CN115029341A - 一种快速克隆配对tcr序列检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种快速克隆配对TCR序列检测方法及其应用。所述的方法包括以下步骤：肿瘤组织中分选并捕获单个肿瘤反应性T细胞，提取、标记单个细胞的mRNA，反转录并构建全长cDNA，cDNA特异性PCR扩增得到cDNA全长转录组；cDNA全长转录组富集后，与启动子序列连接、环化并进行TCR序列的特异性扩增，扩增产物富集后连接到表达载体中得到TCR的全长克隆，进行文库序列比对获得配对的TCR序列。本发明的优点：在一个反转录体系内实现数百个细胞的配对TCR克隆，实现快速，低成本，并且高通量的获取配对TCR。

Description

一种快速克隆配对TCR序列检测方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种快速克隆配对TCR序列检测方法及其应用。
背景技术
T细胞受体(T cell receptor，TCR)是所有T细胞表面的特征性标志，它特异性识别抗原提呈细胞上的抗原肽-MHC复合物，进而触发T细胞免疫应答。由于TCR分子决定着T细胞的抗原识别特异性，如果将肿瘤抗原特异性的TCR 转入普通T细胞中，能够强化该T细胞肿瘤抗原的识别能力，经体外活化增殖后再输入患者体内，可以发挥抗肿瘤功效。因此利用TCR基因导入的方法可以方便地获得大量识别特定抗原的T细胞，经TCR基因修饰的T细胞被称为TCR- T，近年来TCR-T已经成为肿瘤免疫治疗中的研究热点，在临床实验中显示了良好的治疗效果。TCR-T细胞疗法(T Cell Receptor-Gene Engineered T Cells)，通过筛选和鉴定能够特异性结合靶点抗原的TCR序列，采用基因工程手段将其转入到患者外周血来源的T细胞中(或异源T细胞)，再将改造后的T细胞回输至患者体内，使其特异性识别和杀伤表达抗原的肿瘤细胞，从而达到***的目的。
TCR是由α、β两条肽链构成的异源二聚体，每条肽链分为可变区(V区)、恒定区(C区)、跨膜区和胞质区等几部分；其胞质区很短，信号传递主要通过与其以非共价键结合的CD3分子进行。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区；V区又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3 变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，CDR3直接与抗原肽相结合。
TCR筛选技术是TCR相关药物研发最核心的部分。但是目前TCR筛选成本高，耗时长，效率低，尤其是配对TCR全长基因的获取，是整个过程的限速步骤，严重影响了TCR相关药物的研发。
肿瘤内部的肿瘤反应性T细胞通过T细胞受体发挥功能，但一般都处于耗竭状态，难以直接使用。如何快速低廉的把这些肿瘤反应性T细胞的TCR序列克隆出来，然后转导到原代T细胞中，制备状态比较好的T细胞，是目前肿瘤治疗领域所期望突破的技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速低成本克隆配对TCR全长序列的检测方法及其在治疗领域，尤其是个性化治疗领域的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
第一方面，本发明提供一种克隆配对TCR序列的方法，所述的方法包括以下步骤：肿瘤组织中分选并捕获单个肿瘤反应性T细胞，提取、标记单个细胞的mRNA，反转录并构建全长cDNA，cDNA特异性PCR扩增得到cDNA全长转录组；
cDNA全长转录组富集后，与启动子序列连接、环化并进行TCR序列的特异性扩增，扩增产物富集后连接到表达载体中得到TCR的全长克隆，进行文库序列比对获得配对的TCR序列。
在一种具体实施方式中，所述的配对方法中，mRNA反转录时在反转录体系中加入TSO(Template switch oligo)，扩增完成cDNA全长转录组的富集。
在一种具体实施方式中，所述的方法中，通过单细胞标记磁珠5’端的恒定区序列及反转录过程中添加的TSO序列，扩增完成全长转录组的富集。
在一种具体实施方式中，所述的方法中环化方法为：
环化时直接将启动子序列***到TSO序列之前；
所述的启动子可以是任一启动mRNA转录的基因元件，包括但不限于CMV、EF1alpha、SV40、PGK1、CAG、T7、Sp6；
设计PCR引物扩增CMV启动子序列CMV-P，并在正向和反向引物的5’端添加cDNA同源序列后进行TCR序列的特异性扩增，完成TCR的扩增；
CMV启动子序列CMV-P的核酸序列如Seq ID No.1所示。
所述的PCR引物包括CMV-P-F和CMV-P-F；
CMV-P-F序列：
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGGCATTGATTATTGACTAGTTAT；
CMV-P-F序列：
CCCCAAGTACTCTGCGTTGATACCAACCTCTGCTTATATAGACCTCC。
在一种具体实施方式中，所述的配对TCR序列包含TCR-alpha和TCR-beta 序列。
