CN104540947A - 用于调节smn基因家族表达的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的方面提供用于激活或增强SMN1或SMN2的表达的单链寡核苷酸。另外的方面提供包含用于激活或增强包含外显子7的SMN1或SMN2的表达的单链寡核苷酸的组合物和试剂盒。还提供了用于使用这些单链寡核苷酸调节SMN1或SMN2的表达的方法。本发明的另外的方面提供了选择用于激活或增强SMN1或SMN2的表达的候选寡核苷酸的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求2013年3月14日提交的名称为“用于调节SMN基因家族表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODSFOR MODULATING SMN GENE FAMILY EXPRESSION)”的美国临时申请号61/785,529;2012年10月27日提交的名称为“用于调节SMN基因家族表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATINGSMN GENE FAMILY EXPRESSION)”的美国临时申请号61/719,394;以及2012年5月16日提交的名称为“用于调节SMN基因家族表达的组合物和方法(COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING SMN GENEFAMILY EXPRESSION)”的美国临时申请号61/647,858的权益,每个申请通过引用以其全部内容结合在此。
发明领域
本发明涉及基于寡核苷酸的组合物,以及使用基于寡核苷酸的组合物用于治疗疾病的方法。
发明背景
脊髓性肌萎缩(SMA)为引起肌肉损伤,从而导致肌肉功能受损、难以呼吸、呼吸道感染频繁以及最终死亡的一组遗传性疾病。存在基于疾病的发作和严重程度而分类的四种类型的SMA。SMA I型为最严重的形式并且为婴儿死亡的最常见的病因之一,其中在出生时出现肌肉衰弱和呼吸困难的症状。SMA II型稍晚出现,其中从6个月大到2岁出现肌肉衰弱和其他症状。SMA III型在儿童时期出现症状,并且最轻微形式的SMA IV型在成年时期出现症状。已发现所有四种类型的SMA都与SMN基因家族尤其是SMN1的突变相关联。
运动神经元生存(SMN)为参与小核糖核蛋白(snRNP)的组装时转录剪接中涉及的蛋白质。snRNP为蛋白-RNA复合物,其与前体mRNA结合以形成剪接体,该剪接体之后剪接该前体mRNA,从而往往导致去除内含子。三种基因编码SMN或SMN变体,包括SMN1(运动神经元生存1,端粒)、SMN2(运动神经元生存2,着丝粒)以及SMNP(运动神经元生存1,端粒假基因)。SMN1和SMN2是人体内5q13处基因复制的结果。SMN活性的缺乏导致普遍的剪接缺陷,尤其是在脊髓运动神经元中,以及脊柱下运动神经元的变性。
发明内容
在此披露的本发明的多个方面提供可用于上调细胞内某些基因的表达的方法和组合物。在一些实施例中,提供单链寡核苷酸,其靶向基因的PRC2相关区并且因此引起该基因的上调。在此还提供可用于选择性地诱导基因的特定的剪接变体的表达的方法和相关的单链寡核苷酸。在一些实施例中,这些方法可用于控制细胞内由剪接变体编码的特定的蛋白质同工型的水平。在一些情况下,这些方法可用于将蛋白的表达诱导至足以治疗疾病的水平。
在一些实施例中,提供单链寡核苷酸,其靶向SMN基因(例如,人SMN1、人SMN2)的PRC2相关区并且因此引起该基因的上调。例如,根据本发明的一些方面,提供用于出于治疗SMA目的而提高细胞内全长SMN蛋白的表达的方法。因此,在此披露的本发明的方面提供可用于上调细胞内SMN1或SMN2的方法和组合物。在一些实施例中,提供单链寡核苷酸,这些单链寡核苷酸靶向编码SMN1或SMN2的基因的PRC2相关区。在一些实施例中,这些单链寡核苷酸通过缓解或阻止PRC2介导的对SMN1或SMN2的阻抑来激活或增强SMN1或SMN2的表达。
在一些实施例中,这些方法包括向细胞递送与SMN基因的PRC2相关区、例如SMN1或SMN2的RC2相关区互补的第一单链寡核苷酸,以及与SMN基因的前体mRNA、例如SMN1或SMN2的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸,量足以提高SMN1或SMN2的包含(或包括)外显子7的成熟mRNA在该细胞内的表达。
根据本发明的一些方面,提供单链寡核苷酸,这些单链寡核苷酸具有与SMN基因的PRC2相关区(例如,该区的至少8个连续核苷酸)(例如,如SEQ ID NO:1、2、4或5中给出的核苷酸序列的PRC2相关区)互补的区。在一些实施例中,寡核苷酸具有以下特征中的至少一个:a)为5’X-Y-Z的序列,其中X为任何核苷酸并且其中X位于寡核苷酸的5’端,Y为非为微小RNA的人种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列,并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列;b)不包括三个或更多个连续鸟苷核苷酸的序列;c)与每个核苷酸序列具有阈值水平以下的序列一致性的序列,这些核苷酸长度等于第二核苷酸序列、在脱靶基因的5’端上游的50千碱基与该脱靶基因的3’端下游的50千碱基之间;d)与编码RNA的PRC2相关区互补的序列,该RNA形成包括至少两个单链环的二级结构;以及e)具有60%以上G-C含量的序列。在一些实施例中,该单链寡核苷酸具有各自独立地选择的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少两种。在一些实施例中,该单链寡核苷酸具有各自独立地选择的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少三种。在一些实施例中,该单链寡核苷酸具有各自独立地选择的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少四种。在一些实施例中,该单链寡核苷酸具有特征a)、b)、c)、d)以及e)中的每一种。在某些实施例中,该寡核苷酸具有序列5’X-Y-Z,其中该寡核苷酸的长度为8至50个核苷酸。
根据本发明的一些方面,提供具有序列X-Y-Z的单链寡核苷酸,其中X为任何核苷酸,Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列,并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列,其中该单链寡核苷酸与SMN基因的PRC2相关区(例如,如SEQ ID NO:1、2、4或5中给出的核苷酸序列的PRC2相关区)互补。在本发明的一些方面中,提供具有序列5’-X-Y-Z的单链寡核苷酸,其中X为任何核苷酸,Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列,并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列,其中该单链寡核苷酸与SMN基因的PRC2相关区(例如,如SEQ ID NO:1、2、4或5中给出的核苷酸序列的PRC2相关区)的至少8个连续核苷酸互补。在一些实施例中,Y为选自表1的序列。在一些实施例中,该PRC2相关区为SEQ ID NO:9至18中任一个中列出的序列。
