CN107513494A - 一种核酸检测卡及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及核酸分析检测领域,特涉及一种核酸检测卡及其使用方法。本发明采样单元包括卡体、核酸收集试纸、加样孔和封口膜,加样孔设置在卡体上,核酸收集试纸卡在加样孔上,加样孔可被封口膜封闭;核酸收集试纸含有细胞裂解试剂,检测试剂条由样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次设置组成,NC膜为C线、T线的承载体,吸水垫用于核酸检测反应后的冲洗,C线为对照线,T线为检测线,C线、T线上分别包被不同的核酸特异性抗体。本发明利用DNA本身严格的互补配对反应,极大降低了扩增成本,提高了扩增效率和自动化程度,适用于实验研究、临床检测、食品安全检测等领域。
Description
技术领域
本发明涉及核酸分析检测领域,具体的说是一种基于核酸扩增反应和粘性末端介导的链置换反应的核酸检测装置及其使用方法。
背景技术
2003年SARS在中国大部分地区爆发,2005年禽流感的流行性传播以及2014年在非洲肆虐高致死率的埃博拉疫情,这一系列由病毒引起的传染病告诉我们在人类的发展史上一直受到病毒带来的致命性威胁。病毒的传播与变异大大超出了人类的预计,及时准确地诊断病毒对于提高患者存活率,控制疫情传播以及有效疾病治疗有着非常重大的意义。
常规的病原微生物检测方法是采用体外培养技术,但是,仅有约1%的细菌或病毒可以培养,以及培养过程的复杂性和漫长的培养时间,大大限制了这样技术的普及。随着分子生物学的发展,核酸检测被应用于病毒检测之中,不仅缩短了检测时间还提高了检测的灵敏度和特异性。核酸分子是所有病原体包括病毒在内的遗传载体,通过对特异性的核酸进行检测,可以判断样本中是否存在相应的病毒。聚合酶链式反应是最常见的核酸检测方法,该技术的出现使核酸水平的医学检测进入了一个全新的阶段。PCR技术通过在不同温度之间的循环实现DNA分子的复制,该技术需要对温度精确控制,因此依赖于精密的温控装置和专业的人员进行操作。在资源与人力相对匮乏的地区,PCR方法是难以用于病毒检测的。
为了克服对温控装置的依赖,一系列等温扩增方法应运而生,比如环介导等温扩增等。环介导等温扩增可以在60-65℃下对目标核酸进行扩增。等温扩增方法不仅可以是一种快速、灵敏、准确的核酸检测方式,同时对温控和检测设备要求简单,大幅降低了设备成本的投入。采用DNA荧光指示剂配合光学检测或者基于焦磷酸镁副产物的浊度检测,可对样品进行定量分析。
粘性末端介导的链置换反应是指两条完全互补或部分互补的DNA单链杂交后,置换掉一条或多条预杂交的DNA链的过程,该反应是一个动态竞争过程。此反应开始于目标DNA的悬垂末端即粘性末端。TSD依靠的是DNA本身严格的碱基互补配对性质,不需要核酸酶的参与即可发生。因此在DNA双链直接退火杂交的条件下,该反应即可通过互补的单链悬垂区域即粘性末端引发,然后经历一个分支迁移过程而完成。
在临床病例中,同一种病症可能由多种不同的病原体产生,造成医生诊断与对症开药的困难。采用核酸扩增方法,无论是PCR还是等温扩增,如何同时检测多种病原体或者目标基因一直是临床检测中的一个重大挑战。因此,发明一种操作简单、准确度高、灵敏度高的核酸检测产品,实现多种病原体或者目标基因的同时检测具有重要意义。
