CN104619862A - 单细胞的多转录物的高通量测序 - Google Patents

单细胞的多转录物的高通量测序 Download PDF

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Abstract

本公开大体上涉及以高通量方式测序表达于单细胞中的两个或更多个基因。更具体地说，本公开涉及一种用于高通量测序共表达于单细胞中的成对转录物(例如抗体VH和VL编码序列)以测定包括免疫受体的成对多肽链的方法。

Description

单细胞的多转录物的高通量测序
本申请要求2012年6月15日提交的美国临时申请号61/660,370的优先权权益，所述案的所有内容以引用的方式并入本文中。
发明背景
1.发明领域
本发明大体上涉及分子生物学和免疫学的领域。更具体地说，本发明涉及用于高通量分离cDNA编码免疫细胞受体和抗体的方法。
2.相关领域的描述
存在对以高通量从单个细胞鉴别两种或更多种转录物的表达的需要。具体地说，对于许多生物技术和医学应用来说，以极高通量从单个细胞鉴别并且测序编码包括适应性免疫受体的两条链的基因对以准确测定表达于患者或实验室动物中的免疫受体的完整组库是重要的。由B淋巴细胞和T淋巴细胞表达的免疫受体分别由VH和VL抗体基因以及由TCRα/β或γ/δ链基因编码。人具有基于表面标志(CD蛋白)和转录因子(例如Treg T淋巴细胞亚群的FoxP3)的表达被分类成不同亚群的数万或数百万种不同的B淋巴细胞和T淋巴细胞。高通量DNA测序技术已用以测定相关于具体疾病状态的淋巴细胞亚群的VH或VL链的组库，或替代地，TCRα和β的组库，或更一般地说，以研究适应性免疫***的功能(Wu等,2011)。免疫学研究人员对一次高通量分析多转录物具有尤其大的需求。
目前可获得的用于免疫组库测序的方法涉及从所关注的细胞群体，例如骨髓的记忆B细胞或浆细胞，分离出mRNA，然后大批进行RT-PCR以合成用于高通量DNA测序的cDNA(Reddy等,2010；Krause等,2011)。但是，重抗体链和轻抗体链(或α和βT细胞受体)在分开的mRNA链上编码并且必须分开测序。因此，这些可获得的方法具有单独地揭开全部重链免疫组库和轻链免疫组库的可能，但还不能解决以高通量的重链和轻链配对。在不以单细胞水平的多转录物分析以收集重链和轻链配对数据的情况下，包括两条链的全适应性免疫受体不能测序或重建并且表达用于进一步研究。
发明概述
在第一实施方案中，本发明提供一种方法，所述方法包括(a)将单细胞和mRNA捕获剂隔离到单独隔室中；(b)使细胞裂解并且收集具有mRNA捕获剂的mRNA转录物；(c)使用mRNA捕获剂从隔室分离mRNA；(d)进行逆转录，然后对捕获的mRNA进行PCR扩增；以及(e)测序从单细胞扩增的至少两个不同cDNA产物。在某些方面中，细胞可为B细胞(例如，浆细胞或记忆B细胞)、T细胞、NKT细胞和癌细胞。
因此，在特定实施方案中，本发明提供一种用于获得多个成对抗原受体序列的方法，所述方法包括：(a)用固定化寡核苷酸将单哺乳动物细胞分离于单独隔室中用于引发逆转录；(b)使细胞裂解并且允许mRNA转录物与固定化寡核苷酸缔合；(c)进行逆转录，然后进行PCR扩增以获得对应于单细胞的mRNA转录物的cDNA；(d)测序cDNA；以及(e)基于测序鉴别多个单细胞的多mRNA转录物(例如成对抗原受体序列)。例如，在一些方面中，提供一种用于获得多个成对抗体VH和VL序列的方法，所述方法包括：(a)用固定化寡核苷酸将单B细胞分离于单独隔室中用于引发逆转录；(b)使B细胞裂解并且允许mRNA转录物与固定化寡核苷酸缔合；(c)进行逆转录，然后进行PCR扩增以获得对应于单B细胞的mRNA转录物的cDNA；(d)测序cDNA；以及(e)鉴别多个单B细胞的成对抗体VH和VL序列。在另外方面中，提供一种用于获得多个成对T细胞受体序列的方法，所述方法包括(a)用固定化寡核苷酸将单T细胞分离于单独隔室中用于引发逆转录；(b)使T细胞裂解并且允许mRNA转录物与固定化寡核苷酸缔合；(c)进行逆转录，然后进行PCR扩增以获得对应于单T细胞的mRNA转录物的cDNA；(d)测序cDNA；以及(e)基于测序鉴别多个单T细胞的成对T细胞受体序列。
在另外方面中，所述方法包括获得至少10,000个、100,000个或1,000,000个单个细胞(例如，在约100,000个与一千万个或一亿个之间的单个细胞)的序列。因此，在一些方面中，所述方法包括获得至少5,000个、10,000个或100,000个个体成对抗体VH和VL序列(例如，在约10,000个与100,000个、一百万个或一千万个之间的个体成对序列)。在某一方面中，获得如VH和VL序列的成对序列可包括通过进行重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应来连接cDNA(例如，VH和VL cDNA)以连接单分子中的cDNA。在替代方面中，实施方案的方法不包括使用重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应。例如，两个(或更多个)cDNA序列可通过测序不同分子，如通过测序不同分开的VH和VL cDNA分子获得。
在一个方面中，所述方法还包括使用概率分析测定天然成对转录物。在这个方面中，鉴别成对转录物可包括比较原始测序读长计数(read count)。例如，概率分析可包括进行图9的步骤。在特定方面中，方法可包括通过进行序列的概率分析鉴别成对抗体VH和VL序列。在某些方面中，概率分析可基于CDR-H3和/或CDR-L3序列。在一些情况下，鉴别成对抗体VH和VL序列可包括比较原始测序读长计数。在另一方面中，概率分析可包括进行图9的步骤。
本实施方案的某些方面涉及mRNA捕获剂。例如，mRNA捕获剂可为如珠粒的固体支持物，其包括固定化寡核苷酸或如葡聚糖和琼脂糖的聚合物网络。在一个方面中，珠粒为二氧化硅珠粒或磁性珠粒。mRNA捕获剂可包括杂交mRNA的寡核苷酸。例如，寡核苷酸可包括至少一个poly(T)和/或对所关注的转录物特异的引物。在某些方面中，实施方案的珠粒小于分离的单个细胞(例如B细胞)。
在一些方面中，实施方案的单独隔室可为凝胶或微量滴定板中的孔。在一个方面中，单独隔室可具有小于5nL的体积。在一些方面中，孔可在使细胞裂解之前或在进行RT-PCR之前用透性膜密封。在又另一方面中，单独隔室可为乳液中的微泡。
在另外方面中，隔离单细胞(和mRNA捕获剂)和裂解细胞裂解(步骤(a)和(b))可同时进行。因此，在一些方面中，方法可包括分离单细胞和mRNA捕获剂到乳液中并且存在细胞裂解溶液的单独微泡中。
在另外方面中，实施方案的方法可包括通过进行重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应来连接cDNA以将至少2个转录物连接到单DNA分子中(例如，在步骤(e)中)。在替代方面中，步骤(e)可不包括使用重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应。在某些方面中，步骤(e)可包括通过进行重组来连接cDNA。
在又另外方面中，隔离单细胞可包括将细胞引入到包括多个微孔的装置，以使得大部分细胞以单细胞的形式(与mRNA捕获剂一起，如珠粒)捕获。在另外方面中，方法可包括共价连接到同一珠粒的两个或更多个转录物的测序。
因此，在一些实施方案中，提供用于获得多个成对抗体VH和VL序列的方法，其中细胞为B细胞。在一个方面中，方法为用于获得结合到关注抗原的抗体的成对抗体VH和VL序列的方法。在某些方面中，珠粒可缀合到所关注抗原，并且寡核苷酸在结合到所关注抗原的抗体的存在下仅缀合到珠粒。例如，珠粒可包覆有所关注抗原，并且mRNA捕获剂(例如，oligo-T)可与仅在结合到抗原的抗体的存在下的珠粒缔合(参见例如，图10)。例如，mRNA捕获剂可与蛋白A缔合或以其它方式起作用以结合到抗体(若存在)。
实施方案的某些方面可涉及从受试者获得样品(例如，包括用于实施方案的方法中的细胞的样品)。样品可直接取自受试者或可获自第三方。样品包括但不限于血清、粘膜(例如唾液)、淋巴、尿液、粪便，和实体组织样品。类似地，实施方案的某些方面涉及生物体液和来自生物体液的抗体和/或核酸。例如，生物体液可为血液(例如，血清)、脑脊髓液、滑液、产妇母乳、脐带血、腹腔液、粘膜分泌物、泪液、鼻分泌物、唾液、乳汁、或泌尿生殖器分泌物。在某些方面中，根据实施方案使用的细胞为哺乳动物细胞，如小鼠细胞、大鼠细胞或猴子细胞。在优选的方面中，细胞为人细胞。
在一些方面中，实施方案中所用的细胞为B细胞，如来自所选器官如骨髓的B细胞。例如，B细胞可为成熟B细胞，如骨髓浆细胞、脾浆细胞或***浆细胞，或外周血或淋巴器官的细胞。在某些方面中，B细胞是基于细胞表面标志(例如，Blimp-1、CD 138、CXCR4或CD45)的差异表达来选择或富集。在一些情况下，获得所选类别抗体的序列，如IgE、IgM、IgG或IgA序列。
在另外方面中，实施方案的方法可包括使受试者免疫(例如，在获得细胞样品之前)。所述方法可还包括分离淋巴组织。淋巴组织分离可在免疫之后至少或约1、2、3、4、5、6、6、8、9、10天或任何中间范围。所述方法可还包括获得淋巴组织的核酸群体，优选地未将B细胞从淋巴组织中分开。淋巴组织可为初级淋巴组织、次级淋巴组织或三级淋巴组织，如骨髓、脾或***。受试者可为任何动物，如哺乳动物、鱼、两栖动物或鸟。哺乳动物可为人、小鼠、灵长类动物、兔、羊或猪。
为了测定核酸序列(例如，在B细胞中或在淋巴组织中)，可使用本领域中已知的任何核酸测序方法，其包括高通量DNA测序。高通量测序方法的非限制性实例包括合成测序(例如，454测序)、连接法测序、杂交测序、单分子DNA测序、多聚合酶群落测序(multiplexpolony sequencing)、纳米孔测序或其组合。
在另一实施方案中，本发明提供一种***，其包括(a)含水流体相出口，其安置在环形流动油相中；和(b)含水流体相，其中水相流体包含细胞悬浮液并且分散于流动油相内，产生具有包含细胞的含水悬浮液的低尺寸分散性的乳化液滴。在一个方面中，含水流体相出口为针。在另一方面中，含水流体相出口为玻璃管。在某些方面中，油相流过玻璃管或聚合物管。在某些方面中，水相流过聚合物管。在又另一方面中，细胞浓度、含水流体相流速和油相流速允许液滴的形成，其中每个液滴含有单细胞。在一些方面中，细胞选自由以下组成的组：B细胞、T细胞、NKT细胞和癌细胞。在某些方面中，含水流体相包括用于核酸捕获逆转录试剂、聚合酶链式反应试剂和/或其组合的珠粒。
在又另一实施方案中，本发明提供一种组合物，其包含(a)珠粒；(b)能够结合mRNA的寡核苷酸；和(c)对所关注的转录物特异的两个或更多个引物。
在又另一实施方案中，本发明提供一种组合物，其包含具有多个单独微泡的乳液，所述微泡包含具有用于引发逆转录的固定化寡核苷酸的珠粒和个体B细胞，所述B细胞已破裂以释放mRNA转录物。