在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO:30至13087中任一个中给出的核苷酸序列,或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO:30至13087中任一个中给出的核苷酸序列,其中所提供的核苷酸序列的5’端是该寡核苷酸的5’端。在一些实施例中,该互补区(例如,至少8个连续核苷酸)还存在于如SEQ ID NO:7或8中给出的核苷酸序列中。
在一些实施例中,PRC2相关区为如SEQ ID NO:9至14中任一个中列出的序列。在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO:30至8329和13093至13094中任一个中给出的核苷酸序列,或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO:30至8329和13093至13094中任一个中给出的核苷酸序列,其中所提供的核苷酸序列的5’端为该寡核苷酸的5’端。在一些实施例中,该至少8个连续核苷酸还存在于如SEQ ID NO:7中给出的核苷酸序列中。
在一些实施例中,PRC2相关区为如SEQ ID NO:15至18中任一个中列出的序列。在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括如以下任一个中给出的核苷酸序列:SEQ ID NO:1158至1159、1171、1482至1483、1485至1486、2465至2471、2488至2490、2542至2546、2656至2657、2833至2835、3439至3440、3916至3918、4469至4472、4821、5429、5537、6061、7327、8330至13061以及13062至13087,或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中,该至少8个连续核苷酸存在于如SEQ ID NO:8中给出的核苷酸序列中。
在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO:30至13087中任一个中给出的核苷酸序列。在一些实施例中,该寡核苷酸的长度高达50个核苷酸。在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO:30至13087中任一个中给出的核苷酸序列中至少8个核苷酸的片段。
在一些实施例中,单链寡核苷酸包括如表4中给出的核苷酸序列。在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括如表4中给出的核苷酸序列中至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中,单链寡核苷酸由如表4中给出的核苷酸序列组成。
根据本发明的一些方面,提供包括通式A-B-C的化合物,其中A为与基因的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的单链寡核苷酸,B为接头,并且C为与该基因的前体mRNA的剪接控制序列互补的单链寡核苷酸。在一些实施例中,B包括寡核苷酸、肽、低pH不稳定键或二硫键。在一些实施例中,该剪接控制序列驻留在该基因的外显子中。在一些实施例中,该剪接控制序列横跨该基因的内含子-外显子接点。在一些实施例中,该剪接控制序列驻留在该基因的内含子中。在一些实施例中,该剪接控制序列包括至少一个hnRNAP结合序列。在一些实施例中,具有C的序列的寡核苷酸与前体mRNA的剪接控制序列在细胞内的杂交导致一个特定的外显子含入由该细胞内该前体mRNA的加工产生的成熟mRNA中。在一些实施例中,具有C的序列的寡核苷酸与前体mRNA的剪接控制序列在细胞内的杂交导致在由该细胞内该前体mRNA的加工产生的成熟mRNA中排除特定的内含子或外显子。
在一些实施例中,该基因为SMN1或SMN2。在一些实施例中,该剪接控制序列驻留在内含子6、内含子7、外显子7、外显子8内或SMN1或SMN2的内含子7和外显子8的接点处。在一些实施例中,该剪接控制序列包括序列:CAGCAUUAUGAAAG(SEQ ID NO:13100)。在一些实施例中,B包括选自以下的序列:TCACTTTCATAATGCTGG(SEQ ID NO:13088);TCACTTTCATAATGC(SEQ ID NO:13089);CACTTTCATAATGCT(SEQ IDNO:13090);ACTTTCATAATGCTG(SEQ ID NO:13090);以及CTTTCATAATGCTGG(SEQ ID NO:13092)。
在一些实施例中,A具有序列5’-X-Y-Z,其中X为任何核苷酸,Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列,并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中,SMN2基因的PRC2相关区为SEQ ID NO:1、2、4或5内的PRC2相关区。在一些实施例中,Y为选自表1的序列。在一些实施例中,PRC2相关区为SEQ ID NO:9至23中任一个中给出的序列。在一些实施例中,A包括如SEQ ID NO:30至8329和13088至13094中任一个中给出的核苷酸序列,或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中,A包括如SEQ ID NO:30至8329和13088至13094中任一个中给出的核苷酸序列,其中所提供的核苷酸序列的5’端为A的5’端。在一些实施例中,该至少8个连续核苷酸还存在于如SEQ ID NO:7中给出的核苷酸序列中。在一些实施例中,该PRC2相关区为SEQ ID NO:24至29中任一个中给出的序列。
在一些实施例中,A包括如以下任一个中给出的核苷酸序列:SEQ ID NO:1158至1159、1171、1482至1483、1485至1486、2465至2471、2488至2490、2542至2546、2656至2657、2833至2835、3439至3440、3916至3918、4469至4472、4821、5429、5537、6061、7327、8330至13061以及13062至13087,或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中,该至少8个连续核苷酸存在于如SEQ ID NO:8中给出的核苷酸序列中。在一些实施例中,A不包括三个或更多个连续鸟苷核苷酸。在一些实施例中,A不包括四个或更多个连续鸟苷核苷酸。在一些实施例中,A或C的长度为8至30个核苷酸。在一些实施例中,A的长度为8至10个核苷酸,并且该PRC2相关区的互补序列中除1、2或3个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶或鸟苷核苷酸。在一些实施例中,B为包括1至10个胸苷或尿苷的寡核苷酸。在一些实施例中,B在哺乳动物提取物中比A和C更易于裂解。
