CN104583398A - 用于调节基因表达的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的方面提供了选择用于激活靶基因的表达的候选寡核苷酸的方法。本发明的另外的方面提供选择一组寡核苷酸的方法，该组寡核苷酸中富集了激活靶基因的表达的寡核苷酸。另外的方面提供调节基因表达的单链寡核苷酸以及包含这些单链寡核苷酸的组合物和试剂盒。还提供了用于使用这些单链寡核苷酸调节基因表达的方法。

Description

用于调节基因表达的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2012年5月16日提交的名称为“用于调节基因表达的组合物和方法(COMPOSITIONS ANDMETHODS FOR MODULATING GENE EXPRESSION)”的美国临时申请号61/648,016、2012年5月16日提交的名称为“用于调节基因表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FORMODULATING GENE EXPRESSION)”的美国临时申请号61/648,021、2013年3月14日提交的名称为“用于调节基因表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING GENEEXPRESSION)”的美国临时申请号61/786,232，2012年5月16日提交的名称为“用于调节SMN基因家族表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING SMNGENE FAMILY EXPRESSION)”的美国临时申请号61/647,858、2012年10月27日提交的名称为“用于调节SMN基因家族表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING SMNGENE FAMILY EXPRESSION)”的美国临时申请号61/719,394、2013年3月14日提交的名称为“用于调节SMN基因家族表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING SMNGENE FAMILY EXPRESSION)”的美国临时申请号61/785,529、2012年5月16日提交的名称为“用于调节UTRN表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING UTRNEXPRESSION)”的美国临时申请号61/647,886、2012年5月16日提交的名称为“用于调节血红蛋白基因家族表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATINGHEMOGLOBIN GENE FAMILY EXPRESSION)”的美国临时申请号61/647,901、2013年3月14日提交的名称为“用于调节血红蛋白基因家族表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FORMODULATING HEMOGLOBIN GENE FAMILY EXPRESSION)”的美国临时申请号61/785,956、2012年5月16日提交的名称为“用于调节ATP2A2表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FORMODULATING ATP2A2 EXPRESSION)”的美国临时申请号61/647,925、2013年3月14日提交的名称为“用于调节ATP2A2表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING ATP2A2EXPRESSION)”的美国临时申请号61/785,832、2012年5月16日提交的名称为“用于调节APOA1和ABCA1表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING APOA1AND ABCA1 EXPRESSION)”的美国临时申请号61/647,949、2013年3月14日提交的名称为“用于调节APOA1和ABCA1表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING APOA1AND ABCA1 EXPRESSION)”的美国临时申请号61/785,778、2012年5月16日提交的名称为“用于调节PTEN表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING PTENEXPRESSION)”的美国临时申请号61/648,041、2013年3月14日提交的名称为“用于调节PTEN表达的组合物和方法(COMPOSITIONS ANDMETHODS FOR MODULATING PTEN EXPRESSION)”的美国临时申请号61/785,885、2012年5月16日提交的名称为“用于调节BDNF表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FORMODULATING BDNF EXPRESSION)”的美国临时申请号61/648,058以及2012年5月16日提交的名称为“用于调节MECP2表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING MECP2EXPRESSION)”的美国临时申请号61/648,051的权益，每个申请的内容通过引用以其全部内容结合在此。
发明领域
本发明涉及基于寡核苷酸的组合物，以及使用基于寡核苷酸的组合物用于治疗疾病的方法。
发明背景
转录组分析已表明虽然仅1％至2％哺乳动物基因组是蛋白编码的，但70％至90％具有转录活性。最新发现认为这些非蛋白编码转录物的子集在表观遗传调控中起重要作用。尽管它们普遍存在，但许多这类转录物的结构和功能仍然是未表征的。最新研究指示，一些长的非编码RNA在染色质重建中通过与多梳阻抑复合物(PRC2)相互作用而用作遗传调控因子/RNA辅因子，并且因此发挥作用来调空基因表达。
发明内容
本发明的多个方面提供用于选择用于激活或增强靶基因的表达的寡核苷酸的方法。这些方法尤其可用于鉴别用于激活或增强靶基因的表达的候选寡核苷酸，这些靶基因的降低的表达或活性导致了或引起了疾病。本发明的另外的方面提供选择一组寡核苷酸的方法，该组寡核苷酸中富集了激活靶基因的表达的寡核苷酸(例如，与随机寡核苷酸选择相比较)。因此，这些方法可以用于建立其中富集了激活基因表达的寡核苷酸的大型临床候选物库。这类库可以被利用来例如鉴别用于治疗研发的先导寡核苷酸。因此，所提供的方法可用于建立用于靶向包括蛋白编码基因的大多数已知基因的表达的候选寡核苷酸的广阔平台。另外的方面提供调节基因表达的单链寡核苷酸以及包含这些单链寡核苷酸的组合物和试剂盒。还提供了用于使用单链寡核苷酸调节基因表达的方法。
在一些方面，本发明为一种用于通过在第一核苷酸序列内选择PRC2相关区来选择用于激活靶基因的表达的候选寡核苷酸的方法，其中该第一核苷酸序列定位至第一染色体中该靶基因的5’端上游50千碱基与该靶基因的3’端下游50千碱基之间的位置；确定与该PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的第二核苷酸序列；并且将包含该第二核苷酸序列的单链寡核苷酸选择为候选寡核苷酸，其中该寡核苷酸具有以下特征中的至少一种：a)包含5’-X-Y-Z的序列，其中X为任何核苷酸，Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列，并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列，其中X锚定在该寡核苷酸的5’端上；b)不包含三个或更多个连续鸟苷核苷酸的序列；c)与长度等于该第二核苷酸序列的每个核苷酸序列具有阈值水平以下的序列一致性的序列，这些核苷酸序列处在脱靶基因的5’端上游的50千碱基与该脱靶基因的3’端下游的50千碱基之间；d)与编码RNA的PRC2相关区互补的序列，该RNA形成包含至少两个单链环的二级结构；和/或e)具有60％以上G-C含量的序列。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的仅一种。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有各自独立地选择的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少两种。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有各自独立地选择的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少三种。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有各自独立地选择的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少四种。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的每一种。在某些实施例中，该寡核苷酸具有该序列5’X-Y-Z，其中该寡核苷酸的长度为8至50个核苷酸。在一些实施例中，Y为选自表3的序列。
在另一个方面，本发明为一种通过在第一核苷酸序列内选择PRC2相关区来选择富集了激活靶基因的表达的寡核苷酸的一组寡核苷酸的方法，该第一核苷酸序列定位至第一染色体中该靶基因的5’端上游的50千碱基与该靶基因的3’端下游的50千碱基之间的位置；选择一组寡核苷酸，其中该组中的每个寡核苷酸包含与PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的第二核苷酸序列，并且具有以下特征中的至少一种：a)序列：5’-X-Y-Z，其中X为任何核苷酸，Y为非为微小RNA的人种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列，并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列，其中X锚定在该寡核苷酸的5’端上；b)不包含三个或更多个连续鸟苷核苷酸的序列；c)与长度等于该第二核苷酸序列的每个核苷酸序列具有阈值水平以下的序列一致性的序列，这些核苷酸处在脱靶基因的5’端上游的50千碱基与该脱靶基因的3’端下游的50千碱基之间；d)与编码RNA的PRC2相关区互补的序列，该RNA形成包含至少两个单链环的二级结构；和/或e)具有60％以上G-C含量的序列；并且其中该组寡核苷酸富集了激活靶基因的表达的寡核苷酸。
在一些实施例中，寡核苷酸各自具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的仅一种。在一些实施例中，寡核苷酸各自具有各自独立地选择的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少两种。在一些实施例中，寡核苷酸各自具有各自独立地选择的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少三种。在一些实施例中，寡核苷酸各自具有各自独立地选择的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少四种。在一些实施例中，寡核苷酸各自具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的每一种。在某些实施例中，寡核苷酸各自具有该序列5’X-Y-Z，其中该寡核苷酸的长度为8至50个核苷酸。在一些实施例中，Y为选自表3的序列。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸或寡核苷酸中的每一个的长度高达100、50、40、30或20个核苷酸。在其他实施例中，该单链寡核苷酸或寡核苷酸中的每一个的长度为8至30个核苷酸。
在一些实施例中，阈值水平的序列一致性为50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列一致性。
在一个实施例中，Y为表3中给出的长度为6个核苷酸的核苷酸序列。
在其他实施例中，该第一染色体为第一物种的染色体，并且其中该方法进一步包括确定该第二核苷酸序列与第二物种的第二染色体的第二区互补，该第二区位于该靶基因的同源物的5’端上游的50千碱基与该靶基因的该同源物的3’端下游的50千碱基之间。
该第二核苷酸序列可以与该第二染色体的该第二区至少80％互补
在一些实施例中，该第一核苷酸序列定位至包含该靶基因的有义链的该第一染色体的链。在其他实施例中，该第一核苷酸序列定位至包含该靶基因的反义链的该第一染色体的链。
在一些实施例中，该PRC2相关区处在该靶基因的5’端的上游，并且在其他实施例中，该PRC2相关区处在该靶基因的3’端的下游。任选地，该PRC2相关区可以在该靶基因的内含子或外显子内，或者该PRC2相关区可以横跨该靶基因的内含子-外显子接点、5’-UTR-外显子接点或3’-UTR-外显子接点。
该PRC2相关区可以编码形成包含至少两个单链环的二级结构的RNA。任选地，该二级结构包含该至少两个单链环之间的双链茎。在一些实施例中，该PRC2相关区的该至少8个连续核苷酸编码至少一个环或至少两个环的至少一部分或该双链茎的至少一部分。
在其他方面，本发明为一种包含与PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的互补区的单链寡核苷酸，该PRC2相关区位于第一染色体中靶基因的5’端上游的50千碱基与该靶基因的3’端下游的50千碱基之间，其中该寡核苷酸具有以下各项中的至少一种：a)包含5’-X-Y-Z的序列，其中X为任何核苷酸，Y为非为微小RNA的人种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列，并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列；b)不包含三个或更多个连续鸟苷核苷酸的序列；c)与长度等于该第二核苷酸序列的每个核苷酸序列具有阈值水平以下的序列一致性的序列，这些核苷酸处在脱靶基因的5’端上游的50千碱基与该脱靶基因的3’端下游的50千碱基之间；d)与编码RNA的PRC2相关区互补的序列，该RNA形成包含至少两个单链环的二级结构；和/或e)具有60％以上G-C含量的序列。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的仅一种。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有各自独立地选择的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少两种。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有各自独立地选择的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少三种。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有各自独立地选择的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少四种。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的每一种。在某些实施例中，该寡核苷酸具有该序列5’X-Y-Z，其中该寡核苷酸的长度为8至50个核苷酸。在一些实施例中，Y为选自表3的序列。
在一些实施例中，该第一染色体为第一物种的染色体。包含至少8个连续核苷酸的序列位于第二染色体中该靶基因的同源物的5’端上游的50千碱基与该靶基因的该同源物的3’端下游的50千碱基之间，其中该第二染色体为第二物种的染色体。该第一物种可以为人并且该第二物种可以为小鼠。
本发明还包括一种长度为8至30个核苷酸的单链寡核苷酸，其中该单链寡核苷酸与PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补，该PRC2相关区位于染色体中靶基因的5’端上游的50千碱基与该靶基因的3’端下游的50千碱基之间，其中该单链寡核苷酸的核苷酸序列包括选自以下的一个或多个核苷酸序列：(X)Xxxxxx、(X)xXxxxx、(X)xxXxxx、(X)xxxXxx、(X)xxxxXx、以及(X)xxxxxX、(X)XXxxxx、(X)XxXxxx、(X)XxxXxx、(X)XxxxXx、(X)XxxxxX、(X)xXXxxx、(X)xXxXxx、(X)xXxxXx、(X)xXxxxX、(X)xxXXxx、(X)xxXxXx、(X)xxXxxX、(X)xxxXXx、(X)xxxXxX、以及(X)xxxxXX、(X)XXXxxx、(X)xXXXxx、(X)xxXXXx、(X)xxxXXX、(X)XXxXxx、(X)XXxxXx、(X)XXxxxX、(X)xXXxXx、(X)xXXxxX、(X)xxXXxX、(X)XxXXxx、(X)XxxXXx、(X)XxxxXX、(X)xXxXXx、(X)xXxxXX、(X)xxXxXX、(X)xXxXxX、以及(X)XxXxXx、(X)xxXXX、(X)xXxXXX、(X)xXXxXX、(X)xXXXxX、(X)xXXXXx、(X)XxxXXXX、(X)XxXxXX、(X)XxXXxX、(X)XxXXx、(X)XXxxXX、(X)XXxXxX、(X)XXxXXx、(X)XXXxxX、(X)XXXxXx、以及(X)XXXXxx、(X)xXXXXX、(X)XxXXXX、(X)XXxXXX、(X)XXXxXX、(X)XXXXxX、以及(X)XXXXXx、以及XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX以及XXXXXXx，其中“X”表示核苷酸类似物，(X)表示任选的核苷酸类似物，并且“x”表示DNA或RNA核苷酸单位。
在本发明的其他方面，提供了长度为8至30个核苷酸的单链寡核苷酸，该单链寡核苷酸具有与调控靶基因的表达的长的非编码RNA(lncRNA)的至少8个连续核苷酸互补的互补区，其中该寡核苷酸的2至19个核苷酸为核苷酸类似物。
在其他方面，提供了长度为5至30个核苷酸的单链寡核苷酸，该单链寡核苷酸具有与调控靶基因的表达的长的非编码RNA(lncRNA)的至少5个连续核苷酸互补的互补区，其中该寡核苷酸通过可裂解接头连接至第二寡核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸具有在此描述的任何单链寡核苷酸的结构。
在本发明的其他方面，提供了长度为8至40个核苷酸的单链寡核苷酸，该单链寡核苷酸具有与调控蛋白编码参考基因的表达的PRC2结合的长的非编码RNA(lncRNA)的至少5个连续核苷酸互补的互补区，其中该lncRNA转录自含有蛋白编码参考基因的基因组区中与该蛋白编码参考基因相反的链，其中该单链寡核苷酸结合至该lncRNA中起源于外显子、内含子、外显子、内含子-外显子接点、5′UTR、3′UTR、翻译起始区或翻译终止区或与它们重叠的区域。
在本发明的其他方面，提供了长度为8至40个核苷酸的单链寡核苷酸，该单链寡核苷酸具有与调控靶基因的表达的长的非编码RNA(lncRNA)的至少5个连续核苷酸互补的互补区。该寡核苷酸与lncRNA在lncRNA的处于该靶基因的转录区之外的区域具有互补性。
在本发明的仍然其他的方面，提供了长度为8至30个核苷酸的单链寡核苷酸，该单链寡核苷酸具有与抑制靶基因的表达的长的非编码RNA(lncRNA)的至少5个连续核苷酸互补的互补区，其中该寡核苷酸与lncRNA在lncRNA的转录自该靶基因的非编码部分的区域内具有互补性。
在一些实施例中，该lncRNA为PRC2相关区。
本申请通过引用结合2011年11月12日提交、2012年5月18日公开为WO/2012/065143且名称为“多梳相关非编码RNA(POLYCOMB-ASSOCIATED NON-CODING RNAS)”的国际专利申请PCT/US 2011/060493中的SEQ ID NO：1至193，049列出的核苷酸序列。这些序列在此通过前面加上“A”的序列标识符来提及。因此，通过引用从国际专利申请PCT/US 2011/060493结合的核苷酸序列组被称为“序列A1至A193,049”。
本申请通过引用还结合2011年12月19日提交、2012年6月28日公开为WO/2012/087983且名称为“多梳相关非编码RNA(POLYCOMB-ASSOCIATED NON-CODING RNAS)”的国际专利申请PCT/US 2011/65939中的SEQ ID NO：1至916,209或916,626至934,931列出的核苷酸序列。这些序列在此通过前面加上“B”的序列标识符来提及。因此，通过引用从国际专利申请PCT/US 2011/65939结合的核苷酸序列组被称为“序列B1至B916,209或B916,626至B934,931”。
在一些实施例中，该PRC2相关区具有选自序列A1至A193,049，B1至B916,209以及B916,626至B934,931的核苷酸序列。
在一些实施例中，该PRC2相关区具有选自SEQ ID NO：1至1212的核苷酸序列。
该寡核苷酸可以为任何长度。在一些实施例中，该寡核苷酸的长度高达100、50、40、30或20个核苷酸。在其他实施例中，该寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。在仍然其他实施例中，该寡核苷酸的长度为8至10个核苷酸，并且该PRC2相关区的互补序列中除1、2或3个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶或鸟苷核苷酸。
在一些实施例中，该PRC2相关区的该至少8个连续核苷酸处在包含该靶基因的反义链的染色体的链上，并且在其他实施例中处在包含该靶基因的有义链的染色体的链上。
在一些实施例中，该PRC2相关区处在该靶基因的5’端的上游，并且在其他实施例中，该PRC2相关区处在该靶基因的3’端的下游。任选地，该PRC2相关区可以在该靶基因的内含子或外显子内，或者该PRC2相关区可以横跨该靶基因的内含子-外显子接点、5’-UTR-外显子接点或3’-UTR-外显子接点。
该PRC2相关区可以编码形成包含至少两个单链环的二级结构的RNA。任选地，该二级结构包含该至少两个单链环之间的双链茎。在一些实施例中，该PRC2相关区的该至少8个连续核苷酸编码至少一个环或至少两个环的至少一部分或该双链茎的至少一部分。
在一些实施例中，与不具有至少一个核苷酸类似物的寡核苷酸相比较，该至少一个核苷酸类似物导致该寡核苷酸的Tm在1℃至5℃的范围内的升高。
在一些实施例中，该寡核苷酸的至少一个核苷酸包含核苷酸类似物。在其他实施例中，该寡核苷酸的每个核苷酸包含核苷酸类似物。例如，该核苷酸类似物可以为2’O-甲基或桥连核苷酸。在其他实施例中，该寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸或至少一个桥连核苷酸。该桥连核苷酸可以为例如LNA核苷酸、cEt核苷酸或ENA核苷酸类似物。任选地，该寡核苷酸的每个核苷酸为LNA核苷酸。
在一些实施例中，该寡核苷酸的核苷酸包含交替的核苷酸类型。例如，在一些实施例中，该寡核苷酸包含脱氧核糖核苷酸以及2’-氟-脱氧核糖核苷酸。在其他实施例中，该寡核苷酸的核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。在仍然其他实施例中，该寡核苷酸的核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸与ENA核苷酸类似物或者该寡核苷酸的核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸与LNA核苷酸。在仍然其他实施例中，该寡核苷酸的核苷酸包含交替的LNA核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。
该寡核苷酸的5’核苷酸可以具有不同的特性。例如，在一些实施例中，该寡核苷酸的5’核苷酸为脱氧核糖核苷酸或LNA核苷酸。
在一些实施例中，该寡核苷酸的核苷酸包含通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的至少一个LNA核苷酸侧接的脱氧核糖核苷酸。
该单链寡核苷酸还可以包括至少两个核苷酸之间或所有核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施例中，该寡核苷酸的3’位置处的核苷酸具有3’羟基。在其他实施例中，该寡核苷酸的3’位置处的核苷酸具有3’硫代磷酸酯。
任选地，该单链寡核苷酸具有缀合至5’或3’核苷酸的生物素部分。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有5’核苷酸或3’核苷酸或两者上的以下缀合物中的一种或多种：胆固醇、维生素A、叶酸、σ受体配体、适体、肽、如CPP、疏水性分子如脂质、ASGPR或动态多聚缀合物以及其变体。
在另一个方面提供了组合物。该组合物为在此描述的单链寡核苷酸以及载体、缓冲溶液和/或药学上可接受的载体。
在一些方面，本发明为长度为8至20个核苷酸的单链RNA寡核苷酸在药学上可接受的载体中配制的组合物，该单链RNA寡核苷酸具有与调控靶基因的表达的长的非编码RNA(lncRNA)的至少5个连续核苷酸互补的互补区，其中该寡核苷酸的2至19个核苷酸为核苷酸类似物，其中互补的RNA寡核苷酸不存在于该组合物中。
在一些实施例中，这些核苷酸类似物选自由桥连核苷酸、2’氟以及2’O-甲基核苷酸组成的组。在其他实施例中，该桥连核苷酸为LNA、ENA或cEt核苷酸。
该lncRNA可以转录自含有该靶基因的基因组区中与该靶基因相反的链。
在一些实施例中，该寡核苷酸与lncRNA在lncRNA的转录自该靶基因的非编码部分的区域中具有互补性。在其他实施例中，该寡核苷酸与lncRNA在lncRNA的处于该靶基因的转录区之外的区域中具有互补性。
还提供了一种包括容纳任何组合物的容器的试剂盒。
在其他方面，本发明为通过将在此描述的单链寡核苷酸递送到细胞中来提高细胞内靶基因的表达的方法。
在本发明的其他方面，提供了通过向受试者给予在此描述的单链寡核苷酸来提高受试者体内靶基因的水平的方法。
在本发明的仍然其他方面，提供了通过向受试者给予在此描述的单链寡核苷酸来治疗与受试者体内靶基因的降低的水平相关联的病症的方法。
在其他方面，提供了上调基因表达的方法。该方法包括使细胞与长度为8至30个核苷酸的单链RNA寡核苷酸相接触，该单链RNA寡核苷酸具有与抑制靶基因的表达的长的非编码RNA(lncRNA)的至少5个连续核苷酸互补的互补区。
以下申请通过引用以其全部内容结合在此：2011年12月19日提交、2012年6月28日公开为WO/2012/087983且名称为多梳相关非编码RNA(POLYCOMB-ASSOCIATED NON-CODING RNAS)的国际专利申请PCT/US 2011/65939以及2011年11月12日提交、2012年5月18日公开为WO/2012/065143且名称为多梳相关非编码RNA(POLYCOMB-ASSOCIATED NON-CODING RNAS)的国际专利申请PCT/US 2011/060493。
本发明的各个限制性方案可以涵盖本发明的不同的实施例。因此预期的是，涉及任何一个要素或多个要素的组合的本发明的各个限制性方案可以被包括在本发明的各个方面中。本发明并未将其应用局限于以下说明中所陈述或附图中所示的组分的构建和安排的细节。本发明能够进行其他实施例并且能以不同的方式实践或进行。同样，在此所使用的措辞和术语是用于描述的目的，而不应当被视为是限制性的。在此使用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式意图涵盖其后所列的项目和其等效形式，以及其他项目。
表1：序列表简要说明
表2：扩增的PRC2转录组命中的印记区。
PRC2转录组与印记基因坐标的交叉(可从geneimprint.com在线获得)。第1列中示出了通过PRC2结合转录物来靶向的鼠印记基因(即，交叉或邻近基因)。第1列还示出了鼠印记基因的染色体链(“+”号指示基因转录自顶部或正链，而“-”号指示PRC2结合转录物转录自底部或染色体的负链)。第2列中示出了染色体定位和PRC2结合转录物的mm9内的核苷酸坐标，以及“+”号或“-”号，这些符号指示PRC2结合转录物是否转录自染色体的上链(正链命中)或下链(负链命中)。第3列显示了小鼠PRC2结合转录物的序列标识符(即，转录自第2列的小鼠染色体坐标和链的核苷酸序列通过用U置换T来转化成RNA)。第4列示出了从小鼠基因组数据库(MGD)、小鼠基因组信息学、缅因州巴港的美国杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)、万维网(informatics.jax.org)获得、与第1列的鼠印记基因对应的人基因名称。第2列中在如在此描述的UCSC基因组浏览器中进行的小鼠染色体坐标的小鼠对人LiftOver产生第5列中显现的直向同源人染色体坐标。50％保守用于LiftOver分析。另外的人染色体坐标通过将来自小鼠的高度保守或同源的区域映射至人基因组来产生。第6列显示了预测的人PRC2结合转录物的序列标识符(即，转录自第5列的人染色体坐标和链的核苷酸序列通过用U置换T来转化成RNA)。当PRC2相互作用转录物转录自与第1列中的印记参考基因相比相反的链时，那就意味着PRC2相互作用RNA与参考印记基因互补或在取向上为反义链(“相反链”)。应注意到，PRC2结合转录物不必是参考印记基因自身，而是在位置上重叠的相异的转录物。
表3：非为人miRNA的种子序列的六聚物
2010年12月20日提交的美国临时申请61/425,174(该申请的全部内容通过引用结合在此)的附录I为示出数据集中所有读取段的完整的RIP seq数据集的列表。附录I并未随附在此。附录I中的序列读取段直接获自Illumina GA II基因组分析仪并且定向成PRC2结合转录物的反向补体。附录I为生物信息学过滤去除适配子/引物二聚物、线粒体RNA、rRNA、均聚物、具有不定核苷酸的读取段以及截短读取段(＜15nt)之后的所有读取段的过滤子集。
本发明的某些实施方式的详细说明
在此提供的本发明的方面涉及发现多梳阻抑复合物2(PRC2)-相互作用RNA。多梳阻抑复合物2(PRC2)为组蛋白甲基转移酶以及基因组区通过组蛋白H3的甲基化来沉默中涉及的已知的表观遗传调控因子。在其他功能中，PRC2与长的非编码RNA(lncRNA)如RepA和Xist以及Tsix相互作用以便催化组蛋白H3-赖氨酸27的三甲基化。PRC2含有四个亚单位：Eed、Suz12、RbAp48以及Ezh2。
在此称为“RNA免疫沉淀(RIP)-seq”的方法用于鉴别胚胎干细胞中＞100,000多梳阻抑复合物2(PRC2)相互作用RNA的全基因集合(genome-wide pool)。大量转录物出现在印记区、致癌基因和肿瘤压制基因座以及干细胞相关二价结构域之内和附近。确立了直接RNA-蛋白相互作用的证据，一些是经由Ezh2亚单位。确立了进一步的证据：设计来结合至这些PRC2相互作用RNA的单链寡核苷酸在各种分开且独立的实例中可以成功地上调基因表达，这被认为是由于PRC2介导的对这些靶基因的阻抑的抑制作用。因此，PRC2复合物与可以用作人疾病的治疗靶标的RNA的全基因组家族相互作用。在一些实施例中，与PRC2相互作用的RNA的序列的长度在40与60个核苷酸之间。
如在此所使用，术语“PRC2相关区”是指包含或编码与PRC2的组分直接或间接相互作用的核苷酸序列的核酸的区域。PRC2相关区可以存在于与PRC2相互作用的RNA(例如，长的非编码RNA(lncRNA))中。PRC2相关区可以存在于编码与PRC2相互作用的RNA的DNA中。
在一些实施例中，PRC2相关区为响应于对表达RNA的细胞的原位紫外线辐射而交联至PRC2的组分的RNA的区域，或编码那个RNA区的基因组DNA的区域。在一些实施例中，PRC2相关区为用靶向PRC2的组分的抗体免疫沉淀的RNA的区域，或编码那个RNA区的基因组DNA的区域。在一些实施例中，PRC2相关区为用靶向SUZ12、EED、EZH2或RBBP4(它们为PRC2的组分)的抗体免疫沉淀的RNA的区域，或编码那个RNA区的基因组DNA的区域。
在一些实施例中，PRC2相关区为采用靶向PRC2的组分的抗体的RNA免疫沉淀测定中保护其免于核酸酶(例如，RNA酶)破坏的RNA的区域，或编码那个受保护的RNA区的基因组DNA的区域。在一些实施例中，PRC2相关区为采用靶向SUZ12、EED、EZH2或RBBP4的抗体的RNA免疫沉淀测定中保护其免于核酸酶(例如，RNA酶)破坏的RNA的区域，或编码那个受保护的RNA区的基因组DNA的区域。
