CN103792345B - 一种小分子微阵列及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小分子微阵列的制备方法：将芯片基底上修饰的抗非特异性吸附材料的羟基末端与小分子光交联剂的羧基末端通过酯化反应进行键合，然后通过光交联使小分子随机固定其上即得。该方法采用直接酯化的方式，快速、高效地将小分子光交联剂偶联到抗非特异性吸附材料的表面，芯片修饰过程简单方便，常温条件即可完成，既节约了修饰成本，又提高了修饰效率，保证了较高的检测信号；未反应基团依旧保持较高的抗非特异性吸附能力，使得背景信号降低；所制备小分子微阵列检测信号较强、背景信号较弱，可用于高通量筛选小分子药物同靶标的相互作用。

Description

一种小分子微阵列及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物芯片技术领域，尤其涉及一种小分子微阵列及其制备方法。
背景技术
小分子微阵列是近十年来迅速发展的一种高通量药物筛选技术。小分子微阵列是指在固态表面上通过点样（或打印）然后固定各类有机小分子所形成的高密度微阵列——类似于广泛流行的DNA微阵列，一张玻璃（或塑料）衬底上可以打印上万个不同化合物的微阵列，得益于分析仪器的微型化，能够一次性、一步式地同时分析成千上万个生物化学相互作用。1999年，Schreiber等首次报道了小分子阵列，该阵列被作为探针，成功应用于FKBP12及其配基的检测（Koehler,A.N.,A.F.Shamji,and S.L.Schreiber,Discovery of an inhibitor of atranscription factor using small molecule microarrays and diversity-orientedsynthesis.Journal of the American Chemical Society,125(28):pp.8420-8421.2003.）。近些年来，小分子阵列已经被成功应用在蛋白分析和先导化合物开发等重要领域。
由于小分子微阵列需要将大量的、不同化学结构或生化结构的小分子固定在载体表面，如何高效率地固定小分子，并且不影响小分子与蛋白靶标结合生化活性，一直是小分子微阵列（SMM）技术最具有挑战性的难题。近十年来涌现很多种方便、稳定、成本低的固定化方法，其中，通过共价键牢固地固定小分子探针是小分子固定方法的主流。目前，多种选择性偶联反应已经被应用在共价连接方面，同时，多官能团也已经被成功固定在表面形成非选择性偶联。选择性偶联剂种类繁多，可以根据不同需要设计偶联剂末端，用以固定带有特定基团的小分子。但是，选择性或定向性固定小分子探针的技术路线有着根本性的缺陷：小分子探针的活性位点很可能被固定，从而失去与靶标作用的生化活性，可能漏筛良好的活性化合物。因此，非选择性、随机式、普适于所有小分子探针的固定方法将大大提高小分子微阵列技术在药物筛选的普适性，对于提高药物筛选和研发能力具有革命性的意义，因此，相关领域的研究因此成为了一项研究热点。
在众多的研究进展中，尤其以三氟甲基苯基吖丙因（Trifluoromethylaryldiazirine，TFMAD）功能团为基础的光交联表面化学最受瞩目（Kanoh,N.,et al.,Immobilization of Natural Products on Glass Slides by Using a PhotoaffinityReaction and the Detection of Protein–Small-Molecule Interactions.AngewandteChemie,115(45):pp.5742-5745.2003）。与其它偶氮卡宾（carbene）光交联化学相比，TFMAD功能团具有较高的化学稳定性，所产生的卡宾中间体有高反应活性，重排几率低，碳***反应产率高等优点。更为重要的是，仅需要相对低能量的365nm紫外光就可以激发卡宾的产生，从而降低了小分子探针被紫外光降解的几率。TFMAD光化学固定条件温和、可控性强，可通过掩膜在指定区域内进行修饰，可广泛用于各类生物分子的固定。此外，在固相条件下进行光交联可以避免可能由溶剂引起分子特定取向与功能团选择，分子与偶氮的随机性接触得到保证。
2006年，日本理化学研究所的长田裕之等报道了基于TFMAD的非选择光交联小分子微阵列（Naoki Kanoh,Motoki Kyo,Kazuki Inamori,Ami Ando,AyaAsami,Aiko Nakao,and Hiroyuki Osada,Analytical Chemistry,Vol.78,No.7,April1,2006）。在此工作中，他们制备了通过TFMAD光交联表面化学制备了8种***和雄性激素化合物的小规模阵列，通过表面等离子共振技术确认其与***受体a之间的相互作用，但在通量方面和信号强度方面都存在着很大不足。近年来，又出现了基于三维聚乙二醇高分子刷状表面和光交联剂结合的小分子微阵列，该微阵列突破了以往的二维表面，利用表面引发聚合技术在基底生长高分子刷状结构，利用高密度的末端基团固定光交联剂从而非选择性固定小分子药物，利用表面等离子共振成像技术对靶标进行高通量的快速筛选。但是，传统的连接光交联剂的方法使得该微阵列存在着一定的缺陷——非特异性吸附的问题。