在一些实施例中,A包括选自GCTUTGGGAAGUAUG(SEQ ID NO:11394)、CUTUGGGAAGTATG(SEQ ID NO:11395)以及GGTACATGAGTGGCT(SEQ ID NO:11419)的核苷酸序列;B包括核苷酸序列TTTT或UUUU;并且C包括核苷酸序列TCACTTTCATAATGCTGG(SEQID NO:13088)、TCACTTTCATAATGC(SEQ ID NO:13089)、CACTTTCATAATGCT(SEQ ID NO:13090)、ACTTTCATAATGCTG(SEQ IDNO:13091)、或CTTTCATAATGCTGG(SEQ ID NO:13092),并且其中A的3’端连接至B的5’端,并且B的3’端连接至C的5’端。
在一些实施例中,该单链寡核苷酸不包括三个或更多个连续鸟苷核苷酸。在一些实施例中,该单链寡核苷酸不包括四个或更多个连续鸟苷核苷酸。
在一些实施例中,该单链寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。在一些实施例中,该单链寡核苷酸的长度高达50个核苷酸。在一些实施例中,该单链寡核苷酸的长度为8至10个核苷酸,并且该PRC2相关区的互补序列中除1、2或3个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶或鸟苷核苷酸。
在一些实施例中,该单链寡核苷酸与SMN基因的PRC2相关区、例如SEQID NO:1、2、4或5中给出的核苷酸序列的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补,其中该单链寡核苷酸的核苷酸序列包括选自下组的核苷酸序列中的一个或多个,该组由以下各项组成:
(a)(X)Xxxxxx、(X)xXxxxx、(X)xxXxxx、(X)xxxXxx、(X)xxxxXx以及(X)xxxxxX,
(b)(X)XXxxxx、(X)XxXxxx、(X)XxxXxx、(X)XxxxXx、(X)XxxxxX、(X)xXXxxx、(X)xXxXxx、(X)xXxxXx、(X)xXxxxX、(X)xxXXxx、(X)xxXxXx、(X)xxXxxX、(X)xxxXXx、(X)xxxXxX以及(X)xxxxXX,
(c)(X)XXXxxx、(X)xXXXxx、(X)xxXXXx、(X)xxxXXX、(X)XXxXxx、(X)XXxxXx、(X)XXxxxX、(X)xXXxXx、(X)xXXxxX、(X)xxXXxX、(X)XxXXxx、(X)XxxXXx、(X)XxxxXX、(X)xXxXXx、(X)xXxxXX、(X)xxXxXX、(X)xXxXxX以及(X)XxXxXx,
(d)(X)xxXXX、(X)xXxXXX、(X)xXXxXX、(X)xXXXxX、(X)xXXXXx、(X)XxxXXXX、(X)XxXxXX、(X)XxXXxX、(X)XxXXx、(X)XXxxXX、(X)XXxXxX、(X)XXxXXx、(X)XXXxxX、(X)XXXxXx以及(X)XXXXxx,
(e)(X)xXXXXX、(X)XxXXXX、(X)XXxXXX、(X)XXXxXX、(X)XXXXxX以及(X)XXXXXx,以及
(f)XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX以及XXXXXXx,其中“X”表示核苷酸类似物,(X)表示任选的核苷酸类似物,并且“x”表示DNA或RNA核苷酸单位。
在一些实施例中,该寡核苷酸的至少一个核苷酸为核苷酸类似物。在一些实施例中,与不具有至少一个核苷酸类似物的寡核苷酸相比较,该至少一个核苷酸类似物导致该寡核苷酸的的Tm在1℃至5℃的范围内的升高。
在一些实施例中,该寡核苷酸的至少一个核苷酸包括2’O-甲基。在一些实施例中,该寡核苷酸的每个核苷酸包括2’O-甲基。在一些实施例中,该寡核苷酸包括至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸或至少一个桥连核苷酸。在一些实施例中,该桥连核苷酸为LNA核苷酸、cEt核苷酸或ENA修饰的核苷酸。在一些实施例中,该寡核苷酸的每个核苷酸为LNA核苷酸。
在一些实施例中,该寡核苷酸的核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸以及2’-氟-脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中,该寡核苷酸的核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸以及2’-O-甲基核苷酸。在一些实施例中,该寡核苷酸的核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸以及ENA核苷酸类似物。在一些实施例中,该寡核苷酸的核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸以及LNA核苷酸。在一些实施例中,该寡核苷酸的5’核苷酸为脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中,该寡核苷酸的核苷酸包括交替的LNA核苷酸和2’-O-甲基核苷酸。在一些实施例中,该寡核苷酸的5’核苷酸为LNA核苷酸。在一些实施例中,该寡核苷酸的核苷酸包括通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的至少一个LNA核苷酸侧接的脱氧核糖核苷酸。
在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或更多个核苷酸之间的修饰的核苷酸间键(例如,硫代磷酸酯核苷酸间键或其他键)。在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括所有核苷酸之间的修饰的核苷酸间键(例如,硫代磷酸酯核苷酸间键或其他键)。
在一些实施例中,该寡核苷酸的3’位置处的核苷酸具有3’羟基。在一些实施例中,该寡核苷酸的3’位置处的核苷酸具有3’硫代磷酸酯。在一些实施例中,该单链寡核苷酸具有生物素部分或缀合至其5’或3’核苷酸的其他部分。在一些实施例中,该单链寡核苷酸具有胆固醇、维生素A、叶酸、σ受体配体、适体、肽如CPP、疏水性分子如脂质、ASGPR或动态多聚缀合物以及其在5’或3’端处的变体。
根据本发明的一些方面,提供包含在此披露的任何寡核苷酸以及载体的组合物。在一些实施例中,提供在缓冲溶液中包含任何寡核苷酸的组合物。在一些实施例中,将寡核苷酸缀合至载体。在一些实施例中,载体为肽。在一些实施例中,载体为一种类固醇。根据本发明的一些方面,提供包含在此披露的任何寡核苷酸以及药学上可接受的载体的药物组合物。
根据本发明的其他方面,提供包括容纳在此披露的任何组合物的容器的试剂盒。
根据本发明的一些方面,提供提高细胞内SMN1或SMN2的表达的方法。在一些实施例中,这些方法包括将在此披露的单链寡核苷酸中的任一种或多种递送至细胞。在一些实施例中,将该单链寡核苷酸递送至细胞导致SMN1或SMN2的表达水平大于(例如,至少50%大于)不包括该单链寡核苷酸的对照细胞中的SMN1或SMN2的表达水平。
根据本发明的一些方面,提供提高受试者体内SMN1或SMN2的水平的方法。根据本发明的一些方面,提供治疗受试者体内与SMN1或SMN2的降低的水平相关联的病症(例如,脊髓性肌萎缩)的方法。在一些实施例中,这些方法包括向该受试者给予在此披露的单链寡核苷酸中的任一种或多种。