在一些实施例中，PRC2相关区为其中采用靶向PRC2的组分的抗体的RNA免疫沉淀测定的产物的测序反应中出现相对较高频率的序列读取段的RNA的区域，或编码那个RNA区的基因组DNA的区域。在一些实施例中，PRC2相关区为其中采用靶向SUZ12、EED、EZH2或RBBP4的抗体的RNA免疫沉淀测定的产物的测序反应中出现相对较高频率的序列读取段的RNA的区域，或编码那个受保护的RNA区的基因组DNA的区域。在这类实施例中，该PRC2相关区可以称为“峰”。
在一些实施例中，PRC2相关区包含与PRC2复合物相互作用的40至60个核苷酸的序列。在一些实施例中，PRC2相关区包含编码与PRC2相互作用的RNA的40至60个核苷酸的序列。在一些实施例中，PRC2相关区包含长度高达5kb、包含与PRC2相互作用的序列(例如，具有40至60个核苷酸)的序列。在一些实施例中，PRC2相关区包含长度高达5kb的序列，其中编码具有已知与PRC2相互作用的序列(例如，具有40至60个核苷酸)的RNA。在一些实施例中，PRC2相关区包含长度约4kb、包含与PRC2相互作用的序列(例如，具有40至60个核苷酸)的序列。在一些实施例中，PRC2相关区包含长度约4kb的序列，其中编码包括已知与PRC2相互作用的序列(例如，具有40至60个核苷酸)的RNA。
在一些实施例中，PRC2相关区具有序列A1至A193,049，B1至B916,209以及B916,626至B934,931的任一个中给出的序列。
在一些实施例中，提供单链寡核苷酸，其特异性结合至PRC2相关区或与该PRC2相关区互补，例如，具有序列A1至A193,049，B1至B916,209以及B916,626至B934,931中给出的序列的核酸。无意受限于本发明的理论，这些寡核苷酸能够通过防止将PRC2募集至特定染色体基因座来干扰PRC2的结合和功能。例如，在此的数据显示，设计成特异性结合PRC2相关区lncRNA的单链寡核苷酸的单一给药通过结合染色质不仅可以稳定地替换lncRNA，而且可以替换结合至lncRNA的PRC2。在替换之后，PRC2的所有补体在高达24小时未恢复。此外，在此提供的数据支持lncRNA能够以顺式方式募集PRC2，从而阻抑转录lncRNA的特定染色体基因座处或附近的基因表达，因此有可能设计抑制PRC2的功能并提高特定靶基因的表达的寡核苷酸。
在本发明的另外的方面，提供用于选择用于激活靶基因的表达的候选寡核苷酸的方法。这些方法通常包括将包含与PRC2相关区(例如，序列A1至A193,049、B1至B916,209以及B916,626至B934,931中给出的核苷酸序列)互补的核苷酸序列的单链寡核苷酸选择为候选寡核苷酸。在一些实施例中，可以选择富集了激活靶基因的表达的寡核苷酸的寡核苷酸组(例如，与随机寡核苷酸选择相比较)。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸提供用于在调节“PRC2结合RNA靶向的基因(例如，如表1至表3中给出的交叉基因或邻近基因)”的表达的方法中使用，该基因意指通过PRC2结合RNA调控表达的基因。术语“PRC2结合RNA”或“结合PRC2的RNA”可与“PRC2相关RNA”和“PRC2相互作用RNA”互换使用，并且是指直接或间接结合PRC2的lncRNA、RNA转录物或其PRC2相关区(例如，如下文所述的峰)。这类结合可以使用PRC2复合物的组分例如Ezh2的抗体通过免疫沉淀技术来确定。序列A1至A193,049、B1至B916,209和B916,626至B934,931代表含有使用在此描述的RIP-seq方法经实验确定结合PRC2的部分的鼠类RNA序列，或与这些鼠类RNA序列对应的人RNA序列。
这类调节基因表达的方法可以在体外、离体或体内执行。国际专利申请公开WO/2012/065143的表8显示了PRC2结合RNA靶向的基因；RC2结合RNA的序列标识符在与基因名称同一行中给出。在一些实施例中，单链寡核苷酸提供用于在治疗疾病的方法中使用，例如，如国际专利申请公开WO/2012/065143的表9或表2中给出的疾病类别。国际专利申请公开WO/2012/087983的表2显示了PRC2结合RNA靶向的基因；RC2结合RNA的序列标识符在与基因名称同一行中给出。在一些实施例中，单链寡核苷酸提供用于在治疗疾病的方法中使用，例如，如国际专利申请公开WO/2012/087983的表3或表2中给出的疾病类别。该治疗可以包括调节PRC2结合RNA靶向的基因的表达，优选地上调基因表达。该单链寡核苷酸可以配制为肠胃外给药的无菌组合物。应理解，整个说明书中对化合物的使用的任何提及涵盖化合物在制备用于在治疗疾病中使用的药物组合物或药剂中的用途。因此，作为一个非限制性实例，本发明的这个方面包括这类单链寡核苷酸在制备用于在治疗疾病中使用的药剂中的用途，其中该治疗包括上调PRC2结合RNA靶向的基因的表达。
用于选择用于激活基因表达的候选寡核苷酸的方法
在此提供了用于选择用于激活靶基因的表达的候选寡核苷酸的方法。感兴趣的靶基因可以例如为国际专利申请公开WO/2012/065143的表9的基因。感兴趣的靶基因可以例如为国际专利申请公开WO/2012/087983的表3的基因。感兴趣的靶基因可以为FXN、SMN1、SMN2、SMNP、UTRN、HBB、HBD、HBE1、HBG1、HBG2、Hbb-b1、Hbb-bh1、Hbb-y、HBB/HBD、ATP2A2、APOA1、Abca1、PTEN、BDNF、BDNF-AS1、ADIPOQ、MECP2或FOXP3。因此，该候选寡核苷酸可能与选自EQ IDNO：1至1212中给出的序列的序列互补。
典型地，这些方法包括旨在于鉴别寡核苷酸的一个或多个步骤，这些寡核苷酸靶向与该靶基因功能相关的PRC2相关区，例如，lncRNA的PRC2相关区，该lncRNA通过促进(例如，以顺式调控方式)将PRC2募集至该靶基因来调控该靶基因的表达。这类寡核苷酸有望成为用于激活该靶基因的表达的候选物，因为它们具有与核酸(例如，lncRNA)的PRC2相关区杂交的能力。在一些实施例中，这种杂交事件被理解成破坏PRC2与该核酸(例如，lncRNA)的相互作用，并且因此破坏了PRC2以及其相关联的辅阻抑物(例如，染色质重建因子)至靶基因座的募集。
选择候选寡核苷酸的方法可以包括选择定位至涵盖或接近感兴趣的靶基因的染色***置的PRC2相关区(例如，如序列A1至A193,049、B1至B916,209以及B916,626至B934,931中给出的核苷酸序列)。该PRC2相关区可以定位至染色体的包含该靶基因的有义链的链，在这种情况下，该候选寡核苷酸与该靶基因的有义链互补(即，对于该靶基因反义)。可替代地，该PRC2相关区可以定位至第一染色体的包含该靶基因的反义链的链，在这种情况下，该寡核苷酸与该靶基因的反义链(模板链)互补(即，对于该靶基因有义)。
用于选择富集了激活靶基因的表达的寡核苷酸的一组候选寡核苷酸的方法可以包括选择定位至涵盖或接近该靶基因的染色***置的一个或多个PRC2相关区，并且选择一组寡核苷酸，其中该组中的每个寡核苷酸包含与该一个或多个PRC2相关区互补的核苷酸序列。如在此所使用，短语“富集了激活靶基因的表达的寡核苷酸的一组寡核苷酸”是指与具有与富集组相同的物理化学特性(例如，相同的GC含量、Tm、长度等)的随机选择的寡核苷酸相比较激活靶基因的表达的寡核苷酸的数量更大的一组寡核苷酸。
该PRC2相关区可以定位至染色体中该靶基因的5’端上游的50千碱基与该靶基因的3’端下游的50千碱基之间的位置。该PRC2相关区可以定位至染色体中该靶基因的5’端上游的25千碱基与该靶基因的3’端下游的25千碱基之间的位置。该PRC2相关区可以定位至染色体中该靶基因的5’端上游的12千碱基与该靶基因的3’端下游的12千碱基之间的位置。该PRC2相关区可以定位至染色体中该靶基因的5’端上游的5千碱基与该靶基因的3’端下游的5千碱基之间的位置。
所选择的PRC2相关区相对于该靶基因的基因组位置可以变化。例如，该PRC2相关区可以位于该靶基因的5’端的上游。该PRC2相关区可以位于该靶基因的3’端的下游。该PRC2相关区可以位于该靶基因的内含子内。该PRC2相关区可以位于该靶基因的外显子内。该PRC2相关区可以横跨该靶基因的内含子-外显子接点、5’-UTR-外显子接点或3’-UTR-外显子接点。
候选寡核苷酸选择方法通常还可以包括确定或鉴别与该PRC2相关区互补的适当的核苷酸序列。这个核苷酸序列可以与该PRC2相关区的至少6，至少7、至少8、至少9、至少10、至少15或更多个连续核苷酸互补。
该候选寡核苷酸可以包含具有式X-Y-Z的序列，其中X为任何核苷酸，Y为非为微小RNA的人种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列，并且Z为具有变化的长度的核苷酸序列。在一些实施例中，X锚定在寡核苷酸的5’端上。在一些实施例中，当X锚定在寡核苷酸的5’端上时，该寡核苷酸不具有5’连接至X的任何核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施例中，其他化合物如肽类或固醇类在这个实施例中可以连接在5’端上，只要它们不为核苷酸或核苷酸类似物即可。预测具有这些序列特征的候选寡核苷酸以便避免miRNA路径。因此，在一些实施例中，具有这些序列特征的寡核苷酸不可能具有在细胞内起到miRNA分子作用的不期望的结果。该Y序列可以为表3中给出的长度为6个核苷酸的核苷酸序列。
该候选寡核苷酸可以具有不含有鸟苷核苷酸伸展段(例如，3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个连续鸟苷核苷酸)的序列。在一些实施例中，与不具有鸟苷核苷酸伸展段的寡核苷酸相比较，具有鸟苷核苷酸伸展段的寡核苷酸具有提高的非特异性结合和/或脱靶效应。
可以选择该候选寡核苷酸以使得该候选寡核苷酸具有与具有相等长度的每个核苷酸序列具有小于阈值水平的序列一致性的序列，每个核苷酸序列定位至涵盖或接近脱靶基因的基因组位置。例如，候选寡核苷酸可以被设计来确保其不具有定位至涵盖或接近除该靶基因之外的所有已知基因(例如，所有已知蛋白编码基因)的基因组位置的序列。在类似的实施例中，候选寡核苷酸可以被设计来确保其不具有定位至任何其他已知的PRC2相关区(例如，如序列A1至A193,049、B1至B916,209以及B916,626至B934,931中给出的核苷酸序列)、尤其是与任何其他已知基因(例如，任何其他已知的蛋白编码基因)功能相关的PRC2相关区的序列。在任一种情况下，期望该候选寡核苷酸具有脱靶效应的可能性降低。阈值水平的序列一致性可以为50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％的序列一致性。
可以选择该候选寡核苷酸以使得该候选寡核苷酸具有与编码RNA的PRC2相关区互补的序列，该RNA形成包含至少两个单链环的二级结构。已发现，在一些实施例中，与编码形成包含一个或多个单链环(例如，至少两个单链环)的二级结构的RNA的PRC2相关区互补的寡核苷酸具有活性的可能性大于随机选择的寡核苷酸。在一些情况下，该二级结构可以包含该至少两个单链环之间的双链茎。因此，选择方法可以包括选择寡核苷酸的序列，以使得该寡核苷酸与该PRC2相关区之间的互补区位于编码至少一个环的至少一部分的该PRC2相关区的位置。在一些情况下，选择方法可以包括选择寡核苷酸的序列，以使得该寡核苷酸与该PRC2相关区之间的互补区位于编码至少两个环的至少一部分的该PRC2相关区的位置。在一些情况下，选择方法可以包括选择寡核苷酸的序列，以使得该寡核苷酸与该PRC2相关区之间的互补区位于编码该双链茎的至少一部分的该PRC2相关区的位置。在一些实施例中，(例如，lncRNA的)PRC2相关区被鉴别(例如，使用RIP-Seq方法或来自其的信息)。在一些实施例中，含有该PRC2相关区的预测的二级结构RNA(例如，lncRNA)使用RNA二级结构预测算法例如RNAfold、mfold来确定。在一些实施例中，寡核苷酸被设计来靶向形成包含一个或多个单链环(例如，至少两个单链环)结构的二级结构的RNA的区域，该二级结构可以包含该至少两个单链环之间的双链茎。
可以选择该候选寡核苷酸，以使得该候选寡核苷酸具有G-C含量大于30％，G-C含量大于40％，G-C含量大于50％，G-C含量大于60％，G-C含量大于70％或G-C含量大于80％的序列。在其中寡核苷酸的长度为8至10个核苷酸的一些实施例中，该PRC2相关区的互补序列中除1、2、3、4或5个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶或鸟苷核苷酸。
候选寡核苷酸选择方法还可以包括确定该候选寡核苷酸与不同物种(例如，小鼠、大鼠、兔、山羊、猴子等)的染色体在涵盖或接近该靶基因的同源物的位置处互补。这实现了能够在多种物种(例如，人和小鼠)中体内或体外测试寡核苷酸的设计。这种方法还有助于通过选择疾病存在的适当的动物的物种来开发用于治疗人疾病的临床候选物。可以在动物模型中容易地测试该候选寡核苷酸。
在单链寡核苷酸的设计和/或合成包括与通过这类序列信息描述的核酸或PRC2相关区互补的序列的设计和/或合成时，技术人员能够容易地例如通过对形成本领域中公知的常识的部分的沃森-克里克碱基配对规则的理解来确定互补序列。
在一些实施例中，单链寡核苷酸的设计和/或合成包括通过本领域技术人员已知的技术来从起始材料制备寡核苷酸，其中该合成可以是基于PRC2相关区的序列或其一部分。
单链寡核苷酸的设计和/或合成的方法包括以下一个或多个步骤：
鉴别和/或选择PRC2相关区；
设计具有希望程度的与PRC2相关区或其一部分的序列一致性或互补性的核酸序列；
将单链寡核苷酸合成为所希望的序列；
纯化该合成的单链寡核苷酸；并且
任选地将该合成的单链寡核苷酸与至少一种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂混合以形成药物组合物或药剂。
如此设计和/合成的单链寡核苷酸可以在如在此所描述调节基因表达的方法中使用。
优选地，本发明的单链寡核苷酸为化学合成的。用于实践本发明的寡核苷酸可以通过众所周知的化学合成技术来体外合成。
本发明的寡核苷酸可以例如通过结合修饰例如核苷酸修饰来稳定化而免于溶核降解。例如，本发明的核酸序列包括核苷酸序列的5′或3′端处的硫代磷酸酯的至少第一、第二或第三核苷酸间键。作为另一个实例，该核酸序列可以包括2′-修饰的核苷酸，例如，2′-脱氧、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基(2′-O-MOE)、2′-O-氨基丙基(2′-O-AP)、2′-O-二甲基氨基乙基(2′-O-DMAOE)、2′-O-二甲基氨基丙基(2′-O-DMAP)、2′-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2′-O-DMAEOE)或2′-O--N-甲基乙酰氨基(2′-O-NMA)。作为另一个实例，该核酸序列可以包括至少一个2′-O-甲基-修饰的核苷酸，并且在一些实施例中，所有核苷酸包括2′-O-甲基的修饰。在一些实施例中，核酸为“锁定的”，即，包含其中核糖环通过连接2’-O原子和4’-C原子的亚甲基桥“锁定的”核酸类似物。
应理解，在此描述的单链寡核苷酸的任何修饰的化学性质或形式可以彼此组合，并且一个、两个、三个、四个、五个或更多个不同类型的修饰可以被包括在同一分子中。
在一些实施例中，该方法可以进一步包括以下步骤：扩增该合成的单链寡核苷酸，和/或纯化单链寡核苷酸(或扩增的单链寡核苷酸)和/或对如此获得的单链寡核苷酸测序。
因此，制备一种单链寡核苷酸的方法可以为用于制备治疗疾病中使用的药物组合物或药剂的方法，任选地，其中该治疗包括调节与PRC2相关区相关联的基因的表达。
在上文所述方法中，PRC2相关区可以是或已通过包括鉴别结合至PRC2的RNA的方法鉴别或获得。
这类方法可以包括以下步骤：提供含有核糖核酸的样品，将该样品与特异性结合至PRC2或其亚单位的试剂接触，允许在该试剂与该样品中的蛋白之间形成复合物，分配这些复合物，合成与这些复合物中存在的核酸互补的核酸。
在该单链寡核苷酸是基于PRC2相关区，或这种序列的一部分时，该单链寡核苷酸可能是基于与那个序列有关的信息，例如，书面形式或电子形式可获得的序列信息，这些信息可以包括公开可获得的科学出版物或序列数据库中含有的序列信息。
单链寡核苷酸
在本发明的一个方面，提供用于调节细胞内靶基因的表达的、与PRC2相关区互补的单链寡核苷酸。在一些实施例中，上调或提高靶基因的表达。在一些实施例中，与这些PRC2相关区互补的单链寡核苷酸抑制PRC2与长的RNA转录物的相互作用，从而导致组蛋白H3的减少的甲基化以及减少的基因失活，这样使得基因表达被上调或提高。在一些实施例中，这种相互作用可能因防止或减少结合至PRC2的长的RNA的结构的变化而被破坏或抑制。可以使用在此披露用于选择用于激活靶基因的表达的候选寡核苷酸的任何方法来选择寡核苷酸。
在一些实施例中，该互补区与PRC2相关区的至少8至15、8至30、8至40、或10至50、或5至50、或5至40个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续核苷酸互补。在一些实施例中，该互补区与PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补。在一些实施例中，该单链寡核苷酸的序列是基于结合至PRC2的RNA序列，或其一部分，所述部分具有从5至40个连续碱基对，或约8至40个碱基，或约5至15，或约5至30，或约5至40个碱基，或约5至50个碱基的长度。
在此披露的任何寡核苷酸可以通过可裂解接头来连接至在此披露的一个或多个其他寡核苷酸。
如本领域中所使用的术语互补是指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果寡核苷酸的某一位置处的核苷酸能够与PRC2相关区的相同位置处的核苷酸氢键合，那么该单链核苷酸和PRC2相关区被认为彼此在那个位置处互补。该单链核苷酸和PRC2相关区在每个分子中足量的相应位置被可以通过它们的碱基彼此氢键合的核苷酸占据时彼此互补。因此，“互补”为以下这样的术语：用于指示足够程度的互补性或精确配对，以使得在该单链核苷酸与PRC2相关区之间发生稳定且特异性的结合。例如，如果单链核苷酸的一个位置处的碱基能够与PRC2相关区的相应位置处的碱基氢键合，那么这些碱基被认为彼此在那个位置处互补。100％互补性是不需要的。
该单链寡核苷酸可以与PRC2相关区的连续核苷酸至少80％(任选地，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％互补中的一个)互补。在一些实施例中，与PRC2相关区的连续核苷酸的部分相比较，该单链寡核苷酸可以含有1、2或3个碱基错配。在一些实施例中，该单链寡核苷酸在15个碱基时可以具有至多3个错配，或在10个碱基时具有至多2个错配。
本领域中应理解，互补核苷酸序列不必与其可特异性杂交的靶标的核苷酸100％互补。在一些实施例中，出于本披露的目的，互补核酸序列在该序列与靶分子(例如，lncRNA)的结合干扰靶标(例如，lncRNA)的正常功能以致损失活性(例如，抑制PRC2相关阻抑作用，从而导致基因表达上调)时是可特异性杂交的，并且在以下条件下存在足够程度的互补性来避免该序列与非靶序列的非特异性结合：其中非特异性结合的避免是希望的，例如，在体内测定或治疗性治疗情况下以及体外测定情况下的生理条件下，在测定在适合的严格条件下进行时的条件下。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸的长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。在实施例中，该寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。
在一些实施例中，该PRC2相关区出现在与基因序列(有义)相同的DNA链上。在一些实施例中，该PRC2相关区出现在与基因序列(反义)相反的DNA链上。与PRC2相关区互补的寡核苷酸可以结合有义或反义序列。碱基配对可以包括标准的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对和非沃森-克里克碱基配对(例如，摇摆碱基配对(Wobble basepairing)和胡斯坦碱基配对(Hoogsteen base pairing))两者。应理解，对于互补碱基配对，腺苷型碱基(A)与胸苷型碱基(T)或尿嘧啶型碱基(U)互补，胞嘧啶型碱基(C)与鸟苷型碱基(G)互补，并且通用碱基如3-硝基吡咯或5-硝基吲哚可以杂交至任何A、C、U或T并且被认为与它们互补。肌苷(I)在本领域中也被认为是一种通用碱基并且被认为与任何A、C、U或T互补。
在一些实施例中，在此提供的序列、包括序列表中提供的序列中的任何一个或多个胸苷(T)核苷酸(或其修饰的核苷酸)或尿苷(U)核苷酸(或其修饰的核苷酸)可以用适于与腺苷核苷酸碱基配对(例如，经由沃森-克里克碱基配对)的任何其他核苷酸来置换。在一些实施例中，在此提供的序列、包括序列表中提供的序列中的任何一个或多个胸苷(T)核苷酸(或其修饰的核苷酸)或尿苷(U)核苷酸(或其修饰的核苷酸)可以用不同的嘧啶核苷酸来适当地置换或反之亦然。在一些实施例中，在此提供的序列、包括序列表中提供的序列中的任何一个或多个胸苷(T)核苷酸(或其修饰的核苷酸)可以用尿苷(U)核苷酸(或其修饰的核苷酸)来适当地置换或反之亦然。肌苷(I)在本领域中也被认为是一种通用碱基并且被认为与任何A、C、U或T互补。
肌苷(I)在本领域中也被认为是通用碱基并且被认为与任何A、C、U或T互补。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸的GC含量可以在约30％至60％之间。三个或更多个G或C的连续延伸段在一些实施例中可能不是优选的。因此，在一些实施例中，该寡核苷酸不包含三个或更多个鸟苷核苷酸的伸展段。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸特异性结合至在基因组(例如，人基因组)中编码作为单一的连续转录物(例如，非剪接RNA)的RNA或与其互补。在一些实施例中，该单链寡核苷酸特异性结合至在基因组(例如，人基因组)中编码的RNA或与其互补，其中基因组中该RNA的编码区的5’端与该RNA的编码区的3’端之间的距离小于1kb，小于2kb，小于3kb，小于4kb，小于5kb，小于7kb，小于8kb，小于9kb，小于10kb或小于20kb。
应理解，可以排除在此提供的任何寡核苷酸。在一些实施例中，单链寡核苷酸不与SEQ ID NO：1213至1226中的任何一个或多个互补。
核苷酸类似物
在一些实施例中，该寡核苷酸可以包含至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸和/或至少一个桥连核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸可以包含桥连核苷酸如LNA核苷酸、cEt核苷酸或ENA核苷酸类似物。这类核苷酸的实例在此被披露并且在本领域中是已知的。在一些实施例中，该寡核苷酸包含以下美国专利或专利申请公开中的一个中披露的核苷酸类似物：US 7,399,845、US 7,741,457、US 8,022,193、US 7,569,686、US 7,335,765、US 7,314,923、US 7,335,765以及US 7,816,333、US20110009471，每个专利申请的全部内容出于所有目的通过引用结合在此。该寡核苷酸可以具有一个或多个2’O-甲基核苷酸。该寡核苷酸可以完全由2’O-甲基核苷酸组成。
该单链寡核苷酸经常具有一个或多个核苷酸类似物。例如，与不具有至少一个核苷酸类似物的寡核苷酸相比较，该单链寡核苷酸可以具有导致该寡核苷酸的Tm在1℃、2℃、3℃、4℃或5℃范围内的升高的至少一种核苷酸类似物。与不具有核苷酸类似物的寡核苷酸相比较，该单链寡核苷酸可以具有导致该寡核苷酸的Tm在2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或更大的范围内的总升高的多个核苷酸类似物。
该寡核苷酸可以具有的长度为多达50个核苷酸，其中该寡核苷酸的2至10、2至15、2至16、2至17、2至18、2至19、2至20、2至25、2至30、2至40、2至45个或更多个核苷酸为核苷酸类似物。该寡核苷酸可以具有的长度为8至30个核苷酸，其中该寡核苷酸的2至10、2至15、2至16、2至17、2至18、2至19、2至20、2至25、2至30个核苷酸为核苷酸类似物。
该寡核苷酸可以具有的长度为8至15个核苷酸，其中该寡核苷酸的2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9、2至10、2至11、2至12、2至13、2至14个核苷酸为核苷酸类似物。任选地，这些寡核苷酸可以具有每个核苷酸，除了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰的核苷酸。
该寡核苷酸可以完全由桥连核苷酸(例如，LNA核苷酸、cEt核苷酸、ENA核苷酸)组成。该寡核苷酸可以包含交替的脱氧核糖核苷酸与2’-氟-脱氧核糖核苷酸。该寡核苷酸可以包含交替的脱氧核糖核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。该寡核苷酸可以包含交替的脱氧核糖核苷酸与ENA核苷酸类似物。该寡核苷酸可以包含交替的脱氧核糖核苷酸与LNA核苷酸。该寡核苷酸可以包含交替的LNA核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。该寡核苷酸可以具有为桥连核苷酸(例如，LNA核苷酸，cEt核苷酸，ENA核苷酸)的5’核苷酸。该寡核苷酸可以具有为脱氧核糖核苷酸的5’核苷酸。
该寡核苷酸可以包含通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的至少一个桥连核苷酸(例如，LNA核苷酸、cEt核苷酸、ENA核苷酸)侧接的脱氧核糖核苷酸。该寡核苷酸可以包含通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的1、2、3、4、5、6、7、8或更多个桥连核苷酸(例如，LNA核苷酸、cEt核苷酸、ENA核苷酸)侧接的脱氧核糖核苷酸。该寡核苷酸的3’位置可以具有3’羟基。该寡核苷酸的3’位置可以具有3’硫代磷酸酯。
该寡核苷酸可以用标签缀合。例如，该寡核苷酸可以用生物素部分、胆固醇、维生素A、叶酸、σ受体配体、适体、肽、如CPP、疏水性分子如脂质、ASGPR或动态多聚缀合物以及其变体在5’或3’端处的缀合。
优选地，该单链寡核苷酸包含一个或多个修饰，其包含：修饰的糖部分、和/或修饰的核苷间键、和/或修饰的核苷酸和/或其组合。给定寡核苷酸的所有位置不必是均匀修饰的，并且事实上在此描述的一个以上修饰可以结合在单个寡核苷酸中或甚至是寡核苷酸的单个核苷内。
在一些实施例中，这些单链寡核苷酸为含有各自由至少一个核苷酸构成的两个或更多个化学相异区域的嵌合寡核苷酸。这些寡核苷酸典型地含有具有修饰的核苷酸的至少一个区域，这些修饰的核苷酸赋予一个或多个有益特性(例如像，提高的核酸酶抗性、提高的细胞吸收、对靶标的提高的结合亲和力)；以及为能够裂解RNA：DNA或RNA：RNA杂合体的酶的底物的区域。本发明的嵌合的单链寡核苷酸可以形成为具有两个或更多个寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或如上所述的寡核苷酸模拟物的复合结构。这类化合物在本领域中还被称为杂合体或缺口体(gapmer)。传授这类杂合结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,013,830；5,149,797；5,220,007；5,256,775；5,366,878；5,403,711；5,491,133；5,565,350；5,623,065；5,652,355；5,652,356以及5,700,922，每个专利通过引用结合在此。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸包含糖的2′位置处修饰的至少一个核苷酸，例如，2′-O-烷基、2′-O-烷基-O-烷基或2′-氟修饰的核苷酸。在其他实施例中，RNA修饰包括嘧啶的核糖、RNA的3′端处的无碱基残基或倒置碱基上的2′-氟、2′-氨基以及2′O-甲基修饰。这类修饰按照常规结合到寡核苷酸中并且这些寡核苷酸已显示针对给定靶标具有比2′-脱氧寡核苷酸更高的Tm(即，更高的靶标结合亲和力)。
多个核苷酸和核苷修饰已显示使得结合它们的寡核苷酸对核酸酶消化比天然寡聚脱氧核苷酸具有更大的抗性；这些修饰的寡核苷酸比未修饰的寡核苷酸完整存留更长的时间。修饰的寡核苷酸的具体的实例包括以下那些，它们包含修饰的主链，例如，硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键。实例为具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的那些，尤其是CH2-NH-O-CH2、CH，～N(CH3)～O～CH2(已知为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链，CH2--O--N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2以及O-N(CH3)-CH2-CH2主链，其中天然的磷酸二酯主链表示为O-P--O-CH)；酰胺主链(参见De Mesmaeker等人，化学研究述评(Ace.Chem.Res.)1995，28：366-374)；吗啉代基主链结构(参见萨默顿(Summerton)和韦勒(Weller)，美国专利号5,034,506)；肽核酸(PNA)主链(其中寡核苷酸的磷酸二酯主链由聚酰胺主链置换，核苷酸直接或间接地结合至该聚酰胺主链的氮杂氮原子，参见尼尔森(Nielsen)等人，科学(Science)1991，254，1497)。含磷的键包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基以及其他烷基膦酸酯(包含3′-亚烷基膦酸酯以及手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包含3′-氨基氨基磷酸酯以及氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯，以及具有正常3′-5′键的硼烷磷酸酯、这些硼烷磷酸酯的2′-5′连接类似物，以及其中相邻对的核苷单位以3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′来连接的、具有反向极性的那些，参见美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361以及5,625,050。
基于吗啉代基的低聚化合物在达万·A·布万其(Dwaine A.Braasch)和大卫·R·科里(David R.Corey)，生物化学(Biochemistry)，2002，41(14)，4503-4510)；发生学(Genesis)，第30卷，第3期，2001；希斯曼(Heasman)，发育生物学期刊(J.、Dev.Biol.)，2002，243，209-214；纳维斯(Nasevicius)等人，自然-遗传学(Nat.Genet.)，2000，26，216-220；拉切拉(Lacerra)等人，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)，2000，97，9591-9596；以及1991年7月23日颁予的美国专利号5,034,506中进行描述。在一些实施例中，基于吗啉代基的低聚化合物为二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)(例如，如在艾弗森(Iverson)，分子治疗学新见(Curr.Opin.Mol.Ther.)，3：235-238，2001以及王(Wang)等人，基因医学杂志(J.GeneMed.)，12：354-364，2010中进行描述；这些参考文献的披露内容通过引用以其全部内容结合在此)。
王等人，美国化学学会期刊(J.Am.Chem.Soc.)，2000，122，8595-8602中描述了环己烯基核酸寡核苷酸模拟物。
其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸主链具有通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子以及烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些主链包括具有吗啉代键(部分地由核苷的糖部分形成)的那些主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜以及砜主链；甲酰乙酰基以及硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基以及硫代甲酰乙酰基主链；含有烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基以及亚甲基肼基主链；磺酸酯以及磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合N、O、S以及CH2组成部分的其他主链；参见美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439，每个专利通过引用结合在此。