在某些实施方案中，本发明提供一种方法，所述方法包括(a)将公共序列添加到对一组基因靶标特异的两个或更多个寡核苷酸的5’区；(b)通过引发公共序列进行所述组基因标靶的核酸扩增；以及(c)包括在核酸扩增寡核苷酸中，其包括将公共序列固定到表面上，以使得固定化寡核苷酸引发核酸扩增，并且导致扩增序列的表面捕获。
如本文在说明书中所用，“一个”或“一种”可意指一个(种)或多个(种)。如权利要求中所用，当与词语“包括/包含(comprising)”结合使用时，词语“一个”或“一种”可意指一个(种)或多于一个(种)。
除非明确指明仅仅指代替代物，或替代物相互排斥，否则权利要求书中所用的术语“或”用于意指“和/或”，尽管本公开支持仅仅指代替代物和“和/或”的定义。如本文所用的“另一”可意指至少第二个(种)或更多个(种)。
在整个本申请中，术语“约”用于指明值包括装置、用以测定所述值的方法的误差的固有变化，或研究受试者中存在的变化。
通过以下详细描述，本发明的其它目的、特征和优势将变得显而易见。然而，应理解的是，尽管指示本发明的优选实施方案，但是详细描述和特定实施例仅通过说明的方式给出，因为从此详细描述中，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图简述
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。本发明可通过参考与本文提出的特定实施方案的详细描述结合的这些附图中的一个或多个来更好地理解。
图1示出分离到单独密封孔中的细胞。孔中的小的、球形物体为珠粒。本图像是通过透析膜取得的。孔直径为大致56μm。
图2示出左边：在即刻裂解之前分离的单细胞；中间：在裂解过程中的细胞；以及右边：使用时差显微技术(time-lapse microscopy)，紧接于裂解之后的微孔。孔直径为大致56μm。
图3示出连接的OE RT-PCR产物。字母指示恒定区、可变区、接合区和多样性区的大致位置，同时数字指示互补决定区的大致位置。
图4示出连锁(重叠延伸)RT-PCR过程的概况，a)具有5’互补重/轻重叠区的V区引物退火到第一条链cDNA。b)第二条链cDNA通过5’到3’延伸来形成；重叠区结合到所有cDNA中。c)在变性之后，具有第一有义链的重链和轻链退火以通过5’至3’延伸产生完整的850bp产物。将CDR-H3和CDR-L3定位在最终连接构造外侧附近，从而允许通过2x250双端Illumina测序的CDR3分析。
图5示出可存活地封装在经由流动聚焦形成的液滴中的MOPC-21细胞。到流动聚焦装置的两条输入流由等量份的MOPC-21细胞的PBS溶液(100,000个细胞/毫升，细胞流)和0.4％台盼蓝的PBS溶液(染料流)组成，并且细胞流和染料流在乳滴形成之前立即混合在一起。MOPC-21细胞示出排除台盼蓝，说明乳滴内单细胞的可存活地封装。
图6表示施加到B细胞群体的天然抗体VH和VL mRNA的测序的多转录物的高通量测序技术的概况。i)将B细胞群体针对所需表型分选(例如，mBC、记忆B细胞、初生BC、初生B细胞)。ii)将单细胞通过随机下沉到微孔阵列中分离；还将poly(dT)微珠粒添加到孔中。iii)将孔用透析膜密封，并且用裂解缓冲液平衡以裂解细胞并且使VH和VL mRNA退火到poly(dT)珠粒(斑点表示裂解细胞，圆圈描绘磁性珠粒，黑线描绘mRNA链)。iv)将珠粒回收,乳化用于cDNA合成并连锁PCR以产生～850-碱基对VH:VL cDNA产物。v)进行下一代测序(Next-generation sequence)以测序连接的链。vi)生物信息处理用于分析成对VH:VL组库。
图7示出在寡核苷酸固定磁性珠粒上重链和轻链DNA的扩增用于高通量测序。a)珠粒显示3个固定化寡核苷酸的混合物：poly(T)用于mRNA捕获，AHX89用于重链扩增和BRH06用于轻链扩增。b)从已退火到固定化poly(T)寡核苷酸的捕获mRNA(由灰色虚线表示)起始逆转录。特别设计的免疫球蛋白恒定区逆转录引物具有在5’端的AHX89(用于重链)或BRH06(用于轻链)。逆转录聚合酶链式反应发生在乳滴内部。c)V区正向引物具有在5’端的<F3>序列(重链)或<F5>序列(轻链)，其将用于起始焦磷酸测序。cDNA链显示为黑线。
图8示出喷嘴/载体流设备的图。玻璃毛细管提供围绕针出口的外部油相载体流(箭头)。针注射含有细胞的水相，并且单分散液滴由环状油相流动的剪切力产生。
图9示出用于VH和VL序列的配对的一般决策树算法。
图10示意性示出从分离单细胞的mRNA捕获的示例性过程，所述单细胞编码对特定抗原高亲和力的抗体。(a)将分泌抗体的B细胞(左上)分离成含有具有固定抗原的珠粒的隔室。分泌的抗体(灰色)由珠粒捕获，如果B细胞编码对抗原高亲和力的抗体。(b)将任何未结合的细胞分泌抗体洗去并且将具有连接的poly(dT)ssDNA(黑色链)的抗-IgG抗体(白色)添加到隔室。将抗-IgG:poly(dT)(或其它mRNA捕获部分)构造固定在含有捕获抗体的珠粒上。将poly(dT)ssDNA仅与分泌对所需抗原高亲和力的抗体的细胞共定位。(c)将隔室密封并且使细胞裂解。从分泌高亲和力抗体的细胞释放的mRNA链(小圆圈)经由杂交到poly(dT):抗体:珠粒构造上的poly(dT)得以捕获。接着，可将珠粒回收用于单细胞mRNA转录物分析。
说明性实施方案的描述
本公开大体上涉及以高通量方式测序表达于单细胞中的两个或更多个基因。更具体地说，本公开提供一种用于高通量测序共表达于单细胞中的成对转录物以测定包含免疫受体的成对多肽链(例如抗体VH和VL序列)的方法。
本公开的方法允许测定个体生物体或细胞群体中免疫受体和抗体的组库。具体地说，本公开的方法可有助于测定组成免疫受体的多肽链对。B细胞和T细胞各表达免疫受体；B细胞表达免疫球蛋白，T细胞表达T细胞受体(TCR)。两种类型的免疫受体由两条多肽链组成。免疫球蛋白由可变重(VH)链和可变轻(VL)链组成。TCR有两种类型：一种由α和β链组成，并且一种由γ和δ链组成。免疫受体中的每条多肽具有恒定区和可变区。可变区来源于B细胞或T细胞的染色体上基因片段的重组和末端接合重排。在B细胞中，可变区的其它多样化通过体细胞超突变发生。因此，免疫***具有大的受体组库，并且由淋巴细胞表达的任何给定受体对由一对分开的、独特的转录物编码。只有通过已知所述对中两个转录物的序列，人们才能将受体作为整体进行研究。已知单细胞中所表达的免疫受体链对的序列对确定给定个体或细胞群体的免疫组库来说也是重要的。
分析单细胞中多转录物(如包括适应性免疫受体的两个转录物)的目前可获得的方法受低通量和极高仪器和试剂成本限制。目前不存在用于快速分析多少细胞表达所关注的一组转录物的技术，或更具体地说，用于以极高通量(每次实验大于10,000个细胞)测序天然淋巴细胞受体链对的技术。本公开旨在通过提供一种新技术用于在单细胞水平上以大于本领域目前状态两个至三个数量级的通量同时测序多转录物来纠正这些缺陷。
本公开方法的一个优势为，所述方法产生大于本领域目前状态几个数量级的较高通量。此外，本公开允许能够以比竞争技术更快并且成本低得多的高通量方式对于大细胞群体连接两个转录物。
在某些实施方案中，本公开提供以下方法，所述方法包括用缀合到寡核苷酸的珠粒将单细胞分开于隔室中；使细胞裂解；允许从细胞释放的mRNA转录物与寡核苷酸杂交；进行重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应以从来源于单细胞的至少两个转录物共价连接DNA；以及测序连接的DNA。在某些实施方案中，细胞可为哺乳动物细胞。在某些实施方案中，细胞可为B细胞、T细胞、NKT细胞或癌细胞。
在其它实施方案中，本公开提供以下方法，所述方法包括用缀合到寡核苷酸的珠粒将单细胞分开于隔室中；使细胞裂解；允许从细胞释放的mRNA转录物与缀合到珠粒的寡核苷酸杂交；进行逆转录酶聚合酶链式反应以从来源于单细胞的至少两个转录物形成至少两个cDNA；以及测序附接到珠粒的cDNA。
在另一实施方案中，本公开提供一种方法，所述方法包括混合细胞与直径小于细胞直径的珠粒，其中珠粒缀合到寡核苷酸，隔离体积小于5nL的隔室内的细胞和珠粒，使细胞裂解并且允许mRNA转录物与珠粒缔合，从隔室分离珠粒和缔合mRNA，进行逆转录，接着对珠粒缔合的mRNA进行PCR扩增，以及测序每个珠粒的DNA产物以鉴别与每个珠粒缔合的cDNA。
在其它实施方案中，本公开提供一种***，其包括含水流体相出口，其安置在环形流动油相内，其中水相流体包含细胞悬浮液并且分散于流动油相内，产生具有包含细胞的含水悬浮液的低尺寸分散性的乳化液滴。
在其它实施方案中，本公开提供一种组合物，其包含珠粒、能够结合mRNA的寡核苷酸，和对所关注转录物特异的两个或更多个引物。
在某些实施方案中，本公开还提供一种装置，其包括微孔的有序阵列，每个微孔具有设计以容纳单淋巴细胞的尺寸。在一个实施方案中，微孔可为直径为56μm并且深度为50μm的圆形孔，总体积为125pL。此类微孔通常体积在20-3,000pL范围内，尽管各种各样的孔大小、形状和尺寸可用于单细胞容纳(single cell accommodation)。在某些实施方案中，微孔可为纳米孔。在某些实施方案中，装置可为芯片。本公开的装置允许单芯片中数万个单细胞的直接包埋，其中每个细胞在它自己的微孔中。在某些实施方案中，芯片可为显微镜载片的大小。在一个实施方案中，微孔芯片可用于捕获在其自身单独微孔中的单细胞(图6)。微孔芯片可由聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成；但是，本领域中已知的其它合适材料如聚丙烯酰亚胺(polyacrylimide)、硅和蚀刻玻璃也可用于产生微孔芯片。
与寡核苷酸缀合的一些珠粒或其它粒子也可根据本公开的方法捕获于具有单细胞的微孔中。在某些实施方案中，珠粒可包括固定在珠粒表面上的寡核苷酸。在其它实施方案中，珠粒可为磁性的。在其它实施方案中，珠粒可包覆有一个或多个寡核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸可为poly(T)、对重链扩增特异的序列和/或对轻链扩增特异的序列。透析膜覆盖微孔，在裂解试剂透析到微孔中同时保持细胞和珠粒在微孔中。裂解试剂引起细胞的mRNA转录物释放到具有珠粒的微孔中。在寡核苷酸为poly(T)的实施方案中，poly(A)mRNA尾由珠粒上的poly(T)寡核苷酸捕获。因此，每个珠粒包覆有单细胞的mRNA分子。然后将珠粒汇集、洗涤并且重悬浮在具有用于重叠延伸(OE)逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)的试剂的溶液中。本反应混合物包括设计以产生包含共价连接在一起的两个所关注转录物的cDNA的单PCR产物的引物。在热循环之前，试剂溶液/珠粒悬浮液在油相中乳化以产生每个液滴具有不大于一个珠粒的液滴。将OERT-PCR的连接cDNA产物回收并且用作巢式PCR的模板，所述巢式PCR扩增所关注的连接转录物。然后对巢式PCR的纯化产物测序，并且分析配对信息(图6)。在其它实施方案中，限制和连接可用于连接所关注的多转录物的cDNA。在其它实施方案中，重组可用于连接所关注的多转录物的cDNA。