所述的表达载体是任一具有复制子和抗性基因等元件的质粒；在一种具体实施方式中，所述的表达载体为线性化pMax-TRAC和pMax-TRBC载体；
表达载体pMax经过人工改造去掉载体自身的CMV启动子，添加TCR alpha 恒定区得到pMax-TRAC，添加TCR beta恒定区得到pMax-TRBC；
通过重组的方法将纯化后的TCR alpha-1克隆到pMax-TRAC，将纯化后的 TCRbeta-1克隆到pMax-TRBC后具有完整的TCR表达框。
在一种具体实施方式中，分选单个肿瘤反应性T细胞的方法为：肿瘤组织消化为单细胞并制备成单细胞悬液后注入微流控芯片获得单个肿瘤反应性T细胞。
在一种具体实施方式中，所述的提取、标记单个细胞mRNA的方法为：单个肿瘤反应性T细胞分离后，在微孔中加入单细胞标记磁珠，完成单个细胞的 mRNA的捕获和标记。
在一种具体实施方式中，所述的单细胞标记磁珠表面有携带2个恒定的序列，特异barcode序列和poly dT的单链DNA oligo。
在一种具体实施方式中，所述的单细胞标记磁珠携带不同的barcode，用于标记单个T细胞，poly dT用于捕获总mRNA并作为反转录引物。
在一种具体实施方式中，所述的文库序列比对为：分别进行TCR-alpha和 TCR-beta全长克隆后，挑取单克隆进行细胞barcode比对，具有相同细胞barcode 的TCR-alpha和TCR-beta序列为配对TCR。
在一种具体实施方式中，分选单个肿瘤反应性T细胞的方法为：通过使用带有荧光标签的抗体对单细胞悬液进行染色标记后进行流式分选仪进行分选。
在一种具体实施方式中，分选单个肿瘤反应性T细胞的方法为：将肿瘤组织消化为单细胞，使用带有荧光标签的抗体CXCL13-APC对单细胞悬液进行染色标记，单细胞通过流式分选仪分选肿瘤单细胞悬液中CXCL13阳性的T细胞即为肿瘤反应性T细胞。
进一步，在一个具体实施方式中，本发明的配对TCR序列是通过如下方法获得：
S101、将一定数量组织细胞注入到定制的微流控芯片，芯片表面有可以容纳单个细胞的微孔，根据“泊松分布”的原理完成单个细胞的分离。
S102、在微孔中加入单细胞标记磁珠，利用单细胞标记磁珠完成单个细胞的 mRNA的捕获和标记。单细胞标记磁珠表面有携带2个恒定的序列，特异barcode 序列和poly dT的单链DNA oligo。每一个磁珠携带不同的barcode，用于标记单个T细胞，polydT用于捕获总mRNA并作为反转录引物。
S103、单个T细胞进行标记后，开始mRNA的反转录，获取cDNA。
S104、在反转录体系中加入TSO(Template switch oligo)，作为后续PCR 的引物结合区。通过单细胞标记磁珠5’端的恒定区序列及反转录过程中添加上的TSO序列，扩增完成全长转录组的富集。
S105、将获得的扩增产物与扩增的启动子序列进行重组环化处理，然后使用单细胞标记磁珠上的恒定区序列和TCR恒定区特异性引物进行TCR序列的特异性扩增，完成TCR的富集。
在环化时直接将启动子(Promoter)序列***到TSO序列之前，TSO序列中不包含ATG序列，从而不影响TCR基因的表达。磁珠上的恒定区序列和 barcode序列将位于启动子之前。设计PCR引物从pMax载体上扩增CMV启动子序列CMV-P，并在正向和反向引物的5’端添加cDNA同源序列，PCR扩增 CMV启动子。CMV启动子序列CMV-P的核酸序列如见Seq ID No.1所示。
S106、将获得的TCR富集产物与具有TCR恒定区的表达载体重组环化相连，然后转化大肠杆菌进行质粒扩增。
S107、按照上述步骤分别进行TCR-alpha和TCR-beta全长克隆后，挑取单克隆，提取质粒并测序后进行细胞barcode比对，具有相同细胞barcode的TCR- alpha和TCR-beta序列为配对TCR。
第二方面，本发明提供一种TCR-T细胞。
本发明提供的一种TCR-T细胞，所述TCR-T细胞是通过生物工程技术将本发明方法获得的配对TCR序列注入相应的T细胞后获得。
进一步的，所述相应的T细胞是指个体自身T细胞或异源T细胞。
进一步的，所述异源T细胞是同类物种的不同个体的T细胞和/或不同物种的T细胞。
进一步的，所述异源T细胞可以是来自人类不同个体的T细胞或来自其它动物体的T细胞。
第三方面，本发明提供一种药物组合物。
一种药物组合物，所述药物组合物中含有本发明第二方面获得的TCR-T细胞。
进一步的，所述的药物组合物含有药学上可接受的载体。
进一步的，所述的药物组合物含有药学上可接受的载体。
进一步的，所述的载体为包括与药用给予相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延迟剂等。所述的分散介质涉及的载体或稀释剂优选实例包括 (但不限于)水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和人血清白蛋白。也可使用脂质体和非水性媒介物比如固定油。这些介质和试剂用于药用活性物质的用途为本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑在组合物中使用它们。补充的活性化合物也可掺入组合物中。
进一步的，所述的药物组合物制备为相应的药学制剂，所述药学制剂包括但不限于静脉内、皮内、皮下、经口、经皮、经粘膜和直肠给予以及注射。
