植物的抗病性转基因植物的步骤。
上述方法中，所述VdAL的编码基因可为编码序列是序列表中序列2的第1-792位核苷酸的DNA分子。所述VdAL的编码基因也可为编码序列是序列表中序列2的DNA分子。
上述方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为棉属植物。所述棉属植物可为棉花。所述棉花具体可为中棉所41号。
在本发明的实施例中，所述VdAL的编码基因(即序列2所示的DNA分子)通过含有VdAL基因表达盒的VdAL基因重组表达载体导入目的植物中。
上述方法中，其中所述VdAL基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以达到更好的表达效果：
1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述VdAL基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；
2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；
3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；
5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。
所述VdAL基因重组表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞(Weissbach,1998，Method for PlantMolecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition).)。
上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述VdAL基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
为解决上述技术问题，本发明还提供了扩增编码所述VdAL的核酸分子全长或其片段的引物对。
本发明中，所述抗病可为抗黄萎病。所述黄萎病可为V991菌系引发的病害。
实验证明，本发明的VdAL(抗病相关蛋白)及其编码基因可以提高植物的抗黄萎病能力：转VdAL基因棉花的株系的黄萎病指数均低于野生型棉花品种中棉所41号的黄萎病指数，且还均低于丰产性棉花品种鲁棉研28号的黄萎病指数，转VdAL基因棉花株系P1-89、P1-96、P1-117、P1-90、P1-84和P1-134的黄萎病指数甚至低于抗黄萎病棉花品种中植棉2号的黄萎病指数；转VdAL基因棉花的株系的相对防效均高于野生型棉花品种中棉所41号的相对防效，且还高于丰产性棉花品种鲁棉研28号的相对防效，转VdAL基因棉花株系P1-89、P1-96、P1-117、P1-90、P1-84和P1-134的相对防效均达到80％以上，甚至高于抗黄萎病棉花品种中植棉2号的相对防效。
本发明的VdAL(抗病相关蛋白)及其编码基因可以可以提高植物的抗黄萎病能力，并降低黄萎病对棉花产量的影响：转VdAL基因棉花的株系的单株成铃数均高于野生型棉花品种中棉所41号的单株成铃数；转VdAL基因棉花的株系P1-89、P1-96、P1-117、P1-90、P1-84、P1-134、P1-143、P1-109、P1-105、P1-76、P1-82、P1-136、P1-100、P1-127、P1-135、P1-102、P1-80、P1-104、P1-69、P1-110和P1-111的单株成铃数还高于丰产性棉花品种鲁棉研28号的单株成铃数，转VdAL基因棉花株系P1-96、P1-117、P1-82、P1-100、P1-127、P1-102、P1-80、P1-104和P1-69单株成铃数甚至还高于抗黄萎病棉花品种中植棉2号的单株成铃数。
实验证明，本发明的VdAL(抗病相关蛋白)及其编码基因可以用来提高植物的抗病性。
附图说明
图1为部分转VdAL基因棉花株系的黄萎病指数。其中，WT表示中棉所41号，FCK表示鲁棉研28号，RCK表示中植棉2号。
图2为部分转VdAL基因棉花株系的单株成铃数。其中，WT表示中棉所41号，YCK表示鲁棉研28号，RCK表示中植棉2号。
图3为转VdAL基因拟南芥的抗黄萎病能力。其中，A为T3代转VdAL基因拟南芥株系2和株系3；B为半定量PCR鉴定T3代转VdAL基因拟南芥株系2和株系3中的VdAL基因的转录水平；C为接种棉花黄萎菌后的T3代转VdAL基因拟南芥株系2和株系3的生长状况；D为T3代转VdAL基因拟南芥株系2和株系3的病情指数。
图4为western-blot鉴定T3代转VdAL基因拟南芥株系2和株系3中的VdAL蛋白的表达。