目前,精准医疗已成为全球现代医疗的研究热点和发展趋势,国际上有关精准医疗的研究和成果转化风起云涌。我国十三五计划提出大力发展精准医疗,使得在这一科技领域我国将有机会实现弯道超车,走在世界医疗科学技术的先进行列。精准医疗包括精准诊断和精准治疗,其中诊断是治疗的基础,而基于核酸检测技术的分子诊断则是精准诊断的核心。我国乃至国际上目前分子诊断市场主要基于各种大型仪器设备和冗长复杂的组织样品预处理手段,具有费用高、耗时长、目标不准确、普及性不高等缺点。本发明是基于微流控芯片技术的新型分子诊断芯片,较之前一代技术具有高通量、低成本、快速高效、灵敏度高、针对性强、普适性强等优点,具有十分广阔的应用潜力和市场前景。相比现有技术只能采取“全扫”的方式对诊疗对象的全基因组进行测序,造成大量资源的浪费和数据的无意义重复从而使得消费者群体对高昂的测序费用望而却步的现状。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明通过核酸扩增反应或者粘性末端介导的链置换反应,不仅可以肉眼进行定性分析也可通过光学检测仪进行定量分析,实现对单一样本或者多样本中的多种病原体或者目标基因进行同时检测,检测耗时短,准确度和灵敏度高,且利用TSDR反应原理避免了核酸扩增反应中常常所需的核酸扩增酶和三磷酸脱氧核苷酸,利用DNA本身严格的互补配对反应,极大降低了扩增成本,提高了扩增效率和自动化程度,适用于实验研究、临床检测、食品安全检测等领域。
本发明的技术方案是:一种核酸检测卡,包括采样单元、检测单元,其特征在于:所述的采样单元包括卡体、核酸收集试纸、加样孔和封口膜,加样孔设置在卡体上,核酸收集试纸卡在加样孔上,加样孔可被封口膜封闭;所述的核酸收集试纸含有细胞裂解试剂,所述的检测单元包括检测试剂条,所述的检测试剂条由样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次设置组成,结合垫是纳米金颗粒标记的特异性核酸识别片段的载体,样品垫是用于承载微量样本经核酸扩增反应或者粘性末端介导的链置换反应得到的扩增产物的载体,NC膜为C线、T线的承载体,吸水垫用于核酸检测反应后的冲洗,C线为对照线,T线为检测线,C线、T线上分别包被不同的核酸特异性抗体。
根据如上所述的核酸检测卡,其特征在于:所述的检测单元还包括上壳体,下壳体和隔绝垫,上壳体设置有检测窗,下壳体前部包括关卡一、关卡二、隔绝垫卡槽和吸水纸卡槽,隔绝垫放置在隔绝垫卡槽内,吸水纸放置在吸水纸卡槽内,下壳体内侧分别设置关卡一、关卡二,下壳体的后部为承载装置,检测试剂条设置在承载装置上,上壳体连接在下壳体后,检测窗正对C线、T线。
根据如上所述的核酸检测卡,其特征在于:所述的卡体材质为塑料。
根据如上所述的核酸检测卡,其特征在于:所述的封口膜材质为塑料,封口膜通过粘胶或静电作用固定于卡体上。
根据如上所述的核酸检测卡,其特征在于:所述的结合垫和样品垫材质为玻璃纤维。
根据如上所述的核酸检测卡,其特征在于:所述的NC膜材质为硝酸纤维素膜。
根据如上所述的核酸检测卡,其特征在于:还包括反应试剂,所述的反应试剂为核酸扩增试剂,核酸扩增试剂包括引物、核酸扩增反应所需的酶、缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸,粘性末端介导的链置换反应试剂包括引物、荧光团、生物素。
根据如上所述的核酸检测卡,其特征在于:还包括缓冲液,所述的缓冲液为磷酸缓冲液。
根据如上所述的核酸检测卡,其特征在于:还包括检测器,所述的检测器由光学采集单元、图像信号处理器及电子外设组成,通过光学检测读取核酸检测结果,将其显示在液晶屏幕上,并打印出来。
本发明还公开了一种核酸检测卡的使用方法,包括以下步骤:
将检测试剂条放置在下壳体后部的承载装置上,在隔绝垫卡槽上放置隔绝垫,在吸水纸卡槽上放置吸水纸,将上壳体与下壳体卡接在一起,并将卡体套在上壳体与下壳体的前部,使加样孔处于吸水纸卡槽正上方;
通过加样孔向核酸收集试纸分别滴入样品和缓冲液,静置后烘干,将卡体向前推到关卡二,使加样孔处于隔绝垫卡槽正上方;