在另一项具体实施方式中，所述的药物组合物含有不同于TCR-T细胞的第二活性制剂，所述第二活性制剂包括具有抗肿瘤作用的药物、提高患者抵抗力的药物和/或增加患者耐受性的药物等。
本发明第三方面提供的药物组合物用于治疗与T细胞相关的疾病，所述疾病包括感染性疾病、肿瘤、自身免疫疾病和和器官移植等。
第四方面，本发明提供一种诊断和/或评估制剂。
一种诊断和/或评估制剂，所述诊断和/或评估制剂中含有本发明第二方面获得的TCR-T细胞。
进一步的，所述的制剂包括辅料，所述辅料包括载体或稀释剂；
所述的载体或稀释剂为：与TCR-T细胞相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延迟剂。
进一步的，所述的制剂制备为制剂盒。
在另一项具体实施方式中，所述的诊断和/或评估制剂用于诊断或评估与T 细胞相关的疾病或事件；
所述疾病或事件包括感染性疾病、肿瘤、自身免疫疾病和器官移植等。
第五方面，本发明进一步提供本发明第三方面药物组合物的用途。
本发明第二方面提供的药物组合物用于治疗与T细胞相关的疾病，所述疾病包括癌症、感染性疾病和自身免疫病。
进一步的，所述药物组合物中所含有的TCR-T细胞是来自患者自身的T细胞。
进一步的，所述的TCR-T细胞中的TCR序列是从患者自身T细胞获取 mRNA后获得的TCR全长序列信息。
进一步的，所述的药物组合物用于患者自身感染性疾病、肿瘤或免疫性疾病的个体精准治疗。
在另一项具体实施方式中，所述的癌症选自由急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、***癌、阑尾癌、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤、原发性未知癌、中枢神经***淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、***、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、***增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、咽下癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合症、骨髓增生异常综合症、骨髓性白血病、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胰腺癌胰岛细胞、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、***癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、***癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、默克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤、原发部位未知癌、尿道癌、子宫肉瘤、***癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和威尔姆斯瘤组成的组。
在另一项具体实施方式中，所述的自体免疫性疾病选自由关节炎、慢性阻塞性肺疾病、强直性脊柱炎、克罗恩病、皮肌炎、I型糖尿病、子宫内膜异位症、 Goodpasture氏综合症、Graves氏病、格林-巴厘综合症、桥本氏病、化脓性汗腺炎、川崎病、IgA肾病、原发性血小板减少性紫癜、间质性膀胱炎、红斑狼疮、混合性***病、硬斑病、重症肌无力、嗜睡症、神经性肌强直、寻常型天疱疮、恶性贫血、银屑病、银屑病关节炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、复发性多软骨炎、类风湿关节炎、精神***症、硬皮病、干燥综合症、僵人综合症、颞动脉炎、溃疡性结肠炎、脉管炎、白斑病以及韦格纳肉芽肿组成的组。
第六方面，本发明进一步提供本发明第四方面提供的诊断和/或评估制剂的用途。
本发明第四方面提供的诊断和/或评估制剂用于生物标志物、抗体开发、用药和疫苗评估、免疫细胞分化溯源、免疫排斥和耐受、微小残留病检测、食品或其它过敏原检测。
在另一项具体实施方式中，所述的表达载体为病毒载体或非病毒载体。
在另一项具体实施方式中，所述的载体包含编码TCR的核酸和编码CD8αβ或CD8α的核酸。
附图说明
图1为实施例2单细胞标记磁珠示意图；
图2为实施例2中TCR质粒文库构建技术流程图；
图3为实施例2电泳检测PCR扩增得到的TCR alpha和TCR beta基因片段；
图4为实施例2中线性化pMax-TRAC和pMax-TRBC载体图谱。
图5为实施例2中电泳检测TCR alpha和TCR beta基因片段连接到表达载体上的阳性克隆；
图2中，TSO指template switch oligo，V region指TCR的可变区、C region指TCR的恒定区、Promoter为启动子。
具体实施方式
为使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下实施例对本发明的作进一步详细描述，以下实施例仅用于说明发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
