CN107858305A - 一株四环素高效降解细菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株四环素高效降解细菌及其应用,本发明从以鸡粪等为原材料发酵的有机肥中筛选得到一株四环素高效降解细菌,通过生理生化特性及16SrDNA序列分析,该菌株被鉴定为克雷伯氏菌属,并将其命名为TR5。本发明中所使用的菌株降解四环素的效率实验室水平下,通过响应面实验设计,预测可达到90%以上。比目前大多数文献中所报道的数据提高了20%左右。本发明还采用微生物固定化技术提高四环素高效降解细菌在水体中的抗冲击负荷能力和生物数量,为相关水产养殖水体处理以及制药厂四环素类抗生素污水治理方面提供了绿色、无环境污染的生物途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种四环素高效降解细菌克雷伯氏菌属的菌株,特别是涉及一种 微生物固定化包埋技术对水产养殖水体净化及制药厂四环素类抗生素废水治理 的应用。
背景技术
近年来,由于四环素类抗生素在医疗和畜禽养殖业的大量使用所导致的环境 污染问题日趋严重,已成为国内外研究的热点之一。有研究报道称环境中的抗生 素除了会造成化学污染外,还可能会诱导环境中抗性微生物和抗性基因的产生, 并加剧抗生素抗性传播的风险。某些抗性微生物可能会直接或者间接参与到食物 链等途径进入人体,导致人体对抗生素耐药性增加,从而给人类公共健康带来某 种程度的危胁。
四环素是四环素类抗生素的主要种类之一,目前已有不少文献及专利报道过 相关四环素降解的情况及方法,主要包括物理化学方法、高温堆肥法、微生物降 解法、光电催化等。其中,微生物降解法因其条件单一、容易控制、专一性较强、 应用成本低且不会引发二次污染,是目前比较经济有效的方法。但现有技术中, 对微生物降解法的报道并不多,有文献报道了一株木糖氧化无色杆菌对四环素的 降解,降解率为63.9%,还有文献报道了一株枯草芽孢杆菌对四环素的降解, 降解率为62.8%,还有文献中有提到缺陷短波单胞菌(Brevundimonas diminuta), 人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)对四环素的降解,但降解效率都不高。因此影 响了微生物降解法的推广应用。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术的不足,提供一种四环素高效降解细菌,该 菌的对四环素的降解率比现有技术提高了近30%,可应用于水产养殖业水体净化 以及四环素类抗生素制药污水治理。
技术方案
一种四环素高效降解细菌,为肺炎克雷伯氏菌属(Klebsiella pneumoniae), 藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No. 14393,保藏日期为:2017年7月7日,保藏地址为:中国北京。
本发明人通过从以鸡粪等为原材料发酵的有机肥中筛选得到,分离培养基采 用以四环素作为唯一碳源的无碳培养基连续富集培养、平板分离纯化得到高度耐 四环素的单菌落,将分离得到的单菌落无菌操作加入含有一定浓度四环素的培养 液中培养,并设置空白对照组实验,培养一定时间后用HPLC测定培养液中残留 四环素的浓度,分析比较各菌落对四环素的降解效率,进一步筛选出四环素高效 降解菌株。该菌株的16SrDNA基因序列见SEQ ID No1。通过生理生化特性及 16SrDNA序列分析,该菌株被鉴定为克雷伯氏菌属(Klebsiellapneumoniae),并 将其命名为TR5。
上述四环素高效降解细菌在水产养殖业水体净化中的应用。
上述四环素高效降解细菌在四环素类抗生素制药厂污水治理中的应用。
有益效果:本发明将通过微生物固定化处理方法,为四环素高效降解菌的工 业化应用提供了理论基础,本发明的TR5菌株的固定化小球能在水体中稳定的 存在,对水体中四环素有很好的降解效果,并能进行回收处理,具有较高的生物 安全性,应用成本低且不会引发二次污染,可应用于水产养殖业水体净化以及四 环素类抗生素制药污水治理。
附图说明
图1为TR5的进化树图;
图2为不同碳源对TR5生长状况及降解效率的影响图;
图3为不同碳源与不同氮源配伍对TR5生长状况及降解效率的影响;
图4为温度对TR5生长状况及降解效率的影响图;
图5为转速对TR5生长状况及降解效率的影响图
图6为pH对TR5生长状况及降解效率的影响图;
图7为接种量对TR5生长状况及降解效率的影响图。
具体实施方式
实施例1
菌株的分离、纯化和保藏