非特异性吸附一直是生物芯片应用的一个瓶颈，由非特异性吸附引起的高背景信号会对检测信号产生干扰，尤其是对于小分子微阵列来说更是致命的。由于传统方法中,利用羧甲基化的聚甲基丙烯酸聚乙二醇表面偶联二氨基末端PEG，而后利用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)活化末端，最终与光交联剂偶联。这样的三步反应，最终产率为每步反应产率的乘积，导致最终产率大幅度下降，从而对小分子的固定量也变小，会导致检测信号减小；同时，未参与反应的羧基化的末端会让表面在检测溶液中带有一定量的电荷，容易造成静电吸附，增大了非特异性吸附的来源。所以，保留表面抗非特异性吸附的能力，同时增加小分子阵列检测信号成为研究者追求的目标。
发明内容
本发明的目的在于提出一种高检测信号、低检测背景的小分子微阵列及其制备方法。本发明所述小分子微阵列的制备方法采用一步法，快速、高效地将小分子光交联剂偶联到抗非特异性吸附材料的表面，芯片修饰过程简单方便，常温条件即可完成，既节约了修饰成本又提高了修饰效率，保证了较高的检测信号；未反应基团依旧保持聚乙二醇表面的高抗非特异性吸附的能力，使得检测背景降低。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种小分子微阵列的制备方法，包括：
一种小分子微阵列的制备方法，包括：
（1）在芯片基底上修饰带羟基末端的抗非特异性吸附材料；
（2）将带羧基末端和可光交联官能团的小分子光交联剂通过酯化反应键合到所述带羟基末端的抗非特异性吸附材料上；
（3）将小分子溶液点样到步骤（2）所得芯片表面，干燥后，进行光交联，得到小分子微阵列芯片。
作为优选，步骤（1）所述芯片基底选自玻璃、硅片、石英、高分子类薄膜、金属薄膜和金属氧化物薄膜；
优选地，所述高分子类薄膜为聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯中的任意一种；
优选地，所述金属薄膜为金膜或银膜；
优选地，所述金属氧化物薄膜为三氧化二铝膜。
作为优选，步骤（1）所述带羟基末端的抗非特异性吸附材料为烷基硫醇、带羟基末端的高分子表面或超分子自组装表面；
优选地，所述烷基硫醇为带有聚乙二醇链段的烷硫醇；
优选地，所述高分子表面为聚乙二醇或其衍生物、带羟基末端的含氟聚合物、葡聚糖、纤维素或其衍生物或带羟基末端的两性离子聚合物表面；
优选地，所述超分子自组装表面为聚轮烷表面。
关于步骤（1）所述在芯片基底上修饰带羟基末端的抗非特异性吸附材料的具体方式，可以使用本领域技术人员已知的所有方式。常见的修饰方式主要有以下三种：1、在表面引发聚合，即先在基底表面铺上引发剂，再引发单体在表面聚合，从而获得抗非特异性的表面；2.表面接枝，即先获得具有抗非特异性吸附性质的高分子材料，再通过特定的基团反应连接到表面；3.在表面进行超分子自组装，即先在基底表面修饰链状主体分子，再将客体分子组装到表面，最后形成超分子自组装体。
在一个具体实施方案中，步骤（1）中，所述带羟基末端的抗非特异性吸附材料为刷状PEG；在芯片基底上修饰刷状PEG的方法为：
（1’）使用引发剂溶液处理芯片基底；
优选地，所述引发剂为单巯基卤代硫醇溶液；进一步优选地，所述单巯基卤代硫醇溶液的浓度为0.1～100mM、优选0.1mM～10mM、更优选1mM；更进一步优选地，所述单巯基卤代硫醇溶液还包含单巯基聚乙二醇；
在具体的实施方案中，所述单巯基卤代硫醇溶液的浓度为0.1mM、1mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM。
优选地，使用引发剂溶液处理芯片基底的方法如下：将相同浓度且各为0.1～100mM、优选0.1mM～10mM、更优选1mM的单巯基聚乙二醇和单巯基卤代硫醇的乙醇溶液，以（0～999）：1、优选（0～99）：1、更优选99:1的体积比均匀混合，铺到所述基底表面；
在具体的实施方案中，所述单巯基聚乙二醇的乙醇溶液和单巯基卤代硫醇的乙醇溶液的浓度相同且均为0.1mM、1mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM，二者的体积比为0:1、1:1、9:1、49:1、99:1、199:1、299:1、399:1、499:1、599:1、699:1、799:1、899:1、999:1。
（2’）步骤（1’）所得芯片浸泡在含有机还原剂、聚合反应催化剂和PEG的烯类单体的溶液中，无氧环境下进行单体聚合反应即得；
优选地，所述有机还原剂为葡萄糖、抗坏血酸或辛酸亚锡；进一步优选地，所述有机还原剂的含量为1nM～1mM、优选为1nM～0.1mM、更优选为0.04mM；
优选地，所述聚合反应催化剂为过渡金属盐和螯合剂的混合物，所述过渡金属盐优选铁盐或铜盐；所述螯合剂优选为二联吡啶；进一步优选地，所述过渡金属盐的含量为1nM～1mM、优选为1nM～0.1mM、更优选为0.04mM；所述螯合剂的含量为1nM～100mM、优选为1nM～1mM、更优选为0.8mM；
优选地，所述PEG的烯类单体为甲基丙烯酸聚乙二醇酯；进一步优选地，所述PEG的烯类单体的含量为1mM～1M、优选为1mM～100mM、更优选为5mM；
优选地，所述高分子生长的时间为1～40小时、优选1～20小时、更优选18小时。
在另一个具体实施方案中，步骤（1）中，所述带羟基末端的抗非特异性吸附材料为超支化PEG；优选地，在芯片基底上修饰超支化PEG的方法为：
（1’’）使用引发剂溶液处理芯片基底；