肿瘤反应性T细胞的富集
首先通过外科手术取肿瘤组织，然后将肿瘤组织消化为单细胞。将单细胞进行处理后，使用带有荧光标签的抗体对单细胞悬液进行染色标记：CD3-FITC， CD45-PE和CXCL13-APC。将单细胞通过流式分选仪(Sony；SH800S)分选肿瘤单细胞悬液中CXCL13阳性的T细胞。携带CXCL13的这部分T细胞可能为肿瘤反应性T细胞。其他肿瘤反应性T细胞的标签包括：CD39(ENTPD-1)和 CD200等。
实施例2
使用磁珠标记配对TCR alpha和TCR beta链并构建TCR质粒文库。磁珠上携带DNAoligo(图1)，DNA oligo包括：恒定序列1，Barcode，恒定序列2和 oligo dT序列。Barcode用于标记单个细胞，Oligo dT用于捕获mRNA，恒定序列1和恒定序列2用于环化和PCR过程。本发明整体技术流程见图2。
1.单细胞分选
1.1将分选的细胞进行活性测定和细胞计数，保证细胞活率在85％以上，根据计数用PBS将细胞密度调整到2×105/ml～1×106/ml，制备成单细胞悬液。
1.2微流控芯片的处理
定制的微流控芯片表面有容纳单个细胞的微孔，数量为2万个(优选1千～15万个孔)。将微流控芯片置于干净的培养皿上，用200μl的移液器吸取200μl 的100％无水乙醇从进样口注入芯片，可使用移液器在芯片中来回抽吸100％无水乙醇直至芯片中不再出现气泡，及时移除出样口的液体。重复冲洗2～3次，移除出样口处液体后吸取200μl的0.02％PBST(PBS中包含0.02％Tween-20)从进口处注入芯片，时间控制在10s以内及时移除出样口处液体。出样口处保留少量液体，最后盖上培养皿盖，室温静置备用。
1.3注入细胞
移除进出样口多余液体，加200μl的PBS润洗芯片，然后移除出样口及进样口多余液体，重复润洗1次。吸取100μl重悬好的细胞(大约300～500个细胞，优选50～2000个细胞范围)，缓慢匀速注入芯片，立即移除出样口多余液体。静置5min使细胞落入微孔内，静置期间可在显微镜下观察细胞落入微孔情况。待细胞落入微孔内，吸取200μl的PBS缓慢匀速注入芯片冲洗掉多余细胞，立即移除进出样口液体。用PBS重复1次，冲洗掉留在表面未落入微孔内的细胞。
1.4注入单细胞标记磁珠
吸取60μl重悬好的单细胞标记磁珠，缓慢匀速加入芯片进样口。多次吸取 100μl的PBS，缓慢匀速加入进样口，使单细胞标记磁珠缓慢流动，并及时吸取出样口单细胞标记磁珠，直至达到芯片的另一端，在此期间收集进出样口的多余单细胞标记磁珠。吸取200μl的PBS缓慢匀速注入芯片，吸去进出样口多余液体。用PBS重复1次至冲洗掉多余的单细胞标记磁珠。显微镜下观察单细胞标记磁珠掉入孔中的情况，若芯片进口端单细胞标记磁珠空缺较多，可将回收的单细胞标记磁珠置于磁力架上，吸除上清液提高单细胞标记磁珠密度后再次注入到空缺处静置10s后再冲洗。同理，若芯片出口端单细胞标记磁珠空缺较多，可将回收的单细胞标记磁珠注入到出口槽处，用移液器从进口端将单细胞标记磁珠吸入空缺处，静置10s后再冲洗。
2.细胞裂解和和mRNA捕获
2.1注入Lysis Buffer
吸取100μl的Lysis Buffer从进样口缓慢注入芯片时间约15s，立即移除进出样口多余液体。室温静置20min用于裂解细胞并释放mRNA，此步骤可以让单细胞标记磁珠捕获mRNA。
2.2取出单细胞标记磁珠
2.2.1取1.5mL离心管，标记后置于1.5mL规格磁力架上。
2.2.2保持磁力架置于芯片底部，用200μl的Wash Buffer加入到出样口凹槽，快速润洗出样口凹面，润洗完毕后立即移除液体重复润洗3次。
2.2.3将200μl的wash buffer加入出样口，将磁力架转移置于芯片顶部，静置1min，保持磁力架在芯片顶部，将200μl移液器吸头***进样口，吸取200μl 液体，收集到含有单细胞标记磁珠的液体转移至预冷的1.5mL离心管内。重复该步骤1次，收集捕获到mRNA的全部单细胞标记磁珠。
3.反转录和扩增
3.1将装有单细胞标记磁珠的离心管短暂离心后置于1.5ml规格磁力架上，待溶液澄清后，小心吸除上清液。从磁力架上取下离心管，加入1mL的Wash Buffer，用移液器轻轻吹吸混匀后短暂离心置于磁力架上，待溶液澄清后小心移除上清。
3.2从磁力架上取下离心管，加入500μl的1×Wash Buffer，用移液器轻轻吹吸混匀后短暂离心置于磁力架上，待溶液澄清后小心移除上清。
3.3取下离心管，短暂离心后再置于磁力架上，用20μl的移液器吸取残余的液体。只留下离心管底部的单细胞标记磁珠。
3.4在冰上按照如下表格配制RT Mix-1，混匀并短暂离心。
组分 体积
RT Master Mix-1 120μl
100mM DTT 20μl
TS primer 10μl
Reverse Transcriptase 10μl
RNase Inhibitor 5μl
ddH<sub>2</sub>O 35μl
Total 200μl
将配制好的200μl RT Mix-1加入到3.3步骤中的TCR Barcode Beads，并用移液器吹吸混匀。置于提前设置好的金属浴中，42℃，转速1300rpm，反应90min (提前预热)。
3.5 cDNA扩增