本发明的方面涉及提高细胞内SMN蛋白的表达的方法。在一些实施例中,该方法包括向细胞递送与SMN2的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的第一单链寡核苷酸,以及与SMN2的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸,量足以提高SMN2的包含外显子7的成熟mRNA在细胞内的表达。在一些实施例中,与SMN2的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的区与SMN1的相应区具有至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8个或更多个错配。如在此所使用,术语“剪接控制序列”是指在存在于前体mRNA时影响所述前体mRNA在细胞内的剪接的核苷酸序列。在一些实施例中,剪接控制序列包括针对调控mRNA剪接的分子如hnRNAP蛋白的一个或多个结合位点。在一些实施例中,剪接控制序列包括序列CAG或AAAG。在一些实施例中,剪接控制序列驻留在外显子(例如,SMN1或SMN2的外显子,如外显子7或外显子8)内。在一些实施例中,剪接控制序列横跨内含子-外显子接点(例如,SMN1或SMN2的内含子-外显子接点,如内含子6/外显子7接点或内含子7/外显子8接点)。在一些实施例中,剪接控制序列驻留在内含子(例如,SMN1或SMN2的内含子,如内含子6或内含子7)内。在一些实施例中,剪接控制序列包括序列:CAGCAUUAUGAAAG(SEQ ID NO:13100)或其一部分。
在一些实施例中,该第二单链寡核苷酸为包括选自以下的序列的剪接转换寡核苷酸:TCACTTTCATAATGCTGG(SEQ ID NO:13088);TCACTTTCATAATGC(SEQ ID NO:13089);CACTTTCATAATGCT(SEQ IDNO:13090);ACTTTCATAATGCTG(SEQ ID NO:13091);以及CTTTCATAATGCTGG(SEQ ID NO:13092)。在一些实施例中,该第二单链寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。
在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸具有序列5’-X-Y-Z,其中X为任何核苷酸,Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列,并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中,SMN2基因的PRC2相关区为SEQ ID NO:1、2、4或5内的PRC2相关区。在一些实施例中,Y为选自表1的序列。在一些实施例中,PRC2相关区为SEQ ID NO:9至23中任一个中给出的序列。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO:30至8329和13088至13094中任一个中给出的核苷酸序列,或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸包括如SEQ IDNO:30至8329和13088至13094中任一个中给出的核苷酸序列,其中所提供的核苷酸序列的5’端为该第一单链寡核苷酸的5’端。在一些实施例中,该至少8个连续核苷酸还存在于如SEQ ID NO:7中给出的核苷酸序列中。
在一些实施例中,该PRC2相关区为SEQ ID NO:24至29中任一个中给出的序列。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸包括以下任一个中给出的核苷酸序列:SEQ ID NO:1158至1159、1171、1482至1483、1485至1486、2465至2471、2488至2490、2542至2546、2656至2657、2833至2835、3439至3440、3916至3918、4469至4472、4821、5429、5537、6061、7327、8330至13061以及13062-13087,或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中,该至少8个连续核苷酸存在于如SEQ ID NO:8中给出的核苷酸序列中。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸不包括三个或更多个连续鸟苷核苷酸。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸不包括四个或更多个连续鸟苷核苷酸。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸的长度为8至10个核苷酸,并且该PRC2相关区的互补序列中除1、2或3个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶或鸟苷核苷酸。
在一些实施例中,同时向细胞递送该第一单链寡核苷酸和该第二单链寡核苷酸。在一些实施例中,细胞处于受试者体内并且向细胞递送的步骤包括向受试者给予该第一单链寡核苷酸和该第二单链寡核苷酸作为共同配制品。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸通过接头共价连接至该第二单链寡核苷酸。在一些实施例中,该接头包括寡核苷酸、肽、低pH不稳定键或二硫键。在一些实施例中,该接头包括寡核苷酸,任选地,其中该寡核苷酸包括1至10个胸苷或尿苷。在一些实施例中,该接头在哺乳动物提取物中比该第一单链寡核苷酸和该第二单链寡核苷酸更易于裂解。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸未共价连接至该第二单链寡核苷酸。在一些实施例中,分开向细胞递送该第一单链寡核苷酸和该第二单链寡核苷酸。
根据本发明的一些方面,提供用于治疗受试者体内脊髓性肌萎缩的方法。在一些实施例中,这些方法包括向该受试者给予与SMN2的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的第一单链寡核苷酸,以及与SMN2的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸,量足以提高该受试者体内SMN蛋白的表达。
根据本发明的一些方面,提供用于治疗受试者体内脊髓性肌萎缩的方法,这些方法包括向该受试者给予与SMN2的PRC2相关区互补的第一单链寡核苷酸,以及与SMN2的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸,量足以提高该受试者体内SMN蛋白的表达。还提供相关组合物。在一些实施例中,提供组合物,其包含与SMN2的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的第一单链寡核苷酸,以及与SMN2的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸。在一些实施例中,提供组合物,其包含与基因的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的单链寡核苷酸,该单链寡核苷酸经由接头连接至与该基因的前体mRNA的剪接控制序列互补的单链寡核苷酸。还提供包括调控SMN1或SMN2表达的单链寡核苷酸的相关试剂盒。