优选地，所述引发剂为单巯基卤代硫醇溶液；进一步优选地，所述单巯基卤代硫醇溶液的浓度为0.1～100mM、优选0.1～10mM、更优选1mM；更进一步优选地，所述单巯基卤代硫醇溶液还包含单巯基聚乙二醇；
在具体的实施方案中，所述单巯基卤代硫醇溶液的浓度为0.1mM、1mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM。
优选地，使用引发剂溶液处理芯片基底的方法如下：将相同浓度且各为0.1～100mM、优选0.1mM～10mM、更优选1mM的单巯基卤代硫醇和单巯基聚乙二醇的乙醇溶液，以（0～999）：1、优选（0～99）：1、更优选99:1的体积比均匀混合，铺到所述基底表面；
在具体的实施方案中，所述单巯基聚乙二醇的乙醇溶液和单巯基卤代硫醇的乙醇溶液的浓度相同且均为0.1mM、1mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM，二者的体积比为0:1、1:1、9:1、49:1、99:1、199:1、299:1、399:1、499:1、599:1、699:1、799:1、899:1、999:1。
（2’’）步骤（1’’）所得芯片浸泡在含有机还原剂、聚合反应催化剂和PEG的烯类单体的溶液中，无氧环境下进行单体聚合反应，然后取出芯片；
优选地，所述有机还原剂为葡萄糖、抗坏血酸或辛酸亚锡；进一步优选地，所述有机还原剂的含量为1nM～1mM、优选为1nM～0.1mM、更优选为0.04mM；
优选地，所述聚合反应催化剂为过渡金属盐和螯合剂的混合物，所述过渡金属盐优选铁盐或铜盐；所述螯合剂优选为二联吡啶；进一步优选地，所述过渡金属盐的含量为1nM～1mM、优选为1nM～0.1mM、更优选为0.04mM；所述螯合剂的含量为0.8mM；
优选地，所述PEG的烯类单体为甲基丙烯酸聚乙二醇酯；进一步优选地，所述PEG的烯类单体的含量为1mM～1M、优选为1mM～100mM、更优选为5mM；
优选地，所述高分子生长的时间为1～40小时、优选1～20小时、更优选6小时；
（3’’）以2-溴异丁基酰溴对步骤（2’’）所得芯片上的聚合物进行封端，形成大分子引发剂；
（4’’）对所得芯片重复进行步骤（2’’）和步骤（3’’），如此重复3-4次即得。
在又一个具体实施方案中，步骤（1）中，所述带羟基末端的抗非特异性吸附材料为聚轮烷；优选地，在芯片基底上修饰聚轮烷的方法为：
（1’’’）将芯片基底放入两种不同分子量的巯基聚乙二醇的乙醇溶液中，0～30℃孵育1～12小时后，清洗、吹干；
所述两种不同分子量的巯基聚乙二醇分别为分子量为40～400的羟基末端或甲氧基末端硫醇和分子量为1000～20000的羧基末端硫醇；
（2’’’）将步骤（1’’’）所得芯片浸入10mM以上的α-环糊精的水溶液中孵育1～20小时，然后加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，反应10～60分钟；
（3’’’）将步骤（2’’’）所得芯片放入含有1～10mM的苄氧羰基-L-酪氨酸（Z-Tyr-OH）的饱和α-环糊***溶液中，反应1～2小时即得。
在又一个具体实施方案中，步骤（1）中，所述带羟基末端的抗非特异性吸附材料为葡聚糖；优选地，在芯片基底上修饰葡聚糖的方法为：
（1’’’’）将浓度为1～100mM的羟基末端烷硫醇乙醇和/或水溶液铺在芯片表面，室温孵育1～20小时后取出；
（2’’’）将步骤（1’’’’）所得芯片放入含环氧氯丙烷的氢氧化钠和二乙二醇二甲醚的混合溶液中，室温下反应1～10小时后取出；
（3’’’）将步骤（2’’’’）所得芯片放入葡聚糖的氢氧化钠溶液中，室温反应0.1～10小时后即得。
上述制备方法中，作为优选，步骤（2）中，所述可光交联官能团选自乙酰苯、苯甲酮、醌蒽类、芳香叠氮化物和芳香吖丙因，优选为芳香吖丙因；
优选地，步骤（2）具体包括：将步骤（1）所得带羟基末端的抗非特异性吸附材料修饰的芯片放入含所述小分子光交联剂、有机碱类催化剂和脱水剂的溶液中，18～32℃下、优选22～28℃下、更优选25℃下反应1～40小时、优选1～20小时、更优选18小时而得；
进一步优选地，所述溶液的溶剂为有机溶剂；更优选地，所述有机溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺；
进一步优选地，所述有机碱类催化剂选自4-二甲氨基吡啶、N,N-二异丙基乙胺和三乙胺；
进一步优选地，所述脱水剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和二环己基碳二亚胺；
进一步优选地，所述溶液中，小分子光交联剂的末端羧基与脱水剂、有机碱类催化剂的摩尔比为1：（1～3）：（1～3），进一步优选为1：（1～2）：（1～2），更进一步优选为1:1.5:1.5；
进一步优选地，所述溶液中，小分子光交联剂的末端羧基含量为1nM～100mM、优选为1mM～100mM、更优选为10mM。
步骤（2）所述酯化反应为基于固-液界面的酯化反应，通过调整反应物料配比、反应时间等条件，可以控制小分子光交联剂在芯片表面的接枝量，从而保证获得相对高的检测信号和较低的背景信号。
在具体实施方案中，步骤（3）所述小分子溶液可以为任意小分子，例如为小分子药物或有潜在药用价值的小分子；
优选地，所述光交联的条件为：在光强为0.1～100J/cm2、优选为0.1～10J/cm2、更优选为1J/cm2，波长为200～400nm、优选300～400nm、更优选365nm的紫外光下照射1～30分钟、优选1～20分钟、更优选10分钟。