3.5.1在冰上按照如下表格配制PCR Mix-2，混匀并短暂离心
Figure BDA0003656718880000131
Figure BDA0003656718880000141
其中引物序列为：
cDNA-F：TGGTATCAACGCAGAGTACTTGGG；
cDNA-R：CCTACACGACGCTCTTCCGATC。
3.5.2将上一步骤的反转录产物离心，放置于1.5ml规格的磁力架上，待溶液澄清后小心移除上清。
3.5.3将离心管从磁力架上取下，向管中加入配制好的400μl PCR Mix-2，一边吹打混匀，一边分装到8联排管中，每管分装50μl。
3.5.4盖好8联排管盖，置于PCR仪中扩增。PCR反应程序为：
Figure BDA0003656718880000142
4.cDNA产物纯化
4.1 Ampure XP纯化磁珠提前30min从4℃中取出恢复室温。使用前要充分振荡混匀。
4.2将PCR扩增产物收集到1.5m离心管中短暂离心。加入0.6×纯化磁珠涡旋混匀后，室温孵育5min短暂离心，置于1.5mL规格磁力架上静置5min至液体透明澄清，小心吸除上清液至新的1.5mL离心管中。
4.3保持离心管始终处于磁力架上，加入800μl新配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30s小心移除上清。
4.4重复步骤4.3一次。
4.5取下离心管短暂离心，再次置于磁力架上，吸去多余酒精，开盖晾干约 2min。
4.6取下离心管，加入20μl ddH2O，用移液器吹打混匀，室温孵育5min短暂离心后静置于磁力架上至液体透明澄清。
4.7吸取上清并转移至新的EP管中即为纯化产物。
5.环化
5.1为了防止barcode和恒定区序列对后续表达的影响，本发明在环化时直接将启动子(Promoter)序列***到TSO序列之前，TSO序列中不包含ATG序列，从而不影响TCR基因的表达。
PCR扩增CMV启动子：设计PCR引物从pMax载体上扩增CMV启动子序列CMV-P，并在正向和反向引物的5’端添加cDNA同源序列。
CMV启动子序列CMV-P的核酸序列如Seq ID No.1所示。
PCR扩增体系：
Taq mix 2X 25μl
ddH<sub>2</sub>O 22μl
pMax载体 1μl
CMV-P-F 1μl
CMV-P-R 1μl
其中引物序列为：
CMV-P-F序列：
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGGCATTGATTATTGACTAGTTAT；
CMV-P-F序列：
CCCCAAGTACTCTGCGTTGATACCAACCTCTGCTTATATAGACCTCC。
PCR扩增条件：
Figure BDA0003656718880000161
CMV启动子扩增后形成大约600bp单一的条带，基因片段扩增成功。
5.2 PCR产物纯化，按照试剂盒提供的标准操作流程进行(天根生化科技有限公司，DP219-03)操作。
5.2.1将单一的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量。
5.2.2向凝胶块中加入3倍体积溶胶液PE(如果凝胶重0.1g，其体积可视为 100μl，则加入300μl溶胶液PE)。室温15～25℃溶胶5～10min，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
5.2.3将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA5中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA5放入收集管中。
5.2.4向吸附柱CA5中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30～60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA5放入收集管中。
5.2.5重复操作步骤5.2.4。
5.2.6将吸附柱CA5放回收集管中，12000rpm离心2min，尽量除尽漂洗液。将吸附柱CA5置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步实验。
5.2.7将吸附柱CA5放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加提前预热的ddH2O，室温放置2min。12000rpm离心2min收集DNA溶液。
5.3纯化的cDNA和CMV启动子环化
纯化的产物按照下表配制反应体系：
组分 体积
2×clone Enzyme Premix 10μl
纯化的cDNA 5μl
纯化的CMV-P 5μl
使用移液器轻柔充分混匀，短暂离心后将反应管置于PCR仪中，50℃反应 25min进行环化反应。
5.4环化产物纯化
5.4.1提前半小时取出DNA Clean Beads置于室温，使用前充分震荡混匀。
5.4.2加入01×DNA Clean Beads涡旋混匀后加入步骤5.3的产物中，用移液器轻轻吹打混匀，室温孵育10min。。