还已知包括基于阿糖核苷酸(arabinonucleotide)或修饰的阿糖核苷酸残基或由它们构建的寡核苷酸的修饰的寡核苷酸。阿糖核苷为核糖核苷的立体异构体，不同之处仅在于糖环的2′位置处的构型。在一些实施例中，2′-阿糖修饰为2′-F阿糖。在一些实施例中，修饰的寡核苷酸为2’-氟-D-阿糖核酸(FANA)(如例如在洛恩(Lon)等人，生物化学，41：3457-3467，2002和Min等人，生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)，12：2651-2654，2002中所描述；这些参考文献的披露内容通过引用以其全部内容结合在此)。类似的修饰还可以在糖的其他位置处、尤其是3′末端核苷上糖的3′位置或在2′-5′连接的寡核苷酸以及5′末端核苷酸的5′位置上进行。
PCT公开号WO 99/67378披露了经由缔合至互补信使RNA而用于基因表达的提高的序列特异性抑制的阿糖核酸(ANA)低聚物以及其类似物。
其他修饰包括亚乙基桥连的核酸(ENA)(例如，国际专利公开号WO 2005/042777，森田(Morita)等人，核酸研究(Nucleic Acid Res.)，增刊1：241-242，2001；苏罗诺(Surono)等人，人类基因治疗(Hum.GeneTher.)，15：749-757，2004；小泉(Koizumi)，分子治疗学新见，8：144-149，2006以及堀江(Horie)等人，核酸研讨会丛刊(Nucleic Acids Symp.Ser)(Oxf)，49：171-172，2005；这些参考文献的披露内容通过引用以其全部内容结合在此)。优选的ENA包括但不限于2′-O，4′-C-亚乙基-桥连的核酸。
LNA的实例在WO/2008/043753中进行描述并且包括具有以下式的化合物。
其中X和Y独立地选自基团-O-、
-S-、-N(H)-、N(R)-、-CH2-或-CH-(如果是双键的一部分)，
-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-、-CH2-CH2-或-CH2-CH-(如果是双键的一部分)，
-CH＝CH-，其中R选自氢和C1-4-烷基；Z和Z＊独立地选自核苷间键、末端基团或保护基团；B构成天然或非天然的核苷酸碱基部分；并且在任一取向上都可以找到不对称的基团。
优选地，本发明的低聚物中所使用的LNA包含至少一个根据以下任一式的LNA单位
其中Y为-O-、-S-、-NH-或N(RH)；Z和Z＊独立地选自核苷间键、末端基团或保护基团；B构成天然或非天然的核苷酸碱基部分，并且RH选自氢和C1-4-烷基。
在一些实施例中，本发明的低聚化合物如反义寡核苷酸中所使用的锁定核酸(LNA)包含根据PCT/DK 2006/000512的方案2中所示的任一式的锁定核酸(LNA)单位。
在一些实施例中，本发明的低聚物中所使用的LNA包含选自-0-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-0-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-0-P(O)2-S-、-O-P(O，S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-0-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-的核苷间键，其中RH选自氢和C1-4-烷基。
方案2中示出了LNA单位的某些实例：
方案2
术语“硫代-LNA”包括锁定核苷酸，其中以上通式中X或Y中的至少一个选自S或-CH2-S-。硫代-LNA可以为β-D和α-L-构型两者。
术语“氨基-LNA”包括锁定核苷酸，其中以上通式中X或Y中的至少一个选自-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-以及-CH2-N(R)-，其中R选自氢和C1-4-烷基。氨基-LNA可以为β-D和α-L-构型两者。
术语“氧基-LNA”包括锁定核苷酸，其中以上通式中X或Y中的至少一个表示-O-或-CH2-O-。氧基-LNA可以为β-D和α-L-构型两者。
术语“ena-LNA”包括锁定核苷酸，其中以上通式中的Y为-CH2-O-(其中-CH2-O-的氧原子相对于碱基B附接至2′位置)。
在此描述了LNA的另外的细节。
还可以包括一个或多个取代的糖部分，例如，在2′位置上的以下各项中的一个：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3O(CH2)nCH3、O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n为从1至约10；C1至C10低级烷基、烷氧基烷氧基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2 CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；多烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA裂解基团；报告子基团；***子；用于提高寡核苷酸的药物代谢动力学特性的基团；或用于提高寡核苷酸的药效学特性的基团以及具有类似特性的其他取代基。示例修饰包括2′-甲氧基乙氧基[2′-O-CH2CH2OCH3，又称为2′-O-(2-甲氧基乙基)](马丁(Martin)等人，瑞士化学学报(HeIv.Chim.Acta)，1995，78，486)。其他修饰包括2′-甲氧基(2′-O-CH3)、2′-丙氧基(2′-OCH2CH2CH3)以及2′-氟代(2′-F)。类似的修饰还可以在该寡核苷酸的其他位置处，尤其是3′末端核苷酸上糖的3′位置以及5′末端核苷酸的5′位置上进行。寡核苷酸还可以具有糖模拟物如环丁基来代替戊呋喃糖基。
单链寡核苷酸还可以另外或可替代地包括核碱基(本领域中经常简单地称为“碱基”)修饰或取代。如在此所使用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括在天然核酸中仅偶尔或短暂地发现的核碱基，例如，次黄嘌呤，6-甲基腺嘌呤，5-Me嘧啶，尤其是5-甲基胞嘧啶(又称为5-甲基-2′脱氧胞嘧啶并且在本领域中经常称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC以及龙胆二糖基(gentobiosyl)HMC、异胞嘧啶、假异胞嘧啶以及合成核碱基，例如，2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氯-6-氨基嘌呤以及2，6-二氨基嘌呤或其他二氨基嘌呤。参见，例如，科恩伯格(Kornberg)，“DNA复制(DNA Replication)”，W.H.弗里曼出版社(W.H.Freeman&Co.)，旧金山(San Francisco)，1980，第75至77页；以及格贝耶胡·冈加(Gebeyehu、G.)等人，核酸研究，15：4513(1987))。还可以包括本领域中已知的“通用”碱基例如肌苷。已显示5-Me-C取代可将核酸双链体稳定性提高0.6℃至1.2℃(赛格维(Sanghvi)在克鲁克(Crooke)和勒布勒(Lebleu)编著的“反义研究与应用(Antisense Research and Applications)”，CRC出版社(CRC Press)，博卡拉顿(Boca Raton)，1993，第276至278页)并且为示例碱基取代。
给定寡核苷酸的所有位置不必是均匀修饰的，并且事实上在此描述的一个以上修饰可以结合在单个寡核苷酸中或甚至是寡核苷酸的单个核苷内。
在一些实施例中，核苷酸单位的糖和核苷间键(即，主链)都被新基团置换。保持碱基单位以便与适当的核酸靶化合物杂交。已显示具有优异的杂交特性的寡核苷酸模拟物的这样一种低聚化合物称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖主链被含酰胺的主链例如氨基乙基甘氨酸主链置换。核碱基被保持并且直接或间接地结合至主链的酰胺部分的氮杂氮原子。传授PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331以及5,719,262，每个专利通过引用结合在此。PNA化合物的另外的传授可以参见尼尔森等人，科学，1991，254，1497-1500。
单链寡核苷酸还可以包括一个或多个核碱基(本领域中经常简单地称为“碱基”)修饰或取代。如在此所使用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包含嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成以及天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶以及2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶以及胞嘧啶，6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4硫尿嘧啶，8-卤基、8-氨基、8-氢硫基、8-硫烷基、8-羟基以及其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤基尤其5-溴、5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤、以及3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱杂氮腺嘌呤。
另外，核碱基包含在美国专利号3,687,808中披露的那些核碱基、在“聚合物科学与工程简明百科全书(The Concise Encyclopedia OfPolymer Science and Engineering)”，第858至859页，克洛舍维奇(Kroschwitz)编著，约翰威利出版公司(John Wiley&Sons)，1990年中披露的那些核碱基、在英利奇(Englisch)等人，应用化学(AngewandteChemie)，国际版，1991，30，第613页中披露的那些核碱基、以及在赛格维、第15章，反义研究与应用，第289至302页，克鲁克和勒布勒编著，CRC出版社，1993中披露的那些核碱基。这些核碱基中的某一些尤其适用于提高本发明的低聚化合物的结合亲和力。这些核碱基包括5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6以及O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代可将核酸双链体稳定性提高0.6℃至1.2℃(赛格维等人编著，“反义研究与应用”，CRC出版社，博卡拉顿，1993，第276至278页)并且为示例碱基取代，在与2′-O-甲氧基乙基糖修饰相结合时甚至更特别如此。修饰的核碱基在美国专利号3,687,808以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,750,692以及5,681,941中进行描述，每个专利通过引用结合在此。
在一些实施例中，单链寡核苷酸化学连接至增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞吸收的一种或多种部分或缀合物。例如，类型相同或不同的一种或多种单链寡核苷酸可以彼此缀合；或单链寡核苷酸可以缀合至对细胞类型或组织类型具有增强的特异性的靶向部分。这类部分包括但不限于脂质部分如胆固醇部分(勒辛格(Letsinger)等人，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，1989，86，6553-6556)；胆酸(马诺哈兰(Manoharan)等人，生物有机化学与医药化学通讯，1994，4，1053-1060)；硫醚，例如，己基-S-三苯甲基硫醇(马诺哈兰等人，纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.)，1992，660，306-309；马诺哈兰等人，生物有机化学与医药化学通讯，1993，3，2765-2770)；硫代胆固醇(奥伯豪泽尔(Oberhauser)等人，核酸研究，1992，20，533-538)；脂族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(卡巴诺夫(Kabanov)等人，欧洲生物化学学会联盟简讯，1990，259，327-330；斯伍那区克(Svinarchuk)等人，法国生物化学杂志(Biochimie)，1993，75，49-54)；磷脂，例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-邻-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯(马诺哈兰等人，四面体快报(Tetrahedron Lett.)，1995，36，3651-3654；谢伊(Shea)等人，核酸研究，1990，18，3777-3783)；聚胺或聚乙二醇链(马诺哈兰等人，核苷与核苷酸(Nucleosides&Nucleotides)，1995，14，969-973)或金刚烷乙酸(马诺哈兰等人，四面体快报，1995，36，3651-3654)；棕榈基部分(米谢拉(Mishra)等人，生物化学与生物物理学学报，1995，1264，229-237)或十八烷基胺或己基氨基-羰基-t羟胆固醇部分(克鲁克等人，药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)，1996，277，923-937)。还参见美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928以及5,688,941，每个专利通过引用结合在此。
这些部分或缀合物可以包括共价结合至官能团如伯或仲羟基的缀合基团。本发明的缀合基团包括***子、报告子分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强低聚物的药效学特性的基团以及增强低聚物的药物代谢动力学特性的基团。典型的缀合基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素以及染料。在本发明的背景中增强药效学特性的基团包括提高吸收、增强对降解的抗性和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明的背景中增强药物代谢动力学特性的基团包括提高对本发明的化合物的吸收、分布、代谢或分泌的基团。代表性缀合基团在1992年10月23日提交的国际专利申请号PCT/US 92/09196以及美国专利号6,287,860中披露，这些专利通过引用结合在此。缀合部分包括但不限于脂质部分(如胆固醇部分)、胆酸、硫醚(例如，己基-5-三苯甲基硫醇)、硫代胆固醇、脂族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如，二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-邻-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯)、聚胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸、棕榈基部分，或十八烷基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。参见，例如，美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928以及5,688,941。
在一些实施例中，单链寡核苷酸修饰包括该寡核苷酸的5’或3’端的修饰。在一些实施例中，该寡核苷酸的3’端包含羟基或硫代磷酸酯。应认识到，另外的分子(例如，生物素部分或荧光体)可以缀合至该单链寡核苷酸的5’或3’端。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包含缀合至5’核苷酸的生物素部分。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸包含锁定核酸(LNA)、ENA修饰的核苷酸、2’-O-甲基核苷酸或2’-氟-脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸与2’-氟-脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸与ENA修饰的核苷酸。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸与锁定核酸核苷酸。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包含交替的锁定核酸核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。
在一些实施例中，该寡核苷酸的5’核苷酸为脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸的5’核苷酸为锁定核酸核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸的核苷酸包含通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的至少一个锁定核酸核苷酸侧接的脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中，该寡核苷酸的3’位置处的核苷酸具有3’羟基或3’硫代磷酸酯。
在一些实施例中，该单链寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包含至少两个核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包含所有核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。
应认识到，该单链寡核苷酸可以具有如在此所描述的修饰的任何组合。
该寡核苷酸可以包含具有以下修饰模式中的一种或多种的核苷酸序列。
(a)(X)Xxxxxx、(X)xXxxxx、(X)xxXxxx、(X)xxxXxx、(X)xxxxXx以及(X)xxxxxX，
(b)(X)XXxxxx、(X)XxXxxx、(X)XxxXxx、(X)XxxxXx、(X)XxxxxX、(X)xXXxxx、(X)xXxXxx、(X)xXxxXx、(X)xXxxxX、(X)xxXXxx、(X)xxXxXx、(X)xxXxxX、(X)xxxXXx、(X)xxxXxX以及(X)xxxxXX，
(c)(X)XXXxxx、(X)xXXXxx、(X)xxXXXx、(X)xxxXXX、(X)XXxXxx、(X)XXxxXx、(X)XXxxxX、(X)xXXxXx、(X)xXXxxX、(X)xxXXxX、(X)XxXXxx、(X)XxxXXx、(X)XxxxXX、(X)xXxXXx、(X)xXxxXX、(X)xxXxXX、(X)xXxXxX以及(X)XxXxXx，
(d)(X)xxXXX、(X)xXxXXX、(X)xXXxXX、(X)xXXXxX、(X)xXXXXx、(X)XxxXXXX、(X)XxXxXX、(X)XxXXxX、(X)XxXXx、(X)XXxxXX、(X)XXxXxX、(X)XXxXXx、(X)XXXxxX、(X)XXXxXx以及(X)XXXXxx，
(e)(X)xXXXXX、(X)XxXXXX、(X)XXxXXX、(X)XXXxXX、(X)XXXXxX以及(X)XXXXXx，以及
(f)XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX以及XXXXXXx，其中“X”表示核苷酸类似物，(X)表示任选的核苷酸类似物，并且“x”表示DNA或RNA核苷酸单位。以上所列模式各自可以单独或结合任何其他披露的修饰模式在寡核苷酸内出现一次或多次。
寡核苷酸的另外的特征
在此提供的证据为这类寡核苷酸将与基因对应的mRNA的表达提高至少约50％(即，正常值的150％或1.5倍)或约2倍至约5倍。在一些实施例中，涵盖的是，表达可以提高至少约15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或100倍，或任何前述数字之间的任何范围。在其他实验中，提高的mRNA表达已显示与提高的蛋白表达相关。
表2中概括的序列标识符是指与国际专利申请公开WO/2012/087983中披露的PRC2缔合(结合)的RNA(即，将针对寡核苷酸的RNA)的序列。因此，每个序列包含PRC2相关区。(a)表中描述的参考基因、(b)靶向这些基因(调节其表达)的PRC2结合转录物或峰(即，结合至PRC2的RNA的较小区域)以及(c)特异性结合至PRC2结合转录物或峰或与其互补的寡核苷酸各自可以方便地分组为这些类别中的任何类别，这些类别由国际专利申请公开WO/2012/087983的表3中的编号表示或由国际专利申请公开WO/2012/065143的表9中的编号表示，表示如下：疾病由类别编号11、14、15、17、21、24、26、42、44、49、58、69、82、103、119、120、126、143、163、167、172、177、182、183、184、187、191、196、200、203、204、219、220、221、227、234、239、240、244、249、300至323中的任一个或400至643中的任一个来标记。
其他官能团由类别编号10、12、13、16、18、19、20、22、23、25、27、28、29、30、31、32、33、34、36、37、38、39、40、41、43、45、46、47、48、50、51、52、54、55、56、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、100、101、102、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、121、122、123、124、125、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、158、160、161、162、164、165、166、168、169、170、171、173、174、175、176、178、179、180、181、185、186、188、189、190、192、193、194、195、197、198、199、201、202、205、206、207、208、209、210、211、213、215、216、217、218、222、223、224、226、228、229、230、231、232、233、235、236、237、238、241、242、243、245、246、247、248、250、251、252或253来标记。
类别
编号 名称
10 肌动蛋白细胞骨架组织
11 急性髓细胞白血病
12 粘附连接
13 脂肪细胞因子信号转导路径
14 衰老
15 阿尔茨海默氏病
16 氨基糖和核苷酸糖代谢
17 肌萎缩性侧索硬化(ALS)
18 血管生成
19 细胞凋亡
20 精氨酸和脯氨酸代谢
21 致心律失常性右心室发育不良(ARVC)
22 轴突导向
23 B细胞受体信号转导路径
24 基底细胞癌，也在类别644中
25 基本转录因子
26 膀胱癌，也在类别644中
27 血凝
28 血管发育
29 骨发育
30 钙信号转导路径
31 心肌收缩
32 阳离子通道活性
33 细胞粘附
34 细胞周期
35 细胞周期
36 细胞运动
37 细胞表面受体连接信号转导
38 细胞应激反应
39 通道活性
40 趋化因子信号转导路径
41 胆固醇代谢过程
42 慢性髓细胞白血病
43 柠檬酸循环(TCA循环)
44 结肠直肠癌
45 补体和凝血级联
46 细胞因子活性
47 细胞骨架蛋白结合
48 胞质溶胶
49 扩张性心肌病
50 DNA结合
51 DNA修复
52 DNA复制
53 DNA复制
54 药物代谢
55 胚胎形态发生
56 内吞作用
57 内吞作用
58 子宫内膜癌
59 内质网
60 ErbB信号转导路径
61 胞外区
62 眼发育
63 脂肪酸代谢
64 果糖和甘露糖代谢
65 G-蛋白偶联受体蛋白信号转导路径
66 配子体世代
67 间隙连接
68 miRNA型基因沉默
69 胶质瘤
70 葡萄糖代谢过程
71 糖酵解/糖异生
72 高尔基氏体
73 生长因子活性
74 GTP酶调控因子活性
75 心脏发育
76 刺猬信号转导路径
77 造血细胞谱系
78 造血细胞生成
79 造血器官或淋巴器官发育
80 组蛋白修饰
81 亨廷顿舞蹈病
82 肥厚性心肌病(HCM)
83 免疫反应
84 免疫***发育
85 炎症反应
86 胰岛素信号转导路径
87 胞内信号转导级联
88 离子通道活性
89 离子转运
90 Jak-STAT信号转导路径
91 学习或记忆
92 白细胞激活
93 白细胞跨内皮迁移
94 肢发育
95 运动行为
96 长期增强作用
97 肺发育
98 溶酶体
99 溶酶体
100 MAPK信号转导路径
101 MAPKKK级联
102 黑素生成
103 黑素瘤
104 错配修复
105 线粒体
106 线粒体组织
107 mTOR信号转导路径
108 肌肉组织发育
109 ncRNA代谢过程
110 神经元发育
111 神经营养蛋白信号转导路径
112 非小细胞肺癌，也在类别644中
113 Notch信号转导路径
114 核仁
115 ***减数***
116 氧化还原作用
117 氧化磷酸化
118 p53信号转导路径
119 胰腺癌，也在类别644中
120 帕金森氏病
121 癌症内路径，也在类别644中
122 磷酸酶活性
123 磷蛋白磷酸酶活性
124 细胞生物合成过程的正调控
125 PPAR信号转导路径
126 ***癌，也在类别644中
127 蛋白酶体
128 蛋白氨基酸去磷酸化
129 蛋白折叠
130 蛋白激酶活性
131 蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性
132 嘌呤代谢
133 嘧啶代谢
134 Ras蛋白信号转导
135 肌动蛋白细胞骨架的调控
136 自体吞噬的调控
137 细胞死亡的调控，也在类别644中
138 细胞增殖的调控，也在类别644中
139 细胞大小的调控
140 蛋白泛素化的调控
141 Ras蛋白信号转导的调控
142 转录的调控
143 肾细胞癌，也在类别644中
144 缺氧反应
145 类固醇激素刺激反应
146 病毒反应
147 核糖体
148 RNA降解
149 RNA加工
150 经由酯交换反应进行的RNA剪接
151 分泌
152 骨骼***发育
153 骨骼***形态发生
154 小细胞肺癌，也在类别644中
155 小GTP酶调控因子活性
156 ***发生
157 鞘脂代谢
158 剪接体
159 剪接体
160 肝细胞分化
161 类固醇生物合成
162 突触
163 ***性红斑狼疮
164 T细胞激活
165 T细胞受体信号转导路径
166 TGF-β信号转导路径
167 甲状腺癌，也在类别644中
168 Toll样受体信号转导路径
169 转录激活因子活性
170 转录因子活性
171 翻译
172 II型糖尿病
173 泛素介导的蛋白水解
174 血管平滑肌收缩
175 脉管***发育
176 VEGF信号转导路径
177 病毒性心肌炎
178 Wnt信号转导路径
179 氨基酸生物合成
180 锚蛋白重复序列
181 溴结构域
182 心肌病
183 白内障
184 夏柯-马利-托斯氏病
185 细胞因子
186 细胞因子受体
187 耳聋
188 疾病突变
189 egf样结构域
190 内体
191 癫痫
192 糖蛋白
193 生长因子
194 生长因子结合
195 生长因子受体
196 鱼鳞癣
197 免疫球蛋白结构域
198 离子通道
199 亮氨酸重复
200 脑白质营养不良
201 甲基化作用
202 甲基转移酶
203 神经变性
204 神经病
205 细胞核
206 肥胖症
207 蛋白磷酸酶
208 蛋白磷酸酶抑制剂
209 癌基因(包括致癌基因)，也在类别644中
210 分泌
211 丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶
212 ***性红斑狼疮
213 跨膜
214 跨膜蛋白
215 肿瘤压制因子，也在类别644中
216 酪氨酸蛋白激酶
217 ubl缀合路径
218 wd重复
300 膀胱癌中下调，也在类别644中
301 白血病中下调，也在类别644中
302 脑癌中下调，也在类别644中
303 乳腺癌中下调，也在类别644中
304 子***中下调，也在类别644中
305 直肠癌中下调，也在类别644中
306 食管癌中下调，也在类别644中
307 胃癌中下调，也在类别644中
308 头颈癌中下调，也在类别644中
309 肾癌中下调，也在类别644中
310 肝癌中下调，也在类别644中
311 肺癌中下调，也在类别644中
312 淋巴瘤中下调，也在类别644中
313 黑素瘤中下调，也在类别644中
314 多发性骨髓瘤中下调，也在类别644中
315 卵巢癌中下调，也在类别644中
316 胰腺癌中下调，也在类别644中
317 ***癌中下调，也在类别644中
318 肉瘤中下调，也在类别644中
319 非黑素瘤皮肤癌中下调，也在类别644中
320 子宫癌中下调，也在类别644中
321 间皮瘤中下调，也在类别644中
322 肾上腺癌中下调，也在类别644中
323 甲状旁腺癌中下调，也在类别644中
400 肾脏透明细胞肉瘤中上调，也在类别644中
401 急性肺损伤中上调
402 急性巨核细胞白血病中上调，也在类别644中
403 急性髓细胞白血病中上调，也在类别644中
404 急性胰脏炎(未明示者)中上调
405 食管腺癌中上调，也在类别644中
406 肺部腺癌中上调，也在类别644中
407 小肠腺瘤中上调，也在类别644中
408 腺病毒感染中上调
409 伴随脑炎的AIDS中上调
410 酒精中毒中上调
411 亚历山大氏病中上调
412 α-1-抗胰蛋白酶缺乏症中上调
413 阿尔茨海默氏病中上调
414 退行性寡星状胶质瘤(Anaplastic oligoastrocytoma)中上调，也在类别644中
415 雄激素不敏感综合征中上调
416 星形细胞瘤中上调，也在类别644中
417 肌萎缩中上调
418 自身免疫性肝炎中上调
419 细菌感染中上调
420 巴雷特食管(Barrett′s esophagus)中上调
421 小肠原位癌中上调，也在类别644中
422 心肌病中上调
423 慢性肉芽肿性疾病中上调
424 慢性淋巴细胞白血病中上调
425 慢性阻塞性气道疾病中上调
426 慢性多关节幼年型类风湿性关节炎中上调
427 肝硬化中上调
428 ***依赖中上调
429 复合性龋齿中上调
430 克罗恩氏病中上调
431 代谢失调性心脏衰竭中上调
432 脱水中上调
433 扩张性心肌病中上调
434 病毒性心肌炎致扩张性心肌病中上调
435 上皮细胞增殖中上调
436 中枢神经***大肠杆菌感染中上调
437 特发性血小板增多症中上调
438 过度用力衰竭中上调
439 家族性低血磷骨病中上调
440 骨折中上调
441 股骨骨折中上调
442 一般心肌机能障碍中上调
443 成胶质细胞瘤中上调，也在类别644中
444 哈-里二氏综合征中上调
445 幽门螺旋杆菌胃肠道感染中上调
446 丙肝中上调
447 HIV感染中上调
448 亨廷顿舞蹈病中上调
449 高胆固醇血症中上调
450 过度生长中上调
451 特发性血小板减少性紫癜中上调
452 小肠结肠炎耶尔森氏菌感染中上调
453 ***缺乏致不育症中上调
454 心脏损伤中上调
455 ISM-皮肤原位黑素瘤中上调
456 伯氏黑内障中上调
457 肝肿瘤中上调，也在类别644中
458 黄斑变性中上调
459 恶性淋巴瘤中上调，也在类别644中
460 子宫颈恶性肿瘤中上调，也在类别644中
461 十二指肠恶性肿瘤中上调，也在类别644中
462 ***恶性肿瘤中上调，也在类别644中
463 胃部恶性肿瘤中上调，也在类别644中
464 睾丸恶性肿瘤中上调，也在类别644中
465 直肠恶性肿瘤中上调，也在类别644中
466 多发性良性黑素瘤痣中上调
467 糖尿病性肾病中上调
468 非胰岛素依赖性糖尿病中上调