第二方面，本发明提供了一种小分子微阵列，由第一方面任一项所述制备方法制得。
本发明所述小分子微阵列的制备方法示意图如附图1所示，该制备方法通过直接酯化的方式，将芯片基底上修饰的抗非特异性吸附材料的羟基末端与小分子光交联剂的羧基末端进行键合，然后通过光交联使小分子随机固定其上，从而获得高检测信号、低检测背景的三维表面的小分子微阵列，继而利用高通量检测技术进行小分子药物同靶标相互作用的筛选。
本发明所述小分子微阵列制备方法较传统的三维表面小分子微阵列制造方法突出的优点在于，采用一步法，快速、高效地将小分子光交联剂偶联到抗非特异性吸附材料的表面，芯片修饰过程简单方便，常温条件即可完成，既节约了修饰成本，又提高了修饰效率，保证了较高的检测信号；未反应基团依旧保持较高的抗非特异性吸附能力，使得检测背景降低；经过直接酯化方法修饰的表面保持电中性的表面性质，且表面性质均一。
附图说明
图1是本发明的小分子微阵列的制备方法示意图；
图2是三维PEG高分子表面酯化偶联光交联剂前、后的X射线光电子能谱对比；
图3是三维PEG高分子表面酯化偶联光交联剂前、后的FT-IR图谱对比；
图4是本发明所述小分子微阵列与传统方法制备的微阵列在表面等离子共振检测时的检测信号和背景强度对比。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
实施例1刷状PEG表面小分子微阵列的制备
具体步骤：
（1）在玻璃基底上用热蒸镀的方法制备一层3.5nm厚度的铬层和一层50nm厚度的金层，作为生物芯片的基底。
（2）配制400μL浓度为1mM的单巯基卤代硫醇溶液作为引发剂，配制400μL相同浓度的单巯基聚乙二醇，将两种溶液按1:99比例混合，铺到芯片表面，在4℃环境下孵育12小时。
（3）将金片用乙醇和去离子水交替清洗干净。
（4）配制单体溶液：单体溶液共20mL，其中抗坏血酸0.04mM、氯化铜0.04mM、二联吡啶0.8mM、甲基丙烯酸聚乙二醇酯（分子量360）5mM，溶剂为甲醇和水1:1（v/v）的混合溶剂。
（5）将金片浸泡在配制的单体溶液中，放置在无氧环境下生长高分子，生长时间18小时，通过控制生长时间调节高分子膜的厚度。
（6）达到预定生长时间后，将金片取出清洗。
（7）位置酯化所需光交联剂溶液：溶剂为N,N-二甲基甲酰胺（10mL），反应液中光交联剂TFMAD10mM、脱水剂1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）15mM、催化剂4-二甲氨基吡啶（DMAP）15mM。
（8）将芯片浸入酯化溶液中，装入合适容器，密封，室温环境下孵育18小时。达到预定时间后，将芯片取出，用乙醇和水交替冲洗干净，氮气吹干。
（9）将溶解有小分子的二甲基亚砜溶液在制备好的芯片上点样，待干燥后将芯片在365nm紫外光下照射10min，光强为1J/cm2,达到预定时间后将芯片取出，用二甲基亚砜、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、乙醇、去离子水等溶剂依次进行清洗，氮气吹干，即得本发明所述小分子微阵列。
上述制备过程中，还分别检测了芯片高分子表面酯化偶联小分子光交联剂前、后的X射线光电子能谱和FT-IR图谱，分别如图2、图3所示。
由图2可以看出，酯化前、后的X射线光电子能谱发生了变化，由于光交联剂分子中含有有F和N两种原子，所以在酯化后的元素图中出现了原来表面上没有的F和N两种元素，说明酯化方法成功，并且可以通过元素分析，判断表面的光交联剂接枝程度。
由图3可以看出，酯化前（a）和酯化后（b）的红外图谱存在一定差别。半定量地，酯化后的图谱中，1732cm-1处C=O的伸缩振动峰变强，3467cm-1处O-H的伸缩振动峰减弱，这是因为酯化反应使得表面脱水缩合形成酯羰基，而减少了末端的羟基；同时，在1610cm-1和1453cm-1左右出现了苯环伸缩振动的特征峰，说明表面上有光交联剂分子偶联上去；此外，酯化前、后红外图谱中的指纹区也有所差别，这是由于光交联剂含有特殊基团的化学键，如N=N、C-F等。以上表征再次说明酯化偶联光交联剂成功反应。
该小分子微阵列结合表面等离子共振成像技术用来检测小分子药物同靶标蛋白的相互作用，具有更低的背景信号，以及更高的检测信号。
实施例2超支化PEG表面小分子微阵列的制备
具体步骤如下：
（1）准备玻璃基底芯片，将芯片清洗吹干后铺满含有一定量的引发剂溶液。
（2）达到预定反应时间后将玻璃取出，清洗。
（3）配制单体溶液：单体溶液共20mL，其中抗坏血酸0.04mM、氯化铜0.04mM、二联吡啶0.8mM、甲基丙烯酸聚乙二醇酯（分子量360）5mM，溶剂为甲醇和水1:1（v/v）的混合溶剂。
（4）将金片浸泡在配制的单体溶液中，放置在无氧环境下生长高分子，生长时间6小时，通过控制生长时间调节高分子膜的厚度。
（5）达到预定生长时间后，将金片取出，用乙醇和水交替冲洗干净。
（6）将芯片放入1.5mL吡啶和50mL干燥***的混合溶液中，滴加含有10%体积比的2-溴异丁基酰溴（BiBB）的***溶液30mL，0℃下搅拌2小时，再在室温下反应10小时，而后用乙醇和超纯水清洗，氮气吹干。
（7）重复步骤4～7,重复3～4次后，获得超支化的聚乙二醇羟基末端表面。