5.4.3孵育结束后瞬时离心，将1.5mL EP管置于磁力架，静置5min至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清。
5.4.4保持1.5ml EP管置于磁力架上，加入500μl新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠及管壁，小心吸取并丢弃上清。重复该步骤一次。
5.4.5保持1.5ml EP管固定于磁力架上，打开1.5ml EP管管盖，室温干燥。
5.4.6将1.5ml EP管从磁力架上取下，加入22μl的ddH2O进行DNA洗脱，用移液器轻轻吹打至混匀，室温静置10min。
5.4.7瞬时离心，将1.5ml的EP管置于磁力架上，静置5min至液体澄清，转移20μl上清液转移到新的1.5ml EP管中。
6.TCR的富集
6.1将PCR管置于冰上按照如下表格配制富集mix-3
组分 体积
Taq HS premix 25μl
TCR P1-F 2μl
TCR alpha-R/TCR beta-R 2μl
环化产物 大约50ng
ddH<sub>2</sub>O 可变
Total 50μl
其中TCR P1-F引物序列：GCGTCAGATGTGTATAAGAG
TCR alpha-R引物序列：AGTCTCTCAGCTGGTACACG
TCR beta-R引物序列：TCTGATGGCTCAAACACAGC
6.2配制的PCR mix-3轻柔充分混匀，将反应管置于PCR仪中，PCR反应程序为：
Figure BDA0003656718880000181
琼脂糖凝胶电泳检测TCR富集产物，结果见图3。从电泳结果可以看出， TCR alpha可变区包括部分恒定区以及启动子序列，TCR beta可变区包括部分恒定区以及启动子序列扩增后都形成单一的条带。
6.3 TCR富集产物纯化
6.3.1纯化磁珠提前30min从4℃中取出恢复室温。使用前一定要充分混匀。
6.3.2将PCR管中的液体瞬离，计算体积。加入25μl磁珠(0.5×产物体积)，吹打混匀后室温孵育5min，短暂离心后置于磁力架上静置5min至液体透明澄清，小心移除上清至新的PCR管中。
6.3.3保持PCR管始终处于磁力架上，加入200μl新配制的80％乙醇漂洗磁珠。室温孵育30s，小心移除上清。
6.3.4重复步骤3，共计漂洗2次。
6.3.5取下PCR管短暂离心，再次置于磁力架上，吸去多余酒精晾干。
6.3.6取下PCR管加入20μl的ddH2O，吹吸混匀磁珠室温孵育5min，短暂离心后静置于磁力架上至液体透明澄清。
6.3.7吸取上清并转移至新的EP管中即为纯化产物，标记为TCR alpha-1和 TCRbeta-1。该纯化产物携带5’端barcode序列和CMV启动子，TCR可变区全长以及部分的TCR恒定区序列。根据产物的多少可以进行一轮或者多轮富集，保证有足够的产物进行下游的重组反应。
7.连接TCR表达载体
该表达载体pMax经过人工改造去掉载体自身的CMV启动子，添加TCR alpha恒定区得到pMax-TRAC，添加TCR beta恒定区得到pMax-TRBC，具体图谱见图4。通过重组的方法将纯化后的TCR alpha-1克隆到pMax-TRAC，将纯化后的TCR beta-1克隆到pMax-TRBC后具有完整的TCR表达框，可以高效表达TCR亚基。
具体步骤为：
7.1制备线性化pMax-TRAC和pMax-TRBC载体：利用BamHI (NEB:R3136S)和KpnI(NEB:R3142S)将pMax-TRAC和pMax-TRBC线性化并纯化。
7.2重组反应：
Figure BDA0003656718880000201
50℃反应20min。
8.转化大肠杆菌
8.1在冰上解冻感受态细胞DH5α(上海唯地生物科技有限公司)，一般转化产物体积不能超过感受态体积的1/10。
8.2取10μl重组产物，加入到100μl感受态细胞中，轻柔混匀，在冰上放置 20min。
8.3 42℃热激90s，冰上放置2min，加700μl无双抗LB培养基(上海生工)， 37℃摇床220rpm复苏40min，5000rpm离心3min。吸去700μl上清，剩余的液体移液枪混匀后全部涂含Amp平板，37℃微生物培养箱培养过夜。。
实施例3
TCR文库序列比对，获取配对TCR序列
1.第二天从转化了TCR-alpha和TCR-beta基因片段的平板上分别挑选192 个单菌落于200μl的Amp抗性LB培养基37℃摇床摇2h，取2μl菌液PCR初步鉴定阳性克隆。
PCR菌检体系：20μl
2X Taq mix 10μl
ddH<sub>2</sub>O 7μl
菌液 2μl
TCR-F-JJ 0.5μl
TCR-R-JJ 0.5μl
其中TCR-F-JJ引物序列为：taggcacctattggtcttac；
TCR-R-JJ引物序列为：tcactgcattctagttgtgg。
PCR菌检条件：
Figure BDA0003656718880000211
菌检结果用琼脂糖凝胶电泳检测见图5。***序列长度大约在1000bp的条带为阳性克隆，鉴定出来的阳性克隆送相应菌液sanger测序验证。其中测序引物为：
TCR-seq-F：tagaaactgggcttgtcgag；
TCR-seq-R:cattctagttgtggtttgtc。
2.序列比对和TCR配对