469 营养缺乏症中上调
470 阻塞性睡眠呼吸暂停中上调
471 少突神经胶质瘤中上调，也在类别644中
472 ***状甲状腺癌中上调，也在类别644中
473 帕金森氏病中上调
474 猪肾病中上调
475 惊厥前期中上调
476 原发性心肌病中上调
477 原发性开角型青光眼中上调
478 原发性肺发育不全症中上调
479 假单胞菌感染中上调
480 肺气肿中上调
481 肺动脉高压症中上调
482 与II型糖尿病相关联的肾病中上调
483 肾损害中上调
484 色素性视网膜炎中上调
485 风湿性关节炎中上调
486 鳞状细胞癌中上调，也在类别644中
487 肺部鳞状细胞癌中上调，也在类别644中
488 癫痫持续状态中上调
489 ***性感染中上调
490 血小板减少症中上调
491 胸腺癌中上调，也在类别644中
492 移行细胞癌中上调，也在类别644中
493 原位移行细胞癌中上调，也在类别644中
494 溃疡性结肠炎中上调
495 子宫纤维瘤中上调
496 通气相关的肺部损伤中上调
497 心室肥大中上调
498 心室肥大(以及[左心室]肥大)中上调
499 维生素A缺乏症中上调
500 肾脏透明细胞肉瘤中下调，也在类别644中
501 急性肺损伤中下调
502 急性巨核细胞白血病中下调，也在类别644中
503 急性髓细胞白血病中下调，也在类别644中
504 急性胰脏炎(未明示者)中下调
505 食管腺癌中下调，也在类别644中
506 肺部腺癌中下调，也在类别644中
507 小肠腺瘤中下调，也在类别644中
508 腺病毒感染中下调
509 伴随脑炎的AIDS中下调
510 酒精中毒中下调
511 亚历山大氏病中下调
512 α-1-抗胰蛋白酶缺乏症中下调
513 阿尔茨海默氏病中下调
514 退行性寡星状胶质瘤中下调
515 雄激素不敏感综合征中下调
516 星形细胞瘤中下调，也在类别644中
517 肌萎缩中下调
518 自身免疫性肝炎中下调
519 细菌感染中下调
520 巴雷特食管中下调
521 小肠原位癌中下调，也在类别644中
522 心肌病中下调
523 慢性肉芽肿性疾病中下调
524 慢性淋巴细胞白血病中下调
525 慢性阻塞性气道疾病中下调
526 慢性多关节幼年型类风湿性关节炎中下调
527 肝硬化中下调
528 ***依赖中下调
529 复合性龋齿中下调
530 克罗恩氏病中下调
531 代谢失调性心脏衰竭中下调
532 脱水中下调
533 扩张性心肌病中下调
534 病毒性心肌炎致扩张性心肌病中下调
535 上皮细胞增殖中下调
536 中枢神经***大肠杆菌感染中下调
537 特发性血小板增多症中下调
538 过度用力衰竭中下调
539 家族性低血磷骨病中下调
540 骨折中下调
541 股骨骨折中下调
542 一般心肌机能障碍中下调
543 成胶质细胞瘤中下调，也在类别644中
544 哈-里二氏综合征中下调
545 幽门螺旋杆菌胃肠道感染中下调
546 丙肝中下调
547 HIV感染中下调
548 亨廷顿舞蹈病中下调
549 高胆固醇血症中下调
550 过度生长中下调
551 特发性血小板减少性紫癜中下调
552 小肠结肠炎耶尔森氏菌感染中下调
553 ***缺乏致不育症中下调
554 心脏损伤中下调
555 ISM-皮肤原位黑素瘤中下调，也在类别644中
556 伯氏黑内障中下调
557 肝肿瘤中下调，也在类别644中
558 黄斑变性中下调
559 恶性淋巴瘤中下调，也在类别644中
560 子宫颈恶性肿瘤中下调，也在类别644中
561 十二指肠恶性肿瘤中下调，也在类别644中
562 ***恶性肿瘤中下调，也在类别644中
563 胃部恶性肿瘤中下调，也在类别644中
564 睾丸恶性肿瘤中下调，也在类别644中
565 直肠恶性肿瘤中下调，也在类别644中
566 多发性良性黑素瘤痣中下调
567 糖尿病性肾病中下调
568 非胰岛素依赖性糖尿病中下调
569 营养缺乏症中下调
570 阻塞性睡眠呼吸暂停中下调
571 少突神经胶质瘤中下调
572 ***状甲状腺癌中下调
573 帕金森氏病中下调
574 猪肾病中下调
575 惊厥前期中下调
576 原发性心肌病中下调
577 原发性开角型青光眼中下调
578 原发性肺发育不全症中下调
579 假单胞菌感染中下调
580 肺气肿中下调
581 肺动脉高压症中下调
582 与II型糖尿病相关联的肾病中下调
583 肾损害中下调
584 色素性视网膜炎中下调
585 风湿性关节炎中下调
586 鳞状细胞癌中下调，也在类别644中
587 肺部鳞状细胞癌中下调，也在类别644中
588 癫痫持续状态中下调
589 ***性感染中下调
590 血小板减少症中下调
591 胸腺癌中下调，也在类别644中
592 移行细胞癌中下调，也在类别644中
593 原位移行细胞癌中下调，也在类别644中
594 溃疡性结肠炎中下调
595 子宫纤维瘤中下调
596 通气相关的肺部损伤中下调
597 心室肥大中下调
598 心室肥大(以及[左心室]肥大)中下调
599 维生素A缺乏症中下调
600 与骨疾病相关联
601 与癌症疾病相关联，也在类别644中
602 与心血管疾病相关联
603 与***失调疾病相关联
604 与皮肤病相关联
605 与发育疾病相关联
606 与耳鼻喉疾病相关联
607 与内分泌疾病相关联
608 与胃肠道疾病相关联
609 与血液疾病相关联
610 与免疫疾病相关联
611 与代谢疾病相关联
612 与多发性疾病相关联
613 与肌肉疾病相关联
614 与神经***疾病相关联
615 与营养性疾病相关联
616 与眼科疾病相关联
617 与其他疾病相关联
618 与精神疾病相关联
619 与肾脏疾病相关联
620 与呼吸***疾病相关联
621 与骨骼疾病相关联
622 在骨疾病中下降
623 在癌症疾病中下降，也在类别644中
624 在心血管疾病中下降
625 在***失调疾病中下降
626 在皮肤病中下降
627 在发育疾病中下降
628 在耳鼻喉疾病中下降
629 在内分泌疾病中下降
630 在胃肠道疾病中下降
631 在血液疾病中下降
632 在免疫疾病中下降
633 在代谢疾病中下降
634 在多发性疾病中下降
635 在肌肉疾病中下降
636 在神经***疾病中下降
637 在营养性疾病中下降
638 在眼科疾病中下降
639 在其他疾病中下降
640 在精神病中下降
641 在肾脏疾病中下降
642 在呼吸***疾病中下降
643 在骨骼疾病中下降
644 涉及癌症
因此，在各个方面，本发明的特征在于特异性结合至在此披露的任何RNA序列以用于调节基因的表达的寡核苷酸。在另一个方面，本发明的特征还在于特异性结合至序列B47,408至B616,428[小鼠峰]或B652,256至B916,209[人峰]或B916,626至B934,761-[环绕人峰的较长区域]的任何RNA序列或与它们互补的寡核苷酸，而不管是处在与靶基因“相反的链”还是“相同的链”(例如，如国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中所指示)。在一些实施例中，该寡核苷酸提供用于在调节PRC2结合RNA靶向的基因(例如，交叉基因或邻近基因)的表达的方法中使用。这类方法可以在体外、离体或体内执行。在一些实施例中，该寡核苷酸提供用于在治疗疾病的方法中使用。该治疗可以包括调节PRC2结合RNA靶向的基因的表达，优选地上调基因表达。在一些实施例中，该寡核苷酸被配制为肠胃外给药的无菌组合物。通过这些RNA序列靶向的参考基因在表2至表3中给出，并且根据国际专利申请公开WO/2012/087983的表3中的类别1至644分组或者为表2中给出的印记基因。因此，在一个方面，本发明描述了特异性结合至类别1至644中任一个中的一组RNA序列(转录物或峰)或与它们互补的一组寡核苷酸。具体而言，本发明的特征在于使用这类寡核苷酸来上调表2中给出的任何参考基因的表达，以用于治疗国际专利申请公开WO/2012/087983的表3中给出的任何类别(例如，类别编号11、14、15、17、21、24、26、42、44、49、58、69、82、103、119、120、126、143、163、167、172、177、182、183、184、187、191、196、200、203、204、212、300、323和/或400至644中的任一个或多个)中描述的疾病、失调、病症或相关疾病(association)。
通过非限制性实例，类别45(补体和凝血级联)包括选自下组的参考基因，该组由以下各项组成：A2M、SERPINC1、BDKRB1、BDKRB2、CFB、SERPING1、C1QA、C1QB、C1QC、C1R、C1S、C2、C3、C3AR1、C4A、C4B、C4BPA、C4BPB、C5、C5AR1、C6、C7、C8A、C8B、C9、CD59、CPB2、CR1、CR2、CD55、CFD、F2、F3、F5、F7、F8、F9、F10、F11、F12、F13A1、F13B、FGA、FGB、FGG、SERPIND1、CFH、CFI、KLKB1、KNG1、MBL2、CD46、SERPINE1、SERPINA1、PLAT、PLAU、PLAUR、PLG、SERPINF2、PROC、PROS1、MASP1、TFPI、THBD、VWF和/或MASP2。
而A2M、SERPINC1、BDKRB1、BDKRB2、CFB、SERPING1、C1QA、C1QB、C1QC、C1R、C1S、C2、C3、C3AR1、C4A、C4B、C4BPA、C4BPB、C5、C5AR1、C6、C7、C8A、C8B、C9、CD59、CPB2、CR1、CR2、CD55、CFD、F2、F3、F5、F7、F8、F9、F10、F11、F12、F13A1、F13B、FGA、FGB、FGG、SERPIND1、CFH、CFI、KLKB1、KNG1、MBL2、CD46、SERPINE1、SERPINA1、PLAT、PLAU、PLAUR、PLG、SERPINF2、PROC、PROS1、MASP1、TFPI、THBD、VWF和/或MASP2各自被PRC2相关RNA靶向，该PRC2相关RNA具有国际专利申请公开WO/2012/087983的表2的可适用行中显示的序列标识符。例如，根据国际专利申请公开WO/2012/087983的表2，F2靶向序列包括处在与编码基因相同的链上的序列：B620037[F]、B620035[4027]、B790730[4752]、B4539[2059]、B341288[3278]、B4537[4639]；以及处在与编码基因相反的链上的序列：B620036[F]、B790731[F]、B4538[F]、B341286[F]、B341287[F]。
特异性结合至国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中所列作为靶向参考基因A2M、SERPINC1、BDKRB1、BDKRB2、CFB、SERPING1、C1QA、C1QB、C1QC、C1R、C1S、C2、C3、C3AR1、C4A、C4B、C4BPA、C4BPB、C5、C5AR1、C6、C7、C8A、C8B、C9、CD59、CPB2、CR1、CR2、CD55、CFD、F2、F3、F5、F7、F8、F9、F10、F11、F12、F13A1、F13B、FGA、FGB、FGG、SERPIND1、CFH、CFI、KLKB1、KNG1、MBL2、CD46、SERPINE1、SERPINA1、PLAT、PLAU、PLAUR、PLG、SERPINF2、PROC、PROS1、MASP1、TFPI、THBD、VWF和/或MASP2的这些序列中的任一个或与其互补的寡核苷酸组被涵盖用于在在此描述的任何组合物和方法中使用，包括但不限于用于治疗类别45(补体和凝血级联)的疾病，该治疗包括调节任何参考基因A2M、SERPINC1、BDKRB1、BDKRB2、CFB、SERPING1、C1QA、C1QB、C1QC、C1R、C1S、C2、C3、C3AR1、C4A、C4B、C4BPA、C4BPB、C5、C5AR1、C6、C7、C8A、C8B、C9、CD59、CPB2、CR1、CR2、CD55、CFD、F2、F3、F5、F7、F8、F9、F10、F11、F12、F13A1、F13B、FGA、FGB、FGG、SERPIND1、CFH、CFI、KIKB1、KNG1、MBL2、CD46、SERPINE1、SERPINA1、PLAT、PLAU、PLAUR、PLG、SERPINF2、PROC、PROS1、MASP1、TFPI、THBD、VWF和/或MASP2。
类似地，特异性结合至类别643(“在骨骼疾病中下降”)内的基因或与其互补的寡核苷酸被涵盖用于在在此描述的任何组合物和方法中使用，包括但不限于用于治疗骨骼疾病。特异性结合至也为类别644(涉及癌症)的一部分的类别内的基因或与其互补的寡核苷酸被涵盖用于在在此描述的任何组合物和方法中使用，包括但不限于用于治疗癌症。
应理解，本发明的寡核苷酸可以与在此披露的转录物的峰区或非峰区或者邻近峰的区域互补或特异性结合至其。在各个方面，本发明的特征还在于结合至两个或更多个峰之间的RNA序列的寡核苷酸，该两个或更多个峰与彼此相邻例如在彼此的100个碱基、200个碱基、300个碱基、400个碱基、500个碱基、1kb或2kb内的染色体坐标对应，并且优选地与国际专利申请公开WO/2012/065143的表8或国际专利申请PCT/US2011/65939的表2中的相同的参考基因相关联。例如，本发明的特征在于特异性结合至序列A1至A21582或A191089至A193049或B1至B47,407或B934,762至B934,863[小鼠转录物]或B616,429至B652,255或B916,210至B916,625或B934,864至B934,968[人转录物]或B916,626至B934,761[环绕人峰的较大区域]的任何RNA转录物的片段或与其互补的寡核苷酸，所述片段的长度为约2000、约1750、约1500、约1250个核苷酸，或长度优选地为约1000、约750、约500、约400、约300个核苷酸，或长度更优选地为约200、约150或约100个核苷酸，其中RNA的片段包含序列A124437至A190716，或A190934至A191086，或A191087[人峰]，或序列A21583至A124436，或A190717至190933，或191088[小鼠峰]，或序列B47,408至B616,428[小鼠峰]或序列B652,256至B916,209[人峰]中的任何序列，或2010年12月20日提交的美国临时申请号61/425,174的附录I的任何cDNA序列的反向补体内的至少五(5)个连续核苷酸的伸展段。在示例性实施例中，RNA的片段包含序列A124437至A190716，或A190934至A191086，或A191087[人峰]，或序列A21583至A124436，或A190717至A190933，或A191088[小鼠峰]，或序列B47,408至B616,428[小鼠峰]或序列B652,256至B916,209[人峰]中的任何序列，或2010年12月20日提交的美国临时申请号61/425,174的附录I的任何cDNA序列的反向补体内的至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续核苷酸。
因此，例如，本说明书包括结合至以下长度的片段的寡核苷酸，这些片段的长度为约2000、约1750、约1500、约1250个核苷酸，或长度优选地为约1000、约750、约500、约400、约300个核苷酸，或长度更优选地为约200、约150或约100个核苷酸，这些片段为：
(a)序列B1至B47407[小鼠转录物]中的任何序列的片段，这些片段包含序列B47408至B616428[小鼠峰]中的任何序列内至少五(5)个连续核苷酸或6、7、8、9或10或更多个连续核苷酸的伸展段，优选地与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中的相同的参考基因相关联；
(b)序列B616429至B652255[人转录物]中的任何序列的片段，这些片段包含序列B652256至B916209[人峰]中的任何序列内至少五(5)个连续核苷酸或6、7、8、9或10或更多个连续核苷酸的伸展段，优选地与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中的相同的参考基因相关联；
(c)序列B916626至B934761[环绕人峰的较长区域]中的任何序列的片段，这些片段包含序列B652256至B916209[人峰]中的任何序列内至少五(5)个连续核苷酸或6、7、8、9或10或更多个连续核苷酸的伸展段，优选地与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中的相同的参考基因相关联；
(d)序列B934762至B934863[小鼠印记转录物]中的任何序列的片段，这些片段包含序列B47408至B616428[小鼠峰]中的任何序列内至少五(5)个连续核苷酸或6、7、8、9或10或更多个连续核苷酸的伸展段，优选地与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2或表2中的相同的参考基因相关联；
(e)序列B629991、B629992、B630983、B630984、B630990、B631003、B631004、B632396、B632397、B632402、B632403、B632419、B632422、B634959、B638303、B638304、B647595、B647596、B647597、B647598、B647601、B649028以及B934864至B934931[人印记转录物]中的任何序列的片段，这些片段包含序列B652256至B916209[人峰]中的任何序列内至少五(5)个连续核苷酸或6、7、8、9或10或更多个连续核苷酸的伸展段，优选地与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2或表2中的相同的参考基因相关联；
(f)序列B916210至B916625[人转录物]中的任何序列的片段，这些片段包含序列B652256至B916209[人峰]中的任何序列内至少五(5)个连续核苷酸或6、7、8、9或10或更多个连续核苷酸的伸展段，优选地与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中的相同的参考基因相关联；或
(g)序列B934932至B934968[人转录物]中的任何序列的片段，这些片段包含序列B652256至B916209[人峰]中的任何序列内至少五(5)个连续核苷酸或6、7、8、9或10或更多个连续核苷酸的伸展段，优选地与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中的相同的参考基因相关联。
因此，如上所述，该寡核苷酸可以包含与靶RNA的至少10、或10至30或10至40个连续碱基至少80％互补，或与靶RNA的至少15、或15至30或15至40个连续碱基至少80％互补，或与靶RNA的至少20、或20至30或20至40个连续碱基至少80％互补，或与靶RNA的至少25、或25至30或25至40个连续碱基至少80％互补，或与靶RNA的至少30或30至40个连续碱基至少80％互补，或与靶RNA的至少40个连续碱基至少80％互补的碱基序列或由它们组成。另外，该寡核苷酸可以包含与靶RNA的至少5、或5至30或5至40或8至40个连续碱基至少90％互补，或与靶RNA的至少10、或10至30或10至40个连续碱基至少90％互补，或与靶RNA的至少15、或15至30或15至40个连续碱基至少90％互补，或与靶RNA的至少20、或20至30或20至40个连续碱基至少90％互补，或与靶RNA的至少25、或25至30或25至40个连续碱基至少90％互补，或与靶RNA的至少30或30至40个连续碱基至少90％互补，或与靶RNA的至少40个连续碱基至少90％互补的碱基序列或由它们组成。类似地，该寡核苷酸可以包含与靶RNA的至少5、10或15个连续碱基完全互补的碱基序列或由它们组成。应理解，可以包括一些另外的非互补碱基。应理解，包含如所描述的这类碱基序列的寡核苷酸还可以包含其他非互补碱基。例如，寡核苷酸的总长度可以为20个碱基但包含与靶RNA的15个碱基完全互补的15个碱基部分。类似地，寡核苷酸的总长度可以为20个碱基但包含与靶RNA的15个碱基至少80％互补的15个碱基部分。
如上所述，互补性还能够以互补碱基配对中的错配数量来提及。因此，该寡核苷酸可以包含在靶RNA的10个连续碱基上具有至多3个错配，或在靶RNA的15个连续碱基上具有至多3个错配，或在靶RNA的20个连续碱基上具有至多3个错配，或在靶RNA的25个连续碱基上具有至多3个错配，或在靶RNA的30个连续碱基上具有至多3个错配的碱基序列或由它们组成。类似地，该寡核苷酸可以包含在靶RNA的10个连续碱基上具有至多2个错配，或在靶RNA的15个连续碱基上具有至多2个错配，或在靶RNA的20个连续碱基上具有至多2个错配，或在靶RNA的25个连续碱基上具有至多2个错配，或在靶RNA的30个连续碱基上具有至多2个错配的碱基序列或由它们组成。类似地，该寡核苷酸可以包含在靶RNA的至少10、15、20、25或30个连续碱基上具有一个错配的碱基序列或由它们组成。
在在此描述的寡核苷酸的一些或任何实施例中(例如，在实施例的概述、详述或实例中)或在用于设计或合成寡核苷酸的方法中，这些寡核苷酸可以任选地排除如以下公开的任一个或多个中披露的任一种或多种寡核苷酸：作为靶HOTAIR RNA(里尼(Rinn)等人，2007)，Tsix、RepA或Xist RNA，(赵(Zhao)等人，2008)[序列B936166至B936170]，或(萨玛(Sarma)等人，2010)[序列B936177至B936186]或(赵等人，2010)[序列B936187至B936188]或(普拉斯纳斯(Prasnath)等人，2005)[序列B936173至B936176]，或(沙莫夫斯基(Shamovsky)等人，2006)[序列B936172]或(马里纳(Mariner)等人，2008)[序列B936171]或(鲜于(Sunwoo)等人，2008)或(伯纳德(Bernard)等人，2010)[序列B936189]；或作为鉴别为候选PRC2调控因子的靶向短50 200nt RNA(康河(Kanhere)等人，2010)；或(桑原(Kuwabara)等人，美国2005/0226848)[序列B936190至B936191]或(李(Li)等人，美国2010/0210707)[序列B936192至B936227]或(科里等人，7,709,456)[序列B936228至B936245]或(马蒂克(Mattick)等人，WO 2009/124341)，或(科里等人，美国2010/0273863)[序列B936246至B936265]，或(瓦尔斯泰特(Wahlstedt)等人，美国2009/0258925)[序列B935060至B935126]，或BACE：美国2009/0258925[序列B935060至B935126]；ApoA1：美国2010/0105760/EP235283[序列B935127至B935299]，P73，p53，PTEN，WO 2010/065787 A2/EP2370582[序列B935300至B935345]；SIRT1：WO2010/065662 A2/EP09831068[序列B935346至B935392]；VEGF：WO2010/065671 A2/EP2370581[序列B935393至B935403]；EPO：WO2010/065792 A2/EP09831152[序列B935404至B935412]；BDNF：WO2010/093904[序列B935413至B935423]，DLK1：WO 2010/107740[序列B935424至B935430]；NRF2/NFE2L2：WO 2010/107733[序列B935431至B935438]；GDNF：WO 2010/093906[序列B935439至B935476]；SOX2，KLF4，Oct3A/B，“重编程因子”：WO 2010/135329[序列B935477至B935493]；肌养蛋白：WO 2010/129861[序列B935494至B935525]；ABCA1，LCAT，LRP1，ApoE，LDLR，ApoA1：WO 2010/129799[序列B935526至B935804]；HgF：WO 2010/127195[序列B935805至B935809]；TTP/Zfp36：WO 2010/129746[序列B935810至B935824]；TFE3，IRS2：WO 2010/135695[序列B935825至B935839]；RIG1，MDA5，IFNA1：WO 2010/138806[序列B935840至B935878]；PON1：WO2010/148065[序列B935879至B935885]；胶原质：WO/2010/148050[序列B935886至B935918]；Dyrk1A，Dscr1，“唐氏综合症基因”：WO/2010/151674[序列B935919至B935942]；TNFR2：WO/2010/151671[序列B935943至B935951]；胰岛素：WO/2011/017516[序列B935952至B935963]；ADIPOQ：WO/2011/019815[序列B935964至B935992]；CHIP：WO/2011/022606[序列B935993至B936004]；ABCB1：WO/2011/025862[序列B936005至B936014]；NEUROD1，EUROD1，HNF4A，MAFA，PDX，KX6，“胰腺发育基因”：WO/2011/085066[序列B936015至B936054]；MBTPS1：WO/2011/084455[序列B936055至B936059]；SHBG：WO/2011/085347[序列B936060至B936075]；IRF8：WO/2011/082409[序列B936076至B936080]；UCP2：WO/2011/079263[序列B936081至B936093]；HGF：WO/2011/079261[序列B936094至B936104]；GH：WO/2011/038205[序列B936105至B936110]；IQGAP：WO/2011/031482[序列B936111至B936116]；NRF1：WO/2011/090740[序列B936117至B936123]；P63：WO/2011/090741[序列B936124至B936128]；RNAseH1：WO/2011/091390[序列B936129至B936140]；ALOX12B：WO/2011/097582[序列B936141至B936146]；PYCR1：WO/2011/103528[序列B936147至B936151]；CSF3：WO/2011/123745[序列B936152至B936157]；FGF21：WO/2011/127337[序列B936158至B936165]；SIRTUIN(SIRT)：WO2011/139387[序列B936266至B936369和B936408至B936425]；PAR4：WO2011/143640[序列B936370至B936376和B936426]；LHX2：WO2011/146675[序列B936377至B936388和B936427，B936429]；BCL2L11：WO2011/146674[序列B936389至B936398和B936430，B936431]；MSRA：WO2011/150007[序列B936399至B936405和B936432]；ATOH1：WO2011/150005[序列B936406至B936407和B936433]，前述每项通过引用以其全部内容结合在此。在一些或任何实施例中，任选地从本发明排除的是特异性结合至以下区域的任一个或多个或与它们互补的寡核苷酸：序列B935128的核苷酸1至932；序列B935306的核苷酸1至1675；序列B935307的核苷酸1至518；序列B935308的核苷酸1至759；序列B935309的核苷酸1至25892；序列B935310的核苷酸1至279；序列B935311的核苷酸1至1982；序列B935312的核苷酸1至789；序列B935313的核苷酸1至467；序列B935347的核苷酸1至1028；序列B935348的核苷酸1至429；序列B935349的核苷酸1至156；序列B935350的核苷酸1至593；序列B935395的核苷酸1至643；序列B935396的核苷酸1至513；序列B935406的核苷酸1至156；序列B935414的核苷酸1至3175；序列B935426的核苷酸1至1347；序列B935433的核苷酸1至5808；序列B935440的核苷酸1至237；序列B935441的核苷酸1至1246；序列B935442的核苷酸1至684；序列B935473的核苷酸1至400；序列B935474的核苷酸1至619；序列B935475的核苷酸1至813；序列B935480的核苷酸1至993；序列B935480的核苷酸1至401；序列B935481的核苷酸1至493；序列B935482的核苷酸1至418；序列B935496的核苷酸1至378；序列B935497的核苷酸1至294；序列B935498的核苷酸1至686；序列B935499的核苷酸1至480；序列B935500的核苷酸1至501；序列B935533的核苷酸1至1299；序列B935534的核苷酸1至918；序列B935535的核苷酸1至1550；序列B935536的核苷酸1至329；序列B935537的核苷酸1至1826；序列B935538的核苷酸1至536；序列B935539的核苷酸1至551；序列B935540的核苷酸1至672；序列B935541的核苷酸1至616；序列B935542的核苷酸1至471；序列B935543的核苷酸1至707；序列B935544的核苷酸1至741；序列B935545的核苷酸1至346；序列B935546的核苷酸1至867；序列B935547的核苷酸1至563；序列B935812的核苷酸1至970；序列B935913的核苷酸1至1117；序列B935814的核苷酸1至297；序列B935827的核苷酸1至497；序列B935843的核苷酸1至1267；序列B935844的核苷酸1至586；序列B935845的核苷酸1至741；序列B935846的核苷酸1至251；序列B935847的核苷酸1至681；序列B935848的核苷酸1至580；序列B935880的核苷酸1至534；序列B935889的核苷酸1至387；序列B935890的核苷酸1至561；序列B935891的核苷酸1至335；序列B935892的核苷酸1至613；序列B935893的核苷酸1至177；序列B935894的核苷酸1至285；序列B935921的核苷酸1至3814；序列B935922的核苷酸1至633；序列B935923的核苷酸1至497；序列B935924的核苷酸1至545；序列B935950的核苷酸1至413；序列B935951的核苷酸1至413；序列B935962的核苷酸1至334；序列B935963的核苷酸1至582；序列B935964的核苷酸1至416；序列B935990的核苷酸1至3591；序列B935991的核苷酸1至875；序列B935992的核苷酸1至194；序列B936003的核苷酸1至2074；序列B936004的核苷酸1至1237；序列B936013的核苷酸1至4050；序列B936014的核苷酸1至1334；序列B936048的核苷酸1至1235；序列B936049的核苷酸1至17，964；序列B936050的核苷酸1至50,003；序列B936051的核苷酸1至486；序列B936052的核苷酸1至494；序列B936053的核苷酸1至1992；序列B936054的核苷酸1至1767；序列B936059的核苷酸1至1240；序列B936074的核苷酸1至3016；序列B936075的核苷酸1至1609；序列B936080的核苷酸1至312；序列B936092的核苷酸1至243；序列B936093的核苷酸1至802；序列B936102的核苷酸1至514；序列B936103的核苷酸1至936；序列B936104的核苷酸1至1075；序列B936110的核苷酸1至823；序列B936116的核苷酸1至979；序列B936123的核苷酸1至979；序列B936128的核苷酸1至288；序列B936137的核苷酸1至437；序列B936138的核苷酸1至278；序列B936139的核苷酸1至436；序列B936140的核苷酸1至1140；序列B936146的核苷酸1至2082；序列B936151的核苷酸1至380；序列B936157的核苷酸1至742；序列B936165的核苷酸1至4246；序列B936408的核苷酸1至1028；序列B936409的核苷酸1至429；序列B936410的核苷酸1至508；序列B936411的核苷酸1至593；序列B936412的核苷酸1至373；序列B936413的核苷酸1至1713；序列B936414的核苷酸1至660；序列B936415的核苷酸1至589；序列B936416的核苷酸1至726；序列B936417的核苷酸1至320；序列B936418的核苷酸1至616；序列B936419的核苷酸1至492；序列B936420的核苷酸1至428；序列B936421的核苷酸1至4041；序列B936422的核苷酸1至705；序列B936423的核苷酸1至2714；序列B936424的核苷酸1至1757；序列B936425的核苷酸1至3647；序列B936426的核苷酸1至354；序列B936427的核苷酸1至2145；序列B936428的核苷酸1至606；序列B936429的核苷酸1至480；序列B936430的核苷酸1至3026；序列B936431的核苷酸1至1512；序列B936432的核苷酸1至3774；以及序列B936433的核苷酸1至589。在在此描述的寡核苷酸的一些或任何实施例或用于设计或合成它们的方法中，这些寡核苷酸将上调基因表达并且可以特异性结合至或特异性杂交至转录自蛋白编码参考基因的相同链的PRC2结合RNA或与其互补。该寡核苷酸可以结合至PRC2结合RNA的区域，该PRC2结合RNA起源于参考基因(refGene)的蛋白编码有义链的内含子、外显子、内含子外显子接点、5′UTR、3′UTR、翻译起始区或翻译终止区或与它们重叠。