图5为转VdAL基因棉花株系P1-89中VdAL基因的Western blot检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的棉花黄萎菌为V991菌系(齐俊生,李怀方.一种检测棉花黄萎菌毒素致萎性的新方法——叶片针刺涂抹法.棉花学报，2016,18(4):228-232)公众可从中国农业大学(即申请人)获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的中植棉2号为山东金秋种业有限公司产品。
下述实施例中的鲁棉研28号为山东农兴种业有限公司产品
下述实施例中的中棉所41号为新疆棉诚种业有限公司产品。
下述实施例中的拟南芥Col为SALK Institute产品。
下述实施例中的载体pSPT01为中国专利201010521702.6(公开号为CN101962658A)的实施例1的pSPT01，pSPT01为是以pCambia1300为基础进行改造的，目的基因的启动子为Super强启动子，并在启动子后面增加了Flag序列，此外报告基因被更换为tfdA基因。
下述实施例中的载体pCAMBIA1300-Super为中国专利201010521702.6(公开号为CN 101962658A)的实施例1的pCAMBIA1300-Super，pCAMBIA1300-Super为将pCAMBIA1300(GenBank为FJ362601.1)中的CaMV35S启动子更换为Super强启动子，并将酶切位点进行改造得到的载体。
下述实施例中的根癌农杆菌GV3101为北京九州天瑞科技有限公司产品。
实施例1、抗病相关蛋白VdAL提高棉花的抗病性
一、转VdAL基因棉花的构建
1、重组载体及重组菌的构建
人工合成序列表中序列2的第1-792位核苷酸所示的DNA分子，即抗病相关蛋白VdAL基因。将载体pSPT01的Sal I和Kpn I识别位点间的序列替换为序列表中序列2的第1-792位核苷酸所示的DNA分子(即抗病相关蛋白VdAL基因)，保持pSPT01的其他序列不变，得到重组载体，将得到的重组载体命名为pSPT01-VdAL。重组载体pSPT01-VdAL表达序列表中序列1所示的抗病相关蛋白VdAL。
其中，序列2由864个核苷酸组成，编码序列1所示的氨基酸序列。序列2的第793-864位核苷酸编码序列1的第265-287位所示的FLAG；序列2的第1-792位核苷酸编码序列1的第1-264位氨基酸所示的蛋白质。
将pSPT01-VdAL导入根癌农杆菌GV3101中，得到重组菌，将得到的重组菌命名为A-pSPT01-VdAL。
将pSPT01导入根癌农杆菌GV3101中，得到转空载体的重组菌，将得到的重组菌命名为A-pSPT01。
2、转抗病相关蛋白VdAL基因棉花的构建
(1)将步骤1的A-pSPT01-VdAL在含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和终浓度为50μg/mL的利福平的YEB固体培养基上划菌，活化菌株，28℃培养48h，得到单菌落；
(2)挑步骤(1)得到的单菌落于5mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和终浓度为50μg/mL的利福平的YEB液体培养基中，28℃摇菌12h，得到菌液；
(3)将2mL步骤(2)得到的菌液接到500mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和终浓度为50μg/mL的利福平的YEB液体培养基中，28℃摇床震荡培养至OD600＝0.8-1.0，得到菌液；
(4)于4000rpm、10min、室温下离心步骤(3)得到的菌液，得到菌体沉淀；
(5)用1/2MS溶液200mL重悬步骤(4)的菌体沉淀，加入15μL Silwet-77，混匀，得到农杆菌侵染液；
(6)将棉花品种中棉所41号(2，4-D敏感株)的花蕾套袋隔离，第二天上午8-9点对套袋的花蕾喷施步骤(5)的农杆菌侵染液，然后将喷施农杆菌侵染液的花蕾套袋避光，并用红绳标记转化花蕾，该植株即为T0代转基因植株，将转基因植株传代至T4代(每代均为自交)，每代均利用2,4-D进行筛选，得到以下T4代转VdAL基因棉花的株系：P1-89、P1-96、P1-117、P1-90、P1-84、P1-134、P1-143、P1-109、P1-105、P1-76、P1-82、P1-136、P1-100、P1-127、P1-135、P1-102、P1-80、P1-104、P1-69、P1-110、P1-125和P1-111；
(7)在基因组水平上鉴定步骤(6)的T4代转VdAL基因棉花的株系中的VdAL基因。棉花品种中棉所41号为野生型对照，引物对为ATGCTTTCTCTCCAGACCGC和GAGATTTGCCGGCGGCGGTG。结果表明，步骤(6)的T4代转VdAL基因棉花的株系的PCR产物中均有大小为792bp的目的条带，说明步骤(6)的T4代转VdAL基因棉花的株系中均含有VdAL基因；