通过sanger测序得到的TCR alpha和TCR beta完整序列和单个细胞barcode，得到的完整序列通过DNA序列分析软件分析得到TCR alpha和TCR beta全长序列，同时判定具有相同barcode序列的TCR alpha和TCR beta克隆为一对TCR 即为配对TCR。通过这种方法在挑选的克隆中共找出86对配对的TCR。即获取可以配对TCR的全长序列。
其中表1展示了其中20对配对TCR序列的可变区核苷酸序列。
表1 20对配对TCR序列的可变区核苷酸序列
Figure BDA0003656718880000221
Figure BDA0003656718880000231
Figure BDA0003656718880000241
Figure BDA0003656718880000251
Figure BDA0003656718880000261
Figure BDA0003656718880000271
Seq ID No.1序列表信息
Figure BDA0003656718880000272
Figure BDA0003656718880000281
。
序列表
<110> 立凌生物制药（苏州）有限公司
<120> 一种快速克隆配对TCR序列检测方法及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 584
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ggcattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240
aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300
ggcattatgc ccagtacatg accttacggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360
tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta caccaatggg cgtggatagc 420
ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 480
ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa 540
tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag aggt 584

Claims (18)

1.一种快速克隆配对TCR序列的方法，所述的方法包括以下步骤：肿瘤组织中分选并捕获单个肿瘤反应性T细胞，提取、标记单个细胞的mRNA，反转录并构建全长cDNA，cDNA特异性PCR扩增得到cDNA全长转录组；
其特征在于：cDNA全长转录组富集后，与启动子序列连接环化并进行TCR序列的特异性扩增，扩增产物富集后连接到表达载体中得到TCR的全长克隆，进行文库序列比对获得配对的TCR序列。
2.根据权利要求1所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法，其特征在于：所述的方法中，mRNA反转录时在反转录体系中加入TSO，扩增完成cDNA全长转录组的富集。
3.根据权利要求2所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法，其特征在于：所述的方法中，通过单细胞标记磁珠5’端的恒定区序列及反转录过程中添加上的TSO序列，扩增完成全长转录组的富集。
4.根据权利要求1所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法，其特征在于，所述的方法中环化方法为：
环化时直接将启动子序列***到TSO序列之前；所述的启动子是任一启动mRNA转录的基因元件，包括但不限于CMV、EF1alpha、SV40、PGK1、CAG、T7、Sp6；
设计PCR引物扩增CMV启动子序列CMV-P，并在正向和反向引物的5’端添加cDNA同源序列后进行TCR序列的特异性扩增，完成TCR的扩增；
CMV启动子序列CMV-P的核酸序列如Seq ID No.1所示。
5.根据权利要求4所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法，其特征在于：所述的PCR引物包括CMV-P-F和CMV-P-F；
CMV-P-F序列：
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGGCATTGATTATTGACTAGTTAT；
CMV-P-F序列：
CCCCAAGTACTCTGCGTTGATACCAACCTCTGCTTATATAGACCTCC。
6.根据权利要求1所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法，其特征在于：所述的配对TCR序列包含TCR-alpha和TCR-beta系列。
7.根据权利要求1所述的一种快速克隆配对TCR序列的方法，其特征在于：所述的表达载体为任一具有复制子和抗性基因元件的质粒；优选的表达载体为线性化pMax-TRAC和pMax-TRBC载体；