本公开还提供一种方法以捕捉珠粒上单细胞的mRNA，进行cDNA合成，连接单细胞的两个或更多个所需cDNA的序列以产生单分子，并且最终通过高通量(下一代)测序显示连接转录物的序列。根据本公开，增大生物分析中通量的一种方式为使用产生大量3-维平行化微型反应器的乳液。分子生物学的乳液方案通常得到每毫升109-1011个液滴(子pL体积)。用于单细胞聚合酶链式反应(PCR)的以乳液为基础的方法已被广泛接受，并且乳液PCR为许多下一代测序方案中发现的稳健且可靠的程序。但是，乳滴中极高通量RT-PCR还未实现，因为液滴内的细胞裂解物抑制逆转录酶反应。RT-PCR的细胞裂解物抑制可通过稀释到合适体积来减轻。
在另一实施方案中，细胞裂解于含有用于核酸捕获的珠粒的乳滴中。在某些实施方案中，珠粒可与寡核苷酸缀合。在某些实施方案中，寡核苷酸可为poly(T)。在其它实施方案中，寡核苷酸可为对所关注的转录物特异的引物。在某些实施方案中，珠粒可为磁性的。具有细胞和珠粒两者的悬浮液的水溶液通过将含水细胞/珠粒悬浮液注射到油相的快速移动流中来乳化到油相中。移动油相所产生的剪切力在含水悬浮液注射到流中时产生液滴，产生具有低液滴大小分散性的乳液。每个细胞与缀合有寡核苷酸的一些珠粒一起在它自己的液滴中。液滴大小的均匀性有助于确保单独液滴不含有多于一个细胞。然后将细胞热裂解，并且将混合物冷却以允许珠粒捕获mRNA。将乳液破乳，并且收集珠粒。将珠粒重悬浮于乳液OE RT-PCR的溶液中以将所关注的转录物的cDNA连接在一起。根据本公开进行巢式PCR和连接的转录物的测序。在某些实施方案中，细胞的含水悬浮液包含逆转录试剂。在某些其它实施方案中，细胞的含水悬浮液包含聚合酶链式反应和逆转录酶聚合酶链式反应试剂中的一种。在其它实施方案中，限制和连接可用于连接所关注的多转录物的cDNA。在其它实施方案中，重组可用于连接所关注的多转录物的cDNA。
在另一实施方案中，含有单个细胞和RT-PCR试剂的乳滴通过注射到快速移动油相中形成。然后直接对这些液滴进行热循环。在某些实施方案中，重叠延伸逆转录聚合酶链式反应可用于连接所关注的多转录物的cDNA。
在另一实施方案中，单细胞的所关注的cDNA经由RT-PCR附接到如下文所述的珠粒上，并且使用高通量测序直接测序珠粒上的转录物。三种功能化寡核苷酸引物的等量混合物可缀合到功能化珠粒。一种寡核苷酸可为poly(T)以捕获mRNA的poly(A)尾。其它两种寡核苷酸可为用于扩增所关注的转录物的特异性引物。以这种方式制备的珠粒与水溶液中的细胞混合，并且将细胞/珠粒悬浮液乳化，以使得每个细胞与过量珠粒一起在它自己的液滴中。在某些实施方案中，每个液滴可含有平均55个珠粒。将细胞热裂解，并且珠粒上的poly(T)寡核苷酸结合mRNA。将乳液破乳，并且将珠粒收集、洗涤，并且重悬浮于具有用于RT-PCR的试剂和引物的溶液中，所述RT-PCR将导致所关注的转录物以转录物附接到珠粒的这种方式的扩增。将珠粒悬浮液乳化，并且进行RT-PCR。将珠粒收集并用于进行高通量测序，所述高通量测序使用至少两个不同引物通过起始多次序列读取直接测序附接到珠粒的两个转录物，其中每一起始引物对所关注的转录物为特异的。两个转录物通过高通量测序网格中的珠粒位置配对，显示从单细胞一起表达的序列。测序可在例如Applied Biosystem的SOLiD平台、Life Technologies的Proton Torrent或Illumina的HiSeq测序平台上进行。
OE RT-PCR的引物设计确定给定细胞表达的哪些所关注转录物连接在一起。例如，在某些实施方案中，可设计引起VH和VL链转录物的相应cDNA共价连接在一起的引物。连接cDNA的测序显示单细胞表达的VH和VL序列对。在其它实施方案中，还可设计引物组，以使得可确定单个细胞中表达的TCR对的序列，或以使得可确定是否细胞群体共表达任何两个所关注的基因。
偏差可为使用多扩增引物的PCR反应中的显著问题，因为引物效率中的小差异由于PCR的指数特性而产生大的产物差别。减少引物偏差的一个方式为通过用同一引物扩增多基因，这在多重引物组的情况下通常是不可能的。通过将公共扩增区纳入到所关注的多独特引物的5’端，从而将公共扩增区在第一复制事件期间添加到所有PCR产物的5’端。在起始复制事件之后，扩增通过仅在公共区引发来实现以减小引物偏差并且允许最终PCR产物分布保持代表原始模板分布。
这种公共区可以各种方式采用。一个清楚的应用为添加以较高浓度的公共扩增引物和以低浓度的独特引物(具有5’公共区)，以使得大多数核酸扩增针对减小的扩增偏差经由公共序列发生。另一应用为扩增产物的以表面为基础的捕获，例如在乳液PCR期间将PCR产物捕获到微型珠粒上。如果公共序列寡核苷酸固定到珠粒表面上，则所关注的PCR产物将在扩增期间变成共价连接到珠粒。以这种方式，广泛多样的一组转录物可使用单固定化寡核苷酸序列捕获到表面上。
例如，两个不同的公共区可以相同浓度固定到珠粒表面上(例如，一个公共序列用于重链，并且不同的公共序列用于轻链)。在PCR扩增之后，珠粒将包覆有大致50％重链扩增产物，和50％轻链扩增产物。珠粒表面上重链与轻链代表之间的这种平衡有助于确保当珠粒进行高通量测序时重链和轻链的信号足够。
因此，在某些实施方案中，本公开提供包括以下的方法：将公共序列添加到对一组基因靶标特异的两个或更多个寡核苷酸的5’区；以及通过引发公共序列进行所述组基因靶标的核酸扩增。在某些实施方案中，公共序列n固定到表面上。在其它实施方案中，公共序列可用于捕获扩增产物。
本公开的方法允许获得关于单细胞所表达的多转录物的信息。在某些实施方案中，概率分析可用于鉴别读长计数或频率高于非天然对读长计数或频率的天然对。信息可用于例如研究癌细胞不同群体中基因共表达模式。在某些实施方案中，治疗可基于使用本公开的方法获得的表达信息来调整。其它实施方案可集中于新淋巴细胞受体的发现。
实施例
包括以下实施例以示范本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解以下实施例中公开的技术表示由本发明人发现的，在本发明实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以被认为构成本发明实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在已公开并仍获得类似或相似结果的特定实施方案中做出许多改变。
实施例1—高密度微孔板的构造
微柱(56μm直径，50μm高度)的网格使用SU-8光致抗蚀剂(Fisher Scientific)光刻图案化到二氧化硅晶片上，并且二氧化硅晶片用作模具以印刷具有标准显微镜载片的尺寸并且含有每个芯片大致170,000个孔的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片(Sylgard 184，DowCorning)。微柱的尺寸可在约5μm至约300μm范围内宽并且在约5μm至约300μm范围内高。使模制的PDMS芯片在氧等离子体腔室中硅烷化5分钟以产生亲水表面。然后将PDMS芯片在1％牛血清白蛋白(BSA)中封闭30分钟，并且在去离子水和磷酸缓冲盐水(PBS)中洗涤以准备用于细胞接种。
实施例2—以高通量方式连接单细胞的两个转录物的方法
以高通量方式物理连接来源于单细胞的两个或更多个转录物的过程使用实施例1的密封PDMS微孔装置以将单细胞捕捉到分开的孔中。也发生细胞裂解，并且将用于mRNA捕获的poly(T)磁性微米大小珠粒也引入到微孔中。一旦细胞和珠粒已装载，就用透析膜将装置密封，并且引入裂解溶液。随后，将珠粒回收，重悬浮于具有用于重叠延伸(OE)RT-PCR的试剂、引物和聚合酶的溶液中，并且然后将溶液乳化，以使得每个珠粒封装在单乳滴中。使乳液经受热循环以物理连接两个转录物(例如，免疫球蛋白重链和轻链cDNA)，并且将连接产物在循环之后从乳液回收。进行巢式PCR扩增，然后将所得DNA使用Illumina或任何其它NextGen测序技术进行测序，所述技术可得到适当长度的读数以明确说明转录物配对信息(图6)。
上文所概述的方法用以连接包含小鼠杂交瘤细胞系MOPC-21和MOPC-315的混合物中的免疫球蛋白可变重(VH)链和可变轻(VL)链。这些细胞系中的每一者所表达的VH和VL序列为已知的，并且因此这些实验用于方法验证。传代之后两天，将5mL MOPC-21和MOPC-315细胞中的每一者分开地从培养基取出(细胞生长于Falcon通气T-25培养瓶中，在RPMI-1640、10％FBS、1％P/S中10mL体积)并且置于15mL管中。如用血细胞计数器和台盼蓝排除所测量，测定细胞密度为以>98％生存力的150,000个存活细胞/毫升。将RNAse A以30μg/mL的浓度添加到每个管中，并且将细胞以37℃孵育30分钟。然后，将细胞用完全培养基洗涤三次并且用PBS(pH 7.4)洗涤两次。洗涤通过在室温下以250g离心5分钟，接着抽吸并且重悬浮来完成。将细胞浓度用血细胞计数器再次计数，并且混合MOPC-21和MOPC-315细胞以形成具有由17,500个MOPC-21细胞/毫升和17,500个MOPC-315细胞/毫升组成的PBS中的35,000个细胞/毫升的总浓度的细胞悬浮液。
将500μL MOPC-21和MOPC-315细胞混合物施加到已用BSA孵育以封闭非特异性吸附的PDMS微孔装置。将17,500个总细胞添加到每个芯片中。平行使用四个芯片(70,000个总细胞跨四个PDMS芯片分布)，并且允许细胞在轻微搅拌下在5分钟的时程内通过重力下沉到孔中。因为每一PDMS芯片含有大致120,000个孔，并且有效装载的细胞估计为大致70％，所以大致10个孔中有1个孔含有分开的细胞。每孔两个细胞的发生率可用泊松统计(Posson statistics)准确估计，并且在这些条件下，含有细胞的孔中>95％含有单细胞。
然后将微孔装置的表面用PBS洗涤以将未吸附细胞从芯片表面移除，并且将25μL poly(T)磁性珠粒(mRNA Direct Kit，2.8μm直径，Invitrogen Corp.)重悬浮于50μL PBS中，并且施加到每个微孔装置表面，每孔平均55个poly(T)珠粒。在允许磁性珠粒通过重力下沉到孔中之后，将已在PBS中冲洗的BSA封闭的透析膜(12,000-14,000MWCO再生纤维素，25mm平折宽度，Fisher Scientific)放在每个芯片表面上。使用200μL移液管将PBS从芯片和膜表面移除。然后，将1000μL移液管尖端的锥形末端切除以形成被拖过膜的扁平圆筒，将膜按压到PDMS芯片并且从PDMS微孔装置与透析膜之间除去过量PBS，所述微孔装置和透析膜使微孔密封并且捕捉内部的细胞和珠粒(图1)。
细胞裂解和mRNA结合到在微孔内捕捉的poly(T)磁性珠粒通过透析完成。将500μL细胞裂解溶液(具有0.1％脱氧胆酸钠和10mM氧钒核糖核苷复合物的500mM LiCl的100mM tris缓冲溶液(pH 7.5))施加到透析膜，并且透析在室温下在试剂透析到微孔中时发生。如通过时差显微技术测定，细胞裂解在<5分钟内完全完成(图2)。
