CN106645470A

CN106645470A - 一种车前子药材与其配方颗粒中四种成分的含量测定方法

Info

Publication number: CN106645470A
Application number: CN201611112346.6A
Authority: CN
Inventors: 牛丽颖; 田伟; 甄亚钦; 王鑫国; 韩桂茹
Original assignee: Hebei Medical University
Current assignee: Hebei Medical University; Hebei University of Chinese Medicine
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2017-05-10

Abstract

本发明涉及一种车前子药材与其配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量测定方法。其特征：以乙腈为A相、0.5％乙酸为B相，经4次比例变换梯度洗脱，流速0.3mL/min；柱温30℃；检测波长：京尼平苷酸为239nm、咖啡酸为325nm、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为330nm；同时测定了车前子药材与其配方颗粒中四成分的含量。波峰保留时间京尼平苷酸约3分钟、咖啡酸约6.5分钟、毛蕊花糖苷约10.7分钟、异毛蕊花糖苷约12.5分钟，在15分钟内四种成分出峰完毕，且各波峰分离良好，分离度都在3以上。方法简便、快捷，易于普及掌握。

Description

一种车前子药材与其配方颗粒中四种成分的含量测定方法

技术领域

一种车前子药材及其配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量测定方法。

背景技术

车前子为车前科植物车前Plantago asiatica L.或平车前PlantagodeprossaWilld.的干燥成熟种子。是一种常用中药，具清热利尿，渗湿止泻，明目，祛痰的功效。用于热淋涩痛，水肿胀满，暑湿泄泻，目赤肿痛，痰热咳嗽。车前子主含黄酮类、三萜类、挥发油、多糖类及其他等。黄酮类有木犀草素、高车前苷、车前甙等；三萜类有熊果酸、齐墩果酸等；挥发油有2，6二叔丁基对甲酚、3-叔丁基-4-羟基茴香醚等；糖类有L-***糖、D-半乳糖、D-葡萄糖等；其他有京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷等。其质量标准在中国药典2015年版一部车前子药材项下，收载了京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的梯度洗脱HPLC定量测定，二种成分的HPLC运行时间是50分钟。文献虽有采用HPLC以梯度洗脱的方式，测定盐制车前子中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷三成分含量的报道，但运行时间至少也要40分钟，而且未报道波峰分离图谱。目前还未查阅到同时测定车前子药材与其配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷四种成分的含量报道。在上述背景情况下，为简便、快捷、多指标控制车前子药材及其配方颗粒的质量，发明了以乙腈为A相、0.5％乙酸为B相，采用梯度洗脱方式，即0～1min，6％～15％A；1～13min，15％～20％A；13～13.5min，20％～6％A；13.5～20min，6％A；流速0.3mL/min；柱温30℃；检测波长：京尼平苷酸为239nm、咖啡酸为325nm、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为330nm；在15分钟内测定京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷四成分含量的快速测定方法。

车前子药材配方颗粒的制备方法取车前子6500-6700g，分别加水8倍量，煎煮提取二次，每次1-2小时，滤过，滤液70℃减压浓缩，浓缩液喷雾干燥或70℃减压干燥，加糊精适量，混匀，制粒成1000g，分装，即得车前子配方颗粒。

发明内容

以乙腈为A相、0.5％乙酸为B相，采用梯度洗脱方式，即0～1min，6％～15％A；1～13min，15％～20％A；13～13.5min，20％～6％A；13.5～20min，6％A；流速0.3mL/min；柱温30℃；检测波长：京尼平苷酸为239nm、咖啡酸为325nm、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为330nm；在15分钟内京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷出峰完毕，波峰分离良好。方法简便、快捷、易于普及实施。