向加样孔中滴入反应液,反应液与核酸收集试纸和隔绝垫接触,然后采用封口膜封闭加样孔,并放置于烘箱中反应;
反应完毕,将卡体向前推到关卡一,使加样孔处于样品垫正上方,去除封口膜,向加样孔中滴入缓冲液,然后观测C线、T线的变化。
本发明的有益效果是:采用一个检测装置,将多个核酸扩增反应体系预存于核酸检测卡内,通过核酸扩增反应或者粘性末端介导的链置换反应,利用层析效应、核酸扩增反应和粘性末端介导的链置换反应,不仅可以肉眼进行定性分析也可通过光学检测仪进行定量分析,实现对单一样本或者多样本中的多种病原体或者目标基因进行同时检测,检测耗时短,准确度和灵敏度高,且利用TSDR反应原理避免了核酸扩增反应中常常所需的核酸扩增酶和三磷酸脱氧核苷酸,利用DNA本身严格的互补配对反应,极大降低了扩增成本,提高了扩增效率和自动化程度,适用于实验研究、临床检测、食品安全检测等领域。
附图说明
图1为本发明上壳体结构示意图;
图2为本发明下壳体结构示意图;
图3为检测试剂条结构示意图;
图4为隔绝垫示意图;
图5为采样单元示意图;
图6为封口膜示意图;
图7为吸水纸示意图。
附图标记说明:上壳体1、检测窗2、下壳体3、关卡一4、关卡二5、隔绝垫卡槽6、吸水纸卡槽7、核酸收集试纸8、卡体9、加样孔10、吸水垫11、C线12、T线13、NC膜14、结合垫15、样品垫16、隔绝垫 17、吸水纸18、封口膜19。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的技术方案作进一步地详细说明。
如图1所示,本发明的核酸检测卡包括采样单元、检测单元,在测试过程中,还包括配套使用的反应试剂、缓冲液和检测器。
如图5所示,采样单元包括卡体9、核酸收集试纸8、加样孔10和封口膜19,加样孔10设置在卡体9上,核酸收集试纸8卡在加样孔10上,加样孔10可被封口膜19封闭。在检测过程中,微量样本、反应液、缓冲液均由加样孔10加入,对于残余物及多余的缓冲液,可通过吸水纸18吸取,加样完成后,可采用封口膜19将加样孔10密封。本发明的卡体9材质为塑料,在核酸检测过程中,卡体9可向检测单元方向移动并由检测单元上的关卡一4或关卡二5定位,用以完成核酸检测过程的核酸扩增反应或者粘性末端介导的链置换反应和核酸特异性/非特异性结合显色过程。
本发明中核酸收集试纸8含有细胞裂解试剂,可以裂解细胞,使蛋白质变性并有效地保护核酸免受核酸酶、氧化剂和紫外线损伤。本发明核酸收集试纸8上可发生核酸扩增反应,本发明的核酸扩增反应可以是以DNA 为扩增模板的聚合酶链反应、环介导等温扩增反应、滚环扩增反应、依赖解旋酶的等温扩增反应、重组酶介导的等温扩增反应或者其它核酸扩增反应,也可以是以RNA为扩增模板的逆转录聚合酶链反应、逆转录环介导等温扩增反应或者其他逆转录核酸扩增反应。
本发明的封口膜19材质可为塑料,封口膜19通过粘胶或静电作用固定于卡体9上,实现对加样孔10的密封。
如图1至图4所示,检测单元包括上壳体1,与上壳体卡接的下壳体 3、检测试剂条和隔绝垫17,上壳体1设置有检测窗2,下壳体3前部包括关卡一4、关卡二5、隔绝垫卡槽6和吸水纸卡槽7,隔绝垫17放置在隔绝垫卡槽6内,吸水纸18放置在吸水纸卡槽7内,在靠近下壳体3内侧分别设置关卡一4、关卡二5,关卡一4、关卡二5用于对卡体9进行定位。下壳体3的后部为承载装置,用于承载检测试剂条,上壳体1卡接在下壳体3后,检测窗2正对C线12、T线13,这样便于直接观测或仪器测量测试结果。
如图3所示,本发明的检测试剂条由样品垫16、结合垫15、NC膜14 和吸水垫11依次设置组成,结合垫15是纳米金颗粒标记的特异性核酸识别片段的载体,样品垫16是用于承载微量样本经核酸扩增反应或者粘性末端介导的链置换反应得到的扩增产物的载体,NC膜14为C线12、T 线13的承载体,吸水垫11用于核酸检测反应后的冲洗,C线12为对照线, T线13为检测线,当只有C线12存在时,检测结果为阴性,当C线12、 T线13同时存在时则检测结果为阳性。