将PDMS微孔芯片在室温下于皮氏培养皿内维持20分钟，然后置于4℃的冷室中保持额外的10分钟。将Dynal MPC-S磁体置于PDMS微孔装置下方以在将透析膜用镊子移除并且舍弃时保持磁性珠粒在微孔内部。然后将磁体置于具有4个分区的另一皮氏培养皿下方，其中一个分区含有2mL冷的mRNA Direct裂解/结合缓冲液(100mM tris pH 7.5，500mM LiCl，10mM EDTA，1％LiDS，5mM DTT)。将四个PDMS微孔装置依序倒置并且重悬浮于2mL溶液中以允许磁体将珠粒吸出微孔并且进入到mRNA Direct裂解/结合缓冲溶液中。然后将磁性珠粒重悬浮于2mL mRNA Direct裂解/结合缓冲液中，并且将溶液分到两个Eppendforf管中并且置于Dynal MPC-S磁性架上。使用1mL每管的洗涤缓冲液1(100mM tris pH 7.5，500mM LiCl，1mM EDTA，4℃)将珠粒洗涤一次而不重悬浮。然后立即将珠粒在重悬浮的情况下于洗涤缓冲液1中再洗涤。然后立即将珠粒重悬浮于洗涤缓冲液2(20mM tris pH 7.5，50mM KCl，3mM MgCl)中并且放回磁性架上。最后，将珠粒悬浮于含有0.05重量％BSA(InvitrogenUltrapure BSA，50mg/mL)的2.85mL冷的RT-PCR混合物(QuantaOneStep Fast，VWR)中并且引物浓度列举于表1中。扩增用高浓度的两个共同引物(CHrev-AHX89和CLrev-BRH06)完成，所述引物退火到CLrev和CHrev特异引物的5’端的反向互补处。V区引物还含有在5’端处的接头序列以影响VH-VL连锁。先前保留的25μL冷的RT-PCR混合物用于无珠粒或乳化的循环作为无模板对照。将含有poly(T)磁性珠粒的冷的RT-PCR混合物逐滴添加到含有9mL冷藏油相(具有4.5％Span-80、0.4％吐温80、0.05％Triton X-100的分子生物级矿物油，v/v％油相试剂来自Sigma Aldrich Corp.)的搅拌Ika分散管(DT-20，VWR)中，并且将混合物以低速搅动5分钟。将所得乳液以每孔100μL乳液添加到96孔PCR板中，并且置于热循环仪中。RT步骤在以下条件下进行：以55℃30分钟，接着以95℃2min。PCR扩增然后在以下条件下进行：94℃30s变性，57℃1min退火和72℃3min延伸的三次循环；然后94℃30s变性，59℃30s退火和72℃3min延伸的二十七次循环；然后以72℃7min的最终延伸步骤。图3示出最终连接产物的图。
表1：MOPC-21/MOPC-315乳液连锁RT-PCR的引物。
在热循环之后，将乳液收集，分到三个Eppendorf管中并且在室温下以16,000g离心10分钟。将上层矿物油相舍弃，并且添加1.5mL***以萃取剩余油相并且使乳液破乳。将上层醚层移除并且进行两次以上的醚萃取。然后将醚层舍弃，并且在室温下于SpeedVac中保持25分钟移除残余的醚溶剂。将剩余水相在DNA结合缓冲液中稀释5:1，然后分为三个部分并且穿过三个二氧化硅自旋柱(DNA Clean&Concentrator，Zymo Research Corp.)以捕获RT-PCR cDNA产物。在用300μL洗涤缓冲液(Zymo Research Corp)洗涤每个柱之后，将cDNA以每个柱中20μL进行洗脱，并且使用4μL洗脱的cDNA作为模板以200μL的总体积进行巢式PCR反应(具有Taq聚合酶的ThermoPolPCR缓冲液，New England Biosciences)。在以94℃的2min变性步骤之后，以94℃30s变性，62℃30s退火，72℃20s延伸进行循环，持续30个循环。将400nM的每个巢式引物(表2)用于扩增连接的重链和轻链，这产生大致800bp连接产物。
表2：MOPC-21/MOPC-315巢式PCR的引物。
使巢式PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，将800bp带切除并且在50℃下溶解于琼脂糖溶解缓冲液中保持10分钟，然后根据生产商方案(Zymo Research Corp.)捕获到二氧化硅自旋柱上并且从二氧化硅自旋柱洗脱以获得纯化的巢式PCR产物。将纯化的cDNA用Illumina HiSeq测序平台进行碱基对双端读长。能够提供适于鉴别连接转录物的读长的其它NextGen测序技术(例如，Roched 454、PacificBiosciences等)也可用于该目的。(图3)。HiSeq数据输出使用SHortRead Mapping Package软件(SHRiMP)映射到已知MOPC-21和MOPC-315序列并且针对具有>90％同一性的高质量读长过滤成已知转录物序列。以这种方式，获得大致18,000个连接的重链和轻链序列(表3)。
表3：测序的VH-VL对的原始读长计数。
由原始DNA测序数据的配对偏斜度进一步测定正确的转录物配对。就任何给定的两个转录物例如免疫球蛋白重链Hi和轻链Lj而言，以整体重链或轻链映射频率fHi和fLj，算出配对偏斜的量度s：
计算值s将与特定VH配对的VL频率与整体序列组中的VL频率进行比较。s>1的值指明以高于对应于随机配对的频率观察到重-轻对。从具有最大值s的条目推导出自然配对(表4)。针对测序的重和轻对由大致18,000个测序的VH-VL连接对计算的配对偏斜s示于表4中。天然重-轻配对由针对每条重链的s的最大值预测并且以绿色突出显示。本表格证明我们的方法解析细胞的非均匀混合物的天然重链和轻链配对的能力。
表4：计算的配对偏斜。
实施例3—使用5个细胞系的限定混合物的高通量转录物配对分析
将五个永生化B细胞系以不同比率混合并且用于检测OE-PCR所产生的连接产物的配对效率。本实验中所用的五个B细胞系为：MOPC-21、MOPC-315、IM-9、ARH-77和DB(参见表5)。DB表达极低水平的VH和VL转录物并且用作阴性对照。
所有细胞系获自ATCC并且在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的RPMI-1640中培养(参见实施例2)。根据实施例2，在30分钟RNAse处理和随后洗涤之后，将细胞以每芯片17,500个总细胞的密度与poly(T)磁性珠粒一起接种到微孔中。将孔用透析膜密封，使细胞裂解，并且允许mRNA退火到珠粒(实施例2)。然后将珠粒回收，重悬浮于OE RT-PCR混合物中，并且置于乳液中(实施例2)。所用的OE RT-PCR浓度给出在表6中，并且热循环条件表示在表7中。
表5：5个细胞系的概述。
表6：细胞系混合物的OE RT-PCR引物。
表7：OE RT-PCR热循环条件。
#循环 温度(℃) 时间(min)
1 55 30
94 2
4 94 0.5
50 0.5
72 3
4 94 0.5
55 0.5
72 3
22 94 0.5
60 0.5
72 3
1 72 7
将乳液OE RT-PCR产物通过***萃取回收，接着在以下条件下在巢式PCR中用作模板的二氧化硅自旋柱(实施例2)上捕获并且从其洗脱：94℃2min初始变性，94℃30s变性，62℃30s退火，72℃20s延伸，40个总循环。巢式引物序列和浓度报导于表2和8中。
表8：产生大致800bp连接产物的巢式PCR引物。
使巢式PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，将650bp至1000bp的区切除并且用二氧化硅自旋柱(实施例2)纯化。将回收cDNA进行Illumina HiSeq 100bp双端测序。将HiSeq数据映射到含有所有五个克隆的重链和轻链序列的参考文件，并且将数据过滤以获得与参考序列>90％匹配的双端读长，如实施例2中的一样。自然配对通过询问配对数据的偏斜来鉴别。就任何给定的免疫球蛋白重链Hi和轻链Lj而言，以整体重链或轻链映射频率fHi和fLj，算出配对偏斜的量度s：
计算值s将与特定VH配对的VL频率与整体序列组中的VL频率进行比较。s>1的值指明以高于对应于随机配对的频率观察到重-轻对。针对每条重链从具有最大值s的条目推导出自然配对。表9示出鉴别的自然配对和针对测序的重和轻对由大致66,000个测序的VH-VL连接对计算的配对偏斜s。天然重-轻配对由针对每条重链的s的最大值预测并且以绿色突出显示。表9证明我们的方法以高通量解析细胞的非均匀混合物的天然重链和轻链配对的能力。
表9：天然重链和轻链配对的解析。
实施例4—连接捕捉在高密度微孔板内的单B细胞的两个转录物的方法
使B细胞群体通过重力下沉到PDMS微孔板中，如实施例1中所述构造。在本实施例中，每个PDMS载片含有1.7x105个孔，以使得处理的四个载片以≥1:10细胞/孔的占有率同时容纳68,000个淋巴细胞，这基于泊松统计学给出每个孔中仅有一个细胞的至少95％的概率。将具有2.8μm直径的poly(dT)磁性珠粒以平均55个珠粒/孔沉积到微孔中，并且将载片用透析膜覆盖。随后，将膜覆盖的载片用含有1％十二烷基硫酸锂的最佳细胞裂解溶液孵育，这导致细胞在<1min内完全裂解。mRNA退火到poly(dT)磁性珠粒，将磁性珠粒收集，洗涤并且重悬浮于具有用于重叠延伸(OE)RT-PCR的试剂、引物、逆转录酶和聚合酶的溶液中。以此方式，珠粒变得在包括油包水乳液的液滴内分离。使乳液经受热循环以物理连接两个转录物(例如免疫球蛋白重链和轻链cDNA)，并且将连接产物在循环之后从乳液回收。进行巢式PCR扩增，然后将所得DNA使用Illumina或任何其它NextGen测序技术进行测序，这可得到适当长度的读数以明确说明转录物配对信息。过程的概况表示于图6中。
上文所概述的方法用以连接人原代细胞混合物中免疫球蛋白可变重(VH)链和可变轻(VL)链。
将健康的30岁男子用2010-2011三价FluVirin流感疫苗(Novartis)接种，并且在已经获得知情同意之后在接种之后14天采集血液。将PBMC分离并且重悬浮于DMSO/10％FCS中低温贮藏。将冷冻的PBMC解冻并且将细胞悬浮液在PBS/0.2％BSA中用抗人CD19(HIB19，BioLegend，San Diego，CA)、CD27(O323，BioLegend)、CD38(HIT2，BioLegend)和CD3(7D6，Invitrogen，Grand Island，NY)染色。将CD 19+CD3-CD27+CD38int记忆B细胞使用FACSAria II分选仪***(BD Biosciences，San Diego，CA)分选。将细胞或者低温贮藏在DMSO/10％FCS中用于随后的高通量VH:VL配对，或将单细胞分选到含有RNAse抑制剂混合物(Promega，Madison，WI)和10mM Tris-HCl pH 8.0的96孔板中用于单细胞RT-PCR分析。将cDNA使用Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas，Waltham，MA)从单分选细胞合成，接着使用先前所述的引物组和PCR条件扩增免疫球蛋白可变基因(Smith等,2009)。将可变基因以内部分析软件使用IMGT搜索引擎测定(Brochet等,2008)。