（8）位置酯化所需光交联剂溶液：溶剂为N,N-二甲基甲酰胺（10mL），反应液中光交联剂TFMAD10mM、脱水剂1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）15mM、催化剂4-二甲氨基吡啶（DMAP）15mM。
（9）将芯片浸入酯化溶液中，装入合适容器，密封，室温环境下孵育18小时。达到预定时间后，将芯片取出，用乙醇和水交替冲洗干净，氮气吹干。
（10）将溶解有小分子的二甲基亚砜溶液在制备好的芯片上点样，待干燥后将芯片在365nm紫外光下照射10分钟，光强为1J/cm2，达到预定时间后将芯片取出，用二甲基亚砜、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、乙醇、去离子水等溶剂依次进行清洗，氮气吹干即得本发明所述小分子微阵列。
实施例3三维聚轮烷表面小分子微阵列
（1）如实施例1中的步骤1，制备金片作为生物芯片的基底。
（2）准备两种浓度均为1mM、不同分子量的巯基聚乙二醇的乙醇溶液，一种为HS-(CH2)11-EG6，另一种为HS-EGn-COOH（分子量2000）。将两种溶液按10:1体积比混合，再将芯片放入混合溶液中，4℃下孵育12小时。达到预定时间后，取出后乙醇和去离子水交替清洗，氮气吹干。
（3）将芯片浸入到128mM的α-环糊精的水溶液中（20mL）孵育4小时，然后向溶液中加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺750mg和N-羟基琥珀酰亚胺115mg，反应15min。
（4）取出芯片，直接放入含有3.2mM的苄氧羰基-L-酪氨酸（Z-Tyr-OH）的饱和α-环糊***溶液中，再反应2小时，后用超纯水清洗，氮气吹干。
（5）位置酯化所需光交联剂溶液：溶剂为N,N-二甲基甲酰胺（10mL），反应液中光交联剂TFMAD10mM、脱水剂1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）15mM、催化剂4-二甲氨基吡啶（DMAP）15mM。
（6）将芯片浸入酯化溶液中，装入合适容器，密封，室温环境下孵育18小时。达到预定时间后，将芯片取出，用乙醇和水交替冲洗干净，氮气吹干。
（7）将溶解有小分子的二甲基亚砜溶液在制备好的芯片上点样，待干燥后将芯片在365nm紫外光下照射10分钟，光强为1J/cm2,达到预定时间后将芯片取出，用二甲基亚砜、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、乙醇、去离子水等溶剂依次进行清洗，氮气吹干即得本发明所述小分子微阵列。
该小分子微阵列结合石英晶体微天平（QCM）技术用来在线检测小分子药物同靶标蛋白的相互作用，具有低的背景信号，以及高的检测信号，并可以高通量地进行实时在线监测。
实施例4葡聚糖表面小分子微阵列
（1）如实施例1中的步骤1，制备金片作为生物芯片的基底。
（2）配制浓度为1mM羟基末端烷硫醇（HS-(CH2)11-EG3）的乙醇溶液，将溶液铺在芯片表面，4℃下孵育12小时。达到时间后取出，用乙醇和超纯水清洗表面，氮气吹干。
（3）将0.6M的环氧氯丙烷的溶液放入1:1（v/v）混合的0.4M氢氧化钠溶液和二乙二醇二甲醚中，将芯片放入溶液中浸泡，在室温下反应4小时。反应后用乙醇和水交替冲洗。
（4）配制葡聚糖溶液（3g葡聚糖T500溶解在10ml的0.1M的氢氧化钠溶液中），将芯片浸入到葡聚糖溶液中，室温反应20小时。达到预定反应时间后将芯片取出，超纯水清洗，氮气吹干。
（5）位置酯化所需光交联剂溶液：溶剂为N,N-二甲基甲酰胺（10mL），反应液中光交联剂TFMAD10mM、脱水剂1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）15mM、催化剂4-二甲氨基吡啶（DMAP）15mM。
（6）将芯片浸入酯化溶液中，装入合适容器，密封，室温环境下孵育18小时。达到预定时间后，将芯片取出，用乙醇和水交替冲洗干净，氮气吹干。
（7）将溶解有小分子的二甲基亚砜溶液在制备好的芯片上点样，待干燥后将芯片在365nm紫外光下照射10分钟，光强为1J/cm2,达到预定时间后将芯片取出，用二甲基亚砜、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、乙醇、去离子水等溶剂交替进行清洗，氮气吹干即得本发明所述小分子微阵列。
该小分子微阵列结合表面等离子共振成像技术用来检测小分子药物同靶标蛋白的相互作用，具有低的背景信号，以及高的检测信号，并可以高通量地进行实时在线监测。
实施例5使用实施例1所得小分子微阵列的检测分析
基于表面等离子共振成像技术，比较本发明小分子微阵列（实施例1所制备的）与传统小分子微阵列的检测信号机背景信号；检测使用经典相互作用模式FKBP12和RAPA（雷帕霉素），此相互作用为已知，通常作为阳性对照。具体过程为：
（1）将带有RAPA点的传统小分子微阵列芯片放到SPRi仪器上，调整光学位置为12。此处用于对比的传统小分子微阵列芯片是表面有刷状PEG抗非特异性吸附材料的芯片，经过丁二酸酐进行酸化后，用氨基末端的PEG将刷状高分子与光交联剂连接起来；再经过小分子点样、干燥、紫外照射形成的小分子阵列。
（2）选择带有RAPA的点和空白对照点。
（3）通入100nm/ml的FKBP12的PBST溶液，记录结合和解离曲线。
（4）再将本发明小分子微阵列如上述方法进行检测，对比检测信号和背景信号。