(8)利用半定量PCR鉴定步骤(6)的T4代转VdAL基因棉花的株系中的VdAL基因的表达。棉花品种中棉所41号为野生型对照，引物对为：ATGCTTTCTCTCCAGACCGC和GAGATTTGCCGGCGGCGGTGT，内参为UBQ，内参的引物为CCCTGGCTGATTACATC和TGGTGTCAGTGGGTTCAATG。结果表明，T4代转VdAL基因棉花的株系的PCR产物中均有目的条带，说明步骤(6)的T4代转VdAL基因棉花的株系均表达VdAL基因。
(9)利用Western-blot鉴定步骤(6)的T4代转VdAL基因棉花的株系中的VdAL蛋白的表达。棉花品种中棉所41号为野生型对照，抗体为flag抗体(flag抗体为上海近岸科技有限公司/欣百诺生物产品，货号为AB003-01A)，用丽春红(Ponceau S)染色液标记总蛋白调整上样量，使不同泳道中的总蛋白量一致，结果见图5。结果表明，步骤(6)的T4代转VdAL基因棉花的株系均表达VdAL蛋白。
按照步骤(1)-(6)的方法，将A-pSPT01-VdAL替换为A-pSPT01，替他步骤不变，得到转空载体的转基因棉花，将其命名为转空载体棉花。
二、转VdAL基因棉花的抗病性鉴定
对VdAL转基因棉花接种棉花黄萎菌，以接种后的植株的黄萎病指数和单株成铃数评判植株的抗病性。实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
将棉花黄萎菌均匀接种至山东的田间病圃中，得到V991菌系均匀分布的病圃。将步骤一的转VdAL基因棉花的株系P1-89、P1-96、P1-117、P1-90、P1-84、P1-134、P1-143、P1-109、P1-76、P1-82、P1-136、P1-100、P1-127、P1-135、P1-102、P1-80、P1-104、P1-69、P1-110、P1-111和转空载体棉花以及棉花品种中棉所41号、抗黄萎病棉花品种中植棉2号和丰产性棉花品种鲁棉研28号种植在上述病圃中。每个株系30株。
在棉花生长的花铃期按照下述方法对棉花的发病情况进行分级，并计算棉花的黄萎病情指数与相对防效(表2和图1)：
0级：没有叶片发病的植株；
I级：0.1％-25％的叶片发病；
II级：25％-50％的叶片发病，不包括25％的叶片发病；
III级：50％-75％叶片的发病，不包括50％的叶片发病；
IV级：75％以上的叶片发病。
病情指数＝(1×I级株数+2×II级株数+3×III级株数+4×IV级株数)/(4×调查株数)×100。
相对防效(％)＝(中棉所41号病情指数-转VdAL基因棉花病情指数)/中棉所41号病情指数×100％(将中棉所41号的相对防效定义为0)。
在棉花生长的花铃后期统计棉花的单株成铃数，结果如表3和图2所示。
表2、转VdAL基因棉花的黄萎病指数与相对防效
株系/品种 黄萎病情指数 相对防效(％)
P1-89 2.78±1.00 93
P1-96 5.00±0.58 88
P1-117 5.68±0.58 86
P1-90 6.58±1.41 84
P1-84 6.82±0.50 83
P1-134 7.14±3.00 83
P1-143 9.09±1.00 78
P1-109 11.36±1.29 73
P1-76 12.50±1.05 70
P1-82 13.16±2.50 68
P1-136 13.64±2.16 67
P1-100 13.64±0.50 67
P1-127 16.30±2.06 61
P1-135 17.71±1.71 58
P1-102 18.06±1.26 57
P1-80 20.26±2.45 51
P1-104 22.83±4.24 45
P1-69 29.41±0.00 30
P1-110 27.63±0.96 34
P1-111 26.67±1.50 36
转空载体棉花 43.78±2.54 -4
中棉所41号 42.19±0.95 0
中植棉2号 7.61±0.71 82
鲁棉研28号 43.36±1.04 -3
结果显示，棉花品种中棉所41号的黄萎病指数与转空载体棉花的黄萎病指数基本无差异，转VdAL基因棉花的株系的黄萎病指数均低于野生型棉花品种中棉所41号的黄萎病指数，且还均低于丰产性棉花品种鲁棉研28号的黄萎病指数，部分株系(如P1-89、P1-96、P1-117、P1-90、P1-84和P1-134)的黄萎病指数甚至低于抗黄萎病棉花品种中植棉2号的黄萎病指数。棉花品种中棉所41号的相对防效与转空载体棉花的相对防效基本无差异，转VdAL基因棉花的株系的相对防效均高于野生型棉花品种中棉所41号的相对防效，且还高于丰产性棉花品种鲁棉研28号的相对防效，部分株系(如P1-89、P1-96、P1-117、P1-90、P1-84和P1-134)的相对防效均达到80％以上，甚至高于抗黄萎病棉花品种中植棉2号的相对防效。
结果表明，本发明的VdAL可以提高植物的抗黄萎病能力。
表3、转VdAL基因棉花的单株成铃数
株系/品种 单株成铃率数 与中棉所41号的倍数关系
P1-89 10.3±1.91 2.71
P1-96 12.5±1.00 2.55