将冷冻的用于高通量VH:VL配对的记忆B细胞解冻并且通过以250g离心10min回收。将细胞重悬浮于补充有1×GlutaMAX、1×非必需氨基酸、1×丙酮酸钠和1×青霉素/链霉素的200μl RPMI-1640中(Life Technologies)并且在96孔板中以37℃孵育13h。将回收细胞以250g再次离心10min并且重悬浮于400μl PBS中，并且取出6μl用血细胞计数器进行细胞计数。从冷冻储备液中回收大致8,800个细胞。然后将记忆B细胞混入～880个IM-9细胞(ATCC编号CCL-159)作为内部对照。将细胞重悬浮在两个PDMS微孔载片(340,000个孔)上并且允许在轻微搅拌下通过重力在5min的时程内下沉到孔中。通过测量细胞接种前和细胞接种后接种缓冲液中的细胞浓度已经计算细胞接种过程为90％有效；因此在本实验中分析8,000个原代细胞。使用泊松统计学计算在每孔单细胞和多细胞状态下分离的细胞分数：
P ( k , &mu; ) = &mu; k e - &mu; k !
其中k等于单微孔中的细胞数目，并且μ为每孔细胞的平均数，以使得本实验中所用的1:39的细胞:孔比率对应于以一细胞/孔的占有率沉积的细胞的98.7％。将25μl poly(dT)磁性珠粒(Invitrogen mRNADirect Kit)重悬浮于50μl PBS中并且分布在每个PDMS载片表面上，(平均每孔55个poly(dT)珠粒)。允许磁性珠粒通过重力下沉到孔中持续～5min，然后将已在PBS中冲洗的BSA封闭的透析膜(12,000-14,000MWCO再生纤维素，25-mm平折宽度，Fisher Scientific)放在每个载片表面上，密封微孔并且捕捉内部的细胞和珠粒(图1)。将过量PBS使用200μL移液管从载片和膜表面移除。将500μL细胞裂解溶液(具有1％十二烷基硫酸锂、10mM EDTA和5mM DTT的500mMLiCl的100mM TRIS缓冲液(pH 7.5))在室温下施加到透析膜持续20min。时差显微技术显示，所有细胞在1min内全部裂解(图2)。随后，将载片以4℃孵育10min，此时将Dynal MPC-S磁体置于PDMS微孔装置下方以在将透析膜用镊子移除并且舍弃时保持磁性珠粒在微孔内部。将PDMS载片快速倒置在含有2mL冷裂解溶液的皮氏培养皿中，并且将磁体施加在皮氏培养皿的下方以迫使珠粒离开微孔。随后，将含有重悬浮珠粒的1ml裂解溶液的等分试样置于Eppendorf管中，并且将珠粒在Dynal MPC-S磁性架上沉淀并且在不重悬浮的情况下使用1mL每管洗涤缓冲液1(100mM Tris，pH 7.5，500mMLiCl，1mM EDTA，4℃)洗涤一次。将珠粒重悬浮于洗涤缓冲液1中，沉淀并且悬浮于洗涤缓冲液2(20mM Tris，pH 7.5，50mM KC1，3mMMgCl)中并且再次沉淀。最后，将珠粒悬浮于含有0.05重量％BSA(Invitrogen Ultrapure BSA，50mg/mL)和用于VH和VL连锁扩增的引物组的2.85mL冷RT-PCR混合物(Quanta OneStep Fast，VWR)中(图4和表6和10)。将含有poly(dT)磁性珠粒的悬浮液逐滴添加到含有9mL冷冻油相(具有4.5％Span-80、0.4％吐温80、0.05％Triton X-100的分子生物级矿物油，v/v％，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的搅拌IKA分散管(DT-20，VWR)中，并且将混合物以低速搅动5min。将所得乳液以每孔100μL乳液添加到96孔PCR板中，并且置于热循环仪中。RT步骤在以下条件下进行：以55℃30min，接着以94℃2min。PCR扩增在以下条件下进行：94℃30s变性，50℃30s退火，72℃2min延伸的四个循环；94℃30s变性，55℃30s退火，72℃2min延伸的四个循环；94℃30s变性，60℃30s退火，72℃2min延伸的22个循环；然后以72℃7min的最终延伸步骤。在热循环之后，肉眼检查乳液以确保无大量水相存在，这是乳液稳定性的关键指示。在肉眼验证之后，将乳液收集并且在室温下以16,000g离心10min，然后将上层矿物油相舍弃，并且添加1.5mL***以萃取剩余油相并且使乳液破乳。将上层醚层舍弃，进行两次以上醚萃取，并且在室温下将残余醚在SpeedVac中移除持续25min。将水相以5:1稀释于DNA结合缓冲液中，并且穿过二氧化硅自旋柱(DNA Clean&Concentrator，Zymo Research，Irvine，CA)以捕获cDNA产物。将柱用300μL洗涤缓冲液(Zymo Research Corp)洗涤两次，并且将cDNA洗脱到40μL无核酸酶的水中。最后，在以下条件下以200μL的总体积使用4μL洗脱的cDNA作为模板用400nM引物(表8和11)进行巢式PCR扩增(具有Taq聚合酶的ThermoPol PCR缓冲液，NewEngland Biosciences，Ipswich，MA)：以94℃2min初始变性，以94℃变性30s持续39个循环，以62℃退火30s并且以72℃延伸20s，以72℃7min的最终延伸。通过琼脂糖凝胶电泳提取大致850bp连接产物(图3)并且使用2×250双端MiSeq NextGen平台(Illumina，SanDiego，CA)测序。
表10：人VH和VL连锁RT-PCR扩增的引物组。
表11：人VH和VL巢式PCR扩增的引物组。
就生物信息分析而言，在50％核苷酸上针对20的最小Phred质量分数过滤原始2×250MiSeq数据以确保含有CDR3的区中的高读长质量(大致HC nt 65-115或LC nt 55-100)。将序列数据提交到国际免疫遗传信息***(IMGT)用于映射到种系V(D)J基因(Brochet等,2008)。针对框架内V(D)J连接处过滤序列数据，并且将产生的VH和Vκ，λ序列通过Illumina读长ID配对。将CDR-H3核苷酸序列提取并且聚簇至96％nt同一性而忽略终端间隔，以产生数据组中一系列独特的CDR-H3。发现96％nt同一性截止为混入的对照克隆中聚簇测序误差的最佳截止；独特的CDR-H3序列的数目并且因此报导的独特的V基因的数目是指从样品回收的聚簇的数目(表12)。将每个CDR-H3聚簇的顶部读长计数CDR-L3指定为同源对，并且产生一系列回收的VH:VL对。942:1的观察准确率证明保存了IM-9混入对照细胞系中正确重链和轻链配对(表12)。
表12：实施例4的关键实验统计。
1就已知混入细胞而言，(读长正确VL):(读长顶部错误VL)
将使用这种高通量途径鉴别的VH:VL配对与使用已建立的单细胞分选方法鉴别的VH:VL配对进行比较(Smith等,2009；Wrammert等,2008)；此分析以双盲方式进行。在接种有2010-2011三价FluVirin流感疫苗之后第14天，将外周CD19+CD3-CD27+CD38int记忆B细胞从健康志愿者中分离(Smith等,2009)。对于scRT-PCR分析，将168个单B细胞分选到四个96孔板中，并且单独进行168RT和504巢式PCR反应以分开扩增VH和VL(κ和λ)基因。将DNA产物通过凝胶电泳解析并且测序以产生总计51个VH:VL对，其中50个VH:VL对为独特的。回收总计240个独特的CDR-H3:CDR-L3对。还将在高通量配对组中检测的四个CDR-H3序列在单细胞RT-PCR分析中观察。盲法分析显示，通过两种途径分离的CDR-H3:CDR-L3对完全一致(DeKosky等,2013)。已建立的单细胞RT-PCR测序方法与高通量测序方法之间的一致证明根据本公开所述的方法回收的VH:VL序列准确性高。
实施例5—在高通量VH:VL配对之后高亲和力抗体的分离
本实施例描述在加强免疫之后从人外周B细胞分离高亲和力抗破伤风抗体。在已经获得柏林大学夏丽特医学院(CharitéBerlin)的知情同意之后，使一个女性供体对TT/白喉类毒素(TD，20I.E.TT和2I.E.白喉类毒素，Sanofi Pasteur MerckSharpe&Dohme GmbH，Leimen，Germany)加强免疫(将样品匿名编号，并且研究获得医院伦理批准委员会，编号EA1/178/11，和德克萨斯大学奥斯汀分校伦理审查委员会(University of Texas at AustinInstitutional Review Board)，IRB#2011-11-0095批准)。在TT免疫后第7天，将EDTA血液取出并且通过如所述的密度梯度分离进行PBMC分离(Mei等,2009)。将PBMC在4℃下在PBS/BSA中用抗人CD3/CD14-PacB(分别为克隆UCHT1和M5E2，Becton Dickinson，BD)、CD19-PECy7(克隆SJ25C1，BD)、CD27-Cy5(克隆2E4，由荷兰阿姆斯特丹大学学术医学中心的René van Lier赠送，标记在德国风湿性疾病研究中心(Deutsches Rheumaforschungszentrum)(DRFZ)，Berlin)、CD20-PacO(克隆HI47，Invitrogen)、IgD-PerCpCy5.5(克隆L27,BD)、CD38-PE(克隆HIT2,BD)和TT-地高辛(标记在DRFZ)染色15min。将细胞洗涤并且用抗地高辛-FITC(Roche，标记在DRFZ)进行第二次染色，并且在分选之前添加DAPI。将CD19+CD3-CD14-CD38++CD27++CD20-TT+成浆细胞使用FACSAria II分选仪***(BD Biosciences)分选。将一部分分选细胞洗涤并且低温贮藏在DMSO/10％FCS中用于高通量VH:VL配对。
将含有大致2,000个冷冻TT+成浆细胞的一个小瓶解冻并通过以250xg离心10min回收；预期大致20-30％细胞可存活(Kyu等,2009)。将细胞重悬浮于补充有10％FBS、1×GlutaMAX、1×非必需氨基酸、1×丙酮酸钠和1×青霉素/链霉素的300μL RPMI-1640中(全部来自Life Technologies)并且在96孔板中以37℃孵育13h。将回收细胞以250xg再次离心10min并且重悬浮于400μL PBS中，并且取出6μL用血细胞计数器进行细胞计数。将细胞混入有大致30个ARH-77细胞作为内部对照(ATCC编号CRL-1621)并且如实施例4中所述连接VH:VL转录物，省略IgM引物并且使用38-循环巢式PCR；使所得产物进行2×250MiSeq测序。还单独扩增VH和VL链以获得抗体表达的全VH和VL序列。将巢式PCR产物以1:9稀释，并且将0.5μL用作在以下条件下的PCR反应的模板：400nM引物(表8、11和13)，以94℃2min初始变性，以94℃30s变性持续12个循环，以62℃30s退火和以72℃15s延伸，以72℃7min的最终延伸。将所得～450bp VH或～400bp VL产物通过琼脂糖凝胶电泳纯化并且进行2×250MiSeq测序。如上文所述处理序列数据；此外，从TT+成浆细胞配对选择十个VH和VL对用于抗体表达和测试。对于这些十个基因的完全抗体测序，将含有5'V基因FR1-CDR2和3'CDR2-FR4的2×250bp读长通过Illumina读长ID配对，并且从含有所关注的精确CDR3的读长构造共有序列。然后将抗体基因分别克隆到人IgG表达载体pMAZ-VH和pMAZ-VL(Mazor等,2007)。将40μg每个环化连接产物共转染到HEK293F细胞(Invitrogen，NY，USA)。在转染之后6天通过离心收获培养基，并且将IgG由蛋白-A琼脂糖(Pierce，IL，USA)色谱柱纯化。