表达载体pMax经过人工改造去掉载体自身的CMV启动子，添加TCR alpha恒定区得到pMax-TRAC，添加TCR beta恒定区得到pMax-TRBC；
通过重组的方法将纯化后的TCR alpha-1克隆到pMax-TRAC，将纯化后的TCR beta-1克隆到pMax-TRBC后具有完整的TCR表达框。
8.根据权利要求1所述的一种快速快速克隆配对TCR序列的方法，其特征在于，分选单个肿瘤反应性T细胞的方法为：肿瘤组织消化为单细胞并制备成单细胞悬液后注入微流控芯片获得单个肿瘤反应性T细胞。
9.一种TCR-T细胞，其特征在于：所述TCR-T细胞是通过生物工程技术将权利要求1～8任意一项获得的配对TCR序列注入相应的T细胞后获得。
10.根据权利要求9所述的一种TCR-T细胞，其特征在于：所述相应的T细胞是指个体自身T细胞或异源T细胞。
11.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物中含有权利要9或10所述的TCR-T细胞。
12.根据权利要求10所述的药物组合物用于治疗与T细胞相关的疾病，所述疾病包括感染性疾病、肿瘤、自身免疫疾病和器官移植。
13.一种诊断和/或评估制剂，所述诊断和/或评估制剂中含有权利要求9或10所述的TCR-T细胞。
14.根据权利要求12所述的诊断和/或评估制剂，其特征在于：所述的制剂制备为制剂盒。
15.根据权利要求13或14所述的诊断和/或评估制剂用于制备诊断或评估与T细胞相关的疾病或事件的试剂盒的用途；
所述疾病或事件包括感染性疾病、肿瘤、自身免疫疾病和器官移植。
16.根据权利要求11或12所述的药物组合物用于制备治疗与T细胞相关的疾病的药物的用途，所述疾病包括癌症、感染性疾病和自身免疫病。
17.根据权利要求16所述的药物组合物的用途，其特征在于：所述的癌症选自由急性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、***癌、阑尾癌、星形细胞瘤、神经母细胞瘤、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤、乳腺癌、支气管腺瘤、伯基特淋巴瘤、原发性未知癌、中枢神经***淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、***、儿童癌症、慢性淋巴细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、***增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、尤因氏肉瘤、生殖细胞肿瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、咽下癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、白血病、巨球蛋白血症、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合症、骨髓增生异常综合症、骨髓性白血病、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、胰腺癌、胰腺癌胰岛细胞、副鼻窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、***癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、浆细胞瘤、原发性中枢神经***淋巴瘤、***癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、默克尔细胞皮肤癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、胃癌、T细胞淋巴瘤、咽喉癌、胸腺瘤、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤、原发部位未知癌、尿道癌、子宫肉瘤、***癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和威尔姆斯瘤组成的组，所述的自体免疫性疾病选自由关节炎、慢性阻塞性肺疾病、强直性脊柱炎、克罗恩病、皮肌炎、I型糖尿病、子宫内膜异位症、Goodpasture氏综合症、Graves氏病、格林-巴厘综合症、桥本氏病、化脓性汗腺炎、川崎病、IgA肾病、原发性血小板减少性紫癜、间质性膀胱炎、红斑狼疮、混合性***病、硬斑病、重症肌无力、嗜睡症、神经性肌强直、寻常型天疱疮、恶性贫血、银屑病、银屑病关节炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、复发性多软骨炎、类风湿关节炎、精神***症、硬皮病、干燥综合症、僵人综合症、颞动脉炎、溃疡性结肠炎、脉管炎、白斑病以及韦格纳肉芽肿组成的组。
18.根据权利要求15所述的制剂的用途，进一步用于生物标志物、抗体开发、用药和疫苗评估、免疫细胞分化溯源、免疫排斥和耐受、微小残留病检测、食品或其它过敏原检测。
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