根据本发明的一些方面,提供包含在此披露的任何寡核苷酸或化合物以及载体的组合物。在一些实施例中,提供在缓冲溶液中的包含任何寡核苷酸或化合物的组合物。在一些实施例中,将寡核苷酸缀合至载体。在一些实施例中,该载体为肽。在一些实施例中,该载体为一种类固醇。根据本发明的一些方面,提供包含在此披露的任何寡核苷酸以及药学上可接受的载体的药物组合物。
根据本发明的一些方面,提供组合物,其包含与SMN2的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的第一单链寡核苷酸,以及与SMN2的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸。在一些实施例中,该剪接控制序列驻留在SMN2的外显子中。在一些实施例中,该外显子为外显子7或外显子8。在一些实施例中,该剪接控制序列横跨SMN2的内含子-外显子接点。在一些实施例中,该内含子-外显子接点为内含子6/外显子7接点或内含子7/外显子8接点。在一些实施例中,该剪接控制序列驻留在SMN2的内含子中。在一些实施例中,该内含子为内含子6或内含子7(SEQ ID NO:13101)。在一些实施例中,该剪接控制序列包括序列:CAGCAUUAUGAAAG(SEQ ID NO:13100)或其一部分。在一些实施例中,该剪接控制序列包括至少一个hnRNAP结合序列。在一些实施例中,该第二单链寡核苷酸包括选自以下的序列:TCACTTTCATAATGCTGG(SEQ ID NO:13088);TCACTTTCATAATGC(SEQ ID NO:13089);CACTTTCATAATGCT(SEQ ID NO:13090);ACTTTCATAATGCTG(SEQ ID NO:13091);以及CTTTCATAATGCTGG(SEQ ID NO:13092)。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸具有序列5’-X-Y-Z,其中X为任何核苷酸,Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列,并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中,SMN2的PRC2相关区为SEQ ID NO:1、2、4或5内的PRC2相关区。在一些实施例中,Y为选自表1的序列。在一些实施例中,该PRC2相关区为SEQ ID NO:9至23中任一个中给出的序列。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO:30至8329和13093至13094中任一个中给出的核苷酸序列,或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO:30至8329和13093至13094中任一个中给出的核苷酸序列,其中所提供的核苷酸序列的5’端为该第一单链寡核苷酸的5’端。在一些实施例中,该至少8个连续核苷酸还存在于如SEQ ID NO:7中给出的核苷酸序列中。在一些实施例中,该PRC2相关区为SEQ ID NO:24至29中任一个中给出的序列。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸包括以下任一个中给出的核苷酸序列:SEQ ID NO:1158至1159、1171、1482至1483、1485至1486、2465至2471、2488至2490、2542至2546、2656至2657、2833至2835、3439至3440、3916至3918、4469至4472、4821、5429、5537、6061、7327、8330至13061以及13062-13087,或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中,该至少8个连续核苷酸存在于如SEQ ID NO:8中给出的核苷酸序列中。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸不包括三个或更多个连续鸟苷核苷酸。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸不包括四个或更多个连续鸟苷核苷酸。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸和/或第二单链寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸的长度为8至10个核苷酸,并且该PRC2相关区的互补序列中除1、2或3个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶或鸟苷核苷酸。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸通过接头共价连接至该第二单链寡核苷酸。在一些实施例中,该接头包括寡核苷酸、肽、低pH不稳定键或二硫键。在一些实施例中,该接头包括寡核苷酸,任选地,其中该寡核苷酸包括1至10个胸苷或尿苷。在一些实施例中,该接头在哺乳动物提取物中比该第一单链寡核苷酸和该第二单链寡核苷酸更易于裂解。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸未共价连接至该第二单链寡核苷酸。在一些实施例中,该组合物进一步包含载体。在一些实施例中,该载体为药学上可接受的载体。
本发明的另外的方面提供用于选择用于激活或增强SMN1或SMN2的表达的寡核苷酸的方法。在一些实施例中,提供用于选择一组寡核苷酸的方法,该组寡核苷酸中富集于用于激活或增强SMN1或SMN2的表达的候选物(例如,与寡核苷酸随机选择相比较)中。因此,这些方法可以用于建立其中富集了激活或增强SMN1或SMN2的表达的寡核苷酸的多组临床候选物。这类库可以被利用来例如鉴别用于开发治疗SMN1或SMN2的治疗剂的先导寡核苷酸。另外,在一些实施例中,提供寡核苷酸化学性质,其可用于控制用于激活SMN1或SMN2的表达的单链寡核苷酸的药物代谢动力学、生物分布、生物可利用性和/或功效。