表13：VH和VL分开扩增引物的接头。
抗原亲和力通过竞争性ELISA(Friguet等,1985)使用连续稀释抗原中不同浓度的IgG(在1％牛奶的PBS溶液存在下在100nM至0.05nM范围内)进行测定。将板以4℃用10μg/mL TT的50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.6，涂布过夜，在PBST(具有0.1％吐温20的PBS)中洗涤三次并且在室温下用2％牛奶的PBS封闭2h。将具有TT抗原的IgG的预平衡样品添加到封闭ELISA板，在室温下孵育1h，将板用PBST洗涤3次并且以25℃用50μl抗人κ轻链-HRP第二抗体(1:5,000，2％牛奶的PBS)孵育～2min。将板用PBST洗涤3次，然后将50μl Ultra TMB底物(Thermo Scientific，Rockford，IL)添加到每个孔中并且以25℃孵育5min。使用等体积1M H2SO4使反应停止，并且在450nm下读取吸光度(BioTek，Winooski，VT)。每个竞争性ELISA复制物使用四参数逻辑斯蒂(4PL)方程拟合，其中误差表示为所分析的每个IgG的2-3个复制物的s.d.。所有十个抗体示出对TT的特异性并且以高亲和力结合TT(0.1nM≤KD≤18nM；表14)(DeKosky等,2013)。回收的抗TT抗体的高亲和力证明本公开中的高通量VH:VL测序方法用于从人细胞供体的抗体发现的应用。
表14：通过VH:VL对的高通量测序分离的IgG的破伤风类毒素结合亲和力。亲和力由竞争性ELISA稀释曲线计算。
1每条重链和轻链为不同的。
实施例6—经由相互配对一致的VH:VL序列的生物信息鉴别
实施例4和5公开来自高通量测序的正确VH:VL序列对的鉴别，其中给定VH序列的最高读长计数VL序列显示由个体B细胞编码的天然同源VH:VL对。或者，本实施例描述一种经由VH和VL序列的共有配对鉴别高通量VH:VL扩增子数据中的正确VH:VL对的方法。
收集原始数据配对并且将每个VH序列的最高频率VL列表到文件1中。将每个VL的顶部VH分开列表到文件2中。许多计算技术可用于完成列表步骤；例如Bash/Linux shell中的“grep-m 1CDR3文件名”可从含有原始配对数据的文件(文件名)选择CDR-H3或CDR-L3序列(CDR3)的排序在前的同源对，所述原始配对数据已被预分选以含有按递减读长计数排序的序列。数据列表的其它解决方案包括使用散列以收集序列和序列读长计数(例如Perl计算语言)，或使用词典以收集序列和读长计数(例如Python)或其它数据存储结构(例如关联存储器或关联数组)。比较文件1和文件2，并且两个文件中出现的任何VH:VL对示出“共有”，其中给定VH的排序在前的VL所述的对与给定VL的排序在前的VH一致。可应用许多计算技术以完成文件比较；文件比较的一个解决方案使用Bash/Linux中的“连接”命令，其中将含有跨文件匹配的所需域的行打印到标准输出。本实施例中所述的算法在鉴别正确VH:VL对和在减小微小序列误差为有效的，因为含有序列误差的VH:VL对通常由相互协定标准滤除。用于配对的算法的一般决策树以图9提供。
实施例7—扩增记忆B细胞的VH:VL配对
将记忆B细胞分离，体外扩增，并且处理扩增细胞的两个等分试样用于高通量配对。体外克隆扩增产生含有相同VH:VL对的细胞的多拷贝，因此增大在来源于同一B细胞样品的分开等分试样中测序相同VH:VL对的概率。
将PBMC从捐献的人血中分离，并且用CD20-FITC(克隆2H7，BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)、CD3-PerCP(HIT3a，BioLegend，San Diego，CA，USA)、CD19-v450(HIB19，BD)和CD27-APC(M-T271，BD)染色。将CD3-CD19+CD20+CD27+记忆B细胞在补充有10％FBS、1×GlutaMAX、1×非必需氨基酸、1×丙酮酸钠和1×青霉素/链霉素(全部来自Life Technologies)的RPMI-1640的存在下与10μg/mL抗CD40抗体(5C3，BioLegend)、1μg/mL cPgODN 2006(Invivogen，San Diego，CA，USA)、100单位/毫升IL-4、100单位/毫升IL-10和50ng/mL IL-21(PeproTech，RockyHill，NJ，USA)一起孵育四天。将91,000个扩增B细胞接种在12个芯片上，并且在90％估计孔接种效率比之后，根据实施例4所述的方法分析每组(1:25细胞:孔比率)的大致41,000个扩增B细胞。生物信息分析如实施例6中所述进行。将具有≥1读长的1,033个CDR-H3序列在两组中测序，并且972/1,033显示匹配的CDR-L3对以得到94.09％匹配分数。配对准确性AP可由两个独立组的CDR-L3匹配分数f匹配估计：
f匹配＝AP，组1×AP，组2＝AP 2
AP＝f匹配 1/2
从而得到97.0％的整体准确性。通过泊松分布来自每孔单细胞的速率的准确性的理论极限(本实验中所用的1:25细胞:孔比率为98％)与VH:VL配对的实验测定的准确率紧密相关。
实施例8—VH:VL配对的前导肽引物的使用
在本实施例中，退火到抗体cDNA的前导肽区的引物(与对VH和VL结构域的框架1特异的引物相对，公开于实施例4中)用于测序抗体VH:VL对。将记忆B细胞从捐献的人PBMC分离，并且将细胞分开在两组中：组1由29,000个细胞组成并且立即分析(使用总计510,000个孔，1:16细胞:孔比率)，同时组2如实施例7中所述扩增，并且在体外扩增之后分析28,000个细胞(使用总计680,000个孔，1:24细胞:孔比率)。两个实验使用表15中所报导的前导肽重叠延伸引物和具有以下条件的乳液连锁RT-PCR循环如实施例7中所述进行：以55℃30min，接着以94℃2min；94℃30s变性，54℃30s退火，72℃2min延伸的四个循环；94℃30s变性，60℃30s退火，72℃2min延伸的29个循环；然后以72℃7min的最终延伸步骤。额外条码区也包括在VL连锁引物(16N区)中，其用于鉴别单独连锁事件的多序列读长(表15)。巢式PCR如实施例5中进行，其中每组25个PCR循环。
表15：靶向抗体mRNA的前导肽区的重叠延伸RT-PCR引物。
在高通量Illumina 2x 250bp测序巢式PCR产物之后，两个前导肽组中以≥2读长观察的23/23CDR-H3显示匹配CDR-L3。本实施例证明，各种引物组可用于使用本公开的方法测序多转录物。
实施例9—使用喷嘴和环形载体流的低分散性、单细胞油包水液滴形成
在本实施例中，将永生化B细胞系MOPC-21可存活地封装在受控大小的乳滴中，所述乳滴由细胞的PBS和用于细胞活力可视化的台盼蓝染料的混合物组成。本实施例证明单细胞向受控大小分布的乳滴中分离，此外液滴由在液滴形成之前立即混合的两种不同的水流组成(图7)。
将MOPC-21细胞以500,000个细胞/毫升的PBS的浓度重悬浮。将同轴乳化设备通过在19-规格皮下管(Hamilton)内***26-规格针(Hamilton Company，Reno，NV，USA)来构造，并且调整针以使得针尖与皮下管的末端齐平。将同心针置于具有140μm孔口的3/8英寸OD玻璃管(Wale Apparatus，Hellertown，PA，USA)内部，以使得针出口离喷嘴孔口大致2mm。将含水PBS/细胞溶液以500μL/min的速率注射穿过针，同时将PBS/0.4％台盼蓝溶液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)注射穿过19ga皮下管，并且使油相(具有4.5％Span-80、0.4％吐温80、0.05％Triton X-100的分子生物级矿物油，v/v％，SigmaAldrich Corp.)以3mL/min的速率穿过玻璃管。将悬浮于油相中的液滴收集到2mL Eppendorf管中。注射泵(KD Scientific Legato 200，Holliston，MA，USA)用于控制水流速，齿轮泵(M-50，ValcoInstruments，Houston，TX，USA)用于控制油流速，并且所得乳液经由光学显微镜分析。产生平均直径为大致85μm的液滴，并且封装的单细胞如通过台盼蓝排除所测量显示出高生存力(图5)。
实施例10—经由封装于乳滴中测序B细胞中的多转录物
在本实施例中，细胞裂解和mRNA退火到poly(T)珠粒在使用实施例9中所概述的方法产生的乳液内完成。将记忆B细胞群体分离并且细胞如实施例7中扩增。记忆B细胞以100k/mL的浓度重悬浮于PBS中并且以500μL/min的速率穿过实施例8的乳液发生器装置的最深处26-规格针。将450μL poly(dT)磁性珠粒(1.0μm直径，NewEngland Biosciences，Ipswich，MA，USA)用磁体沉淀并且重悬浮于5mL细胞裂解/结合缓冲液(100mM tris pH 7.5，500mM LiCl，10mMEDTA，0.5％十二烷基硫酸锂，5mM DTT)中，并且使所得混合物以500μL/min的速率穿过19-规格皮下管，同时使油相(具有4.5％Span-80、0.4％吐温80、0.05％Triton X-100的分子生物级矿物油，v/v％，Sigma Aldrich Corp.)以3mL/min的速率穿过最外玻璃管以产生由直径大致85μm含有单细胞的含水液滴组成的乳液。将乳液流收集到2mL Eppendorf管中，并且使细胞在产生液滴时由洗涤剂裂解以允许mRNA捕获到封装在乳滴中的poly(dT)磁性珠粒上。
每个2mL乳液管保持在室温下持续三分钟，之后置于冰上持续最少10分钟。然后将管在4℃下以16,000x g离心5分钟，将上层矿物油层移除并且舍弃。添加200μL冷***以使乳液化学破乳并且将管以16,000x g离心2.5分钟以使磁性珠粒沉淀。将磁性珠粒用移液管取出，沉淀并且重悬浮于2mL裂解/结合缓冲液(100mM tris pH7.5，500mM LiCl，10mM EDTA，0.5％LiDS，5mM DTT)中。然后将珠粒洗涤并且重悬浮于如实施例8中的OE RT-PCR混合物中。使用前导肽引物，引物浓度给出在表15中。将OE RT-PCR混合物珠粒悬浮液乳化并且热循环，萃取cDNA，并且进行巢式PCR(参见实施例8)。将巢式PCR产物电泳以纯化连接转录物，所述转录物然后如上文实施例8测序。