通过方法学考察，京尼平苷酸进样量在0.2921～2.921μg，与峰面积呈良好的线性关系(见表1、图1)，回归方程为Y＝52.781X+0.8012，r＝0.9999；咖啡酸进样量在0.0034～0.0336μg，与峰面积呈良好的线性关系(见表2、图2)，回归方程为Y＝171.34X-0.022，r＝0.9997；毛蕊花糖苷进样量在0.0476～0.476μg，与峰面积呈良好的线性关系(见表3、图3)，回归方程为Y＝63.501X-0.005，r＝0.9996；异毛蕊花糖苷进样量在0.1027～1.027μg，与峰面积呈良好的线性关系(见表4、图4)，回归方程为Y＝61.501X-0.031，r＝0.9996。采用加样回收实验，结果表明：京尼平苷酸的平均回收率为99.31％，RSD为1.51％(n＝9，见表5)；咖啡酸的平均回收率为98.64％，RSD为1.40％(n＝9，见表6)；毛蕊花糖苷的平均回收率为98.23％，RSD为1.62％(n＝9，见表7)；异毛蕊花糖苷的平均回收率为99.46％，RSD为1.99％(n＝9，见表8)。精密度(见表9)、稳定性(见表10)、重复性(见表11)，均符合方法学要求。适用于车前子药材与其配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量测定。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：

(1)色谱条件与***适用性试验以乙腈为A相、0.5％乙酸为B相，采用梯度洗脱方式，即0～1min，6％～15％A；1～13min，15％～20％A；13～13.5min，20％～6％A；13.5～20min，6％A；流速0.3mL/min；柱温30℃；检测波长：京尼平苷酸为239nm、咖啡酸为325nm、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为330nm；理论板数按京尼平苷酸峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备精密称取京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制成质量浓度分别为0.2921，0.0034，0.0476，0.1027mg/mL的混合对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备取车前子药材细粉1.5g，精密称定；或车前子配方颗粒0.5g，研细，精密称定；分别置棕色具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25ml，密塞，称定重量，药材细粉以功率250W，频率33kHz超声处理30分钟；配方颗粒以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟；放冷，再称定重量，用60％甲醇补足各自减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量(见表12)。

本发明的原理如下：

京尼平苷酸属于环烯醚萜类与糖结合成的苷；咖啡酸属于酚酸类化合物；毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷则都属于苯丙素苷类化合物，水解后形成1分子咖啡酸和去咖啡酰毛蕊花糖苷与去咖啡酰异毛蕊花糖苷，都是偏水溶性化合物，易溶于含水醇。从其紫外光谱图得知，京尼平苷酸在约239nm(图5)、咖啡酸在约325nm(图6)、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷在约330nm(图7、图8)有最大吸收，所以选择其最大吸收为检测波长，进行含量测定。直接以含水甲醇超声提取药材或配方颗粒中的四种成分，滤过后，进样即可。无萃取、无蒸干、简便、快捷、实用。通过经时地调整A相和B相体积比，使四种成分在15分钟内出峰完毕。再依据该四种成分的进样量在一定范围内，与其峰面积呈现良好的线性关系，而用于定量测定。

本发明的创新点及有益效果如下：

(1)以乙腈为A相、0.5％乙酸为B相，采用梯度洗脱方式，即0～1min，6％～15％A；1～13min，15％～20％A；13～13.5min，20％～6％A；13.5～20min，6％A；流速0.3mL/min；柱温30℃；检测波长：京尼平苷酸为239nm、咖啡酸为325nm、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为330nm；在15分钟内使京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷出峰完毕，且波峰分离良好。方法简便、快捷、易于普及实施，为首次报道。

(2)中国药典2015年版一部车前子药材项下，收载的京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的梯度洗脱HPLC定量测定，二种成分的HPLC运行时间是50分钟。本发明测定车前子的四种成分，其运行时间才15分钟，测定效率是药典方法的3倍以上。

(3)本申请能在15分钟内，使京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷四成分测定完毕，且波峰分离度良好，其关键技术还在于将流动相的流速设定在0.3mL/min，不但节约了流动相，降低了柱压力，而且大幅度提高了波峰间的分离度，使了各波峰的保留时间：京尼平苷酸约3分钟、咖啡酸约6.5分钟、毛蕊花糖苷约10.7分钟、异毛蕊花糖苷约12.5分钟，相互分离度都在3以上，并在15分钟内运行完毕(见图9、10、11)。