P1-117 12.2±1.21 2.49
P1-90 9.4±1.32 1.92
P1-84 8.9±1.10 1.82
P1-134 6.7±0.89 1.37
P1-143 10.2±0.78 2.08
P1-109 9.3±1.12 1.90
P1-105 10.7±0.99 2.18
P1-76 11.5±1.13 2.35
P1-82 12.1±0.57 2.47
P1-136 8.8±1.31 1.80
P1-100 13.1±1.16 2.67
P1-127 12.2±1.30 2.49
P1-135 9.1±2.00 1.86
P1-102 11.9±0.30 2.43
P1-80 12.5±1.23 2.55
P1-104 13.3±0.95 2.71
P1-69 12.1±1.41 2.47
P1-110 10.9±0.59 2.22
P1-111 10±1.11 2.04
转空载体棉花 4.1±1.18 0.84
中棉所41号 4.9±0.78 ——
中植棉2号 11.5±1.43 ——
鲁棉研28号 8.0±1.90 ——
注：“——”表示未作比较。
结果显示，棉花品种中棉所41号的单株成铃数与转空载体棉花的单株成铃数基本无差异，转VdAL基因棉花的株系的单株成铃数均高于野生型棉花品种中棉所41号的单株成铃数；转VdAL基因棉花的株系P1-89、P1-96、P1-117、P1-90、P1-84、P1-134、P1-143、P1-109、P1-105、P1-76、P1-82、P1-136、P1-100、P1-127、P1-135、P1-102、P1-80、P1-104、P1-69、P1-110和P1-111的单株成铃数还高于丰产性棉花品种鲁棉研28号的单株成铃数，部分株系(如P1-96、P1-117、P1-82、P1-100、P1-127、P1-102、P1-80、P1-104和P1-69)单株成铃数甚至还高于抗黄萎病棉花品种中植棉2号的单株成铃数。结果表明，本发明的VdAL可以提高植物的抗黄萎病能力，并降低黄萎病对棉花产量的影响。
实施例2、抗病相关蛋白VdAL提高拟南芥的抗病性
一、转VdAL基因拟南芥的构建
1、重组载体及重组菌的构建
人工合成序列表中序列2的第1-792位核苷酸所示的DNA分子，即抗病相关蛋白VdAL基因。将载体pCAMBIA1300-Super的Pst I和Kpn I识别位点间的序列替换为序列表中序列2所示的第1-792位核苷酸的DNA分子(即抗病相关蛋白VdAL基因)，pCAMBIA1300-Super的其他序列不变，得到重组载体，将得到的重组载体命名为pCAMBIA1300-Super-VdAL。重组载体pCAMBIA1300-Super-VdAL表达序列表中序列1所示的蛋白质。
其中，序列2由864个核苷酸组成，编码序列1所示的氨基酸序列。序列2的第793-864位核苷酸编码序列1的第265-287位所示的FLAG；序列2的第1-792位核苷酸编码序列1的第1-264位氨基酸所示的蛋白质。
将pCAMBIA1300-Super-VdAL导入根癌农杆菌GV3101中，得到重组菌，将得到的重组菌命名为A-pCAMBIA1287-Super-VdAL。
将pCAMBIA1300-Super导入根癌农杆菌GV3101中，得到转空载体的重组菌，将该重组菌命名为A-pCAMBIA1300-Super。
2、转抗病相关蛋白VdAL基因拟南芥的构建
(1)将步骤1的重组菌A-pCAMBIA1300-Super-VdAL在含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和终浓度为50μg/mL的利福平的YEB固体培养基上划菌，活化菌株，28℃培养48h，得到单菌落；
(2)挑步骤(1)得到的单菌落于5mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和终浓度为50μg/mL的利福平的YEB液体培养基中，28℃摇菌12h，得到菌液；
(3)将2mL步骤(2)得到的菌液接到500mL含有终浓度为50μg/mL的卡那霉素和终浓度为50μg/mL的利福平的YEB液体培养基中，28℃摇床震荡培养至OD600＝0.8-1.0，得到菌液；
(4)于4000rpm、10min、室温下离心步骤(3)得到的菌液，得到菌体沉淀；
(5)用1/2MS溶液200mL重悬步骤(4)的菌体沉淀，加入15μL Silwet-77，混匀，得到农杆菌侵染液；
(6)将处于开花期的拟南芥Col的花絮在步骤(5)得到的农杆菌侵染液中浸泡30sec，然后取出拟南芥在黑暗中室温培养24h，得到侵染后的拟南芥；
(7)将步骤(6)的侵染后的拟南芥在弱光下室温培养24h后，于22℃、16h光照/8h黑暗的光周期下培养，该植株即为T0代转基因植株，将转基因植株传代至T3代(每代均为自交)，每代均利用潮霉素进行筛选，得到T3代转VdAL基因拟南芥株系2和株系3(图3中A)；