在高通量Illumina 2x 250bp测序巢式PCR产物之后，根据实施例6中所述的算法，回收14,121个具有≥2读长的VH:VL对(组1中7,367个VH:VL对，和组2中6,754对)。在两组中观察3,935个CDR-H3具有≥2读长。两个组中所观察到的CDR-H3中3,899/3,935显示匹配CDR-L3，根据实施例7中所概述的式表明99.5％整体准确性。本实施例证明经由从乳滴内分离的单细胞的mRNA捕获测序多转录物。
实施例11—单细胞的重链和轻链cDNA的平行测序
先前实施例说明了使用磁性珠粒以捕获来自单细胞的mRNA并且共价连锁所需cDNA(例如，VH和VL cDNA)以产生单扩增子。因此产生的单VH-VL扩增子通过高通量DNA测序来测序以显示自然成对的VH和VL序列的组库。
在实施例中，捕获到珠粒上的cDNA直接测序而不用连接(即不用产生连接的VH-VL扩增子)。以此方式，显示单细胞的所需转录物的鉴别而不必进行重叠延伸PCR。首先，三个5’-胺功能化引物(表17)的等量混合物缀合到功能化磁性珠粒，以使得每个磁性珠粒上的固定化寡核苷酸为以下比例：1/3用于mRNA捕获的poly(T)，1/3对所需转录物1特异的引物(例如，表1的AHX89引物)和1/3对所需转录物2特异的引物(表17)。这些引物缀合的磁性珠粒用于双重目的：第一，在裂解之后，poly(T)引物捕获单个细胞的重链和轻链mRNA，如实施例4-6；第二，在乳液RT-PCR步骤中，AHX89和BRH06引物引起重链和轻链cDNA在珠粒表面上扩增。在RT-PCR之后，磁性珠粒用作高通量测序的测序模板。过程概述于图7中。
将三个5’-胺寡核苷酸(表16)的等量混合物根据生产商方案固定到功能化磁性珠粒上(Dynal MyOne Carboxylic Acid珠粒，1.0μm直径，InvitrogenCorp.)。然后，将MOPC-21和MOPC-315永生化细胞的混合物洗涤并且以100,000个细胞/毫升悬浮于PBS(pH 7.4)中。每毫升细胞裂解/mRNA结合溶液添加1.2x 108个功能化磁性珠粒，如实施例10中所概述。将细胞/珠粒悬浮液如实施例10中乳化，将细胞裂解，并且mRNA退火到珠粒。然后将珠粒通过使乳液破乳来回收，如实施例10中所述洗涤，并且进行乳液RT-PCR。RT-PCR引物浓度给出在表17中。循环条件如下：以55℃30min，接着以94℃2min；94℃30s变性，57℃1min退火，72℃2min延伸的四个循环；94℃30s变性，59℃30s退火，72℃2min延伸的29个循环；然后以72℃7min的最终延伸步骤。
表16：缀合到磁性珠粒表面的引物。
表17：MOPC-21/MOPC-315RT-PCR混合物中的引物。
在乳液RT-PCR之后，将乳液用正丁醇根据SOLiD基因测序生产商方案(Applied Biosystems)破乳，并且将磁性珠粒用作Ion Torrent测序平台(Life Technologies)的直接模板。测序首先用<F3>重链引物起始以收集重链cDNA序列，接着用<F5>轻链引物测序以收集轻链cDNA序列。将重链和轻链序列通过置于Ion Torrent测序平台上匹配以获得天然重链和轻链配对。
实施例12—编码高亲和力抗体的细胞的成对VH:VL转录物的测序
先前实施例详述了使用不同技术测序各种细胞群体的多转录物。本实施例描述使用抗原依赖性poly(dT)捕获和随后的VH:VL测序对来自仅编码对所关注的特定抗原特异的高亲和力抗体的细胞高通量测序天然成对的VH:VL抗体序列的方法。
根据生产商方案，抗原涂布的磁性珠粒通过将无疫苗级破伤风类毒素(TT)(1mM寡核苷酸，40nM TT，Statens Serum Institut，Copenhagen,Denmark)共价偶联到羧酸功能化的磁性珠粒(1μm直径Dynal MyOne COOH珠粒，Life Technologies)来制备。
将PBMC在施用破伤风类毒素(TT)/白喉类毒素加强接种(TD；20I.E.TT和2I.E.白喉类毒素，Sanofi Pasteur MSD GmbH，Leimen，Germany)之后14天从捐献的血液收集，并且经由标记抗体染色和FACS分选来分选，如实施例7中。将记忆B细胞如实施例4中所述与抗原涂布珠粒(大致40个珠粒/孔)一起接种到无菌PDMS载片中，将细胞使用透析膜密封在孔内并且在以下记忆B细胞刺激培养基中在PDMS微孔载片内与10μg/mL抗CD40抗体(5C3，BioLegend)，500U/ml IL-4和5ng/ml IL-5(PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA)一起培养四天：补充有10％免疫球蛋白耗竭的FBS、1×GlutaMAX、1×非必需氨基酸、1×丙酮酸钠和1×青霉素/链霉素(全部来自LifeTechnologies)的RPMI-1640。在此期间，刺激细胞以分泌抗体(Taubenheim等,2012)，并且对TT特异的任何分泌抗体变为结合到含有固定化抗原的磁性微珠粒。
将5’端链霉亲和素标记的poly(dT)25寡核苷酸的溶液(IntegratedDNA Technologies，USA)以等摩尔比率与山羊抗人IgG-生物素缀合物(B1140，Sigma-Alrich，USA)混合。链霉亲和素和生物素在溶液中缔合以形成具有拴系的poly(dT)25寡核苷酸的抗IgG抗体用于mRNA捕获。在培养四天以后，将密封破坏，并且将载片表面用400μL PBS轻轻洗涤三次以洗去分泌抗体而不会干扰孔中的细胞和珠粒。将过量PBS移除，将含有10nM抗IgG抗体/poly(dT)25缀合物的350μLRPMI-1640培养基添加到微孔载片表面，并且将载片在室温下孵育45分钟。在45min孵育的时程内，在4天分泌期(即抗原标记的微珠粒与编码TT的特异性抗体的分泌细胞共定位于孔)之后已经由抗TT抗体涂布的任何抗原标记的微珠粒变为修饰有poly(dT)25用于mRNA捕获。随后，将载片用400uL PBS轻轻洗涤三次以移除过量抗体/寡核苷酸缀合物，并且将微孔用透析膜密封，将细胞裂解，将珠粒用磁体回收，并且如新实施例3中进行乳液连锁RT-PCR，除了0.1％十二烷基硫酸锂代替1％十二烷基硫酸锂用于细胞裂解缓冲液中。进行巢式PCR并且将连接转录物使用长读长Next Generation测序平台测序，如新实施例5中。
本方法中概述的过程富集高亲和力抗原特异性VH:VL对的序列组，因为仅具有结合IgG免疫球蛋白的抗原标记的珠粒含有细胞裂解之后mRNA捕获所需的poly(dT)25序列。因此，本实施例中概述的方法说明了应用高通量VH:VL配对技术用于在单一实验中测序大量抗原特异性VH:VL对而不必进行免疫球蛋白的表面表达。
实施例13—使用低分散性液滴乳液乳化的单细胞上的RT-PCR
如在实施例6中，乳液通过将水流从喷嘴注射到快速移动的环状油相中形成。载体流产生的剪切力诱导具有严格受控大小分布的含水液滴的形成，并且喷嘴/载体流方法产生单分散液滴大小的乳液，其减小由液滴大小的范围造成的每乳滴多细胞的发生率。在本实施例中，两个永生化细胞系(MOPC-21和MOPC-315)的混合物用于说明直接在大致4nL体积的乳滴中的细胞封装和连锁RT-PCR而无中间细胞裂解或mRNA捕获步骤。
将RNAse处理并且洗涤的MOPC-21和MOPC-315细胞(如实施例2中)的等量混合物以50,000个细胞/毫升的浓度重悬浮于PBS中，同时制备另一水相，其由具有0.1％BSA(Invitrogen Ultrapure BSA，50mg/mL)、4％SuperAse In RNAse抑制剂(Invitrogen，USA)和0.1％NP-40洗涤剂的2x浓缩RT-PCR混合物(Quanta OneStep Fast qRT-PCR)组成。将乳化设备如实施例10中制备。将所有针和针供应管在1％BSA中预封闭30分钟并且用PBS冲洗，将PBS中的细胞通过内(26规格)针递送，同时将RT-PCR混合物和洗涤剂经由外(19规格)针递送，其中两个水相为500μL/min。油载体相(具有4.5％Span-80、0.4％吐温80、0.05％Triton X-100的分子生物级矿物油，v/v％，油相试剂来自Sigma Aldrich Corp.)以3mL/min的速率流过外玻璃管并且将样品如实施例10中收集。将与2mL NP-40稀释剂混合的总计2mL细胞/RT-PCR混合物乳化用于分析的大致100,000个细胞。RT-PCR混合物的引物浓度给出在表1中，其中使用与实施例11中热循环条件相同的热循环条件。
然后将RT-PCR的细胞乳液置于96孔板中并且热循环，萃取cDNA，并且进行巢式PCR反应(参见实施例4)。巢式PCR引物给出在表2中，并且PCR的热循环条件如下：以94℃的2min变性步骤，接着以94℃30s变性，62℃30s退火，72℃20s延伸的热循环，持续30个循环。将巢式PCR产物电泳以纯化连接的VH-VL cDNA，从而用作NextGen测序的模板。
因此，本发明非常适合于达到所提及的目的和优势以及自身固有的目的和优势。上文所公开的具体实施方案仅仅是说明性的，因为本发明可以以对受益于本文教义的本领域技术人员来说显而易见的不同但等效的方式进行修改和实践。此外，旨在不限制本文所示的构造或设计的细节，除了如以下权利要求书中所述。因此显然，可对上文所公开的具体说明性实施方案做出更改或修改，并且所有这些变化都被认为是在本发明的范围和精神内。尽管关于“包含”、“含有”或“包括”不同组分或步骤描述组合物和方法，但是组合物和方法也可“基本上由”或“由”不同组分或步骤“组成”。上文所公开的所有数字和范围可变化某一量。每当公开具有下限和上限的数字范围时，就明确公开了落在范围内的任何数字和任何包括的范围。具体地说，本文公开的值的每个范围(形式为“约a至约b”，或等效地“大致a至b”，或等效地“大致a-b”)应理解为阐述涵盖在值的较宽范围内的每个数字和范围。另外，除非专利权所有人另外明确地并且清楚地定义，否则权利要求书中的术语具有它们简单的、普遍的意义。此外，如权利要求书中所用的不定冠词“一个”或“一种”在本文中定义为意指引入的一个或多于一个元件。如果本说明书和可以引用方式并入本文的一个或多个专利或其它文件中存在词语或术语用法的任何矛盾，那么应采用与本说明书一致的定义。
***
根据本公开，本文公开的并且要求保护的所有方法可在无需过度实验的情况下制得和实施。尽管本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案加以描述，但对本领域技术人员显而易见的是可使本文所述的方法和本文所述方法的步骤的顺序发生变化，而不偏离本发明的概念、精神和范围。更具体说来，显而易见的是在化学上和生理学上相关的某些试剂可取代本文所述的试剂，同时达到相同或相似结果。对本领域技术人员来说显而易见的是所有此类相似的替代和修改被认为处在如由随附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