结果如图4所示，图4结果显示：从RAPA和FKBP12相互作用情况来看，与传统小分子微阵列芯片相比，本发明的小分子微阵列检测信号较强，而背景信号较低。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明，但本发明并不局限于上述，即不意味着本发明必须依赖上述才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (100)

1.一种小分子微阵列的制备方法，其特征在于，包括：
(1)在芯片基底上修饰带羟基末端的抗非特异性吸附材料；
(2)将带羧基末端和可光交联官能团的小分子光交联剂通过酯化反应键合到所述带羟基末端的抗非特异性吸附材料上；
(3)将小分子溶液点样到步骤(2)所得芯片表面，干燥后，进行光交联，得到小分子微阵列芯片；
其中，步骤(2)具体包括：将步骤(1)所得带羟基末端的抗非特异性吸附材料修饰的芯片放入含所述小分子光交联剂、有机碱类催化剂和脱水剂的溶液中，18～32℃下反应1～40小时；小分子光交联剂的末端羧基与脱水剂、有机碱类催化剂的摩尔比为1：(1～3)：(1～3)。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(1)所述芯片基底选自玻璃、硅片、石英、高分子类薄膜、金属薄膜和金属氧化物薄膜。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述高分子类薄膜为聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯中的任意一种。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述金属薄膜为金膜或银膜。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述金属氧化物薄膜为三氧化二铝膜。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(1)所述带羟基末端的抗非特异性吸附材料为烷基硫醇、带羟基末端的高分子表面或超分子自组装表面。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述烷基硫醇为带有聚乙二醇链段的烷硫醇。
8.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述高分子表面为聚乙二醇或其衍生物、带羟基末端的含氟聚合物、葡聚糖、纤维素或其衍生物或带羟基末端的两性离子聚合物表面。
9.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于，所述超分子自组装表面为聚轮烷表面。
10.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述带羟基末端的抗非特异性吸附材料为刷状PEG。
11.根据权利要求10所述制备方法，其特征在于，在芯片基底上修饰刷状PEG的方法为：
(1’)使用引发剂溶液处理芯片基底；
(2’)步骤(1’)所得芯片浸泡在含有机还原剂、聚合反应催化剂和PEG的烯类单体的溶液中，无氧环境下进行单体聚合反应，生长高分子，即得。
12.根据权利要求11所述制备方法，其特征在于，所述引发剂为单巯基卤代硫醇溶液。
13.根据权利要求12所述制备方法，其特征在于，所述单巯基卤代硫醇溶液的浓度为0.1mM～100mM。
14.根据权利要求13所述制备方法，其特征在于，所述单巯基卤代硫醇溶液的浓度为0.1mM～10mM。
15.根据权利要求14所述制备方法，其特征在于，所述单巯基卤代硫醇溶液的浓度为1mM。
16.根据权利要求12所述制备方法，其特征在于，所述单巯基卤代硫醇溶液还包含单巯基聚乙二醇。
17.根据权利要求12所述制备方法，其特征在于，使用引发剂溶液处理芯片基底的方法如下：将相同浓度且各为0.1mM～100mM单巯基聚乙二醇和单巯基卤代硫醇的乙醇溶液以(0～999)：1的体积比均匀混合，铺到所述基底表面。
18.根据权利要求17所述制备方法，其特征在于，所述单巯基聚乙二醇和单巯基卤代硫醇的浓度相同且各为0.1mM～10mM。
19.根据权利要求18所述制备方法，其特征在于，所述单巯基聚乙二醇和单巯基卤代硫醇的浓度相同且各为1mM。
20.根据权利要求17所述制备方法，其特征在于，所述单巯基聚乙二醇和单巯基卤代硫醇的乙醇溶液的体积比为(0～99)：1。
21.根据权利要求20所述制备方法，其特征在于，所述单巯基聚乙二醇和单巯基卤代硫醇的乙醇溶液的体积比为99:1。
22.根据权利要求11所述制备方法，其特征在于，所述有机还原剂为葡萄糖、抗坏血酸或辛酸亚锡。
23.根据权利要求11所述制备方法，其特征在于，所述有机还原剂的含量为1nM～1mM。
24.根据权利要求23所述制备方法，其特征在于，所述有机还原剂的含量为1nM～0.1mM。
25.根据权利要求24所述制备方法，其特征在于，所述有机还原剂的含量为0.04mM。
26.根据权利要求11所述制备方法，其特征在于，所述聚合反应催化剂为过渡金属盐和螯合剂的混合物。
27.根据权利要求26所述制备方法，其特征在于，所述过渡金属盐为铁盐或铜盐。
28.根据权利要求26所述制备方法，其特征在于，所述过渡金属盐的含量为1nM～1mM。
29.根据权利要求28所述制备方法，其特征在于，所述过渡金属盐的含量为1nM～0.1mM。