称取以鸡粪等为原材料发酵的有机粪肥5g至50ml含不同浓度梯度四环素 的液体培养基,并以四环素作为唯一碳源(培养基配方为:每1L培养液里含有 5g(NH4)2SO4、1gKH2PO4、0.5g MgSO4·7H2O、0.1g CaCl2、0.1g NaCl),于 28℃、150rpm下培养7d,按照同样的培养条件通过连续富集培养,得到能在 以高浓度四环素作为唯一碳源的条件下生长的菌株,接下来吸取0.2%的菌悬液 涂布于含有更高浓度四环素并以其为碳源的固体培养基,培养2~3d后挑取典型 的单一菌落进行分离纯化培养,将最终分离得到的纯培养菌株进行高浓度四环素 培养液培养,采用HPLC测得培养液中四环素的初始浓度,及培养一定时间后培 养液中四环素的残余浓度,得到不同纯培养菌株对应的四环素降解效率,分析比较数据,得到四环素高效降解菌,该菌株的16SrDNA基因序列见SEQ ID No1, 通过生理生化特性及16SrDNA序列分析,该菌株被鉴定为克雷伯氏菌属 (Klebsiellapneumoniae),并将其命名为TR5。该菌株已于2017年7月7日保 藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No. 14393。
实施例2
不同的碳源、氮源、pH、温度及接种量对TR5的生长及降解四环素的影响
实验组以葡萄糖、淀粉、乳糖等糖类作为菌株生长所需的碳源,以酵母浸粉、 蛋白胨、干酪素等作为菌株生长所需的氮源,pH 3~11,温度在15℃~40℃,接 种量为2%~10%的实验室培养条件下进行试验。
图1为TR5的进化树图。
图2为碳源对TR5生长状况及降解效率的影响图,由图2可以看出,由于乙 酸钠呈碱性,且碱性条件下四环素不稳定易分解,TR5菌株在此实验室条件下的 生长状况也不佳,依据此图最终决定选用葡萄糖作为该菌株实验室条件下的最佳 碳源。
图3为不同碳源与不同氮源配伍对TR5生长状况及降解效率的影响图;由 图3可以看出,以葡萄糖作为最佳碳源,同时以酵母浸粉作为氮源的情况下, TR5对四环素的降解效率最佳,故最终选用酵母浸粉作为该菌株实验室条件下的 最佳氮源。
图4为温度对TR5生长状况及降解效率的影响图,由图4可以看出,TR5 菌株在25-30℃条件下降解四环素效率较高。
图5为转速对TR5生长状况及降解效率的影响图,由图5可以看出,TR5 菌株在转速为180rpm时降解效率最佳,根据生长曲线可初步推测,该菌比较好 氧。
图6为pH对TR5生长状况及降解效率的影响图,由图6可以看出,TR5在 pH7.0左右对四环素的降解效率较高。
图7为接种量对TR5生长状况及降解效率的影响图,由图7可以看出,接种 量对四环素的降解并无明显影响。
综上,实验结果显示该菌株在以葡萄糖作为碳源,酵母浸粉作为氮源,pH 7~9,温度在25℃~30℃时降解效率较高,接种量对降解效率影响不大。
实施例3
降解能力测定实验
1、四环素高效降解细菌(TR5)在水产养殖业水体净化中的应用
取某人工养殖鱼塘的水,将水体进行初步净化处理后,用HPLC对水体中四 环素的含量进行测定,为200ppm,将鱼塘的水分装到培养瓶(每瓶20ml),并 在每瓶培养中加入20颗的固定化包埋了TR5菌株的小球进行培养,并设置一个 空白对照组,培养5d后对培养瓶中四环素的含量进行再次测定,发现实验组与 对照组相比,四环素含量有了明显的降低,实验组降解效率为86%。
2、四环素高效降解细菌在四环素类抗生素制药厂污水治理中的应用
取某制药厂排放的四环素类抗生素制药废水,将废水经过初步净化处理后, 参照国标的方法用HPLC对水体中四环素的含量进行测定,为435ppm,将制药 废水定量分装到培养瓶(每瓶20ml),并在每瓶培养中加入20颗的固定化包埋 了TR5菌株的小球进行培养,并设置一个空白对照组,培养5d后对培养瓶中四 环素的含量进行再次测定,发现实验组与对照组相比,四环素含量有了明显的降 低,实验组降解效率为88%。
Claims (3)
1.一种四环素高效降解细菌,其特征在于,所述细菌为克雷伯氏菌属,已保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心,保藏编号为CGMCC No.14393,保藏日期为:2017年7月7日,保藏地址为:中国北京。
2.权利要求1所述四环素高效降解细菌在水产养殖业水体净化中的应用。
3.权利要求1所述四环素高效降解细菌在抗生素制药厂污水治理中的应用。
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