(8)在基因组水平上鉴定步骤(7)的T3代转VdAL基因拟南芥株系2和株系3中的VdAL基因。拟南芥Col为野生型对照，引物对为：ATGCTTTCTCTCCAGACCGCAGC和TAGCGCAGTTACGATCAGGGTCG。结果表明，株系2和株系3的PCR产物中均有大小为403bp的目的条带，说明株系2和株系3中均含有VdAL基因；
(9)利用半定量PCR鉴定步骤(7)的T3代转VdAL基因拟南芥株系2和株系3中的VdAL基因的表达。拟南芥Col为野生型对照，引物对为：GCAACATCACCCTTCGTACT和CAGACTGGTTGCCGAAGAA。内参为UBQ，内参的引物为CCCTGGCTGATTACATC和TGGTGTCAGTGGGTTCAATG(图3中B)。结果表明，株系2和株系3的PCR产物中均有目的条带，说明株系2和株系3均表达VdAL基因。
(10)利用western-blot鉴定步骤(7)的T3代转VdAL基因拟南芥株系2和株系3中的VdAL蛋白的表达。拟南芥Col为野生型对照，抗体为flag抗体(flag抗体为上海近岸科技有限公司/欣百诺生物产品，货号为AB003-01A)，用丽春红(Ponceau S)染色液标记总蛋白调整上样量，使不同泳道中的总蛋白量一致，结果见图4。结果表明，株系2和株系3均表达VdAL蛋白。
按照步骤(1)-(7)的方法，将A-pCAMBIA1300-Super-VdAL替换为A-pCAMBIA1300-Super，替他步骤不变，得到转空载体的转基因拟南芥，将其命名为转空载体拟南芥。
二、转VdAL基因拟南芥的抗病性鉴定
对VdAL转基因拟南芥接种棉花黄萎菌，以接种后的植株的病害指数评判植株的抗病性。实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
将棉花黄萎菌的孢子悬浮于无菌蒸馏水中，得到浓度为1×106cfu/mL的孢子悬液。将步骤一的转VdAL基因拟南芥株系2在上述孢子悬液中浸泡30s后，在22℃、16h光照/8h黑暗的光周期下培养21天，得到处理株系2，共处理30株。
按照上述方法，将步骤一的VdAL基因拟南芥株系2分别替换为步骤一的VdAL基因拟南芥株系3、Col和步骤一的转空载体拟南芥，其他步骤均不变，分别得到处理株系3、处理Col和处理转空载体拟南芥。
按照上述方法，将步骤一的VdAL基因拟南芥株系2替换为Col非转基因对照、并将孢子悬液替换为无菌蒸馏水，其他步骤均不变，得到蘸水对照Col。
按照下述标准(请核实下述标准)分别统计处理株系2、处理株系3、处理Col、处理转空载体拟南芥和蘸水对照Col的病情指数(图3中C和D)：
0级：没有叶片发病的植株；
1级：0.1％-25％的叶片发病；
2级：25％-50％的叶片发病，不包括25％的叶片发病；
3级：50％-75％叶片的发病，不包括50％的叶片发病；
4级：75％以上的叶片发病。
病情指数的计算公式：病情指数＝[Σ各级病级数×株数/(总株数×最高病级)]×100。
结果显示，Col的病情指数和转空载体拟南芥的病情指数无显著差异；Col的病情指数为95±2.6；株系2的病情指数为76±1.6，为Col的0.80；株系3的病情指数为74±5.4，为Col的0.78；蘸水对照Col的病情指数为0。株系2和株系3的病情指数均显著低于Col的的病情指数。结果表明，VdAL可以提高植物的抗黄萎病能力。

Claims (8)

1.如下a)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列1的第1-264位氨基酸的蛋白质；
c)氨基酸序列是序列1的蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下1)或2)所示的基因：
1)核苷酸序列是序列表中序列2的第1-792位核苷酸的DNA分子；
2)核苷酸序列是序列表中序列2的DNA分子。
4.权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述生物材料在调控植物抗病性中的应用；所述抗病性为抗黄萎病。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
6.一种培育抗病性转基因植物的方法，包括向受体植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因得到抗病性高于所述受体植物的抗病性转基因植物的步骤；所述抗病性为抗黄萎病。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：权利要求1所述蛋白质的编码基因是编码序列为序列表中序列2的第1-792位核苷酸的DNA分子。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物和/或单子叶植物。
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