在在此描述的寡核苷酸的一些或任何实施例或用于设计或合成它们的方法中，这些寡核苷酸将上调基因表达并且可以特异性结合至或特异性杂交至转录自蛋白编码参考基因的相反链(反义链)的PRC2结合RNA或与其互补。该寡核苷酸可以结合至PRC2结合RNA的区域，该PRC2结合RNA起源于参考基因的蛋白编码反义链的内含子、外显子、内含子外显子接点、5′UTR、3′UTR、翻译起始区或翻译终止区或与它们重叠。
可以修饰在此描述的寡核苷酸，例如包含修饰的糖部分、修饰的核苷间键、修饰的核苷酸和/或其组合。此外，这些寡核苷酸可以展现出以下特性中的一种或多种：不诱导靶RNA的实质性裂解或降解；不引起靶RNA的基本完全的裂解或降解；不激活RNA酶H路径；不激活RISC：不募集任何Argonaute家族蛋白；不被Dicer裂解；不介导替代的剪接；不具有免疫刺激性；具有核酸酶抗性；与未修饰的寡核苷酸相比较，具有提高的细胞吸收；对细胞或哺乳动物无毒；可以具有改进的内体排出(endosomal exit)；干扰lncRNA与PRC2、优选地Ezh2亚单位，但任选地Suz12、Eed、RbAp46/48亚单位或辅助因子如Jarid2的相互作用；减少组蛋白H3赖氨酸27甲基化和/或上调基因表达。
在在此描述的寡核苷酸的一些或任何实施例或用于设计或合成它们的方法中，这些寡核苷酸可以任选地排除结合启动子区的DNA的那些寡核苷酸，如在桑原等人的美国2005/0226848或李(Li)等人的美国2010/0210707或科里等人的7,709,456或马蒂克等人的WO 2009/124341中所描述；或结合3′UTR区的DNA的那些寡核苷酸，如在科里等人的美国2010/0273863中所描述。
设计来与RNA相互作用以调节基因表达的寡核苷酸为与设计来结合DNA靶标(例如，与转录RNA的潜在的基因组DNA序列互补)的那些相异的碱基序列的子集。
用于调节基因表达的方法
在另一个方面，本发明涉及用于调节细胞(例如，癌细胞、干细胞或其他正常细胞类型)内基因表达以用于基因或表观遗传治疗的方法。这些细胞可以为体外的、离体的或体内的(例如，在患有癌症例如肿瘤的受试者体内)。在一些实施例中，用于调节细胞内基因表达的方法包括递送如在此所描述的单链寡核苷酸。在一些实施例中，向细胞递送该单链寡核苷酸导致基因表达的水平比尚未递送该单链寡核苷酸的对照细胞内的基因表达的水平大至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或以上。在某些实施例中，向细胞递送该单链寡核苷酸导致基因表达的水平比尚未递送该单链寡核苷酸的对照细胞内的基因表达的水平大至少50％。
在本发明的另一个方面，方法包括向受试者(例如，人)给予包含如在此所描述提高该受试者体内蛋白水平的单链寡核苷酸的组合物。在一些实施例中，该蛋白水平的提高为比给药之前该受试者体内的蛋白的量高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％或以上。
作为另一个实例，为了提高细胞内肿瘤压制因子的表达，这些方法包括向该细胞引入与定位至涵盖或接近靶基因(例如，如国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中给出的肿瘤压制因子、表2中的印记基因和/或国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中的其他生长压制基因(例如，Nkx2-1或Titf-1，例如，在患有癌症的受试者例如肺腺癌患者体内))的基因组位置的(例如，长的非编码RNA的)PRC2相关区充分互补的单链寡核苷酸。
在另一个方面，本发明提供治疗与受试者体内特定基因的降低的表达水平相关联的病症(例如，癌症)的方法，该方法包括给予如在此所描述的单链寡核苷酸。
受试者可以包括非人哺乳动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、山羊、牛或马。在优选的实施例中，受试者为人。
在一些实施例中，使用在此描述的方法可以治疗的特定的癌症例如在国际专利申请公开WO/2012/087983的表3中列出，并且包括但不限于：乳腺癌、肺癌、***癌、CNS(例如，胶质瘤)、唾液腺癌、***癌、卵巢癌以及白血病(例如，ALL、CML或AML)。这些基因与特定癌症的关联在本领域中是已知的，例如，如在福特里尔(Futreal)等人，自然癌症综述(Nat Rev Cancer.)2004；4；177-83(参见，例如，表1，通过引用结合在此)；以及COSMIC(癌症体细胞突变目录)数据库和网站，班福德(Bamford)等人，英国癌症杂志(Br J Cancer.)2004；91；355-8中所描述；还参见福布斯(Forbes)等人，人类遗传学实验指南(CurrProtoc Hum Genet.)2008；第10章；第10.11单元，以及COSMIC数据库，例如，第50卷(2010年11月30日)。应理解，对例如国际专利申请公开WO/2012/087983的表3中任何特定类型的癌症的提及意指可以治疗患有其他类型癌症即一般癌症的患者。
此外，在此描述的方法可以用于调节(例如，增强或降低)干细胞的多能性并且沿特异性分化路径引导干细胞以便产生内胚层、中胚层、外胚层以及它们的发展衍生物。为了提高、维持或增强多能性，这些方法包括向该细胞引入特异性结合至(例如，在此披露的任何长的非编码RNA的)核酸的PRC2相关区或与其互补的单链寡核苷酸。在在此描述的方法中有用的干细胞包括成人干细胞(例如，从受试者例如有待治疗的受试者的内耳、骨髓、间充质、皮肤、脂肪、肝、肌肉或血液获得的成人干细胞)；胚胎干细胞或从胎盘或脐带血获得的干细胞；祖细胞(例如，源自于内耳、骨髓、间充质、皮肤、脂肪、肝、肌肉或血液的祖细胞)；以及诱导的多能干细胞(例如，iPS细胞)。
在一些实施例中，在此描述的方法包括给予包含与(例如，在此描述的lncRNA的，例如，如在序列A1至A193,049，B1至B916,209以及B916,626至B934,931中给出的)核酸的PRC2相关区互补的单链寡核苷酸的组合物例如无菌组合物。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷酸(例如，锁定核酸(LNA)分子)。
单链寡核苷酸已用作治疗动物(包括人)的疾病病况的治疗部分。单链寡核苷酸可以为有用的治疗模态，这些治疗模态可以被配置成在用于治疗细胞、组织以及动物特别是人的治疗方案中有用。
对于治疗法，怀疑患有癌症的动物优选为人通过给予根据本发明的单链寡核苷酸来治疗。例如，在一个非限制性实施例中，这些方法包括向需要治疗的动物给予治疗有效量的如在此所描述的单链寡核苷酸的步骤。配制、递送以及给药
在此描述的寡核苷酸可以被配制来向受试者给药。应理解，配制品、组合物和方法可以用在此披露的任何寡核苷酸来实践。
这些配制品可以方便地按单位剂型形式呈现并且可以通过制药领域中熟知的任何方法来制备。可以与载体材料组合以便产生单一剂型的活性成分(例如，本发明的寡核苷酸或化合物)的量将根据所治疗的宿主、具体给药模式例如皮内或吸入而变化。可以与载体材料组合以便产生单一剂型的活性成分的量将通常是产生治疗效果例如肿瘤阻抑的化合物的量。
本发明的药物配制品可以根据本领域已知用于制造药物的任何方法来制备。这类配制品可以含有甜味剂、调味剂、着色剂以及防腐剂。配制品可以与适于制造的无毒的药学上可接受的赋形剂混合。配制品可以包含一种或多种稀释剂、乳化剂、防腐剂、缓冲液、赋形剂等，并且可以提供成这类形式如液体、粉末、乳液、冻干粉末、喷雾、乳膏、洗剂、受控释放配制品、片剂、丸剂、凝胶、贴片上、植入体内等。
配制的单链寡核苷酸组合物可以呈现各种状态。在一些实例中，该组合物为至少部分结晶(均匀地结晶)和/或无水的(例如，小于80％、50％、30％、20％或10％水)。在另一个实例中，该单链寡核苷酸处于水相，例如处于包括水的溶液中。该水相或结晶组合物可以例如结合到递送媒介物例如脂质体(特别是针对水相)或颗粒(例如，对结晶组合物而言微粒可能是适当的)中。一般而言，该单链寡核苷酸组合物以与目标给药方法相容的方式配制。
在一些实施例中，该组合物通过以下方法中的至少一种来制备：喷雾干燥、冻干、真空干燥、蒸发、流化床干燥或这些技术的组合；或与脂质一起超声处理、冷冻干燥、冷凝以及其他自组装技术。
单链寡核苷酸制剂可以与另一种试剂组合配制或给予(一起或分开)，另一种试剂例如另一种治疗剂或稳定单链寡核苷酸的试剂，例如与单链寡核苷酸复合的蛋白质。其他试剂包括螯合剂，例如，EDTA(例如，以去除二价阳离子如Mg2+)，盐，RNA酶抑制剂(例如，宽特异性RNA酶抑制剂如RNAsin)等。
在一个实施例中，该单链寡核苷酸制剂包括另一种单链寡核苷酸，例如，调节第二基因的表达的第二单链寡核苷酸或调节第一基因的表达的第二单链寡核苷酸。其他制剂还可以包括至少3个、5个、十个、二十个、五十个或一百个或更多个不同的单链寡核苷酸种类。这类单链寡核苷酸相对于类似数量的不同基因可以介导基因表达。
在一个实施例中，该单链寡核苷酸制剂包括至少一种第二治疗剂(例如，除寡核苷酸之外的试剂)。举例来说，例如，用于治疗癌症的单链寡核苷酸组合物可能进一步包含化疗剂。
递送途径
包括单链寡核苷酸的组合物可以通过各种途径向受试者递送。示例性途径包括：静脉内、皮内、局部、经直肠、肠胃外、***内、***内、鼻内、经肺、经眼。
本发明的单链寡核苷酸分子可以结合到适于给药的药物组合物中。这类组合物典型地包括一种或多种单链寡核苷酸种类以及药学上可接受的载体。如在此所使用，词语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何以及所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。对于药物活性物质使用此类介质与试剂在本领域内是熟知的。除了任何常规的与活性成分不相容的介质或试剂之外，将涵盖此类介质和试剂在组合物中的使用。辅助活性化合物也可以结合到组合物中。
本发明的药物组合物能够以多种方式给予，这取决于希望是局部治疗还是***治疗以及有待治疗的区域。给药可以为局部的(包括眼部给药、***给药、直肠给药、鼻内给药、经皮给药)、口服的或肠胃外的。肠胃外给药包括静脉滴注、皮下注射、腹膜内注射或肌内注射、或鞘内给药或心室内给药。
给药途径和部位可以被选择来增强靶向作用。例如，为了靶向肌细胞，肌内注射到相关肌肉中将是合理的选择。可以通过给予呈气溶胶形式的单链寡核苷酸来靶向肺细胞。血管内皮细胞可以通过对气囊导管涂布单链寡核苷酸并机械地引入寡核苷酸来靶向。
局部递送
局部给药是指通过使配制品直接接触受试者的表面来向该受试者递送。局部递送的最常见形式为递送至皮肤，但在此披露的组合物也可以直接涂覆至身体的其他表面，例如，涂覆至眼睛、粘膜，体腔的表面或内表面。如上所述，最常见的局部递送为递送至皮肤。术语涵盖若干给药途径，包括但不限于局部给药和经皮给药。这些给药模式典型地包括穿透皮肤的可渗透性屏障并且有效递送至靶组织或组织层。局部给药可以用作穿透表皮和真皮并最终实现组合物的***递送的手段。局部给药还可以用作向受试者的表皮或真皮，或其特定组织层或底层组织选择性递送寡核苷酸的手段。
用于局部给药的配制品可以包括经皮贴片、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴液、栓剂、喷雾、液体以及粉末。常规的药物载体、水性基质、粉末基质或油性基质、增稠剂等可能是需要的或希望的。涂布的避孕套、手套等也可能是有用的。
皮内递送为用于脂溶性治疗剂的给药的有用途径。真皮比表皮更易渗透，并且因此吸收更为迅速地通过擦伤、烧伤或剥离后的皮肤。炎症和增加流向皮肤的血流的其他生理病症也增强经皮吸收。经由这种途径的吸收可以通过使用油性媒介物(涂擦)或通过使用一种或多种渗透增强剂来增强。经由经皮途径递送在此披露的组合物的其他有效方式包括皮肤的水合作用以及受控释放局部贴片的使用。经皮途径提供递送在此披露的组合物以用于***和/或局部治疗的潜在有效的手段。此外，离子电渗疗法(在电场影响下通过生物膜传递离子溶质)、超声透入疗法或超声导入疗法(使用超声波来增强整个生物膜特别是皮肤和角膜上的不同治疗剂的吸收)以及媒介物特征相对于给药部位处剂量位置和保持时间的优化可能是用于增强局部涂覆的组合物在整个皮肤和粘膜部位上的传送的有用方法。
经口或经鼻递送
经口和经鼻膜两者提供优于其他给药途径的优点。例如，通过这些膜给予的寡核苷酸可以具有快速起效的作用，提供治疗性血浆水平，避免肝脏的首过代谢作用，并且避免寡核苷酸在有害胃肠(GI)环境中的暴露。另外的优点包括易于进入膜部位以使得寡核苷酸可以容易地涂覆、局部化和去除。
在口服递送中，组合物可以靶向口腔的表面，例如，舌下粘膜，舌下粘膜包括舌部的腹面的膜和口腔底部或构成颊部的内层的颊粘膜。舌下粘膜为相对可渗透的，从而给出对许多试剂的快速吸收和可接受的生物可利用性。另外，舌下粘膜为方便的、可接受的以及易于接近的。
单链寡核苷酸的药物组合物还可以通过将如上所述的混合的胶束药物配制品以及推进剂从计量的剂量喷雾分配器喷入到(而非吸入到)腔中来向人类的颊腔给药。在一个实施例中，在将药物配制品和推进剂喷入到颊腔中之前，首先振荡该分配器。
用于口服给药的组合物包括粉末或颗粒、水性悬浮液或溶液、糖浆、浆料、乳液、酏剂或非水性介质、片剂、胶囊、锭剂或含片。在片剂的情况下，可以使用的载体包括乳糖、柠檬酸钠以及磷酸盐。各种崩解剂(如淀粉)和润滑剂(如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠以及滑石)普遍用于片剂中。对于胶囊形式的口服给药，可用稀释剂为乳糖和高分子量聚乙二醇。当需要用于口服使用的水性悬浮液时，可以将核酸组合物与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，可以添加某些甜味剂和/或调味剂。
肠胃外递送
肠胃外给药包括静脉滴注、皮下注射、腹膜内注射或肌内注射、鞘内给药或心室内给药。在一些实施例中，肠胃外给药包括直接给药至疾病部位(例如，注射到肿瘤中)。
用于肠胃外给药的配制品可以包括也可以含有缓冲液、稀释剂以及其他适合的添加剂的无菌水溶液。可以通过例如附接至贮药库(reservoir)的心室内导管来帮助心室内注射。对于静脉内使用，应控制溶质的总浓度以便使制剂等渗。
眼部递送
可以向眼部组织给予在此描述的任何单链寡核苷酸。例如，可以将组合物涂覆至眼睛或邻近组织的表面，例如，眼睑内部。对于眼部给药，可以通过本领域已知的眼部递送***如涂药器或滴眼瓶来递送软膏或滴眼液。这类组合物可以包括粘液模拟物质(mucomimetics)如透明质酸、硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素或聚(乙烯醇)，防腐剂如山梨酸、EDTA或苄基氯化铬以及常用量的稀释剂和/或载体。还可以向眼睛的内部给予该单链寡核苷酸，并且可以通过针或可以将该单链寡核苷酸引至选定区域或结构的其他递送装置来引入该单链寡核苷酸。
肺部递送
肺部递送组合物可以由患者吸入分散剂来递送，这样使得该分散剂内的该组合物(优选地为单链寡核苷酸)可以抵达该组合物可以容易地通过肺泡段而直接吸收进入血液循环的肺部。肺部递送可以有效用于***递送和局部递送两者以用于治疗肺部疾病。
可以通过不同的方法来实现肺部递送，包括使用基于气雾化、气溶胶化、胶束以及干粉的配制品。可以用液体气雾器、基于气溶胶的吸入器以及干粉分配装置来实现递送。计量剂量装置是优选的。使用雾化器或吸入器的一个益处在于污染的可能性被最小化，因为装置是独立的。干粉分配装置例如递送可以容易地配制成干粉的试剂。单链寡核苷酸组合物可以独自或结合适合的粉末载体稳定地存储为冻干或喷雾干燥的粉末。组合物的吸入递送可以通过给药计时元件来介导，该给药计时元件可以包括计时器、剂量计数器、测时装置或时间指示器，在它们结合到装置中时在气溶胶药剂的给药过程中实现剂量追踪、依从性监测和/或触发剂量给患者。
术语“粉末”意指由细微分散的固体颗粒组成的组合物，这些固体颗粒是自由流动的，并且能够容易地分散在吸入装置中，并且随后由受试者吸入，以使得颗粒抵达肺部以便允许穿透到肺泡中。因此，粉末被称为“可吸入的”。优选地，平均粒度小于约10μm的直径，优选地具有相对均匀的球形分布。更优选地，直径小于约7.5μm并且最优选地小于约5.0μm。通常，粒度分布为在约0.1μm与约5μm的直径之间，特别是约0.3μm至约5μm。
术语“干燥”意指组合物按水的重量计(w％)具有低于约10％，通常低于约5w％并且优选地低于约3w％的含水量。干燥组合物可以使得颗粒能够容易地分散在吸入装置中以便形成气溶胶。
术语“治疗有效量”为在有待治疗的受试者体内提供所希望水平的靶基因表达以便给出期望的生理反应所需的组合物中存在的寡核苷酸的量。术语“生理学有效量”为递送至受试者以便给出所希望的缓解性或治愈性效果的量。术语“药学上可接受的载体”意指可以被带入肺部而不对肺部产生显著的不良的毒理学作用的载体。
可用作载体的药物赋形剂的类型包括稳定剂如人血清白蛋白(HSA)、增量剂如糖类、氨基酸以及多肽；pH调节剂或缓冲液；盐如氯化钠；等。这些载体可以为结晶形式或无定形形式或者可以为两者的混合物。
适合的pH调节剂或缓冲液包括由有机酸和碱制备的有机盐，如柠檬酸钠、抗坏血酸钠等；柠檬酸钠是优选的。胶束单链寡核苷酸配制品的肺部给药可以通过具有推进剂的计量剂量喷雾装置来实现，这些推进剂如四氟乙烷、七氟乙烷、二甲基氟丙烷、四氟丙烷、丁烷、异丁烷、二甲基醚以及其他非CFC和CFC推进剂。
装置和植入体
示例性装置包括引入到脉管***中的装置，例如，***到血管组织的内腔中的装置，或装置自身形成脉管结构一部分的装置，包括支架、导管、心脏瓣膜以及其他血管装置。这些装置例如导管或支架可以放置在肺部、心脏或腿部的脉管结构中。
其他装置包括非血管装置，例如，植入到腹膜中，或器官或腺组织中的装置，例如人造器官。该装置可以释放除单链寡核苷酸之外的治疗物质，例如，装置可以释放胰岛素。
在一个实施例中，包括单链寡核苷酸的组合物的单位剂量或测量剂量通过植入装置来分配。该装置可以包括监控受试者体内参数的传感器。例如，该装置可以包括泵以及例如任选地相关联的电子器件。
组织例如细胞或器官可以离体用单链寡核苷酸治疗，并且之后给予或植入到受试者体内。该组织可以为自体组织、异体组织或异种组织。例如，可以治疗组织来减少移植物对抗宿主病。在其他实施例中，该组织为异体的并且治疗该组织来治疗特征在于所述组织中的不想要的基因表达的失调。例如，可以治疗组织例如造血细胞(例如，骨髓造血细胞)来抑制不想要的细胞增殖。引入无论是自体的还是移植的治疗组织都可以与其他疗法结合。在一些实施方案中，单链寡核苷酸处理的细胞例如通过半渗透多孔屏障与其他细胞分离开来，该半渗透多孔屏障防止细胞离开移植体，但使得来自身体的分子能够到达细胞并且使得由细胞产生的分子进入身体。在一个实施例中，该多孔屏障由藻酸盐形成。
在一个实施例中，避孕装置涂布有或含有单链寡核苷酸。示例性装置包括避孕套、子宫帽、IUD(植入式子宫装置)、海绵体、***用套以及节育装置。
剂量
在一个方面，本发明的特征为向受试者(例如，人受试者)给予单链寡核苷酸(例如，作为化合物或作为组合物的组分)的方法。在一个实施例中，该单位剂量在约10mg与25mg/kg体重之间。在一个实施例中，该单位剂量在约1mg与100mg/kg体重之间。在一个实施例中，该单位剂量在约0.1mg与500mg/kg体重之间。在一些实施例中，该单位剂量超过0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、25、50或100mg/kg体重。
所定义的量可以为有效用于治疗或预防疾病或失调例如与靶基因相关联的疾病或失调的量。单位剂量例如可以通过注射(例如，静脉内或肌内)、吸入剂量或局部涂覆来给予。
在一些实施例中，每天给予该单位剂量。在一些实施例中，小于每天一次的频率，例如小于每2、4、8或30天一次的频率给予该单位剂量。在另一个实施例中，该单位剂量不按一定频率给予(例如，非规律的频率)。例如，可以单次给予该剂量单位。在一些实施例中，该单位剂量一天给予一次以上，例如，一个小时、两个小时、四个小时、八个小时、十二个小时等给予一次。
在一个实施例中，向受试者给予单链寡核苷酸的初始剂量以及一个或多个维持剂量。一个或多个维持剂量通常低于该初始剂量，例如，比该初始剂量小一半。维持方案可以包括用在从每天0.0001至100mg/kg体重，例如每天100、10、1、0.1、0.01、0.001或0.0001mg/kg体重的范围内的一个或多个剂量治疗受试者。每1、5、10或30天可以给予不超过一次的维持剂量。另外，治疗方案可以持续一段时间，该段时间将根据具体疾病的性质、严重程度以及患者的总体情况来变化。在一些实施例中，每天可以递送不超过一次的剂量，例如，每24、36、48小时或更多小时不超过一次，例如，每5或8天不超过一次。在治疗之后，可以监控患者的病症变化以及疾病病况的症状的缓解。寡核苷酸的剂量可以在患者对当前剂量水平未作出显著响应的情况下增加，或者剂量可以在观察到疾病病况的症状的缓解的情况下，在疾病病况消除的情况下或在观察到不希望的副作用的情况下减小。
在特定情况下根据需要或认为适当时，有效剂量能够以单次剂量或两次或更多次剂量给予。如果希望促进重复或频繁的输注，可建议植入递送装置，例如，泵、半永久性支架(例如，静脉内、腹膜内、脑池内或囊内)或贮药库。
在一些实施例中，该寡核苷酸药物组合物包括多个单链寡核苷酸种类。在另一个实施例中，单链寡核苷酸种类相对于天然存在的靶序列(例如，PRC2相关区)具有与另一个种类不重叠并且不邻近该另一个种类的序列。在另一个实施例中，多个单链寡核苷酸种类对不同的PRC2相关区具有特异性。在另一个实施例中，该单链寡核苷酸是等位基因特异性的。
在一些情况下，用单链寡核苷酸结合其他治疗模态来治疗患者。例如，可以结合化疗将单链寡核苷酸给予正治疗癌症的患者。
在成功治疗之后，可能希望使该患者经受维持治疗以便防止疾病病况的复发，其中以从0.0001mg至100mg/kg体重的范围内的维持剂量给予本发明的化合物。
该单链寡核苷酸组合物的浓度为足以在人体内有效治疗或预防失调或调控生理病症的量。所给予的单链寡核苷酸的浓度或量将取决于针对试剂和给药方法例如经鼻、经颊、经肺确定的参数。例如，鼻用配制品可能倾向于要求一些成分的浓度较低以便避免对鼻腔通道的刺激或烧伤。有时希望将口服配制品稀释多达10至100倍以便提供适合的鼻用配制品。
某些因素可能会影响有效治疗受试者所需的剂量，包括但不限于疾病或失调的严重程度、先前治疗、受试者的总体健康和/或年龄以及存在的其他疾病。此外，使用治疗有效量的单链寡核苷酸对受试者治疗可以包括单一治疗、或优选地可以包括一系列治疗。还将认识到，用于治疗的单链寡核苷酸的有效剂量可以在具体治疗的过程中增大或减小。例如，可以在给予一种单链寡核苷酸组合物之后监控该受试者。基于来自监控的信息，可以给予另外的量的该单链寡核苷酸组合物。
给药取决于有待治疗的疾病病症的严重程度和响应性，其中治疗过程持续从数天至数月，直到实现治愈或者实现疾病病况减轻。最佳给药计划可以从对患者体内的靶基因表达水平的测量计算。普通技术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方式以及重复率。最佳剂量可以根据单独化合物的相对效力来变化，并且通常可以基于在体外和体内动物模型中发现有效的EC50来估算。在一些实施例中，动物模型包括表达人靶基因的转基因动物。在另一个实施例中，用于测试的组合物包括至少在内部区域中与在动物模型中的靶基因与人体中的靶基因之间保守的序列互补的单链寡核苷酸。
在一个实施例中，单链寡核苷酸组合物的给药为肠胃外的，例如，静脉内(例如，作为推注或作为可扩散的输注)、皮内、腹膜内、肌内、鞘内、心室内、颅内、皮下、经粘膜、经颊、舌下、经内窥镜、经直肠、口服、***内、局部、经肺、鼻内、经尿道或经眼。可以通过受试者或通过另一个人例如卫生保健提供者来提供给药。该组合物能够以测量剂量或递送计量剂量的分配器提供。下文更详细地论述了选择的递送模式。
试剂盒
在本发明的某些方面，提供试剂盒，其包括容纳包含单链寡核苷酸的组合物的容器。在一些实施例中，该组合物为包含单链寡核苷酸和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施例中，该药物组合物的单独组分可以提供在一个容器中。可替代地，可能希望将该药物组合物的组分分开提供在两个或更多个容器中，例如，一个容器用于单链寡核苷酸，并且至少另一个用于载体化合物。该试剂盒可以封装在多个不同的构型如单个盒子内的一个或多个容器中。不同的组分可以例如根据试剂盒所提供的说明书来组合。组分可以根据在此描述例如用于制备和给予药物组合物的方法来组合。该试剂盒还可以包括递送装置。
通过以下实例来进一步说明本发明，这些实例绝不应该解释为进一步的限制。在本发明通篇引用的所有参考(包括文献参考、颁予的专利、公开专利申请以及共同待决专利申请)的全部内容清楚地通过引用结合在此。
实例
以下实例将进一步描述本发明，这些实例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。
材料与方法
以下材料和方法用于下文给出的实例1至7中。
RIP-seq
使用107个野生型16.7(李(Lee)和陆(Lu)，1999)以及Ezh2-/-ES细胞进行RNA免疫沉淀。为了构建RIP-seq库，分离细胞核，制备细胞核溶解物，用400U/ml DNA酶处理并且用抗-Ezh2抗体(Active Motif)或对照IgG(细胞信号转导技术(Cell Signaling Technology))孵育。用蛋白A琼脂糖珠粒免疫沉淀RNA-蛋白复合物并且使用Trizol(英杰公司(Invitrogen))提取RNA。为了保存链信息，将模板转换用于库构建。20至150ng RNA和适配子1(5’-CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNN-3’；SEQ IDNO：1277)用于使用Superscript II逆转录试剂盒(英杰公司)进行第一链cDNA合成。Superscript II添加非模版CCC 3’突出部分，这些突出部分用于杂交至适配子2-GGG模版-转换引物(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCTGGG-3’；SEQ ID NO：1278)。在第1链cDNA合成过程中，用适配子1将样品在20℃下孵育10分钟，之后在37℃下孵育10分钟，并且在42℃下孵育45分钟。然后添加变性的模版转换引物并且将每管在42℃下孵育30分钟，之后在75℃下孵育15分钟。通过正向(5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’；SEQ ID NO：1279)和反向(5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT-3’；SEQ IDNO：1280)Illumina引物来扩增所得cDNA。通过Phusion聚合酶(伯乐(Biorad))进行PCR如下：在98℃下30秒，[98℃下10秒，65℃下30秒，72℃下30秒]20至24个循环并且72℃下5分钟。针对大小选择，将PCR产物加载到3％NuSieve凝胶上，并且切下200至1,200bp产物并且通过QIAEX II琼脂糖凝胶提取试剂盒(凯杰公司(Qiagen))来提取。负RT(Minus-RT)样品通常不产生产物。通过PicoGreen量化DNA浓度。5至10ml的2至20nM cDNA样品通过MGH分子生物学部的测序核心设备(Sequencing Core Facility)来在Illumina GAII测序。
生物信息学分析
除如下所述之外，所有分析都使用C++程序来进行。使用Illuminapipeline进行图像处理和碱基识别(base calling)。通过交叉匹配(crossmatch)来检测3’适配子序列并且修整≥5个碱基的匹配，过滤均聚物读取段，并且从所有随后分析中排除与线粒体基因组和核糖体RNA匹配的读取段。然后使用shortQueryLookup(巴泽罗(Batzoglou)等人，2002)将剩余序列与mm9小鼠参考基因组比对。保留误差≤1的比对。由于库构建和测序从PRC2结合RNA的相反链产生序列，在所有进一步的分析中，我们将每个读取段看作是反向互补的。为了确定原始a-Ezh2RIP-seq库相较于其技术和生物复制物以及还有Ezh2-/-对照系的RIP-seq的相关系数，将比较两个样品之间每个基因的读取段的数量，并且对于每对，在映射至每个参考基因的读取段的数量之间计算皮尔逊相关系数(Pearson correlation)。也就是说，针对每个样品，产生具有映射至每个参考基因的读区段的计数的矢量，并且计算所有矢量对之间的皮尔逊相关系数。
从UCSC基因组浏览器数据库获得mm9(RepeatMasker)中的重复序列的位置。PRC2转录组读取段与这些重复的重叠通过使RepeatMasker数据的坐标与读取段比对的坐标交叉来获得。UCSC转录组用作一般参考。为了获得一组非重叠的相异转录区，UCSC转录组转录物按起始坐标分类，并且将重叠转录物合并在相同链上(接合的UCSC转录组：总共39,003个转录物)。将读取段比对坐标与合并的UCSC转录物的那些交叉以便确定PRC2转录组中存在的UCSC转录物的数量。将转录物的命中区域转换成RPKM单位，其中读取段计数为1/(n＊K＊M)，并且n为基因组中比对的数量，K为转录物长度除以1,000，并且M为仅包括映射至mm9的读取段的测序深度除以1,000,000。这种归一化允许具有不同长度的转录物之间以及具有不同测序深度的样品之间的比较。
为了产生启动子图(promoter maps)，启动子区被定义为相对于TSS(获自参考基因目录，UCSC基因组浏览器)的-10,000至+2000个碱基。绘制与启动子区重叠的读取段计数，例外的是放宽了10个比对的限值。对于染色体比对，计算每个染色体上所有非重叠连续100kb窗口的读取段数量。将读取段归一化，以使得定位至n位置的那些读取段计数为每个位置处的1/nth读取段。使用以R书写的用户脚本来绘图。通过比较WT和Ezh2-/-样品中所有转录物的每条链上的RPKM分值发现了所有富集的转录物列表。然后将它们的坐标与感兴趣的特征的坐标交叉。使用UCSC的LiftOver实用程序将NCBI37/mm9小鼠组件坐标中不存在的特征转换成那些坐标。liftOver实用程序有效地使基因组彼此映射，从而允许快速识别相同种类的连续组件之间或两个相异种类之间感兴趣的区域。
RIP/qRT-PCR
基于现有方法，使用5ul兔抗-小鼠-Ezh2抗体(Active Motif)或正常的兔IgG(密理博公司(Millipore))进行RIP验证。RIP之后是使用ICYCLER IQTM实时检测***(伯乐)进行定量的、链特异性RT-PCR。基因特异性PCR引物对为：
Malat-1：正向5’-GCCTTTTGTCACCTCACT-3’；SEQ ID NO：1281
反向5’-CAAACTCACTGCAAGGTCTC-3’；SEQ ID NO：1282
Malat1-as：正向5’-TACTGGGTCTGGATTCTCTG-3’；SEQ IDNO：1283
反向5’-CAGTTCCGTGGTCTTTAGTG-3’；SEQ ID NO：1284
Foxn2-as：正向5’-GGCTATGCTCATGCTGTAAC；SEQ ID NO：1285
反向5’-GTTACTGGCATCTTTCTCACA-3’；SEQ ID NO：1286
Ly6e-as：正向5’-CCACACCGAGATTGAGATTG-3’；SEQ IDNO：1287
反向5’-GCCAGGAGAAAGACCATTAC-3’；SEQ ID NO：1288
Bgn-as：正向5’-TGTGAACCCTTTCCTGGA-3’；SEQ ID NO：1289
反向5’-CTTCACAGGTCTCTAGCCA-3’；SEQ ID NO：1290
Gtl2：正向5’-CGAGGACTTCACGCACAAC-3’；SEQ ID NO：1291
反向5’-TTACAGTTGGAGGGTCCTGG-3’；SEQ ID NO：1292
Gtl2-as：正向5’-CACCCTGAACATCCAACA-3’；SEQ ID NO：1293
反向5’-CATCTGCTTTTCCTACCTGG-3’；SEQ ID NO：1294