30.根据权利要求29所述制备方法，其特征在于，所述过渡金属盐的含量为0.04mM。
31.根据权利要求26所述制备方法，其特征在于，所述螯合剂为二联吡啶。
32.根据权利要求26所述制备方法，其特征在于，所述螯合剂的含量为1nM～100mM。
33.根据权利要求32所述制备方法，其特征在于，所述螯合剂的含量为1nM～1mM。
34.根据权利要求33所述制备方法，其特征在于，所述螯合剂的含量为0.8mM。
35.根据权利要求11所述制备方法，其特征在于，所述PEG的烯类单体为甲基丙烯酸聚乙二醇酯。
36.根据权利要求11所述制备方法，其特征在于，所述PEG的烯类单体的含量为1mM～1M。
37.根据权利要求36所述制备方法，其特征在于，所述PEG的烯类单体的含量为1mM～100mM。
38.根据权利要求37所述制备方法，其特征在于，所述PEG的烯类单体的含量为5mM。
39.根据权利要求11所述制备方法，其特征在于，所述高分子生长的时间为1～40小时。
40.根据权利要求39所述制备方法，其特征在于，所述高分子生长的时间为1～20小时。
41.根据权利要求40所述制备方法，其特征在于，所述高分子生长的时间为18小时。
42.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述带羟基末端的抗非特异性吸附材料为超支化PEG。
43.根据权利要求42所述制备方法，其特征在于，在芯片基底上修饰超支化PEG的方法为：
(1”)使用引发剂溶液处理芯片基底；
(2”)步骤(1”)所得芯片浸泡在含有机还原剂、聚合反应催化剂和PEG的烯类单体的溶液中，无氧环境下进行单体聚合反应，生长高分子，然后取出芯片；
(3”)以2-溴异丁基酰溴对步骤(2”)所得芯片上的聚合物进行封端，形成大分子引发剂；
(4”)对所得芯片重复进行步骤(2”)和步骤(3”)，如此重复3-4次即得。
44.根据权利要求43所述制备方法，其特征在于，所述引发剂为单巯基卤代硫醇溶液。
45.根据权利要求44所述制备方法，其特征在于，所述单巯基卤代硫醇溶液的浓度为0.1mM～100mM。
46.根据权利要求45所述制备方法，其特征在于，所述单巯基卤代硫醇溶液的浓度为0.1mM～10mM。
47.根据权利要求46所述制备方法，其特征在于，所述单巯基卤代硫醇溶液的浓度为1mM。
48.根据权利要求44所述制备方法，其特征在于，所述单巯基卤代硫醇溶液还包含单巯基聚乙二醇。
49.根据权利要求44所述制备方法，其特征在于，使用引发剂溶液处理芯片基底的方法如下：将相同浓度且各为0.1mM～100mM单巯基聚乙二醇和单巯基卤代硫醇的乙醇溶液以(0～999)：1的体积比均匀混合，铺到所述基底表面。
50.根据权利要求49所述制备方法，其特征在于，所述单巯基聚乙二醇和单巯基卤代硫醇的浓度相同且各为0.1mM～10mM。
51.根据权利要求50所述制备方法，其特征在于，所述单巯基聚乙二醇和单巯基卤代硫醇的浓度相同且各为1mM。
52.根据权利要求51所述制备方法，其特征在于，所述单巯基聚乙二醇和单巯基卤代硫醇的乙醇溶液的体积比为(0～99)：1。
53.根据权利要求52所述制备方法，其特征在于，所述单巯基聚乙二醇和单巯基卤代硫醇的乙醇溶液的体积比为99:1。
54.根据权利要求43所述制备方法，其特征在于，所述有机还原剂为葡萄糖、抗坏血酸或辛酸亚锡。
55.根据权利要求43所述制备方法，其特征在于，所述有机还原剂的含量为1nM～1mM。
56.根据权利要求55所述制备方法，其特征在于，所述有机还原剂的含量为1nM～0.1mM。
57.根据权利要求56所述制备方法，其特征在于，所述有机还原剂的含量为0.04mM。
58.根据权利要求43所述制备方法，其特征在于，所述聚合反应催化剂为过渡金属盐和螯合剂的混合物。
59.根据权利要求58所述制备方法，其特征在于，所述过渡金属盐为铁盐或铜盐。
60.根据权利要求59所述制备方法，其特征在于，所述过渡金属盐的含量为1nM～1mM。
61.根据权利要求60所述制备方法，其特征在于，所述过渡金属盐的含量为1nM～0.1mM。
62.根据权利要求61所述制备方法，其特征在于，所述过渡金属盐的含量为0.04mM。
63.根据权利要求58所述制备方法，其特征在于，所述螯合剂为二联吡啶。
64.根据权利要求58所述制备方法，其特征在于，所述螯合剂的含量为1nM～100mM。
65.根据权利要求64所述制备方法，其特征在于，所述螯合剂的含量为1nM～1mM。
66.根据权利要求65所述制备方法，其特征在于，所述螯合剂的含量为0.8mM。
67.根据权利要求43所述制备方法，其特征在于，所述PEG的烯类单体为甲基丙烯酸聚乙二醇酯。
68.根据权利要求43所述制备方法，其特征在于，所述PEG的烯类单体的含量为1mM～1M。
69.根据权利要求68所述制备方法，其特征在于，所述PEG的烯类单体的含量为1mM～100mM。
70.根据权利要求69所述制备方法，其特征在于，所述PEG的烯类单体的含量为5mM。
71.根据权利要求43所述制备方法，其特征在于，所述高分子生长的时间为1～40小时。
72.根据权利要求43所述制备方法，其特征在于，所述高分子生长的时间为1～20小时。
73.根据权利要求43所述制备方法，其特征在于，所述高分子生长的时间为6小时。
74.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述带羟基末端的抗非特异性吸附材料为聚轮烷。