(4)由本申请的图9、10、11的测定图谱与表12的测定数据，揭示了在药材规定的取样量内未检测到咖啡酸，而京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的含量较高、异毛蕊花糖苷很低，仅为毛蕊花糖苷含量的约1/9；但在配方颗粒中成分的含量发生了变化，检测到咖啡酸、且毛蕊花糖苷含量明显降低，仅为异毛蕊花糖苷含量的约1/6，而异毛蕊花糖苷的含量显著升高，。说明在加热提取过程中药材所含的成分发生了结构变化，煎煮后用于临床的都是转结构后的成分。以四种成分指标控制车前子药材与其配方颗粒的质量，不但质量可控性提升，而且有利于市场对其质量的监督评价。

(5)一般情况下，HPLC的流速都是1mL/min，通过本申请完成，提示在特定的情况下，可以通过流动相组分、比例以及流速，达到高效率、低成本、高分离度、准确，同时测定多种成分的目的。

附图说明

图1京尼平苷酸的线性关系图

图2咖啡酸的线性关系图

图3毛蕊花糖苷的线性关系图

图4异毛蕊花糖苷的线性关系图

图5京尼平苷酸的光谱扫描图

图6咖啡酸的的光谱扫描图

图7毛蕊花糖苷的光谱扫描图

图8异毛蕊花糖苷的光谱扫描图

图9为京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷对照品HPLC色谱图

图10为车前子药材HPLC色谱图

图11为车前子配方颗粒HPLC色谱图

图1、图2、图3、图4纵坐标为峰面积；横坐标为进样量(μg)

图5、图6、图7、图8纵坐标为吸收强度(mAU)；横坐标为吸收波长(nm)

图9、图10、图11中，1.京尼平苷酸 2.咖啡酸 3.毛蕊花糖苷 4.异毛蕊花糖苷

本发明具体实施方式

实施例1：

(1))色谱条件与***适用性试验以乙腈为A相、0.5％乙酸为B相，采用梯度洗脱方式，即0～1min，6％～15％A；1～13min，15％～20％A；13～13.5min，20％～6％A；13.5～20min，6％A；流速0.3mL/min；柱温30℃；检测波长：京尼平苷酸为239nm、咖啡酸为325nm、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为330nm；理论板数按京尼平苷酸峰计算应不低于3000；

(3)供试品溶液的制备取车前子药材细粉1.5g，精密称定，置棕色具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25ml，密塞，称定重量，以功率250W，频率33kHz超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷的含量。

实施例2：

色谱条件与***适用性试验以乙腈为A相、0.5％乙酸为B相，采用梯度洗脱方式，即0～1min，6％～15％A；1～13min，15％～20％A；13～13.5min，20％～6％A；13.5～20min，6％A；流速0.3mL/min；柱温30℃；检测波长：京尼平苷酸为239nm、咖啡酸为325nm、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷为330nm；理论板数按京尼平苷酸峰计算应不低于3000；

(3)供试品溶液的制备取车前子配方颗粒0.5g，研细，精密称定；置棕色具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇25ml，密塞，称定重量，以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟，放冷，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液用0.45μm的微孔滤膜滤过，续滤液作为供试品溶液；

表1京尼平苷酸进样量与峰面积

表2咖啡酸进样量与峰面积

表3毛蕊花糖苷进样量与峰面积

表4异毛蕊花糖苷进样量与峰面积

表5样品中京尼平苷酸的回收率试验结果

表6样品中咖啡酸的回收率试验结果

表7样品中毛蕊花糖苷的回收率试验结果

表8样品中异毛蕊花糖苷的回收率试验结果

表9精密度实验结果(峰面积)

表10稳定性实验结果(峰面积)

表11重复性试验结果(mg/g)

表12车前子药材和配方颗粒的含量测定结果(mg/g)

注：回收率试验中，为降低京尼平苷酸和异毛蕊花糖苷对照品用量，其总体积是5ml，取样量降低到25ml的1/5，即0.05g。

Claims

1.一种车前子药材与其配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量测定方法，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的一种车前子药材与其配方颗粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷的含量测定方法，其特征在于所述的车前子配方颗粒每1g相当原生药材6.5～6.7g。