根据本发明的其他方面,提供包括容纳在此披露的任何组合物的容器的试剂盒。根据本发明的其他方面,提供试剂盒,这些试剂盒包括第一容器,该第一容器容纳与基因的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的第一单链寡核苷酸;以及第二容器,该第二容器容纳与该基因的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸。在一些实施例中,该剪接控制序列驻留在该基因的外显子中。在一些实施例中,该剪接控制序列横跨该基因的内含子-外显子接点。在一些实施例中,该剪接控制序列驻留在该基因的内含子中。在一些实施例中,该剪接控制序列包括至少一个hnRNAP结合序列。在一些实施例中,具有C的序列的寡核苷酸与前体mRNA的剪接控制序列在细胞内的杂交导致特定的外显子含入在由该细胞内该前体mRNA的加工产生的成熟mRNA中。在一些实施例中,具有C的序列的寡核苷酸与前体mRNA的剪接控制序列在细胞内的杂交导致在由该细胞内该前体mRNA的加工产生的成熟mRNA中排除的特定的内含子或外显子。在一些实施例中,该基因为SMN1或SMN2。在一些实施例中,该剪接控制序列驻留在内含子6、内含子7、外显子7、外显子8内或内含子7和外显子8的接点处。(在一些实施例中,该剪接控制序列包括序列:CAGCAUUAUGAAAG(SEQ ID NO:13100)。在一些实施例中,该第二单链寡核苷酸包括选自以下的序列:TCACTTTCATAATGCTGG(SEQ IDNO:13088);TCACTTTCATAATGC(SEQ ID NO:13089);CACTTTCATAATGCT(SEQ ID NO:13090);ACTTTCATAATGCTG(SEQ IDNO:XX);以及CTTTCATAATGCTGG(SEQ ID NO:13091)。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸具有序列5’X-Y-Z,其中X为任何核苷酸,Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列,并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列。在一些实施例中,SMN2基因的PRC2相关区为SEQ ID NO:1、2、4或5内的PRC2相关区。在一些实施例中,Y为选自表1的序列。在一些实施例中,该PRC2相关区为SEQ ID NO:9至23中任一个中给出的序列。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸包括如SEQ IDNO:30至8329和13093至13094中任一个中给出的核苷酸序列,或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO:30至8329和13093至13094中任一个中给出的核苷酸序列,其中所提供的核苷酸序列的5’端为该第一单链寡核苷酸的5’端。在一些实施例中,该至少8个连续核苷酸还存在于如SEQ ID NO:7中给出的核苷酸序列中。在一些实施例中,该PRC2相关区为SEQ ID NO:24至29中任一个中给出的序列。在一些实施例中,该第一单链寡核苷酸包括如以下任一个中给出的核苷酸序列:SEQ ID NO:1158至1159、1171、1482至1483、1485至1486、2465至2471、2488至2490、2542至2546、2656至2657、2833至2835、3439至3440、3916至3918、4469至4472、4821、5429、5537、6061、7327、8330至13061以及13062至13087,或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中,该至少8个连续核苷酸存在于如SEQ ID NO:8中给出的核苷酸序列中。
附图简要说明
图1提供SMN1和SMN2mRNA加工的示意图。
图2提供概括实例2中所测试的细胞系的基因型和包括SMA分类的专利信息的表。还描绘了细胞系中的基线SMN蛋白水平。
图3描绘了RT-PCR测定的结果,显示了针对SMN2的PRC2相关区的寡核苷酸(寡核苷酸1至52和59至101)以及剪接转换寡核苷酸(寡核苷酸53至58)(针对SMN1/2的外显子1的PCR引物)在细胞系3814中对SMNmRNA表达的影响。
图4描绘了RT-PCR测定的结果,显示了针对SMN2的PRC2相关区的寡核苷酸(寡核苷酸1至52和59至101)以及剪接转换寡核苷酸(寡核苷酸53至58)(针对SMN1/2的外显子1的PCR引物)在细胞系3813中对SMNmRNA表达的影响。
图5示出剪接转换寡核苷酸(寡核苷酸53至58)提高了全长SMN2的表达。结果是基于DdeI限制性消化之后获得的PCR产物的凝胶分离分析。测试了两个细胞系3813和9677。靶向SMN2的PRC2相关区的寡核苷酸84在单独递送至细胞时并未展现出全长SMN2表达的提高。
图6提供SMN ELISA(Enzo)的结果,显示了针对SMN2的PRC2相关区的某些寡核苷酸单独在某些SMA患者成纤维细胞中转染24小时之后并未显著提高SMN2蛋白(与经过脂质转染胺处理的细胞相比较-虚线)。
图7提供SMN ELISA的结果,显示了针对SMN2的PRC2相关区的寡核苷酸组合剪接转换寡核苷酸(寡核苷酸53)在SMA患者成纤维细胞中转染24小时之后显著提高了SMN2蛋白(与经过脂质转染胺处理的细胞相比较-虚线)。
图8提供SMN ELISA的结果,显示了针对SMN2的PRC2相关区的寡核苷酸组合剪接转换寡核苷酸(寡核苷酸54)在SMA患者成纤维细胞中转染24小时之后显著提高了SMN2蛋白(与经过脂质转染胺处理的细胞相比较-虚线)。
图9提供RT-PCR测定的结果,显示了针对SMN2的PRC2相关区的寡核苷酸组合剪接转换寡核苷酸(寡核苷酸53或54)在SMA患者成纤维细胞中转染24小时之后显著提高了SMN2蛋白(与阴性对照寡核苷酸和经过脂质转染胺处理的细胞相比较)。测试了LNA/2’OMe交替寡核苷酸(LM设计)和DNA/LNA交替寡核苷酸(DL设计)。
表格简述
表1:非为人miRNA的种子序列的六聚物
表2:为实验室测试制备的寡核苷酸序列。RQ(第2列)和RQ SE(第3列)显示了寡核苷酸相对于对照孔(通常为单独的载体)的活性以及标准误差或实验的三次重复(triplicate replicates)。已示出[寡核苷酸]在体外实验中以纳摩尔计并且在体内实验中以微克/千克体重计。
表3:寡核苷酸修饰列表
表4:为测试从患有脊髓性肌萎缩的受试者获得的人细胞而制备的寡核苷酸序列。表格示出修饰的核苷酸序列,其中lnaX表示具有3’硫代磷酸酯键的LNA核苷酸,omeX为2’-O-甲基核苷酸,dX为脱氧核苷酸。核苷酸码末端处的s指示该核苷酸具有3’硫代磷酸酯键。序列末端处的“-Sup”标记以下事实:3’末端的3’键上缺少磷酸酯或硫代磷酸酯。针对表2、表5、表6以及表7中所测试的寡核苷酸,格式化序列列示出了包括修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
表8:细胞系
附录简要说明
·附录A;附录A含有表5,示出来自不同的寡核苷酸的测试的RT-PCR数据。
·附录B;附录B含有表6,示出来自不同的组合治疗(例如,两种寡核苷酸、一种寡核苷酸和一种药物)的测试的RT-PCR数据。
·附录C;附录C含有表7,示出来自不同的寡核苷酸的测试的ELISA数据。
对应注释出附录A至C中表5至表7的以下列信息。SEQID:所使用的寡核苷酸的碱基序列的序列标识符;寡核苷酸名称:寡核苷酸的名称;Avg RQ:一个或多个靶基因的基于RT-PCR的表达水平的平均相对量化;Avg RQ SE:基于RT-PCR的表达水平的相对量化的均值的标准误差;“相对于仅脂对照的SMN%”是指SMN蛋白水平(ng/mg总蛋白)在与经过脂质转染胺2000(转染试剂)处理的细胞相比较时转化成%的比率;“SMN CVV%”是指变异系数;Exp#:实验参考编号;靶标:靶基因;[寡核苷酸]:所使用的寡核苷酸的浓度以nM计,除非另外指明;细胞系:所使用的细胞系;测定类型;所使用的测定;时间(hr):处理之后的测定时间;第2种药物:组合实验中所使用的第二种寡核苷酸(通过寡核苷酸名称鉴别)或药物的名称;[2nd]:第二种寡核苷酸或药物的浓度;单位:浓度单位;第3种药物:组合试验中使用的第三种寡核苷酸(通过寡核苷酸名称鉴别)或药物的名称;[3rd]:第三种寡核苷酸或药物的浓度;注释:有关实验的注解。寡核苷酸名称与表2和表4中的那些对应。