75.根据权利要求74所述制备方法，其特征在于，在芯片基底上修饰所述聚轮烷的方法为：
(1”’)将芯片基底放入两种不同分子量的巯基聚乙二醇的乙醇溶液中，0～30℃孵育1～12小时后，清洗、吹干；
所述两种不同分子量的巯基聚乙二醇分别为分子量为40～400的羟基末端或甲氧基末端硫醇和分子量为1000～20000的羧基末端硫醇；
(2”’)将步骤(1”’)所得芯片浸入10mM以上的α-环糊精的水溶液中孵育1～20小时，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，反应10～60分钟；
(3”’)将步骤(2”’)所得芯片放入含有1mM～10mM的苄氧羰基-L-酪氨酸Z-Tyr-OH的饱和α-环糊***溶液中，反应1～2小时即得。
76.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述带羟基末端的抗非特异性吸附材料为葡聚糖。
77.根据权利要求76所述制备方法，其特征在于，在芯片基底上修饰葡聚糖的方法为：
(1””)将浓度为1mM～100mM的羟基末端烷硫醇乙醇和/或水溶液铺在芯片表面，室温孵育1～20小时后取出；
(2””)将步骤(1””)所得芯片放入含环氧氯丙烷的氢氧化钠和二乙二醇二甲醚的混合溶液中，室温下反应1～10小时后取出；
(3””)将步骤(2””)所得芯片放入葡聚糖的氢氧化钠溶液中，室温反应0.1～10小时后即得。
78.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述可光交联官能团选自乙酰苯、苯甲酮、醌蒽类、芳香叠氮化物和芳香吖丙因。
79.根据权利要求78所述制备方法，其特征在于，所述可光交联官能团为芳香吖丙因。
80.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(2)具体包括：将步骤(1)所得带羟基末端的抗非特异性吸附材料修饰的芯片放入含所述小分子光交联剂、有机碱类催化剂和脱水剂的溶液中，22～28℃下反应1～20小时而得。
81.根据权利要求80所述制备方法，其特征在于，步骤(2)具体包括：将步骤(1)所得带羟基末端的抗非特异性吸附材料修饰的芯片放入含所述小分子光交联剂、有机碱类催化剂和脱水剂的溶液中，25℃下反应。
82.根据权利要求81所述制备方法，其特征在于，步骤(2)具体包括：将步骤(1)所得带羟基末端的抗非特异性吸附材料修饰的芯片放入含所述小分子光交联剂、有机碱类催化剂和脱水剂的溶液中反应18小时。
83.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述溶液的溶剂为有机溶剂。
84.根据权利要求83所述制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺。
85.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述有机碱类催化剂选自4-二甲氨基吡啶、N,N-二异丙基乙胺和三乙胺。
86.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述脱水剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和二环己基碳二亚胺。
87.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述溶液中小分子光交联剂的末端羧基与脱水剂、有机碱类催化剂的摩尔比为1：(1～2)：(1～2)。
88.根据权利要求87所述制备方法，其特征在于，所述溶液中小分子光交联剂的末端羧基与脱水剂、有机碱类催化剂的摩尔比为1:1.5:1.5。
89.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述溶液中小分子光交联剂的末端羧基含量为1nM～100mM。
90.根据权利要求89所述制备方法，其特征在于，所述溶液中小分子光交联剂的末端羧基含量为1mM～100mM。
91.根据权利要求90所述制备方法，其特征在于，所述溶液中小分子光交联剂的末端羧基含量为10mM。
92.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤(3)所述小分子为小分子药物或有潜在药用价值的小分子。
93.根据权利要求92所述制备方法，其特征在于，所述光交联的条件为：在光强为0.1～100J/cm2，波长为200～400nm的紫外光下照射1～30分钟。
94.根据权利要求93所述制备方法，其特征在于，所述光交联的光强为0.1～10J/cm2。
95.根据权利要求94所述制备方法，其特征在于，所述光交联的光强为1J/cm2。
96.根据权利要求93所述制备方法，其特征在于，所述光交联的波长为300～400nm。
97.根据权利要求96所述制备方法，其特征在于，所述光交联的波长为365nm。
98.根据权利要求93所述制备方法，其特征在于，所述光交联的照射时间为1～20分钟。
99.根据权利要求98所述制备方法，其特征在于，所述光交联的照射时间为10分钟。
100.一种小分子微阵列，其特征在于，由权利要求1-99任一项所述制备方法制得。
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