参考文献
以下参考文献以引用方式特别并入本文，在某种程度上，它们提供示例性程序或对本文所阐述的那些进行补充的其它细节。
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Claims (64)

1.一种方法，其包括：
a)将单细胞和mRNA捕获剂隔离到单独隔室中；
b)裂解所述细胞并且用所述mRNA捕获剂收集mRNA转录物；
c)使用所述mRNA捕获剂从所述隔室分离所述mRNA；
d)进行逆转录，接着对所述捕获的mRNA进行PCR扩增；以及
e)测序从单细胞扩增的至少两个不同cDNA产物。
2.如权利要求1所述的方法，其进一步定义为获得多个成对抗体VH和VL序列的方法，其中所述细胞为B细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述mRNA捕获剂为珠粒。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述珠粒为磁性的。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述珠粒包括杂交mRNA的寡核苷酸。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述寡核苷酸包括poly(T)和对所关注的转录物特异的引物中的至少一者。
7.如权利要求2所述的方法，其进一步定义为获得结合到所关注抗原的抗体的成对抗体VH和VL序列的方法。
8.如权利要求3所述的方法，其中所述珠粒缀合到所关注抗原，并且所述寡核苷酸在结合到所关注抗原的抗体的存在下仅缀合到所述珠粒。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述单独隔室为凝胶或微量滴定板中的孔。
10.如权利要求1所述的方法，所述单独隔室具有小于5nL的体积。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述孔在步骤(c)之前用透性膜密封。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述单独隔室为乳液中的微泡。
13.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)和(b)同时进行。
14.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)和(b)包括将单细胞和mRNA捕获剂分离到乳液中并且存在细胞裂解溶液的单独微泡中。
15.如权利要求2所述的方法，其包括从至少10,000个单个细胞获得序列。
16.如权利要求2所述的方法，其包括获得至少5,000个单独成对抗体VH和VL序列。
17.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)包括通过进行重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应连接cDNA以将至少2个转录物连接到单DNA分子中。
18.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)不包括使用重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应。
19.如权利要求2所述的方法，其中步骤(e)包括通过进行重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应连接VH和VL cDNA以将VH和VLcDNA连接到单分子中。
20.如权利要求2所述的方法，其中步骤(e)不包括使用重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应并且其中所述VH和VL cDNA为分开的分子。
21.如权利要求2所述的方法，其中所述VH和VL序列通过测序不同分子获得。
22.如权利要求2所述的方法，其还包括鉴别所述成对抗体VH和VL序列包括进行所述序列的概率分析。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述概率分析是基于所述CDR-H3或CDR-L3序列。
24.如权利要求22所述的方法，其中鉴别所述成对抗体VH和VL序列包括比较原始测序读长计数。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述概率分析包括进行图9的步骤。
26.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)包括通过进行重组连接cDNA。
27.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的组：B细胞、T细胞、NKT细胞和癌细胞。
28.如权利要求1所述的方法，其中隔离所述单细胞包括将所述细胞引入到包括多个微孔的装置，以使得大部分细胞以单细胞的形式被捕获。
29.如权利要求1所述的方法，其中步骤(e)包括测序共价连接到同一珠粒的两个或更多个转录物。
30.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
31.如权利要求1所述的方法，其还包括使用概率分析测定天然成对转录物。
32.如权利要求31所述的方法，其中鉴别所述成对转录物包括比较原始测序读长计数。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述概率分析包括进行图9的步骤。
34.一种***，其包括：
a)含水流体相出口，其安置在环形流动油相内；以及
b)含水流体相，其中所述水相流体包含细胞悬浮液并且分散于所述流动油相内，产生具有包含细胞的含水悬浮液的低尺寸分散性的乳化液滴。
35.如权利要求34所述的***，其中所述含水流体相出口为针。
36.如权利要求34所述的***，其中所述含水流体相出口为玻璃管。
37.如权利要求34所述的***，其中所述油相流过玻璃管。
38.如权利要求34所述的***，其中所述油相流过聚合物管。
39.如权利要求34所述的***，其中所述水相流过聚合物管。
40.如权利要求34所述的***，其中细胞浓度、含水流体相流速和油相流速允许液滴的形成，其中每个液滴含有单细胞。
41.如权利要求34所述的***，其中所述细胞选自由以下组成的组：B细胞、T细胞、NKT细胞和癌细胞。
42.如权利要求34所述的***，其中所述含水流体相包括用于核酸捕获的珠粒。
43.如权利要求34所述的***，其中所述含水流体相包括逆转录试剂、聚合酶链式反应试剂和其组合。
44.一种组合物，其包含具有多个单独微泡的乳液，所述微泡包含具有用于引发逆转录的固定化寡核苷酸的珠粒和个体B细胞，所述B细胞已破裂以释放个体B细胞的mRNA转录物。
45.一种方法，其包括：
a)将公共序列添加到对一组基因靶标特异的两个或更多个寡核苷酸的5’区；
b)通过引发所述公共序列进行所述组的基因靶标的核酸扩增；以及
c)包括在所述核酸扩增寡核苷酸中，其包括将所述公共序列固定到表面上，以使得固定化寡核苷酸引发核酸扩增，并且导致扩增序列的表面捕获。
46.一种用于获得多个成对抗原受体序列的方法，其包括：
a)用固定化寡核苷酸将单哺乳动物细胞分离于单独隔室中用于引发逆转录；
b)使所述细胞裂解并且允许mRNA转录物与所述固定化寡核苷酸缔合；
c)进行逆转录，然后进行PCR扩增以获得对应于单细胞的所述mRNA转录物的cDNA；
d)测序所述cDNA；以及
e)基于所述测序鉴别多个单细胞的多mRNA转录物。
47.如权利要求46所述的方法，其进一步定义为获得多个成对抗体VH和VL序列的方法，其包括：
a)用固定化寡核苷酸将单B细胞分离于单独隔室中用于引发逆转录；
b)使所述B细胞裂解并且允许mRNA转录物与所述固定化寡核苷酸缔合；
c)进行逆转录，然后进行PCR扩增以获得对应于单B细胞的所述mRNA转录物的cDNA；
d)测序所述cDNA；以及
e)基于所述测序鉴别多个单B细胞的所述成对抗体VH和VL序列。
48.如权利要求46所述的方法，其进一步定义为获得多个成对T细胞受体序列的方法，其包括：
a)用固定化寡核苷酸将单T细胞分离于单独隔室中用于引发逆转录；
b)使所述T细胞裂解并且允许mRNA转录物与所述固定化寡核苷酸缔合；
c)进行逆转录，然后进行PCR扩增以获得对应于单T细胞的所述mRNA转录物的cDNA；
d)测序所述cDNA；以及
e)基于所述测序鉴别多个单T细胞的所述成对T细胞受体序列。
49.如权利要求47所述的方法，其进一步定义为获得结合到所关注抗原的抗体的成对抗体VH和VL序列的方法。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述寡核苷酸为仅存在结合到所关注抗原的抗体的固定化寡核苷酸。
51.如权利要求46所述的方法，其中所述单独隔室为凝胶或微量滴定板中的孔。
52.如权利要求46所述的方法，其中所述孔在步骤(b)之前用透性膜密封。
53.如权利要求46所述的方法，其中所述单独隔室为乳液中的微泡。
54.如权利要求46所述的方法，其中所述寡核苷酸固定到珠粒上。
55.如权利要求46所述的方法，其中步骤(a)和(b)同时进行。
56.如权利要求55所述的方法，其中步骤(a)和(b)包括将单细胞和固定到珠粒上的寡核苷酸分离到乳液中并且存在细胞裂解溶液的单独微泡中。
57.如权利要求46所述的方法，其中步骤(c)包括通过进行重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应连接所述成对抗原受体cDNA以将所述成对抗原受体cDNA连接到单分子中。
58.如权利要求46所述的方法，其中步骤(c)不包括使用重叠延伸逆转录酶聚合酶链式反应并且其中所述成对抗原受体序列cDNA为分开的分子。
59.如权利要求46所述的方法，其中鉴别所述成对抗原受体序列的步骤(e)包括进行所述序列的概率分析。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述成对抗原受体序列为成对VH和VL序列，并且所述概率分析是基于所述CDR-H3或CDR-L3序列。
61.如权利要求59所述的方法，其中鉴别所述成对抗原受体序列包括比较原始测序读长计数。
62.如权利要求59所述的方法，其中所述概率分析包括进行图9的步骤。
63.如权利要求46所述的方法，其包括从至少10,000个单个细胞获得序列。
64.如权利要求46所述的方法，其还包括在步骤(c)之前分离所述固定化mRNA转录物。
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