Hapa1-upstream：正向5’-GGTCCAAAATCGGCAGT-3’；SEQID NO：1227
反向5’-GTCCTCAAATCCCTACCAGA-3’；SEQ ID NO：1228
Htr6-downstream：正向5’-ACACGGTCGTGAAGCTAGGTA-3’；SEQ ID NO：1229
反向5’-CAGTTGGAGTAGGCCATTCCC-3’；SEQ ID NO：1230
Nespas/TR019501：正向5’-AGATGAGTCCAGGTGCTT-3’；SEQ ID NO：1231
反向5’-CAAGTCCAGAGTAGCCAAC-3’；SEQ ID NO：1232
已描述Xist正向3F5和反向2R引物(赵等人，2008)。对于链特异性cDNA合成，使用反向引物，用SYBR绿(伯乐)执行qPCR，并且记录阈值交叉(Ct)。将每个值归一化成输入RNA水平。
RNA印迹分析
将5μg聚(A+)RNA从16.7ES细胞中分离，通过含有甲醛的0.8％琼脂糖凝胶分离开，印迹到Hybond-XL(通用电气医疗集团(GEHealthcare))上，并且使用Ultrahyb(Ambion)在42℃下杂交至探针。使用STRIP-EZ PCR试剂盒(Ambion)产生探针并且使用以下各项自基因组DNA扩增：
Malat1-AS-F，5’-TGGGCTATTTTTCCTTACTGG-3’；SEQ ID NO：1233
Malat1-AS-R，5’-GAGTCCCTTTGCTGTGCTG-3’；SEQ ID NO：1234
(Gtl2)Meg3-F，5’-GCGATAAAGGAAGACACATGC-3’；SEQ IDNO：1235
Meg3-R，5’-CCACTCCTTACTGGCTGCTC-3’；SEQ ID NO：1236
Meg3ds-F3，5’-ATGAAGTCCATGGTGACAGAC-3’；SEQ ID NO：1237
Meg3ds-R2，5’-ACGCTCTCGCATACACAATG-3’；SEQ ID NO：1238
Rtl1-F，5’-GTTGGGGATGAAGATGTCGT-3’；SEQ ID NO：1239
Rtl1-R，5’-GAGGCACAAGGGAAAATGAC-3’；SEQ ID NO：1240
Nespas ds-F，5’-TGGACTTGCTACCCAAAAGG-3’；SEQ ID NO：1241
Nespas ds-R，5’-CGATGTTGCCCAGTTATCAG-3’；SEQ ID NO：1242
Bgn-AS-F，5’-CAACTGACCTCATAAGCAGCAC-3’；SEQ ID NO：1243
Bgn-AS-R，5’-AGGCTGCTTTCTGCTTCACA-3’；SEQ ID NO：1244
Htr6up-F，5’-ATACTGAAGTGCCCGGAGTG-3’；SEQ ID NO：1245
Htr6up-F，5’-ATACTGAAGTGCCCGGAGTG-3’；SEQ ID NO：1246
UV-交联RIP
使用现有方法进行UV-交联IP，例外的是RNA蛋白复合物中的转录物在RNA分离之前不通过RNA酶处理修整，以便于保存全长RNA用于RT-PCR。以254nm、400mJ/cm2(使用Stratagene STRATALINKER)UV照射小鼠ES细胞，用破坏性超声处理将细胞核溶解在RSB-TRITON缓冲液(10mM Tris-HCl，100mM NaCl，2.5mM MgCl2，35μg/mL毛地黄皂苷，0.5％曲通X-100)中。在4℃下，用鲑鱼***DNA/蛋白琼脂糖珠粒将细胞核溶解物预清洁1小时，并且用抗体孵育过夜。然后用蛋白A DYNABEADS(英杰公司)沉淀RNA/抗体复合物，首先在低严格性缓冲液(1XPBS[150mM NaCl]，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸盐，0.5％NP-40)中洗涤，然后在高严格性高盐缓冲液(5XPBS[750mM NaCl]，0.1％SDS，0.5％脱氧胆酸盐，0.5％NP-40)中洗涤两次，并且用蛋白酶K来处理。使用TRIZOL(英杰公司)来提取RNA，并且如上所述进行RT-qPCR。
人PRC2组分的表达和纯化
对于人PRC2亚单位的表达，pFastBac1中N末端标注标记的EZH2和SUZ12在Sf9细胞中进行表达。对于整个PRC2复合物的表达，标注标记的EZH2与未标记的SUZ12、EED以及RBAP48共表达。通过在BC300缓冲液(20mM HEPES pH 7.9，300mM KCl，0.2mM EDTA，10％甘油，1mM DTT，0.2mM PMSF以及完全蛋白酶抑制剂(罗氏(Roche))中进行四个冷冻-解冻循环来制备提取物，并且与M2珠粒结合4小时并且在用0.4mg/ml标注肽在BC300中洗脱之前用BC2000洗涤。将EZH2和PRC2调节至100mM KCl并且加载到HiTrap肝素FF 1ml柱上并且用100至1000mM KCl梯度洗脱。使用Amicon ultra 10kDaMWCO浓缩器(密理博公司)浓缩峰部分并且将它们加载到用BC300平衡的Superose 6柱上。收集并且浓缩峰部分。对于SUZ12，将标注洗脱浓缩并且将其加载到用BC300平衡的Superdex 200柱上。
电泳迁移率位移测定(EMSA)
对于RNA-EMSA，将30nt Hes-1探针(反义方向上TSS下游约270bp)用于凝胶位移。使用T4多核苷酸激酶(Ambion)用[γ-33p]ATP放射性标记RNA探针。在4℃下，用标记的探针将纯化的PRC2蛋白(1μg)孵育1小时。在250V下，在4℃下，在0.5×TBE中，在4％非变性聚丙烯酰胺凝胶上分离RNA蛋白复合物，持续1小时。干燥凝胶，并且将其暴露于Kodak BioMax胶片。
RNA拉下测定
将T7启动子序列结合到RepA，Xist外显子1和截短Gtl2的PCR产物的正向引物中。将全长Gtl2克隆到pYX-ASC中并且将XistE1克隆到pEF1/V5/HisB(英杰公司)中。特定的引物序列为：
RepA-F：TAATACGACTCACTATAGGGAGAcccatcggggccacggatacctgtgtgtcc；SEQ ID NO：1247
RepA-R：taataggtgaggtttcaatgatttacatcg；SEQ ID NO：1248
截短型-Gtl2-F：TAATACGACTCACTATAGGGAGATTCTGAGACACTGACCATGTGCCCAGTGCACC；SEQ ID NO：1249
截短型-Gtl2-R：CGTCGTGGGTGGAGTCCTCGCGCTGGGCTTCC；SEQ ID NO：1250
Xist E1-F：atgctctgtgtcctctatcaga；SEQ ID NO：1251
Xist E 1-R：gaagtcagtatggagggggt；SE Q ID NO：1252
然后使用Mega Script T7(Ambion)转录RNA，使用Trizol纯化，并且缓慢冷却以便促进二级结构形成。对于拉下测定，将3μg标注-PRC2或标注-GFP和补充有20U RNAsin的5pmol RNA在冰上孵育30分钟。添加10μl标注珠粒，并且在4℃下，将这些标注珠粒在旋转轮(rotatingwheel)上孵育1小时。用含有150mM KCl、25mM Tris pH 7.4、5mMEDTA、0.5mM DTT、0.5％NP40以及1mM PMSF的200μl缓冲液将珠粒洗涤3次。通过添加35μl 0.2M-甘氨酸pH 2.5将RNA蛋白复合物从标注珠粒中洗脱出来。通过添加1/10th体积的1M Tris pH 8.0来中和洗脱液，并且通过凝胶电泳来分析。
敲除分析和qRT-PCR
将shRNA寡核苷酸克隆到MISSION pLKO.1-puro(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))载体中，并且通过脂质转染胺2000(英杰公司)将该shRNA寡核苷酸转染到野生型小鼠ES细胞中。在嘌呤霉素选择10天之后，收集细胞并且进行qRT-PCR以便验证RNA敲除。相应的错义序列(scrambled sequence)(MISSION脱靶shRNA)用作对照(Scr)。用于Gtl2的shRNA寡核苷酸：(上链)5′-CCG GGC AAG TGA GAG GACACA TAG GCT CGA GCC TAT GTG TCC TCT CAC TTG CTT TTTG-3′；SEQ ID NO：1253(下链)5′-AAT TCA AAA AGC AAG TGA GAGGAC ACA TAG GCT CGA GCC TAT GTG TCC TCT CAC TTG C-3′；SEQ ID NO：1254。用于Gtl2和Gtl2-as RNA的qPCR引物如上所述。用于Dlk1RNA的引物：(正向)5′-ACG GGA AAT TCT GCG AAA TA-3′；SEQ ID NO：1255(反向)5′-CTT TCC AGA GAA CCC AGG TG-3′；SEQID NO：1256。另一个Gtl2shRNA购自开放的生物***公司(OpenBiosystems)(v2MM_97929)。通过qPCR来测试在用这种shRNA敲除之后的Ezh2水平。在测试多个克隆之后，我们总结出Gtl2可以在早期传代克隆中敲除(50％至70％)，但敲除的克隆难以长期维持在培养物中。
DNA ChIP和实时PCR
如所描述进行ChIP(赵等人，2008)。每次IP使用5μlα-Ezh2抗体(Active Motif 39103)、正常的兔IgG(Upstate 12-370)以及α-H3K27me3(Upstate)。用prGtl2F/prGtl2R在Gtl2近端DMR，用DMR-F/DMR-R在Gtl2远端DMR，用prDlk1F/prDlk1R在Dlk1启动子以及用prGAPDH-F/prGAPDH-R在Gapdh启动子处进行针对ChIP DNA的实时PCR。引物序列是如下：
近端-DMR 5’-CATTACCACAGGGACCCCATTTT；SEQ ID NO：1257
近端-DMR 5’-GATACGGGGAATTTGGCATTGTT；SEQ ID NO：1258
prDlk1F 5’-CTGTCTGCATTTGACGGTGAAC；SEQ ID NO：1259
prDlk1R 5’-CTCCTCTCGCAGGTACCACAGT；SEQ ID NO：1260
远端-DMR-F 5’-GCCGTAAAGATGACCACA；SEQ ID NO：1261
远端-DMR-R 5’-GGAGAAACCCCTAAGCTGTA；SEQ ID NO：1262
prGAPDH-F5’-AGCATCCCTAGACCCGTACAGT；SEQ ID NO：1263
prGAPDH-R 5’-GGGTTCCTATAAATACGGACTGC；SEQ IDNO：1264
prActin-F 5’-GCA GGC CTA GTA ACC GAG ACA；SEQ ID NO：1265
prActin-R 5’-AGT TTT GGC GAT GGG TGC T；SEQ ID NO：1266
以下材料和方法用于下文给出的实例6至10中。
LNA核转染-将2×106个SV40T转化的MEF重悬浮在100μl Mef核转染溶液(龙沙(Lonza))中。将Cy3标记的LNA分子添加至2μM的最终浓度。使用T-20程序来转染细胞。将2ml培养基添加至细胞，并且每个时间点将100μl这种悬浮液铺在一个凝胶化10孔载玻片上。使用Exiqon软件(exiqon.com处可获得)设计LNA序列。策略性地引入修饰的LNA碱基以便最大化靶亲和力(Tm)，同时最小化自杂交分值。LNA分子序列(从5’至3’)是如下：
LNA-Scr，GTGTAACACGTCTATACGCCCA；SEQ ID NO：1267
LNA-C1，CACTGCATTTTAGCA；SEQ ID NO：1268
LNA-C2，AAGTCAGTATGGAG；SEQ ID NO：1269
LNA-B，AGGGGCTGGGGCTGG；SEQ ID NO：1270
LNA-E，ATAGACACACAAAGCA；SEQ ID NO：1271
LNA-F，AAAGCCCGCCAA；SEQ ID NO：1272
LNA-4978，GCTAAATGCACACAGGG；SEQ ID NO：1273
LNA-5205，CAGTGCAGAGGTTTTT；SEQ ID NO：1274
LNA-726，TGCAATAACTCACAAAACCA；SEQ ID NO：1275
LNA-3’，ACCCACCCATCCACCCACCC；SEQ ID NO：1276
实时PCR-在核转染之后使用Trizol(英杰公司)提取总RNA。使用Superscript II试剂盒进行逆转录酶反应，并且使用icycler SYBR绿化学法(伯乐)对cDNA样品进行实时PCR。
ChIP-在核转染之后，在不同的时间点将细胞固定在1％甲醛溶液中。通过添加甘氨酸至0.125M来停止固定，并且如先前所述(28)进行ChIP并且通过qPCR量化。
抗体-购买用于不同表位的抗体如下：H3K27me3、Active Motif39535；Ezh2，Active Motif 39639；以及BD Pharmingen 612666。对于免疫染色，以1∶100的稀释度使用H3K27me3抗体，并且以1∶500使用Ezh2抗体(BD Pharmingen)。Alexa-Fluor第二抗体来自英杰公司。对于蛋白质印迹法，以1∶2000的稀释度使用Ezh2抗体(BD Pharmingen)。以1∶5000的稀释度使用肌动蛋白抗体(西格玛A2066)。
DNA FISH、RNA FISH以及免疫染色-细胞在凝胶化载玻片或细胞旋转玻片(cytospun)上生长。基于现有方法进行RNA FISH、DNA FISH、系列RNA-DNA FISH、免疫染色以及免疫FISH。使用缺口平移标记的pSx9-3探针或Xist核糖核酸探针组合(cocktail)来进行Xist RNA FISH。pSx9-3用作Xist DNA FISH的探针。对于中期分布，将秋水仙碱添加至细胞，持续1小时。用胰蛋白酶处理细胞并且在室温下，使它们在3ml0.056M KCl中重悬浮30分钟，将这些细胞离心并且重悬浮在甲醇∶乙酸(3∶1)固定剂中。在固定剂更换若干次之后，将细胞滴在冷硬的载玻片上并且针对RNA或DNA FISH进行处理。
实例1.通过RIP-seq捕获PRC2转录组
通过将两种现有方法天然RIP和RNA-seq组合来开发捕获结合至PRC2的RNA的全基因组集合的方法(这种方法在此称为“RIP-seq”)。将通过α-Ezh2抗体免疫沉淀的核RNA从小鼠ES细胞和Ezh2-/-对照物分离，使用链特异性适配子产生cDNA，并且纯化从200至1,200nt的那些并且使它们经受Illumina测序。
在中试实验中，我们对107个ES细胞进行RIP并且包括若干对照RIP以便评定α-Ezh2拉下(pulldown)的特异性。在野生型拉下以及其技术和生物复制物中，α-Ezh2抗体从107个ES细胞沉淀出70至170ngRNA，并且产生＞200nt的cDNA涂片。用RNA酶的处理消除了这个大小范围内的产物，并且-RT样品未产生产物，从而表明免疫沉淀的材料确实为RNA。当野生型细胞通过IgG(约24ng)来免疫沉淀时，Ezh2-/-拉下中存在小于约10倍的RNA(约14ng)。还观察到模拟(mock)RIP对照物(无细胞)上500倍的富集。在＞200nt的大小范围内，对照RIP(空细胞，IgG拉下，模拟)甚至进一步耗尽RNA，因为这些样品大多数是适配子和引物二聚物。可计算地滤出适配子/引物二聚物、rRNA、线粒体RNA、＜18nt或具有不定核苷酸的读取段以及超过15个碱基的均聚物延伸段(homopolymer runs)。在等量细胞下，对照RIP显著耗尽读取段。在野生型库中，在过滤之后剩余231,880至120万个读取段。对比之下，对照物中仅剩余4,888至73,691个读取段。对照物中的大多数转录物具有虚假性质(适配子/引物二聚物、均聚物等)。因此，野生型RIP与对照RIP相比较展现出实质性的RNA富集以及更大程度的RNA复杂性。
野生型库中接近所有读取段的一半表示三次或更多次。甚至在去除复本以便避免潜在的PCR人为产物之后，野生型库仍含有301,427个相异的读取段(技术和生物复制物分别为98,704和87,128)，然而对照样品仅产生1,050(IgG)和17,424(空)。野生型库彼此之间高度类似，其中在分别与Ezh2-/-和IgG对照物相比较时的0.27至0.01相比较，相关系数(CC)为0.71至0.90。映射至＞10拷贝/基因组的重复元件的读取段占据总野生型读取段的＜20％，其中样品重复是最常见的并且占据85.714％，而LINE、SINE和LTR表示相对不足。由于具有≤10个比对的读取段具有最大表示，在下文中我们将分析集中于这些读取段(≤10的截断值保留具有低拷贝基因组复本的基因)。
通过绘制随染色***置而变的相异读取段来检查基因组分布。比对显示PRC2相关RNA出现在野生型库中的每个染色体上。IgG和Ezh2-/-对照物的比对展现出少数且分散的读取段。因此，针对PRC2转录物组，我们的RIP-seq产生了特定的且可复制的图谱。大量野生型读取段命中X染色体，并且X失活中心的缩放(zoom)显示出我们的阳性对照-Tsix、RepA和Xist RNA各自表现几十次。RIP-seq检测的高灵敏性通过RepA和Xist的表示来表明，RepA和Xist总体表达为＜10拷贝/ES细胞。在另一方面，X失活中心的其他非编码RNA未发生命中。因此，RIP-seq技术既具有灵敏性又具有特异性。
实例2.PRC2转录组
为了获得饱和覆盖度，扩大测序规模，并且获得原始野生型样品的3190万个读取段以及其生物复制物的3640万个读取段。在去除复本和过滤之后，针对每个库分别保留比对≤10的1,030,708和852,635个相异读取段。然后将这些读取段与中试野生型读取段结合以用于随后的分析(此后为，WT库)并且将Ezh2-/-库用作对照来进行所有分析。
基于WT对空库中的相对表示来设计策略，从而推测出WT中应富集真正的阳性。使用“读取段/千碱基/百万读取段”(RPKM)作为测序的基因长度和深度的归一化手段来计算基因表示，并且之后将接合UCSC的转录组中的所有39,003个转录物通过其WT RPKM(x轴)和其空RPKM(y轴)值映射至散点图。在两个库中零表示或接近零表示的转录物占据了大多数数据点[(0，0)的蓝云(blue cloud)]。具有非零x值和零y值的转录物指示仅在WT拉下中表示的群体。为了确定适当的富集阈值，我们进行计算机差减法(in silico subtraction)。针对相同的校准物，检查WT/空RPKM比例。Xist/RepA分值为4.18/0，这表明WT库中存在数百至数千的表示，但空库中不存在表示。Tsix分值为10.35/3.27，Bsn pasr为0.95/0，并且Kcnq1ot1为1.17/0。阴性对照分值为较小比例，其中Pax3-pasr为0.11/0.26，Hey1-pasr为0.28/0，Hotair为0.25/0，Insl6为0.27/3.09并且Ccdc8为0.22/5.04。基于这一点，要求3∶1的RPKM(WT)/RPKM(空)富集比以及0.4的最小RPKM。
“PRC2转录组”的转录物鉴别是基于以下事实：野生型细胞系中的EZH2抗体拉下的RNA比Ezh2空系多约10倍，从而指示野生型库高度富集了PRC2相关转录物，并且另外的计算机差减法是不必要的。使用这个标准，扩增的PRC2转录组的大小估算为约57K RNA。
实例3：来自附录I的PRC2结合峰(PRC2相关区)的鉴别
在一些或任何实施例中，蛋白结合伴侣(例如，PRC2)所结合的RNA的区域为单链寡核苷酸被设计来与之杂交的靶lncRNA上的一个示例性位置。例如，这些区域可以通过查阅附录I中的数据并鉴别数据集中富集的区域来鉴别；这些区域可能包括PRC2结合序列。
附录I中的序列读取段直接获自Illumina GA II基因组分析仪并且定向成PRC2结合转录物的反向补体。附录I为生物信息学过滤去除适配子/引物二聚物、线粒体RNA、rRNA、均聚物、具有不定核苷酸的读取段以及截短读取段(＜15nt)之后的所有读取段的过滤子集。这些区域可能代表在以上实例1(RIP-seq方法)中所描述的RIP和随后的RNA纯化步骤期间受到最佳保护而免于内源性核酸酶破坏的区域，并且因此代表结合至PRC2或相关联的蛋白或复合物的RNA的候选区。根据附录I，提取与转录物对应的读取段，这些转录物富集了3∶1的WT对空[RPKM(WT)/RPKM(空)≥3.0]并且具有的最小RPKM值为0.4。读取段(峰)连续累积的PRC2结合转录物的区域被鉴别并且被视作是RNA内的候选PRC2接触区。
附录I中的序列读取段用于使用博德研究所(Broad Institute)的Arachne比对器ShortQueryLookup来产生参考基因组上的序列覆盖度，ShortQueryLookup是基于制作参考基因组的k-mer(K＝12)词典并且基于基因组中的匹配k-mer位置来在读取段的候选位置上进行局部的史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)比对。比对器进行多次放置。最佳比对被允许具有至多一个误差，并且还可接受与最佳比对误差数量相差1的比对。覆盖度通过除以读取段比对的位置数量来归一化(例如，如果读取段与四个位置对准，向四个位置中的每个碱基添加0.25)。
为了获得靶峰，使用以下方法。基准水平的小鼠(mm9)区域覆盖度记录(file)用作起点，在这些区域中，所富集的野生型转录组覆盖度为Ezh2-/-转录组覆盖度的至少三倍，并且具有的最小RPKM覆盖度为至少0.4。该覆盖度为链特异性的。接着，在长度为100bp的非重叠连续窗口中，确定峰值以及其位置。然后，针对位于窗口边缘、确定位于较大峰一侧的那些峰，校正峰位置。那些峰移至较大峰的顶部。然后去除重复的峰位置。位于平顶的峰位置移至平顶的中心。然后使用高斯核函数(Gaussian kernel)(1/sqrt(2＊σ＊pi))＊exp(-t^2/(2＊σ))来使覆盖度平滑，其中σ＝5.0。之后通过将最近位置定位至峰以使得平滑覆盖度小于或等于三分之一最大覆盖度来确定峰宽。彼此重叠的邻近峰通过将边界放置在它们之间、在峰之间的中点来分辨。然后将峰与峰的位置、宽度、最大幅值以及宽度之下的未平滑的覆盖度总和输出到表中。mm9中的小鼠峰的相应的核苷酸序列(通过用U置换T来转化成RNA)出现在序列B47,408至B616,428[小鼠峰]中。在如在此所述的UCSC基因组浏览器中进行这些小鼠峰的小鼠染色体坐标和链的小鼠对人LiftOver，以便产生直向同源人染色体坐标。这个过程和LiftOver连锁在本领域中是已知的。当每个小鼠峰的小鼠坐标(mm9)转化成相应的人(hg19)坐标时，50、65、75和95的映射百分比产生基本上相同的位置和长度结果，而不管何时发生匹配。因此，使用50％的映射参数。
每个相应的人峰RNA序列(即，人染色体坐标和链的核苷酸序列通过用U置换T来转化成RNA)出现在序列B652,256至B916,209[人峰]中。表1显示出小鼠序列和相应的人序列。将这些人峰和人PRC2转录组(即，PRC2结合转录物的人序列)与来自NCBI数据库的已知基因交叉以便鉴别PRC2结合RNA靶向的基因(即，交叉基因或邻近基因)。
国际专利申请公开WO/2012/087983的表2示出小鼠和人峰的注释与每个峰附近或与其交叉的基因名称。与人基因(前部列出)或小鼠基因(后部列出)相关联的独特的NCBI基因ID出现在邻近基因名称的括号内。峰坐标与基因坐标之间的重叠程度出现在方括号内。正数指示两者之间的重叠核苷酸的数量，并且负数表示两者之间的间隙的大小(即，两者之间距离的核苷酸数量)。对于峰，方括号内的“F”指示峰坐标完全与基因坐标重叠。对于转录物，方括号内的“F”指示转录物坐标完全与基因坐标重叠，或反之亦然。RNA转录物或峰相对于参考基因在“相反链”列中“反义”，而RNA转录物或峰在“相同链”列中在与参考基因相同的“有义”取向上。
生物信息学分析指示平均峰为约40至60个碱基，这对单链寡核苷酸的初始设计而言是优良的大小。这些峰各自完全由附录I中的反向补体读取段表示，因为每个峰与来自附录I的重叠的反向补体读取段的片段对应。在编码基因的任何地方以及无论是有义取向还是反义取向上都可以找到这些峰。还可以在启动子/5’UTR区、内含子、内部外显子和3’UTR以及除此之外的地方找到峰。分析强烈表明PRC2相互作用转录物不是蛋白编码mRNA，而是与mRNA序列重叠的一个或多个相异转录物。许多为先前未描述的新RNA。
在此披露的方法可以用于设计以足够的特异性结合至靶位置或片段，或与靶RNA充分互补以便给出所希望的效果的单链寡核苷酸。在一些实施例中，这些方法包括使用本领域中已知的生物信息学方法来鉴别具有二级结构例如一个、两个或更多个茎环结构或假结(pseudoknots)的区域，并且选择单链寡核苷酸所靶向的那些区域。
长度为5至500个核苷酸，或长度为约5至约100个核苷酸，或长度为约2kb，包含峰内或紧邻其的至少五(5)个连续核苷酸的伸展段的另外的靶片段被认为同样适于靶向作用。
对于与较长的人转录物序列不匹配的人峰中的每一个而言，周围的人染色体序列的较长的2kb片段被鉴别，并且出现在序列B916,626至B934,761[环绕人峰的较大区域]中。
实例4.支持RNA直接结合至人峰区内或周围的PRC2的证据
执行实验来测试以下想法：实例2中使用这个标准来鉴别的RNA直接结合PRC2。使用纯化的重组人PRC2亚单位EED、EZH2、SUZ12以及RBAP48来进行体外生化分析。新鉴别的Hes1(Notch信号转导路径中的转录因子)的反义RNA含有双茎环结构，还在RepA中发现的基序。在RNA电泳迁移率位移测定(EMSA)中，28-nt RepA和30-nt Hes1-as探针都通过PRC2来移动，而来源于Xist(DsI，DsII)的其他区域的RNA却并非如此。茎环结构突变会减少PRC2结合。为了确定PRC2的哪个亚单位结合Hes1-as，我们使用特异性亚单位来进行EMSA。EZH2使野生型强烈移动，但未使突变Hes1-as RNA移动，而SUZ12或EED均未使Hes1-as移动。在使用整个PRC2时，RNA蛋白位移总是较为离散，从而表明其他亚单位稳定了相互作用。
这些结果显示Hes1-as RNA直接并特异性地与PRC2相互作用，并且Ezh2为RNA结合亚单位。另外的证据来自于以下观察，Xist/Tsix基因座内的两个最大峰定位至重复A区(Repeat A region)，该重复A区为已知在正向链和反向链两者上直接与EZH2相互作用的28-nt重复基序。来源于“峰”的RNA片段显示出PRC2的稳固移动，而定位在“峰”之外的那些片段薄弱地移动。因此我们认为国际专利申请公开WO/2012/087983的表2的许多(如非全部)鉴别的“峰”表示RNA的PRC2真正相互作用的结构域。这些结果显示峰以及可能的邻近区域直接并特异性地与PRC2复合物相互作用。
实例5.单链寡核苷酸对上调mRNA表达的体外影响
A.ApoE
单链寡核苷酸被设计来靶向lncRNA以便于上调ApoE。寡核苷酸具有小于16个碱基的长度，并且包含全部由硫代磷酸酯键连接的未修饰的DNA和多个锁定核酸修饰的碱基。按照下文简单地执行转染和数据分析。
使用Promega SV 96总RNA分离***，省略DNA酶步骤来从Hep3B细胞收获RNA。在单独的中试实验中，确定50ngRNA是用于逆转录酶反应的足够的模板。将从Hep3B细胞收获的RNA归一化以使得50ngRNA输入至每个逆转录反应中。对于太稀而不能达到这个限值的少数样品，添加最大输入体积。然后完成定量PCR评价。
通过如上所概述的定量PCR确定ApoE mRNA表达的基线水平。还确定组成性表达的不同管家基因的mRNA的基线水平。对于ApoE，出于比较目的选择具有与ApoE mRNA近似相同的基线表达水平的“对照”管家基因。
以25,000细胞/500uL的密度将Hep3B细胞接种到24孔培养板中的每个孔中，并且用脂质转染胺和单链寡核苷酸进行转染。对照细胞只含有脂质转染胺。在转染48小时后，在-80℃下，存储约200uL细胞培养物上清液以用于ELISA。在转染48小时后，从Hep 3B细胞收获RNA，并且如上所概述的执行定量PCR。通过每个单链寡核苷酸诱导的ApoEmRNA表达的百分比通过将在单链寡核苷酸存在下的mRNA水平相对于在对照物(脂质转染胺单独)存在下的mRNA水平归一化来确定。将这与“对照”管家基因的mRNA表达的提高并行比较。
总共26种测试的寡核苷酸与根据以上实例2鉴别的PRC2结合RNA序列互补。在这26种寡核苷酸中，7种上调了人Hep3B细胞内的apoE表达，如由相对于“对照”管家基因提高的ApoE mRNA水平所指示。
使用人肾近端小管上皮细胞(RPTEC)重复以上程序。在与根据以上实例2鉴别的PRC2结合RNA序列互补的26种寡核苷酸中，相对于“对照”管家基因，5种提高肾细胞内的ApoE mRNA水平。相对于基线表达，水平提高了约1.5倍至约5倍。
此外，在与根据以上实例3鉴别的与apoE相关联的峰互补的11种寡核苷酸中，3种上调了apoE表达。
已证明长度短至8个核碱基的单链寡核苷酸可上调基因表达。
B.Nkx2-1
针对设计来靶向lncRNA的单链寡核苷酸，重复如以上实例5A中所描述的实验以便于上调Nkx2-1。总共13种测试的寡核苷酸与根据以上实例2鉴别的PRC2结合RNA序列互补。在这13种寡核苷酸中，如由相对于基线提高的Nkx2-1mRNA表达所指示，3种上调了Nkx2-1表达，但没有“对照”管家基因可以与Nkx2-1匹配，这归因于低水平的固有表达。此外，在与根据以上实例3鉴别的与Nkx2-1相关联的峰互补的9种寡核苷酸中，3种上调了Nkx-21表达。
C.Brca1
针对设计来靶向lncRNA的单链寡核苷酸，重复如以上实例5A中所描述的实验以便于上调Brca1。总共30种测试的寡核苷酸与根据以上实例2鉴别的两个PRC2结合RNA序列互补。在这30种寡核苷酸中，5种寡核苷酸上调了Brca1表达。在这30种寡核苷酸中，13种寡核苷酸还与根据以上实例3鉴别的与Brca1相关联的峰互补。在与峰互补的这13种寡核苷酸中，2种寡核苷酸上调了Brca1表达。相对于基线表达，水平提高了约2倍至约3倍。
D.Smad7
针对设计来靶向序列表中给出的lncRNA的单链寡核苷酸，重复如以上实例5A中所描述的实验以便于上调Smad7，但有以下例外：使用肾细胞系RPTEC来替代HepB3。总共28种测试的寡核苷酸与序列B18602互补。在这28种寡核苷酸中，4种上调了Smad7表达。此外，在与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中与Smad7相关联的峰互补的28种寡核苷酸中，4种上调了Smad7表达。
E.SirT6
针对设计来靶向lncRNA的单链寡核苷酸，重复如以上实例5A中所描述的实验以便于上调SirT6。总共25种测试的寡核苷酸与根据以上实例2鉴别的PRC2结合RNA序列互补。在这25种寡核苷酸中，3种上调了SirT6表达。总共2种测试的寡核苷酸与根据以上实例2鉴别的另一个PRC2结合RNA序列互补。在这2种寡核苷酸中，1种上调了SirT6表达。总共2种测试的寡核苷酸与根据以上实例2鉴别的另一个PRC2结合RNA序列互补。在这2种寡核苷酸中，两种都未上调SirT6表达。相对于基线表达，水平提高了2倍至6倍。此外，在与根据以上实例3鉴别的与SirT6相关联的峰互补的6种寡核苷酸中，1种上调了SirT6表达。
F.SerpinF1
针对设计来靶向lncRNA的单链寡核苷酸，重复以上实例5A中所描述的实验以便于上调SerpinF1。总共38种测试的寡核苷酸与根据以上实例2鉴别的两个PRC2结合RNA序列互补。在这38种寡核苷酸中，3种上调了SerpinF1表达。相对于基线表达，水平提高了1.2倍至2倍。此外，在与根据以上实例3鉴别的与SerpinF1相关联的峰互补的32种寡核苷酸中，3种上调了SerpinF1表达。
G.KLF1
针对设计来靶向如国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中给出的lncRNA的单链寡核苷酸，重复如以上实例5A中所描述的实验以便于上调KLF1。总共30种测试的寡核苷酸与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中的序列B15688和B15689互补。在这30种寡核苷酸中，15种上调了人Hep3B细胞内的KIF1表达，如由相对于“对照”管家基因提高的KLF1mRNA水平所指示。此外，在与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中与KLF1相关联的峰互补的2种寡核苷酸中，1种上调了KIF1表达。相对于基线表达，水平提高了2倍至50倍。
H.Rps19
针对设计来靶向如国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中给出的lncRNA的单链寡核苷酸，重复如以上实例5A中所描述的实验以便于上调rps19。总共30种测试的寡核苷酸与序列B630259和B630260互补。在这30种寡核苷酸中，7种上调了rps19表达，如由相对于“对照”管家基因提高的rps19mRNA表达所指示。此外，在与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中与rps19相关联的峰互补的25种寡核苷酸中，7种上调了Rps19表达。相对于基线表达，水平提高了1.2倍至1.6倍。