本发明的某些实施方案的详细说明
脊髓性肌萎缩(SMA)是婴儿死亡的最常见遗传病因,它是常染色体隐性神经肌肉疾病,其特征在于:脊柱前角中α-运动神经元的进行性损失,从而导致四肢和躯干的随意肌的麻痹和萎缩。基于发作的严重程度和年龄,SMA临床细分成I型、II型以及III型(MIM 253300、253550以及253400),其中I型通常理解为是最严重的。
SMN1基因的功能损失导致SMA。人具有另外的SMN基因拷贝,称为SMN2。两种SMN基因都在染色体5q13上的一个区段复制内作为反向重复驻留。SMN1和SMN2几乎是相同的。在一些情况下,SMN1和SMN2的区别在于11个核苷酸取代,包括内含子6中的七个、内含子7中的两个、编码外显子7中的一个以及非编码外显子8中的一个。与SMN1相比较,外显子7中的取代包括翻译沉默的C至T过渡,这导致交替的剪接,因为取代破坏了上游3’剪接位点的识别,其中在前体mRNA剪接过程中频繁跳过外显子7。因此,SMN2主要编码跳过外显子7的蛋白同工型(SMNΔ7),该蛋白质同工型为不稳定的,错误定位的,并且仅具有部分的。
在此提供了可用于选择性地诱导SMN1或SMN2的特定的剪接变体的表达的方法和相关的单链寡核苷酸。这些方法可用于控制细胞内由剪接变体编码的特定的SMN蛋白同工型的水平。在一些情况下,这些方法可用于将SMN蛋白的表达诱导至足以治疗SMA的水平。例如,根据本发明的一些方面,提供用于出于治疗SMA目的而提高细胞内全长SMN蛋白的表达的方法。在一些实施例中,这些方法包括向细胞递送与SMN1或SMN2的PRC2相关区互补的第一单链寡核苷酸,以及与SMN1或SMN2的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸,量足以提高SMN1或SMN2的包含(或包括)外显子7的成熟的mRNA在细胞内的表达。在此详细描述本发明的另外的方面。多梳阻抑复合物2(PRC2)-相互作用RNA
在此提供的本发明的方面涉及发现多梳阻抑复合物2(PRC2)-相互作用RNA。多梳阻抑复合物2(PRC2)为组蛋白甲基转移酶以及使基因组区通过组蛋白H3的甲基化沉默中涉及的已知的表观遗传调控剂(epigenetic regulator)。在其他功能中,PRC2与长的非编码RNA(1ncRNA)如RepA、Xist以及Tsix相互作用以便催化组蛋白H3-赖氨酸27的三甲基化。PRC2含有四个亚单位:Eed、Suz12、RbAp48以及Ezh2。本发明的方面涉及单链寡核苷酸可以诱导或增强SMN1或SMN2的表达的认识,这些单链寡核苷酸结合至在基因组区内表达的RNA(例如,lncRNA)的PRC2相关区,该基因组区涵盖或功能性接近SMN1或SMN2基因。在一些实施例中,认为这个上调源于PRC2介导的SMN1或SMN2的阻抑的抑制作用。
如在此所使用,术语“PRC2相关区”是指包括或编码与PRC2的组分直接或间接相互作用的核苷酸序列的核酸的区域。PRC2相关区可以存在于与PRC2相互作用的RNA(例如,长的非编码RNA(1ncRNA))中。PRC2相关区可以存在于编码与PRC2相互作用的RNA的DNA中。在一些情况下,该PRC2相关区等效地称为PRC2相互作用区。
在一些实施例中,PRC2相关区为响应于对表达RNA的细胞的原位紫外线辐射而交联至PRC2的组分的RNA的区域,或编码所述RNA区域的基因组DNA的区域。在一些实施例中,PRC2相关区为与靶向PRC2的组分的抗体一起免疫沉淀的RNA的区域,或编码所述RNA区域的基因组DNA的区域。在一些实施例中,PRC2相关区为与特异性结合至SUZ12、EED、EZH2或RBBP4(如上所述为PRC2的组分)的抗体一起免疫沉淀的RNA的区域,或编码所述RNA区域的基因组DNA的区域。
在一些实施例中,PRC2相关区为在采用靶向PRC2的组分的抗体的RNA免疫沉淀测定中被保护免于核酸酶(例如,RNase)破坏的RNA的区域,或编码所述受保护的RNA区域的基因组DNA的区域。在一些实施例中,PRC2相关区为在采用靶向SUZ12、EED、EZH2或RBBP4的抗体的RNA免疫沉淀测定中被保护免于核酸酶(例如,RNase)破坏的RNA的区域,或编码所述受保护的RNA区域的基因组DNA的区域。
在一些实施例中,PRC2相关区为RNA的区域,其中在采用靶向PRC2的组分的抗体的RNA免疫沉淀测定的产物的测序反应中出现相对高频率的序列读取,或编码所述RNA区域的基因组DNA的区域。在一些实施例中,PRC2相关区为RNA的区域,其中在采用特异性结合至SUZ12、EED、EZH2或RBBP4的抗体的RNA免疫沉淀测定的产物的测序反应中出现相对高频率的序列读取,或编码所述受保护的RNA区域的基因组DNA的区域。在这类实施例中,该PRC2相关区可以称为“峰”。
在一些实施例中,PRC2相关区包括与PRC2复合物相互作用的、具有40至60个核苷酸的序列。在一些实施例中,PRC2相关区包括编码与PRC2相互作用的RNA的、具有40至60个核苷酸的序列。在一些实施例中,PRC2相关区包括长度高达5kb、包括与PRC2相互作用的序列(例如,具有40至60个核苷酸)的序列。在一些实施例中,PRC2相关区包括长度高达5kb的序列,其中编码具有已知与PRC2相互作用的序列(例如,具有40至60个核苷酸)的RNA。在一些实施例中,PRC2相关区包括长度约4kb、包括与PRC2相互作用的序列(例如,具有40至60个核苷酸)的序列。在一些实施例中,PRC2相关区包括长度约4kb的序列,其中编码包括已知与PRC2相互作用的序列(例如,具有40至60个核苷酸)的RNA。在一些实施例中,PRC2相关区具有如SEQ ID NO:9至29中任一个中给出的序列。在一些实施例中,PRC2相关区具有如SEQ ID NO:24至29中任一个中给出的序列。
在一些实施例中,提供单链寡核苷酸,其特异性结合至涵盖或接近SMN1或SMN2基因的基因组区内的PRC2相关区或与其互补。在一些实施例中,提供单链寡核苷酸,其特异性结合至具有如SEQ ID NO:9至29中任一个中给出的序列的PRC2相关区或与其互补。在一些实施例中,提供单链寡核苷酸,其特异性结合至一个PRC2相关区或与其互补,该PRC2相关区具有如SEQ ID NO:9至29中任一个中给出的序列,该序列连同来自这些SEQ ID所定位的相应基因组区(例如,在人基因组中)的2kb、高达5kb或高达10kb侧接序列相结合。在一些实施例中,单链寡核苷酸具有如SEQ ID NO:30至13087中任一个中给出的序列。在一些实施例中,单链寡核苷酸具有如表2中给出的序列。在一些实施例中,与单链寡核苷酸互补的SMN1或SMN2的PRC2相关区选自SEQ IDNO:24至29。在一些实施例中,与SMN1或SMN2的PRC2相关区互补的单链寡核苷酸包括选自以下的序列:SEQ ID NO:1158至1159、1171、1482至1483、1485至1486、2465至2471、2488至2490、2542至2546、2656至2657、2833至2835、3439至3440、3916至3918、4469至4472、4821、5429、5537、6061、7327、8330至13061以及13062-13087。在一些实施例中,与SMN1或SMN2的PRC2相关区互补的单链寡核苷酸包括选自11395、11394、10169以及10170的序列。