本发明的样品垫16材质为玻璃纤维,用于承载微量样本经核酸扩增反应或者粘性末端介导的链置换反应得到的扩增产物,并经吸水垫11导引至结合垫15及NC膜14,并与NC膜14上包被的C线12、T线13 上包被的特异性/非特异性识别核酸片段反应;
结合垫15材质为玻璃纤维,用于承载经纳米金颗粒标记的特异性核酸识别片段,用以捕获样品垫16上的样本核酸片段扩增产物;
NC膜14材质为硝酸纤维素膜,用于承载核酸检测显色使用的C线12、 T线13,C线12、T线13上分别包被不同的核酸特异性抗体,用于结合纳米金颗粒标记的特异性识别核酸片段与样本核酸扩增产物杂交的复合物。
本发明配套使用的反应试剂可以为核酸扩增试剂,核酸扩增试剂包括引物、核酸扩增反应所需的酶、缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸,粘性末端介导的链置换反应试剂包括引物、荧光团、生物素,不包括核酸扩增所需的酶和三磷酸脱氧核苷酸,预装于核酸检测卡以外的试管等容器里,以备使用。
本发明的缓冲液可以采用磷酸缓冲液等,缓冲液预装于核酸检测卡以外的试管等容器里,以备使用。
本发明的核酸检测装置配套使用的检测器,由光学采集单元、图像信号处理器及相关电子外设组成,通过光学检测读取核酸检测结果,将其显示在液晶屏幕上,并打印出来
下面通过一个具体的实施方式对本发明做进一步的说明,但具体实施例并不对本发明做任何限定。
实例1:肺小细胞肺癌中上皮生长因子受体基因19位点检测
取出核酸检测装置平方在实验台上,向加样孔10中加入1滴样本,室温静置5分钟;
1)继续向加样孔10中加入1-2滴缓冲液,静置5分钟后,将卡体9 向前推到关卡二5位置;
2)向加样孔10中加1滴反应液,同时将封口膜19封闭加样孔10,将检测装置置于65℃烘箱中1小时左右;
取出检测装置,去除封口膜19,将其继续向前推置关卡一4处,滴加 1滴缓冲液于加样孔10中,5分钟内肉眼即可看出C线12、T线13的变化。当只有C线12存在时,检测结果为阴性,当C线12、T线13同时存在时则检测结果为阳性,也可放入核酸检测装置配套使用的检测器中定量检测出对应的结果。
本发明还公开了核酸检测卡的使用方法,包括以下步骤:
将检测试剂条放置在下壳体3后部的承载装置上,在隔绝垫卡槽6上放置隔绝垫17,在吸水纸卡槽7上放置吸水纸18,将上壳体1与下壳体3 卡接在一起,并将卡体9套在上壳体1与下壳体3的前部,使加样孔10 处于吸水纸卡槽7正上方;
通过加样孔10向核酸收集试纸8分别滴入样品和缓冲液,静置后烘干,将卡体9向前推到关卡二5,使加样孔10处于隔绝垫卡槽6正上方;
然后向加样孔10中滴入反应液,反应液与核酸收集试纸8和隔绝垫 17接触,然后采用封口膜19封闭加样孔10,并放置于烘箱中反应;
反应完毕,将卡体9向前推到关卡一4,使加样孔10处于样品垫16 正上方,去除封口膜19,向加样孔10中滴入缓冲液,然后观测C线12、 T线13的变化。
本发明所采取的高通量微流控诊断芯片技术则完全摒弃了背景技术所采用的方式方式,而是以“片段式”的反应体系针对性地对目标基因片段进行扩增或信号放大并进行直读式的超灵敏性检测,从而实现了和临床医生的初步诊断相辅相成并为精确的临床诊断提供有力可靠的依据,使精准诊断和精准医疗真正成为现实。而在新兴的病原体检测领域,本发明研制的高通量高灵敏性微流控分子诊断芯片技术更是具有传统分子诊断技术所不可比拟的技术优势。由于本技术基于目的性极强的病原微生物基因片段的快速扩增而不是对病原微生物全基因组的“扫描”,所以该分子诊断芯片能快速精确判断病原体种类和数量。这一成果将使得我国目前仍旧部分存在着的抗生素滥用问题彻底成为历史,其市场化将具有不可估量的社会效益和经济效益。