I.PTEN
针对设计来靶向如国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中给出的lncRNA的单链寡核苷酸，重复如以上实例5A中所描述的实验以便于上调PTEN。总共40种测试的寡核苷酸与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中的序列B650,560和B650,559互补。在这40种寡核苷酸中，18种寡核苷酸上调了PTEN表达。在这40种寡核苷酸中，31种还与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中与PTEN相关联的峰互补。在与峰互补的这31种寡核苷酸中，11种寡核苷酸上调了PTEN表达。相对于基线表达，水平提高了约1.5倍至约5倍。
J.EPO
针对设计来靶向如国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中给出的lncRNA的单链寡核苷酸，重复如以上实例5A中所描述的实验以便于上调***(EPO)。总共13种测试的寡核苷酸与序列B932,189或B932,190互补。在这13种寡核苷酸中，5种上调了EPO表达。此外，在与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中与EPO相关联的峰互补的2种寡核苷酸中，1种上调了EPO表达。相对于基线表达，水平提高了4倍。
使用可商购试剂盒[DEP00，RnD***]的ELISA测定根据制造商的说明书来使用以便确定细胞上清液中存在的分泌的蛋白。通过将寡核苷酸诱导的蛋白水平相对于对照物(脂质转染胺单独)诱导的蛋白水平归一化来确定蛋白的诱导倍数。数据显示，在所测试的提高EPO mRNA表达的1种寡核苷酸中，该寡核苷酸证明了相应的EPO蛋白表达的提高。体内测试与序列B14486和B14487(与小鼠EPO基因重叠的转录物)互补的3种寡核苷酸上调小鼠EPO表达的能力。
此外，同样测试靶向下游峰区的其他两种寡核苷酸。在这些中，4种寡核苷酸与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中与EPO相关联的峰区互补。向雄性C57Bl6/J小鼠[6至8周龄和20至25g]皮下给予单次寡核苷酸注射，剂量为100μl无菌磷酸盐缓冲食盐水中10mg/kg或25mg/kg。
在注射之后48小时的时间点，经由心脏穿刺法来取终末血液样品，并且使用ELISA测定[MEP00，RnD***]根据制造商的说明书来测定EPO蛋白的水平。在所测试的与序列B14486或B14487或峰互补的寡核苷酸中，在25mg/kg的剂量下，一种展现出EPO蛋白的5倍诱导，并且另一种展现出7倍诱导。在体内诱导EPO蛋白表达的这两种寡核苷酸中，一种在为序列B461812的小鼠峰的150个碱基内(并且另一种在该小鼠峰的1500个碱基内)，并且两者都处在与该小鼠峰相反的链上。这个小鼠峰与序列B845472的人峰对应。
K.BDNF
针对设计来靶向如国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中给出的lncRNA的单链寡核苷酸，重复如以上实例5A中所描述的实验以便于上调BDNF。总共21种测试的寡核苷酸与序列B620236和B620237互补。在这21种寡核苷酸中，9种上调了BDNF表达。总共2种测试的寡核苷酸与序列B130,694互补。在这2种寡核苷酸中，1种上调了BDNF表达。相对于基线表达，水平提高了1.5倍至6倍。此外，在与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中与BDNF相关联的峰互补的14种寡核苷酸中，6种上调了BDNF表达。相对于基线表达，水平提高了2倍至7倍。
L.颗粒体蛋白(Granulin)
针对设计来靶向如国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中给出的lncRNA的单链寡核苷酸，重复如以上实例5A中所描述的实验以便于上调颗粒体蛋白。总共30种测试的寡核苷酸与序列B640164和B192311互补。在这30种寡核苷酸中，6种上调了颗粒体蛋白表达，如由相对于“对照”管家基因提高的颗粒体蛋白mRNA表达所指示。此外，在与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中与颗粒体蛋白相关联的峰互补的22种寡核苷酸中，4种上调了颗粒体蛋白表达。相对于基线表达，水平提高了1.5倍至2倍。
M.KLF4
总共30种测试的寡核苷酸与序列B624099互补。在这30种寡核苷酸中，13种上调了人Hep3B细胞内的KLF1表达，如由相对于“对照”管家基因提高的KIF4mRNA水平所指示。此外，在与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中与KLF4相关联的峰互补的20种寡核苷酸中，10种上调了KLF4表达。相对于基线表达，水平提高了2倍至15倍。
N.Fvii(因子VII)
针对设计来靶向如国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中给出的lncRNA的单链寡核苷酸，重复如以上实例5A中所描述的实验以便于上调Fvii。设计来靶向Fvii的寡核苷酸具有约20个碱基的长度，并且包含用2’-O-Me修饰的具有整个硫代磷酸酯键主链的DNA。总共25种测试的寡核苷酸与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中的序列B632564和B632565互补。在这25种寡核苷酸中，12种上调了Fvii表达。相对于基线表达，水平提高了2倍至25倍。此外，在与国际专利申请公开WO/2012/087983的表2中与Fvii相关联的峰互补的25种寡核苷酸中，12种上调了Fvii表达。
实例6.靶向Xist重复C的LNA分子使Xist RNA快速地从Xi移位
使用Geneious(Geneious v5.1，可在因特网geneious.com上获得)来比对重复C，并且合成与具有高度内部重复保守性的两个区域互补的LNA分子。第一LNA分子的所有14个重复(LNA-C1)中都显示出保守性，并且第二LNA分子在14个(LNA-C2)中的13个中显示出保守性。将LNA分子分开核转染到转化的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中，并且将细胞粘附到载玻片上并且在核转染后的0分钟(紧接在核转染之后)与8小时之间的不同时间点原位固定。为了检查对Xist RNA的影响，使用Xist特异性探针进行RNA荧光原位杂交(FISH)。(MEF细胞因转化而为四倍体的；每个四倍体细胞具有两个Xa和两个Xi)。在用错义LNA分子(LNA-Scr)转染的对照物中，在所有时间点，在80％至90％的细胞中观察到浓厚的Xist云。有趣的是，LNA-C1或-C2的引入导致Xist RNA立即从Xi丧失。甚至是在t＝0(在LNA引入之后立即(数秒至数分钟内)固定细胞)，约10％的核显示出Xist RNA团簇的松动，其中团簇看起来是暗淡且扩散的。核与全部Xist云的百分比在第一小时期间继续下降并且在t＝60分钟(21％，n＝190)时达到最小值。这些发现指示只要引入LNA分子，它们就破坏Xist与染色质的结合。然而，Xist从Xi中的丧失为暂时的，因为对未分化的胚胎干(ES)细胞中可见的初生转录物而言典型的Xist RNA的精确位置在t＝3小时时变得可见。直到核转染后8至24小时(81％在8小时，n＝117)，才看到Xist云的完全恢复。
下一个实验解决LNA分子在小鼠ES细胞、细胞在培养中分化时重现XCI的建立的离体模型中是否具有类似的影响。在未分化状态，野生型雌性ES细胞表达低水平的Xist RNA，通过RNA FISH作为精确位置信号可见。到分化的第6天，约40％的细胞正常具有上调的Xist RNA。当在第6天用LNA-C1核转染ES细胞时，Xist移位快速地发生，从而在1小时达到最大值并且通过8小时来恢复。因此，LNA分子在ES细胞中同在体细胞中一样有效。这些结果与从用siRNA或shRNA朝向Xist的相同区域核转染的MEF获得的那些形成了鲜明的对比。siRNA或shRNA在1、3或24小时的时间点都未导致Xist的丧失，并且仅在48小时时出现Xist云的部分减少(在1小时有83％，n＝84；在24小时有80％，n＝106)。因此，在多个细胞类型中，LNA分子可以使用极为迅速的动力学有效用于靶向长的细胞核ncRNA如Xist的，远远快于siRNA或shRNA的动作。
为了测试LNA分子的特异性，用重复C LNA分子核转染人293细胞。小鼠与人Xist/XIST之间的序列比较揭示了LNA-C1靶向的区域在15nt的10个中为保守的，并且对于LNA-C2，在14nt的10个中为保守的。错义LNA分子的核转染之后人细胞内XIST RNA FISH几乎在所有细胞(92％，n＝108)内显示出两个正常的XIST云。类似地，用LNA-C1或LNA-C2的核转染并未改变XIST云(LNA-C1，89％，n＝126；LNA-C2，85％，n＝139)。因此，小鼠重复C LNA分子并不影响人XIST定位，从而表明它们以物种特异性方式起作用。为了确定人重复C是否会使人XIST移位，我们将与人重复C互补的LNA分子核转染到293细胞中，但未观察到XIST云的丧失(在1小时有91％，n＝103；在3小时有87％，n＝95以及在8小时有92％，n＝85)。这个发现指示，虽然重复C可能在人体内发挥作用，但另外的人元件在RNA定位中起作用。虽然小鼠重复C出现了14次，但人重复仅出现一次。
实例7.Xist RNA在没有转录物脱稳定的情况下移位
若干机制可以解释Xist的消失。LNA分子可以退火至互补区并且靶向Xist用于降解。可替代地，与LNA分子杂交可以使Xist RNA从Xi移位，而不影响转录物稳定性。为了区分这些可能性，在不同的时间点，通过qRT-PCR来相对于Gadph水平(对照)量化Xist水平。在1小时时，当Xist云不再可见时，Xist水平与错义对照中可见的水平仍是相当的。甚至在3小时和8小时时，Xist水平也未显著改变。这些结果显示出Xist移位是在RNA未完全降解的情况下发生的。因此，LNA分子通过封闭Xist与染色质相互作用而非改变RNA的稳定性来起作用。
Xist的快速移位和恢复的缓慢动力学为研究与Xist的定位机制相关的若干未能解决的问题提供了机遇。为了明确Xist在Xi上的重现是归因于移位的Xist分子的重定位还是归因于新合成RNA的涂布，我们在放线菌素D(ActD)存在下进行时程分析，放线菌素D为RNA聚合酶II的抑制剂。先前研究已显示Xist在细胞中的半衰期为约4至6小时。据推测，用ActD处理细胞0至8小时在这个时间帧期间会阻止Xist RNA的新合成，并且因此Xist云的重现将暗示移位的RNA重定位回到Xi上。将LNA分子引入到细胞中，并且然后允许在含有ActD的培养基中回收这些细胞。在错义对照中，在不存在ActD下，在所有时间点，Xist云为清晰可见的。在存在ActD下，Xist云在1小时和3小时时间点为明显的，并且到8小时时丧失，与4至6小时的半衰期一致。在不存在ActD下允许回收的、经过LNA-C1-或LNA-C2-处理的样品中，Xist的精确位置在3小时时为可见的，并且Xist云到8小时时间点时恢复。然而，在存在ActD下，Xist云从未恢复，无论是全部还是部分。因此，LNA分子介导的从Xi的移位之后Xist恢复归因于新RNA合成而非移位转录物的重定位。
实例8.Xist RNA首先定位在X失活中心附近
进一步利用快速移位和缓慢恢复，我们将明确Xist是以逐步形式扩展还是同时定位在整个Xi上的长期存在的问题。一个假设为涂布起始于Xist基因座附近，并且通过沿X定位的加强元件(booster elements)进行至染色体的两端。可替代地，涂布可以通过多个X连接的接种点全部一次性发生，这些接种点将促进局部扩展。在3至8小时的恢复期期间分析中期染色体上的Xist定位在用错义LNA分子处理的细胞中，涂布有Xist RNA的所有中期染色体显示出与早期工作中描述的非均匀图案类似的带状图案。相比之下，经过LNA-C1处理的细胞给出了中间图案。在1小时时，中期染色体未显示出Xist RNA(0％，n＝41)的涂层。在3小时时，当Xist RNA可以视作是间期细胞中的精确位置时，主要图案为中期染色体中间单个亮色条带连同X上其他地点少量非常暗淡的条带(52％，n＝46)的组合。这个结果表明Xist RNA初始局部地结合。为了确定强RNA条带是否定位至Xist区，在非变性核上执行Xist RNAFISH，并且之后发生变性并杂交至Xist探针。事实上，在3小时标记点观察到的聚焦RNA条带与Xist区共定位。在5小时时，可以看到中等程度的涂布和强度(68％，n＝38)。在8小时时，主要图案为对对照细胞而言典型的全染色体染色图案(78％，n＝38)。在对照物中，在任何时间都无法观察到中间图案。这些发现主张，在FISH技术的时间和空间分辨率中，Xist RNA初始在附近结合，但看上去是同时扩展至Xi的其余部分。
实例9.Xist RNA移位伴随PRC2定位的丧失
多梳阻抑复合物2(PRC2)结合至Xi的模式是相当受关注的，因为它的Ezh2亚单位催化组蛋白H3在赖氨酸27处的三甲基化(H3K27me3)。若干研究已显示PRC2以Xist依赖方式定位至Xi，因为在ES细胞中缺失Xist妨碍分化过程中的PRC2募集，并且在MEF细胞中有条件地缺失Xist导致了Xi上PRC2的丧失。然而，PRC2募集至X并从其中丧失的动力学是未知的。由于Xist RNA直接募集PRC2，应明确LNA分子介导的Xist移位在LNA分子递送之后是否通过对MEF内Ezh2的免疫染色而导致PRC2的立即丧失。在用重复C LNA分子处理之后，Ezh2快速丧失。Xist与PRC2丧失之间存在几乎完全的一致性。在1小时和3小时时，在丧失Xist的核内从未观察到Ezh2焦点，并且相反地，在具有恢复的Xist云的核内总是观察到该Ezh2焦点。Xi上Ezh2的丧失归因于Ezh2蛋白转换。然而，PRC2的短暂移位在1至8小时的时间帧内并未导致H3K27me3的明显丧失。因此，针对初始靶向作用和建立XCI之后的稳定缔合两者，PRC2在Xi上的定位绝对取决于Xist RNA，但H3K27me3标记在Xist和PRC2移位的短期内为稳定的。
考虑到这一点，应明确LNA分子是否影响基因沉默。在3小时时，当Xist最大限度移位时，针对Xist进行RNA FISH，并且X连接的两个基因Pgk1或Hprt经受XCI。在对照核转染(LNA-Scr)细胞中，从Xi观察到Xist云，并且从Xa观察到初生Pgk1或Hprt转录物。用LNA-C1和LNA-4978核转染并未改变表达模式，因为在79％(n＝39)的对照物和80％(n＝36)的经过LNA-C1处理的细胞中仍可看到Pgk1转录物的两个焦点，并且在84％(n＝44)的对照物和79％(n＝35)的经过LNA-C1处理的细胞中可看到Hprt RNA的两个焦点。从未看到Pgk1或Hprt转录物的四个焦点。因此，与H3K27me3的保留相一致，Xist和PRC2的短暂丧失并不破坏沉默。
实例10.Xist定位要求重复C周围的较宽的结构域
下一个实验研究Xist内的其他保守的重复。由于重复A已显示对靶向PRC2而言为必要的，所以实验集中于重复B、E以及F，并且发现Xist定位不受单独或组合靶向任何重复的影响。还测试了保守的独特的Xist的区域，包括LNA-726、LNA-4978和LNA-5205以及LNA-3’(Xist的远端)。除与15nt元件对应的LNA-4978，未受影响的Xist定位在重复C下游280bp。LNA-4978诱导与LNA-C1/C2类似的作用，但不同之处在于其更为缓慢的动力学。在1小时时，Xist云仍为可见的，但看起来是暗淡的且分散的(78％，n＝125)。云的数量在3小时时达到最小值(25％，n＝158)。在8小时时，Xist作为小的精确位置(small pinpoint)(39％，n＝123)为可见的。恢复直到24小时时间点才完全。对于重复C LNA分子，Xist的丧失并不归因于RNA转换，如由qRT-PCR所确定，并且Ezh2发生移位，而不影响H3K27me3或改变Ezh2蛋白水平。因此，Xist至染色质的定位涉及更广阔的区域，该区域涵盖重复C和重复直接下游的独特区域。
为了确定两个基序是否协作，将LNA-4978和LNA-C1分开或一起核转染到MEF中。如所期望的，用LNA-C1单独处理导致截至1小时时Xist RNA云丧失并且在3小时时开始恢复，并且用LNA-4978处理分别显示在3小时时丧失并且在8小时时恢复。用两种LNA分子处理扩大了Xist消耗窗口。截至1小时时观察到Xist RNA和Ezh2的丧失(与LNA-C1单独情况一样)并且恢复直到8小时时间点才开始(与LNA-4978单独情况一样)。因此，LNA分子作用为加成的，而非协同的，因为在Xist消耗时间窗口加宽之外，作用未被增强。
实例11.LNA分子核转染之后的Ezh2恢复为缓慢的但沿Xi为均匀的
最终，应明确重靶向Xi的Ezh2在恢复期期间是否严格地遵循XistRNA的逐步重定位。由于PRC2通常在启动子附近结合，X基因启动子处的Ezh2定位通过定量染色质免疫沉淀法(qChIP)来分析。虽然雌性细胞具有两个X并且通过抗体拉下的Ezh2表位理论上可以来自Xa或Xi，但证据指示大量Ezh2和H3K27me3结合至Xi。Ezh2事实上富集在Xi上沉默的基因(例如，Xmr、Pgk1)的启动子处，而非逃离XCI的基因(例如，Jarid1c)的启动子处。然后，MEF细胞用LNA-C1核转染，并且在1小时与24小时之间使用抗-Ezh2抗体进行qChIP。在t＝1小时时，在所有测试的靶基因启动子处，Ezh2水平急剧下降至背景水平，从而指示结合启动子的Ezh2的消耗严格地遵循Xist沿Xi的移位。在3小时时间点和8小时时间点，所有基因范围内存在渐进的均匀的Ezh2水平的提高，其中许多基因截至t＝8小时时看起来达到Ezh2饱和量。在t＝0小时时具有最高水平Ezh2的启动子上，Ezh2水平直到24小时才完全恢复。因此，ChIP拉下预期主要(若非几乎排他的话)源自于Xi。相比之下，En1对照物(已知的常染色体PRC2靶标)处的Ezh2水平未发生显著变化。因此，Ezh2水平在整个Xi上以类似的动力学升降。Xist RNA和Ezh2结合在1小时与8小时之间的丧失提供了细胞可以被重编程来实现新的表观遗传状态期间的机会的窗口。
表3：非为人miRNA的种子序列的六聚物
AAAAAA、AAAAAG、AAAACA、AAAAGA、AAAAGC、AAAAGG、AAAAUA、AAACAA、AAACAC、AAACAG、AAACAU、AAACCC、AAACCU、AAACGA、AAACGC、AAACGU、AAACUA、AAACUC、AAACUU、AAAGAU、AAAGCC、AAAGGA、AAAGGG、AAAGUC、AAAUAC、AAAUAU、AAAUCG、AAAUCU、AAAUGC、AAAUGU、AAAUUA、AAAUUG、AACAAC、AACAAG、AACAAU、AACACA、AACACG、AACAGA、AACAGC、AACAGG、AACAUC、AACAUG、AACCAA、AACCAC、AACCAG、AACCAU、AACCCC、AACCCG、AACCGA、AACCGC、AACCGG、AACCUA、AACCUU、AACGAA、AACGAC、AACGAG、AACGAU、AACGCU、AACGGG、AACGGU、AACGUA、AACGUC、AACGUG、AACGUU、AACUAU、AACUCA、AACUCC、AACUCG、AACUGA、AACUGC、AACUGU、AACUUA、AACUUC、AACUUG、AACUUU、AAGAAA、AAGAAG、AAGAAU、AAGACG、AAGAGA、AAGAGC、AAGAGG、AAGAGU、AAGAUU、AAGCAA、AAGCAC、AAGCAG、AAGCAU、AAGCCA、AAGCCC、AAGCCG、AAGCCU、AAGCGA、AAGCGG、AAGCGU、AAGCUA、AAGGAA、AAGGAC、AAGGCU、AAGGGC、AAGGGU、AAGGUU、AAGUAA、AAGUAC、AAGUAU、AAGUCC、AAGUCG、AAGUGA、AAGUGG、AAGUUA、AAGUUU、AAUAAA、AAUAAC、AAUAAG、AAUAAU、AAUACA、AAUACC、AAUACG、AAUAGA、AAUAGC、AAUAGG、AAUAGU、AAUAUC、AAUAUU、AAUCAA、AAUCAU、AAUCCA、AAUCCC、AAUCCG、AAUCGA、AAUCGC、AAUCGU、AAUCUA、AAUCUG、AAUCUU、AAUGAA、AAUGAC、AAUGAG、AAUGAU、AAUGCG、AAUGCU、AAUGGA、AAUGGU、AAUGUA、AAUGUC、AAUGUG、AAUUAA、AAUUAC、AAUUAG、AAUUCC、AAUUCG、AAUUGA、AAUUGG、AAUUGU、AAUUUC、AAUUUG、ACAAAA、ACAAAC、ACAAAG、ACAAAU、ACAACC、ACAACG、ACAACU、ACAAGA、ACAAGC、ACAAGU、ACAAUC、ACAAUG、ACAAUU、ACACAG、ACACCA、ACACCC、ACACCG、ACACCU、ACACGA、ACACGC、ACACGU、ACACUC、ACACUG、ACACUU、ACAGAA、ACAGAC、ACAGCC、ACAGCG、ACAGCU、ACAGGG、ACAGUC、ACAGUG、ACAGUU、ACAUAA、ACAUAC、ACAUCC、ACAUCG、ACAUCU、ACAUGA、ACAUGC、ACAUGU、ACAUUG、ACAUUU、ACCAAA、ACCAAC、ACCAAG、ACCAAU、ACCACC、ACCACG、ACCAGA、ACCAGU、ACCAUA、ACCAUG、ACCAUU、ACCCAA、ACCCAC、ACCCCA、ACCCCG、ACCCGA、ACCCGC、ACCCUA、ACCCUC、ACCCUU、ACCGAA、ACCGAC、ACCGAU、ACCGCA、ACCGCC、ACCGCG、ACCGCU、ACCGGA、ACCGGC、ACCGGU、ACCGUA、ACCGUC、ACCGUG、ACCGUU、ACCUAA、ACCUAC、ACCUAG、ACCUAU、ACCUCA、ACCUCC、ACCUCG、ACCUCU、ACCUGA、ACCUGC、ACCUGU、ACCUUA、ACCUUC、ACCUUU、ACGAAA、ACGAAC、ACGAAG、ACGAAU、ACGACA、ACGACC、ACGACG、ACGACU、ACGAGA、ACGAGC、ACGAGG、ACGAGU、ACGAUA、ACGAUC、ACGAUG、ACGAUU、ACGCAA、ACGCAG、ACGCAU、ACGCCC、ACGCCG、ACGCCU、ACGCGA、ACGCGG、ACGCGU、ACGCUA、ACGCUG、ACGCUU、ACGGAA、ACGGAC、ACGGAG、ACGGAU、ACGGCC、ACGGCG、ACGGCU、ACGGGC、ACGGGG、ACGGGU、ACGGUA、ACGGUC、ACGGUG、ACGGUU、ACGUAA、ACGUAC、ACGUAU、ACGUCC、ACGUCG、ACGUCU、ACGUGA、ACGUGC、ACGUGG、ACGUGU、ACGUUA、ACGUUC、ACGUUG、ACGUUU、ACUAAA、ACUAAG、ACUAAU、ACUACA、ACUACC、ACUACG、ACUACU、ACUAGG、ACUAUC、ACUAUG、ACUAUU、ACUCAU、ACUCCC、ACUCCG、ACUCCU、ACUCGA、ACUCGC、ACUCGG、ACUCUC、ACUCUU、ACUGAG、ACUGAU、ACUGCC、ACUGCG、ACUGCU、ACUGGG、ACUGGU、ACUGUC、ACUUAA、ACUUAC、ACUUAU、ACUUCA、ACUUCC、ACUUCG、ACUUCU、ACUUGA、ACUUGC、ACUUGU、ACUUUA、ACUUUC、ACUUUG、AGAAAA、AGAAAC、AGAAAG、AGAACC、AGAACG、AGAACU、AGAAGC、AGAAGU、AGAAUA、AGAAUC、AGAAUG、AGAAUU、AGACAA、AGACAC、AGACAU、AGACCA、AGACCC、AGACCG、AGACCU、AGACGA、AGACGC、AGACGU、AGACUA、AGACUC、AGACUU、AGAGAC、AGAGAG、AGAGAU、AGAGCC、AGAGCG、AGAGCU、AGAGGC、AGAGGG、AGAGGU、AGAGUA、AGAGUU、AGAUAC、AGAUAG、AGAUAU、AGAUCC、AGAUCG、AGAUCU、AGAUGA、AGAUGC、AGAUGG、AGAUUA、AGAUUC、AGAUUG、AGAUUU、AGCAAC、AGCACA、AGCACG、AGCACU、AGCAGA、AGCAUA、AGCAUC、AGCAUG、AGCCAA、AGCCAU、AGCCCA、AGCCGA、AGCCGC、AGCCGG、AGCCGU、AGCCUA、AGCCUC、AGCGAA、AGCGAG、AGCGAU、AGCGCA、AGCGCC、AGCGCG、AGCGCU、AGCGGA、AGCGGC、AGCGGU、AGCGUA、AGCGUC、AGCGUG、AGCGUU、AGCUAA、AGCUAC、AGCUAG、AGCUAU、AGCUCA、AGCUCC、AGCUCG、AGCUCU、AGCUGA、AGCUGG、AGCUGU、AGCUUC、AGCUUU、AGGAAU、AGGACC、AGGACG、AGGAGA、AGGAGU、AGGAUA、AGGCAA、AGGCAU、AGGCCG、AGGCGA、AGGCGC、AGGCGG、AGGCUA、AGGCUC、AGGCUU、AGGGAC、AGGGAU、AGGGGA、AGGGGU、AGGGUA、AGGGUG、AGGUAA、AGGUAC、AGGUCA、AGGUCC、AGGUCU、AGGUGA、AGGUGC、AGGUGG、AGGUGU、AGGUUC、AGGUUG、AGUAAA、AGUAAG、AGUAAU、AGUACA、AGUACG、AGUAGC、AGUAGG、AGUAUA、AGUAUC、AGUAUG、AGUAUU、AGUCAA、AGUCAC、AGUCAG、AGUCAU、AGUCCA、AGUCCG、AGUCCU、AGUCGA、AGUCGC、AGUCGG、AGUCGU、AGUCUA、AGUCUC、AGUCUG、AGUCUU、AGUGAA、AGUGAC、AGUGCG、AGUGGG、AGUGUC、AGUUAA、AGUUAC、AGUUAG、AGUUCC、AGUUCG、AGUUGA、AGUUGC、AGUUGU、AGUUUA、AGUUUC、AGUUUG、AGUUUU、AUAAAC、AUAAAU、AUAACA、AUAACC、AUAACG、AUAACU、AUAAGA、AUAAGC、AUAAGG、AUAAGU、AUAAUC、AUAAUG、AUAAUU、AUACAC、AUACAG、AUACAU、AUACCA、AUACCC、AUACCG、AUACGA、AUACGC、AUACGG、AUACGU、AUACUA、AUACUC、AUACUG、AUACUU、AUAGAA、AUAGAC、AUAGAU、AUAGCA、AUAGCG、AUAGCU、AUAGGA、AUAGGU、AUAGUA、AUAGUC、AUAGUG、AUAGUU、AUAUAC、AUAUAG、AUAUCC、AUAUCG、AUAUCU、AUAUGA、AUAUGC、AUAUGG、AUAUGU、AUAUUC、AUAUUG、AUAUUU、AUCAAA、AUCAAC、AUCAAG、AUCAAU、AUCACA、AUCACC、AUCACG、AUCAGC、AUCAGG、AUCCAA、AUCCAU、AUCCCC、AUCCCG、AUCCGA、AUCCGC、AUCCGG、AUCCUA、AUCCUC、AUCCUG、AUCGAA、AUCGAC、AUCGAG、AUCGAU、AUCGCA、AUCGCC、AUCGCG、AUCGCU、AUCGGC、AUCGGG、AUCGGU、AUCGUC、AUCGUG、AUCGUU、AUCUAA、AUCUAC、AUCUAG、AUCUAU、AUCUCC、AUCUCG、AUCUGU、AUCUUG、AUCUUU、AUGAAA、AUGAAC、AUGAAG、AUGAAU、AUGACC、AUGACU、AUGAGG、AUGAGU、AUGAUA、AUGAUC、AUGAUU、AUGCAA、AUGCAG、AUGCCA、AUGCCC、AUGCCG、AUGCGA、AUGCGG、AUGCGU、AUGCUC、AUGCUU、AUGGAC、AUGGCC、AUGGGA、AUGGGC、AUGGGU、AUGGUC、AUGGUG、AUGUAC、AUGUAU、AUGUCA、AUGUCC、AUGUCG、AUGUGU、AUGUUA、AUGUUC、AUUAAA、AUUAAC、AUUAAG、AUUAAU、AUUACA、AUUACC、AUUACG、AUUACU、AUUAGA、AUUAGC、AUUAGG、AUUAGU、AUUAUA、AUUAUC、AUUAUG、AUUCAC、AUUCCA、AUUCCG、AUUCCU、AUUCGA、AUUCGC、AUUCGG、AUUCGU、AUUCUA、AUUCUC、AUUCUU、AUUGAA、AUUGAC、AUUGAU、AUUGCC、AUUGCG、AUUGCU、AUUGGA、AUUGGC、AUUGGG、AUUGGU、AUUGUA、AUUGUC、AUUGUG、AUUGUU、AUUUAA、AUUUAG、AUUUAU、AUUUCC、AUUUCG、AUUUCU、AUUUGA、AUUUGC、AUUUGU、AUUUUA、AUUUUC、AUUUUG、AUUUUU、CAAAAG、CAAACA、CAAACC、CAAACG、CAAACU、CAAAGA、CAAAGG、CAAAUA、CAAAUU、CAACAC、CAACAU、CAACCA、CAACCC、CAACCG、CAACGA、CAACGC、CAACGG、CAACGU、CAACUA、CAACUC、CA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、UAACCG、UAACCU、UAACGA、UAACGC、UAACGG、UAACGU、UAACUA、UAACUG、UAACUU、UAAGAG、UAAGAU、UAAGCA、UAAGCC、UAAGCG、UAAGCU、UAAGGA、UAAGGC、UAAGGG、UAAGGU、UAAGUA、UAAGUC、UAAGUG、UAAGUU、UAAUAA、UAAUCA、UAAUCC、UAAUCG、UAAUCU、UAAUGA、UAAUGG、UAAUGU、UAAUUA、UAAUUC、UAAUUG、UACAAC、UACAAG、UACAAU、UACACC、UACACG、UACACU、UACAGA、UACAGC、UACAUA、UACAUC、UACAUU、UACCAA、UACCAC、UACCAG、UACCAU、UACCCC、UACCCG、UACCCU、UACCGA、UACCGC、UACCGG、UACCGU、UACCUA、UACCUG、UACGAA、UACGAC、UACGAG、UACGAU、UACGCA、UACGCC、UACGCG、UACGCU、UACGGC、UACGGG、UACGGU、UACGUA、UACGUC、UACGUG、UACGUU、UACUAA、UACUAC、UACUAG、UACUAU、UACUCA、UACUCC、UACUCG、UACUCU、UACUGA、UACUGC、UACUGG、UACUUA、UACUUG、UACUUU、UAGAAA、UAGAAG、UAGAAU、UAGACA、UAGACG、UAGAGA、UAGAGC、UAGAGU、UAGAUA、UAGAUC、UAGAUG、UAGCAU、UAGCCC、UAGCCG、UAGCCU、UAGCGA、UAGCGC、UAGCGU、UAGCUA、UAGCUC、UAGCUG、UAGGAA、UAGGAU、UAGGCG、UAGGCU、UAGGGU、UAGGUC、UAGGUG、UAGGUU、UAGUAA、UAGUAC、UAGUAG、UAGUAU、UAGUCA、UAGUCG、UAGUGU、UAGUUA、UAGUUC、UAGUUG、UAGUUU、UAUAAC、UAUAAG、UAUACU、UAUAGA、UAUAGC、UAUAGG、UAUAGU、UAUAUA、UAUAUC、UAUAUG、UAUAUU、UAUCAA、UAUCAC、UAUCAU、UAUCCA、UAUCCC、UAUCCG、UAUCCU、UAUCGA、UAUCGC、UAUCGG、UAUCGU、UAUCUA、UAUCUC、UAUCUG、UAUCUU、UAUGAA、UAUGAC、UAUGAG、UAUGAU、UAUGCA、UAUGCG、UAUGCU、UAUGGA、UAUGGC、UAUGUC、UAUGUG、UAUGUU、UAUUAG、UAUUCA、UAUUCC、UAUUCG、UAUUCU、UAUUGA、UAUUGG、UAUUUA、UAUUUC、UAUUUG、UAUUUU、UCAAAA、UCAAAC、UCAAAG、UCAACC