本发明的市场定位可以初步定为:①病原体检测。目前病原体检测技术的发展方兴未艾,抗生素滥用的问题仍然严重。本发明可以使得临床用药的针对性更精确,极大程度的避免了误诊和患者在用药上的经济浪费。②疾病基因检测。不同于对人体进行全基因测序的方式,利用基于高通量高灵敏性的微流控分子诊断芯片技术,临床基因诊断和基因风险诊断将走入千家万户,小型化、快速化、经济实用型的便携式基因诊断仪将使得医生和患者对其基因风险和疾病隐患更了然于胸,实现对疾病的针对性精确预防和治疗。
本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种核酸检测卡,包括采样单元、检测单元,其特征在于:所述的采样单元包括卡体、核酸收集试纸、加样孔和封口膜,加样孔设置在卡体上,核酸收集试纸卡在加样孔上,加样孔可被封口膜封闭;所述的核酸收集试纸含有细胞裂解试剂,所述的检测单元包括检测试剂条,所述的检测试剂条由样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫依次设置组成,结合垫是纳米金颗粒标记的特异性核酸识别片段的载体,样品垫是用于承载微量样本经核酸扩增反应或者粘性末端介导的链置换反应得到的扩增产物的载体,NC膜为C线、T线的承载体,吸水垫用于核酸检测反应后的冲洗,C线为对照线,T线为检测线,C线、T线上分别包被不同的核酸特异性抗体。
2.根据权利要求1所述的核酸检测卡,其特征在于:所述的检测单元还包括上壳体,下壳体和隔绝垫,上壳体设置有检测窗,下壳体前部包括关卡一、关卡二、隔绝垫卡槽和吸水纸卡槽,隔绝垫放置在隔绝垫卡槽内,吸水纸放置在吸水纸卡槽内,下壳体内侧分别设置关卡一、关卡二,下壳体的后部为承载装置,检测试剂条设置在承载装置上,上壳体连接在下壳体后,检测窗正对C线、T线。
3.根据权利要求1或2所述的核酸检测卡,其特征在于:所述的卡体材质为塑料。
4.根据权利要求1或2所述的核酸检测卡,其特征在于:所述的封口膜材质为塑料,封口膜通过粘胶或静电作用固定于卡体上。
5.根据权利要求1或2所述的核酸检测卡,其特征在于:所述的结合垫和样品垫材质为玻璃纤维。
6.根据权利要求1或2所述的核酸检测卡,其特征在于:所述的NC膜材质为硝酸纤维素膜。
7.根据权利要求1或2所述的核酸检测卡,其特征在于:还包括反应试剂,所述的反应试剂为核酸扩增试剂,核酸扩增试剂包括引物、核酸扩增反应所需的酶、缓冲液、三磷酸脱氧核苷酸,粘性末端介导的链置换反应试剂包括引物、荧光团、生物素。
8.根据权利要求1或2所述的核酸检测卡,其特征在于:还包括缓冲液,所述的缓冲液为磷酸缓冲液。
9.根据权利要求1或2所述的核酸检测卡,其特征在于:还包括检测器,所述的检测器由光学采集单元、图像信号处理器及电子外设组成,通过光学检测读取核酸检测结果。
10.一种核酸检测卡的使用方法,包括以下步骤:
将检测试剂条放置在下壳体后部的承载装置上,在隔绝垫卡槽上放置隔绝垫,在吸水纸卡槽上放置吸水纸,将上壳体与下壳体卡接在一起,并将卡体套在上壳体与下壳体的前部,使加样孔处于吸水纸卡槽正上方;
通过加样孔向核酸收集试纸分别滴入样品和缓冲液,静置后烘干,将卡体向前推到关卡二,使加样孔处于隔绝垫卡槽正上方;
向加样孔中滴入反应液,反应液与核酸收集试纸和隔绝垫接触,然后采用封口膜封闭加样孔,并放置于烘箱中反应;
反应完毕,将卡体向前推到关卡一,使加样孔处于样品垫正上方,去除封口膜,向加样孔中滴入缓冲液,然后观测C线、T线的变化。
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