、UCAACU、UCAAGA、UCAAGC、UCAAUA、UCAAUC、UCAAUG、UCAAUU、UCACCC、UCACCG、UCACCU、UCACGA、UCACGC、UCACGG、UCACGU、UCACUA、UCACUC、UCACUU、UCAGAA、UCAGAC、UCAGAG、UCAGCG、UCAGCU、UCAGGA、UCAGGC、UCAGGU、UCAGUC、UCAGUU、UCAUAA、UCAUCA、UCAUCC、UCAUCG、UCAUGC、UCAUGG、UCAUGU、UCAUUA、UCAUUG、UCCAAA、UCCAAC、UCCAAG、UCCAAU、UCCACA、UCCACC、UCCACG、UCCAGC、UCCAGG、UCCAUA、UCCAUC、UCCAUU、UCCCAA、UCCCAG、UCCCAU、UCCCCC、UCCCCG、UCCCCU、UCCCGA、UCCCGC、UCCCGG、UCCCGU、UCCCUA、UCCCUC、UCCGAA、UCCGAC、UCCGAG、UCCGAU、UCCGCA、UCCGCC、UCCGGA、UCCGGC、UCCGGU、UCCGUA、UCCGUC、UCCGUG、UCCUAA、UCCUCA、UCCUCG、UCCUCU、UCCUGC、UCCUGU、UCCUUA、UCCUUC、UCCUUU、UCGAAA、UCGAAC、UCGAAG、UCGAAU、UCGACA、UCGACC、UCGACG、UCGACU、UCGAGA、UCGAGC、UCGAGG、UCGAUA、UCGAUC、UCGAUG、UCGAUU、UCGCAA、UCGCAC、UCGCAG、UCGCAU、UCGCCA、UCGCCC、UCGCCG、UCGCCU、UCGCGA、UCGCGC、UCGCGU、UCGCUA、UCGCUC、UCGGAA、UCGGAC、UCGGAG、UCGGAU、UCGGCA、UCGGCU、UCGGGG、UCGGGU、UCGGUC、UCGGUG、UCGGUU、UCGUAA、UCGUAC、UCGUAG、UCGUAU、UCGUCA、UCGUCC、UCGUCG、UCGUCU、UCGUGA、UCGUGU、UCGUUA、UCGUUC、UCGUUG、UCGUUU、UCUAAC、UCUAAG、UCUAAU、UCUACA、UCUACC、UCUACG、UCUACU、UCUAGC、UCUAGG、UCUAGU、UCUAUA、UCUAUC、UCUAUG、UCUAUU、UCUCAG、UCUCAU、UCUCCG、UCUCGC、UCUCGG、UCUCGU、UCUCUC、UCUGAA、UCUGAU、UCUGCA、UCUGCG、UCUGCU、UCUGGC、UCUGGU、UCUGUC、UCUGUG、UCUGUU、UCUUAA、UCUUAC、UCUUAG、UCUUAU、UCUUCA、UCUUCC、UCUUCG、UCUUCU、UCUUGC、UCUUGG、UCUUGU、UCUUUA、UCUUUC、UCUUUG、UCUUUU、UGAAAA、UGAAAC、UGAACA、UGAACC、UGAAGG、UGAAUC、UGAAUG、UGACAA、UGACAC、UGACAG、UGACCA、UGACCC、UGACCG、UGACGA、UGACGC、UGACGG、UGACGU、UGACUA、UGACUC、UGACUU、UGAGAG、UGAGAU、UGAGCA、UGAGCC、UGAGCU、UGAGGC、UGAGGU、UGAGUA、UGAGUU、UGAUAC、UGAUAG、UGAUAU、UGAUCA、UGAUCG、UGAUCU、UGAUGA、UGAUGC、UGAUGG、UGAUGU、UGAUUA、UGAUUC、UGAUUG、UGAUUU、UGCAAC、UGCAAG、UGCACA、UGCACG、UGCAGG、UGCAGU、UGCAUC、UGCCCA、UGCCCC、UGCCCG、UGCCGA、UGCCGC、UGCCGG、UGCCGU、UGCCUA、UGCCUC、UGCCUG、UGCCUU、UGCGAA、UGCGAC、UGCGAU、UGCGCC、UGCGCG、UGCGCU、UGCGGC、UGCGGG、UGCGGU、UGCGUA、UGCGUC、UGCGUG、UGCGUU、UGCUAC、UGCUAU、UGCUCC、UGCUCG、UGCUGC、UGCUGG、UGCUGU、UGCUUA、UGCUUU、UGGAAC、UGGAAG、UGGAGC、UGGAUC、UGGAUU、UGGCAA、UGGCAC、UGGCAG、UGGCCG、UGGCCU、UGGCGA、UGGCGC、UGGCGU、UGGCUA、UGGCUC、UGGCUU、UGGGAA、UGGGCA、UGGGCC、UGGGGC、UGGGUC、UGGUAA、UGGUAG、UGGUAU、UGGUCC、UGGUCG、UGGUCU、UGGUGA、UGGUGC、UGGUGG、UGGUGU、UGGUUA、UGGUUG、UGUAAA、UGUAAC、UGUAAG、UGUACC、UGUACG、UGUACU、UGUAGA、UGUAGC、UGUAGU、UGUAUC、UGUAUU、UGUCAA、UGUCAC、UGUCAG、UGUCAU、UGUCCA、UGUCCC、UGUCCG、UGUCGA、UGUCGC、UGUCGG、UGUCGU、UGUCUA、UGUCUC、UGUGAC、UGUGAG、UGUGAU、UGUGCA、UGUGGU、UGUGUA、UGUGUU、UGUUAC、UGUUAG、UGUUAU、UGUUCA、UGUUCC、UGUUCG、UGUUGG、UGUUGU、UGUUUA、UGUUUC、UGUUUG、UGUUUU、UUAAAA、UUAAAC、UUAAAG、UUAAAU、UUAACC、UUAACG、UUAACU、UUAAGU、UUAAUA、UUAAUC、UUAAUG、UUAAUU、UUACAA、UUACAC、UUACAG、UUACAU、UUACCA、UUACCC、UUACCG、UUACCU、UUACGA、UUACGC、UUACGG、UUACGU、UUACUA、UUACUC、UUACUG、UUACUU、UUAGAA、UUAGAC、UUAGCC、UUAGCG、UUAGCU、UUAGGC、UUAGGU、UUAGUA、UUAGUC、UUAGUU、UUAUAA、UUAUAC、UUAUAG、UUAUAU、UUAUCC、UUAUCG、UUAUCU、UUAUGA、UUAUGG、UUAUGU、UUAUUA、UUAUUC、UUAUUG、UUAUUU、UUCAAC、UUCAAU、UUCACA、UUCACC、UUCACG、UUCACU、UUCAGC、UUCAGG、UUCAGU、UUCAUA、UUCAUC、UUCAUG、UUCAUU、UUCCAA、UUCCCA、UUCCCG、UUCCGA、UUCCGU、UUCCUU、UUCGAA、UUCGAC、UUCGAG、UUCGAU、UUCGCA、UUCGCC、UUCGCG、UUCGCU、UUCGGA、UUCGGC、UUCGGG、UUCGGU、UUCGUA、UUCGUC、UUCGUG、UUCGUU、UUCUAC、UUCUAG、UUCUCA、UUCUCG、UUCUGG、UUCUUA、UUCUUU、UUGAAA、UUGAAC、UUGAAG、UUGAAU、UUGACC、UUGACG、UUGACU、UUGAGA、UUGAGC、UUGAGU、UUGAUA、UUGAUC、UUGAUG、UUGAUU、UUGCAA、UUGCAC、UUGCAG、UUGCAU、UUGCCC、UUGCCG、UUGCGA、UUGCGC、UUGCGG、UUGCGU、UUGCUA、UUGCUC、UUGCUG、UUGCUU、UUGGAA、UUGGAG、UUGGCC、UUGGCG、UUGGCU、UUGGGC、UUGGGU、UUGGUA、UUGGUG、UUGUAA、UUGUAC、UUGUCA、UUGUCG、UUGUCU、UUGUGC、UUGUGG、UUGUUA、UUGUUG、UUGUUU、UUUAAA、UUUAAC、UUUAAG、UUUAAU、UUUACA、UUUACC、UUUACG、UUUACU、UUUAGA、UUUAGC、UUUAGG、UUUAGU、UUUAUA、UUUAUC、UUUAUG、UUUAUU、UUUCAU、UUUCCA、UUUCCG、UUUCCU、UUUCGA、UUUCGC、UUUCGG、UUUCGU、UUUCUA、UUUCUC、UUUCUG、UUUCUU、UUUGAA、UUUGAC、UUUGAG、UUUGAU、UUUGCC、UUUGCU、UUUGGA、UUUGGC、UUUGGG、UUUGGU、UUUGUA、UUUGUC、UUUGUU、UUUUAA、UUUUAG、UUUUAU、UUUUCC、UUUUCG、UUUUCU、UUUUGA、UUUUGC、UUUUGG、UUUUGU、UUUUUA、UUUUUC、UUUUUU
表2：扩增的PRC2转录组命中的印记区。
前述书面说明书被认为足以使本领域的技术人员能够实践本发明。本发明不限于所提供的实例的范围，因为实例意图作为本发明的一个方面的单一说明，并且其他功能上等效的实施例也属于本发明的范围。根据前述说明，除了那些在此显示并且描述的内容之外的本发明的不同修改对于本领域的技术人员将变得很清楚，并且属于随附权利要求书的范围。本发明的每个实施例不必涵盖本发明的优点和目的。

Claims (107)

1.一种选择用于激活靶基因的表达的候选寡核苷酸的方法，该方法包括：
在第一核苷酸序列内选择PRC2相关区，其中该第一核苷酸序列定位至第一染色体中该靶基因的5’端上游的50千碱基与该靶基因的3’端下游的50千碱基之间的位置；
确定与该PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的第二核苷酸序列；并且
将包含该第二核苷酸序列的单链寡核苷酸选择为该候选寡核苷酸，其中该寡核苷酸具有以下特征中的至少一种：
a)序列：5’-X-Y-Z，其中X为任何核苷酸，Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列，并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列，其中X锚定在该寡核苷酸的5’端上；
b)不包含三个或更多个连续鸟苷核苷酸的序列；
c)与长度等于该第二核苷酸序列的每个核苷酸序列具有阈值水平以下的序列一致性的序列，这些核苷酸序列处在脱靶基因的5’端上游的50千碱基与该脱靶基因的3’端下游的50千碱基之间；
d)与编码RNA的PRC2相关区互补的序列，该RNA形成包含至少两个单链环的二级结构；或
e)具有60％以上G-C含量的序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中该单链寡核苷酸的长度高达50个核苷酸。
3.如权利要求1所述的方法，其中该单链寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。
4.如权利要求1所述的方法，其中该寡核苷酸具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少两种。
5.如权利要求1所述的方法，其中该寡核苷酸具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少三种。
6.如权利要求1所述的方法，其中该寡核苷酸具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少四种。
7.如权利要求1所述的方法，其中该寡核苷酸具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的每一种。
8.一种选择富集了激活靶基因的表达的寡核苷酸的一组寡核苷酸的方法，该方法包括：
在第一核苷酸序列内选择PRC2相关区，该第一核苷酸序列定位至第一染色体中该靶基因的5’端上游的50千碱基与该靶基因的3’端下游的50千碱基之间的位置；
选择一组寡核苷酸，其中该组中的每个寡核苷酸包含与该PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的第二核苷酸序列，并且具有以下特征中的至少一种：
a)序列：5’-X-Y-Z，其中X为任何核苷酸，Y为非为微小RNA的人种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列，并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列，其中X锚定在该寡核苷酸的5’端上；
b)不包含三个或更多个连续鸟苷核苷酸的序列；
c)与长度等于该第二核苷酸序列的每个核苷酸序列具有阈值水平以下的序列一致性的序列，这些核苷酸序列处在脱靶基因的5’端上游的50千碱基与该脱靶基因的3’端下游的50千碱基之间；
d)与编码RNA的PRC2相关区互补的序列，该RNA形成包含至少两个单链环的二级结构；和/或
e)具有60％以上G-C含量的序列；并且
其中该组寡核苷酸富集了激活靶基因的表达的寡核苷酸。
9.如权利要求8所述的方法，其中这些寡核苷酸中每一个的长度高达50个核苷酸。
10.如权利要求8所述的方法，其中这些寡核苷酸中每一个的长度为8至30个核苷酸。
11.如权利要求8所述的方法，其中该组中的这些寡核苷酸各自共享特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少一种。
12.如权利要求8所述的方法，其中该组中的这些寡核苷酸各自共享特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少两种。
13.如权利要求8所述的方法，其中该组中的这些寡核苷酸各自共享特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少三种。
14.如权利要求8所述的方法，其中该组中的这些寡核苷酸各自共享特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少四种。
15.如权利要求8所述的方法，其中该组中的这些寡核苷酸各自共享特征a)、b)、c)、d)以及e)中的每一种。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中该阈值水平的序列一致性为50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％序列一致性。
17.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中该第一染色体为第一物种的染色体，并且其中该方法进一步包括
确定该第二核苷酸序列与第二物种的第二染色体的第二区互补，该第二区位于该靶基因的同源物的5’端上游的50千碱基与该靶基因的该同源物的3’端下游的50千碱基之间。
18.如权利要求17所述的方法，其中该第二核苷酸序列与该第二染色体的该第二区至少80％互补。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中该第一核苷酸序列定位至包含该靶基因的有义链的该第一染色体的链。
20.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中该第一核苷酸序列定位至包含该靶基因的反义链的该第一染色体的链。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该PRC2相关区处在该靶基因的5’端的上游。
22.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该PRC2相关区处在该靶基因的3’端的下游。
23.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该PRC2相关区处在该靶基因的内含子内。
24.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该PRC2相关区处在该靶基因的外显子内。
25.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其中该PRC2相关区横跨该靶基因的内含子-外显子接点、5’-UTR-外显子接点或3’-UTR-外显子接点。
26.如权利要求1至25中任一项所述的方法，其中该PRC2相关区编码RNA，该RNA形成包含至少两个单链环的二级结构。
27.如权利要求26所述的方法，其中该二级结构包含该至少两个单链环之间的双链茎。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中该方法进一步包括确定该PRC2相关区的该至少8个连续核苷酸编码这些环中至少一个的至少一部分。
29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括确定该PRC2相关区的该至少8个连续核苷酸编码这些环中至少两个的至少一部分。
30.如权利要求26至29中任一项所述的方法，其中该方法进一步包括确定该PRC2相关区的该至少8个连续核苷酸编码该双链茎的至少一部分。
31.一种单链寡核苷酸，包含与PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的互补区，该PRC2相关区定位在第一染色体中靶基因的5’端上游的50千碱基与该靶基因的3’端下游的50千碱基之间，其中该寡核苷酸具有以下各项中的至少一种：
a)包含5’-X-Y-Z的序列，其中X为任何核苷酸，Y为非为微小RNA的人种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列，并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列；
b)不包含三个或更多个连续鸟苷核苷酸的序列；
c)与长度等于第二核苷酸序列的每个核苷酸序列具有阈值水平以下的序列一致性的序列，这些核苷酸序列处在脱靶基因的5’端上游的50千碱基与该脱靶基因的3’端下游的50千碱基之间；
d)与编码RNA的PRC2相关区互补的序列，该RNA形成包含至少两个单链环的二级结构；和/或
e)具有60％以上G-C含量的序列。
32.如权利要求31所述的单链寡核苷酸，其中该第一染色体为第一物种的染色体，并且其中包含该至少8个连续核苷酸的序列位于第二染色体中该靶基因的同源物的5’端上游的50千碱基与该靶基因的该同源物的3’端下游的50千碱基之间，其中该第二染色体为第二物种的染色体。
33.如权利要求32所述的单链寡核苷酸，其中该第一物种为人，并且该第二物种为小鼠。
34.如权利要求31至33中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少两种。
35.如权利要求31至33中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少三种。
36.如权利要求31至33中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少四种。
37.如权利要求31至33中任一项所述的方法，其中该寡核苷酸具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的每一种。
38.如任何以上权利要求所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的长度高达50个核苷酸。
39.如任何前述权利要求所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。
40.如权利要求31至34中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的长度为8至10个核苷酸，并且该PRC2相关区的该互补序列中除1、2或3个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶或鸟苷核苷酸。
41.如权利要求31至37中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该PRC2相关区的该至少8个连续核苷酸在包含该靶基因的有义链的该染色体的链中。
42.如权利要求31至37中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该PRC2相关区的该至少8个连续核苷酸在包含该靶基因的反义链的该染色体的链中。
43.如权利要求31至42中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该PRC2相关区处在该靶基因的该5’端的上游。
44.如权利要求31至42中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该PRC2相关区处在该靶基因的该3’端的下游。
45.如权利要求31至42中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该PRC2相关区处在该靶基因的内含子内。
46.如权利要求31至42中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该PRC2相关区处在该靶基因的外显子内。
47.如权利要求31至42中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该PRC2相关区横跨该靶基因的内含子-外显子接点、5’-UTR-外显子接点或3’-UTR-外显子接点。
48.如权利要求31至47中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该PRC2相关区编码RNA，该RNA形成包含至少两个单链环的二级结构。
49.如权利要求48所述的单链寡核苷酸，其中该二级结构包含该至少两个单链环之间的双链茎。
50.如权利要求48或49所述的单链寡核苷酸，其中该PRC2相关区的该至少8个连续核苷酸编码这些环中至少一个的至少一部分。
51.如权利要求48至50中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该PRC2相关区的该至少8个连续核苷酸编码这些环中至少两个的至少一部分。
52.如权利要求48至51中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该PRC2相关区的该至少8个连续核苷酸编码该双链茎的至少一部分。
53.如权利要求31至52中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的至少一个核苷酸为核苷酸类似物。
54.如权利要求53所述的单链寡核苷酸，其中与不具有该至少一个核苷酸类似物的寡核苷酸相比较，该至少一个核苷酸类似物导致该寡核苷酸的Tm在1℃至5℃范围内的升高。
55.如权利要求31至54中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的至少一个核苷酸包含2’O-甲基。
56.如权利要求31至54中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的每个核苷酸包含2’O-甲基。
57.如权利要求31至54中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸或至少一个桥连核苷酸。
58.如权利要求57所述的单链寡核苷酸，其中该桥连核苷酸为LNA核苷酸、cEt核苷酸或ENA核苷酸类似物。
59.如权利要求31至54中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的每个核苷酸为LNA核苷酸。
60.如权利要求31至54中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的这些核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸与2’-氟-脱氧核糖核苷酸。
61.如权利要求31至54中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的这些核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。
62.如权利要求31至54中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的这些核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸与ENA核苷酸类似物。
63.如权利要求31至54中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的这些核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸与LNA核苷酸。
64.如权利要求60至63中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的5’核苷酸为脱氧核糖核苷酸。
65.如权利要求31至54中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的这些核苷酸包含交替的LNA核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。
66.如权利要求65所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的该5’核苷酸为LNA核苷酸。
67.如权利要求31至54中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的这些核苷酸包含通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的至少一个LNA核苷酸侧接的这些脱氧核糖核苷酸。
68.如权利要求31至68中任一项所述的单链寡核苷酸，进一步包含至少两个核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。
69.如权利要求68所述的单链寡核苷酸，进一步包含所有核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。
70.如权利要求31至69中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的3’位置处的核苷酸具有3’羟基。
71.如权利要求31至69中任一项所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸的3’位置处的核苷酸具有3’硫代磷酸酯。
72.如权利要求31至71中任一项所述的单链寡核苷酸，进一步包含缀合至该5’核苷酸的生物素部分。
73.如权利要求31至71中任一项所述的单链寡核苷酸，进一步包含该5’核苷酸或该3’核苷酸或两者上的以下缀合物中的一种或多种：胆固醇、维生素A、叶酸、σ受体配体、适体、肽、如CPP、疏水性分子如脂质、ASGPR或动态多聚缀合物以及其变体。
74.一种长度为8至30个核苷酸的单链寡核苷酸，该单链寡核苷酸具有与调控靶基因的表达的长的非编码RNA(IncRNA)的至少8个连续核苷酸互补的互补区，其中该寡核苷酸的2至19个核苷酸为核苷酸类似物。
75.如权利要求74所述的单链寡核苷酸，其中与不具有该核苷酸类似物的寡核苷酸相比较，这些核苷酸类似物中的每一种导致该寡核苷酸的Tm在1℃至5℃范围内的升高。
76.如权利要求74所述的单链寡核苷酸，其中这些核苷酸类似物是选自由桥连核苷酸、2’氟以及2’O-甲基核苷酸组成的组。
77.如权利要求76所述的单链寡核苷酸，其中该桥连核苷酸为LNA、ENA或cEt核苷酸。
78.如权利要求74所述的单链寡核苷酸，其中这些核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸与2’-氟-脱氧核糖核苷酸。
79.如权利要求74所述的单链寡核苷酸，其中这些核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。
80.如权利要求74所述的单链寡核苷酸，其中这些核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸与ENA核苷酸类似物。
81.如权利要求74所述的单链寡核苷酸，其中这些核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸与LNA核苷酸。
82.如权利要求74所述的单链寡核苷酸，其中该单链寡核苷酸的该5’核苷酸为脱氧核糖核苷酸。
83.如权利要求74所述的单链寡核苷酸，其中这些核苷酸包含交替的LNA核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。
84.如权利要求74所述的单链寡核苷酸，其中该单链寡核苷酸的该5’核苷酸为LNA核苷酸。
85.如权利要求74所述的单链寡核苷酸，其中这些核苷酸包含通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的至少一个LNA核苷酸侧接的这些脱氧核糖核苷酸。
86.如权利要求74至85中任一项所述的单链寡核苷酸，进一步包含至少两个核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。
87.如权利要求74所述的单链寡核苷酸，其中该单链寡核苷酸的3’位置处的核苷酸具有3’羟基。
88.如权利要求74所述的单链寡核苷酸，其中该单链寡核苷酸的该3’位置处的该核苷酸具有3’硫代磷酸酯。
89.一种长度为5至30个核苷酸的单链寡核苷酸，该单链寡核苷酸具有与调控靶基因的表达的长的非编码RNA(IncRNA)的至少5个连续核苷酸互补的互补区，其中该寡核苷酸通过可裂解接头连接至第二寡核苷酸。
90.如权利要求74所述的单链寡核苷酸，其中该寡核苷酸具有如权利要求31至73中任一项所述的单链寡核苷酸的结构。
91.一种长度为8至40个核苷酸的单链寡核苷酸，该单链寡核苷酸具有与调控蛋白编码参考基因的表达的PRC2结合的长的非编码RNA(IncRNA)的至少5个连续核苷酸互补的互补区，其中该IncRNA转录自含有该蛋白编码参考基因的基因组区中与该蛋白编码参考基因相反的链，其中该单链寡核苷酸结合至该IncRNA中起源于外显子、内含子、外显子、内含子-外显子接点、5′UTR、3′UTR、翻译起始区或翻译终止区或与它们重叠的区域。
92.一种长度为8至40个核苷酸的单链寡核苷酸，该单链寡核苷酸具有与调节靶基因的表达的长的非编码RNA(IncRNA)的至少5个连续核苷酸互补的互补区，其中该寡核苷酸与该IncRNA在该IncRNA的处于该靶基因的转录区之外的区域中具有互补性。
93.一种长度为8至30个核苷酸的单链寡核苷酸，该单链寡核苷酸具有与抑制靶基因的表达的长的非编码RNA(IncRNA)的至少5个连续核苷酸互补的互补区，其中该寡核苷酸与该IncRNA在该IncRNA的转录自该靶基因的非编码部分的区域中具有互补性。
94.一种包含如权利要求31至73中任一项所述的单链寡核苷酸以及载体的组合物。
95.一种在缓冲溶液中的包含如权利要求31至73中任一项所述的单链寡核苷酸的组合物。
96.一种包含如权利要求31至73中任一项所述的单链寡核苷酸以及药学上可接受的载体的药物组合物。
97.一种包括容纳如权利要求94至96中任一项所述的组合物的容器的试剂盒。
98.一种配制在药学上可接受的载体中的、长度为8至20个核苷酸的单链RNA寡核苷酸的组合物，该单链RNA寡核苷酸具有与调控靶基因的表达的长的非编码RNA(IncRNA)的至少5个连续核苷酸互补的互补区，其中该寡核苷酸的2至19个核苷酸为核苷酸类似物，其中互补的RNA寡核苷酸不存在于该组合物中。
99.如权利要求98所述的组合物，其中这些核苷酸类似物是选自由桥连核苷酸、2’氟以及2’O-甲基核苷酸组成的组。
100.如权利要求99所述的组合物，其中该桥连核苷酸为LNA、ENA或cEt核苷酸。
101.如权利要求98所述的组合物，其中该IncRNA转录自含有该靶基因的基因组区中与该靶基因相反的链。
102.如权利要求98所述的组合物，其中该寡核苷酸与该IncRNA在该IncRNA的转录自该靶基因的非编码部分的区域中具有互补性。
103.如权利要求98所述的组合物，其中该寡核苷酸与该IncRNA在该IncRNA的处于该靶基因的转录区之外的区域中具有互补性。
104.一种提高细胞内靶基因的表达的方法，该方法包括将如权利要求31至73中任一项所述的单链寡核苷酸递送到该细胞中。
105.一种提高受试者体内靶基因的水平的方法，该方法包括向该受试者给予如权利要求31至73中任一项所述的单链寡核苷酸。
106.一种治疗与受试者体内靶基因的降低的水平相关联的病症的方法，该方法包括向该受试者给予如权利要求31至73中任一项所述的单链寡核苷酸。
107.一种上调基因表达的方法，该方法包括：使细胞与长度为8至30个核苷酸的单链RNA寡核苷酸相接触，该单链RNA寡核苷酸具有与抑制靶基因的表达的长的非编码RNA(IncRNA)的至少5个连续核苷酸互补的互补区。
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