无意受限于本发明的理论,这些寡核苷酸能够通过防止将PRC2募集至特定染色体基因座来干扰PRC2的结合和功能。例如,设计成特异性结合PRC2相关区lncRNA的单链寡核苷酸的单一给药通过结合染色质不仅可以稳定地替换lncRNA,而且可以替换结合至lncRNA的PRC2。在替换之后,PRC2的完整补体在高达24小时之内未恢复。另外,lncRNA能够以顺式方式募集PRC2,从而阻抑转录lncRNA的特定染色体基因座处或附近的基因表达。
在一些实施例中,提供调节基因表达的方法,这些方法可以在体外、离体或体内执行。应理解,整个说明书中对化合物的用途的任何提及涵盖所述化合物在制备用于治疗与SMN1或SMN2的降低的水平或活性相关联的病症(例如,脊髓性肌萎缩)的药物组合物或药剂的中的用途。因此,作为一个非限制性实例,本发明的这个方面包括这类单链寡核苷酸在制备用于治疗疾病的药剂中的用途,其中该治疗包括上调SMN1或SMN2的表达。
在本发明的另外的方面,提供用于选择用于激活SMN1或SMN2的表达的候选寡核苷酸的方法。这些方法通常包括选择包括与PRC2相关区互补的核苷酸序列(例如,如SEQ ID NO:9至29中任一个中给出的核苷酸序列)的单链寡核苷酸作为候选寡核苷酸。在一些实施例中,可以选择富集了激活SMN1或SMN2的表达的寡核苷酸(例如,与随机寡核苷酸选择相比较)的多组寡核苷酸。
用于调节SMN1或SMN2的表达的单链寡核苷酸
在本发明的一个方面,提供用于调节细胞内SMN1或SMN2的表达的、与PRC2相关区互补的单链寡核苷酸。在一些实施例中,上调或提高SMN1或SMN2的表达。在一些实施例中,与这些PRC2相关区互补的单链寡核苷酸抑制PRC2与长的RNA转录物的相互作用,以使得上调或提高基因表达。在一些实施例中,与这些PRC2相关区互补的单链寡核苷酸抑制PRC2与长的RNA转录物的相互作用,从而导致组蛋白H3的减少的甲基化以及减少的基因失活,这样使得上调或提高基因表达。在一些实施例中,这种相互作用可能因防止或减少结合至PRC2的长的RNA的结构的变化而被破坏或抑制。可以使用在此披露用于选择用于激活SMN1或SMN2的表达的候选寡核苷酸的任何方法来选择寡核苷酸。
该单链寡核苷酸可以包括与SEQ ID NO:1至8中任一个中给出的核苷酸序列的PRC2相关区互补的互补区。该单链寡核苷酸的互补区可以与PRC2相关区的至少6、例如至少7、至少8、至少9、至少10、至少15或更多个连续核苷酸互补。
应认识到,归因于SMN1与SMN2之间的高同源性,与SMN1的PRC2相关区互补的单链寡核苷酸常常也与SMN2的相应PRC2相关区互补。
PRC2相关区可以定位至染色体中在SMN1或SMN2基因的5’端上游50千碱基与SMN1或SMN2基因的3’端下游50千碱基之间的位置。PRC2相关区可以定位至染色体中在SMN1或SMN2基因的5’端上游25千碱基与SMN1或SMN2基因的3’端下游25千碱基之间的位置。PRC2相关区可以定位至染色体中在SMN1或SMN2基因的5’端上游12千碱基与SMN1或SMN2基因的3’端下游12千碱基之间的位置。PRC2相关区可以定位至染色体中在SMN1或SMN2基因的5’端上游5千碱基与SMN1或SMN2基因的3’端下游5千碱基之间的位置。
所选择的PRC2相关区相对于SMN1或SMN2基因的基因组位置可以变化。例如,PRC2相关区可以位于SMN1或SMN2基因的5’端上游。PRC2相关区可以位于SMN1或SMN2基因的3’端下游。PRC2相关区可以位于SMN1或SMN2基因的内含子内。PRC2相关区可以位于SMN1或SMN2基因的外显子内。PRC2相关区可以横跨SMN1或SMN2基因的内含子-外显子接点、5’-UTR-外显子接点或3’-UTR-外显子接点。
该单链寡核苷酸可以包括具有式5’-X-Y-Z的序列,其中X为任何核苷酸,Y为非为微小RNA的人种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列,并且Z为具有变化的长度的核苷酸序列。在一些实施例中,X为寡核苷酸的5’核苷酸。在一些实施例中,当X锚定在寡核苷酸的5’端时,寡核苷酸不具有在5’连接至X的任何核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施例中,其他化合物如肽类或固醇类在这个实施例中可以连接在5’端上,只要它们不为核苷酸或核苷酸类似物即可。在一些实施例中,该单链寡核苷酸具有序列5’X-Y-Z并且长度为8至50个核苷酸。预测具有这些序列特征的寡核苷酸以便避免miRNA路径。因此,在一些实施例中,具有这些序列特征的寡核苷酸不可能具有在细胞内起到miRNA分子作用的不期望的结果。Y序列可以为表1中给出的长度为6个核苷酸的核苷酸序列。
该单链寡核苷酸可以具有不含有尿苷核苷酸伸展段(例如,3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个连续鸟苷核苷酸)的序列。在一些实施例中,与不具有鸟苷核苷酸伸展段的寡核苷酸相比较,具有鸟苷核苷酸伸展段的寡核苷酸具有提高的非特异性结合和/或脱靶效应。
该单链寡核苷酸可以具有与具有相等长度的每个核苷酸序列具有小于阈值水平的序列一致性的序列,这些核苷酸定位至涵盖或接近脱靶基因的基因组位置。例如,寡核苷酸可以被设计来确保其不具有定位至涵盖或接近除SMN1或SMN2之外的所有已知基因(例如,所有已知蛋白编码基因)的基因组位置的序列。在类似的实施例中,寡核苷酸可以被设计来确保其不具有定位至任何其他已知的PRC2相关区、尤其是与任何其他已知基因(例如,任何其他已知的蛋白编码基因)在功能上相关的PRC2相关区的序列。在任一种情况下,该寡核苷酸有望具有降低的具有脱靶效应的可能性。阈值水平的序列一致性可以为50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、99%或100%的序列一致性。
该单链寡核苷酸可以具有与编码RNA的PRC2相关区互补的序列,RNA形成包括至少两个单链环的二级结构。已发现,在一些实施例中,与编码形成包括一个或多个单链环(例如,至少两个单链环)的二级结构的RNA的PRC2相关区互补的寡核苷酸具有活性(例如,能够激活或增强靶基因的表达)的可能性大于随机选择的寡核苷酸。在一些情况下,该二级结构可以包括该至少两个单链环之间的双链茎。因此,该寡核苷酸与该PRC2相关区之间的互补区可以位于编码至少一个环的至少一部分的该PRC2相关区的位置。在一些情况下,该寡核苷酸与该PRC2相关区之间的互补区可以位于编码至少两个环的至少一部分的该PRC2相关区的位置。在一些情况下,该寡核苷酸与该PRC2相关区之间的互补区可以位于编码双链茎的至少一部分的该PRC2相关区的位置。在一些实施例中,(例如,lncRNA的)PRC2相关区被鉴别(例如,使用RIP-Seq方法或来自其的信息)。在一些实施例中,含有该PRC2相关区的预测的二级结构RNA(例如,lncRNA)使用RNA二级结构预测算法例如RNAfold、mfold来确定。在一些实施例中,寡核苷酸被设计来靶向形成包括一个或多个单链环(例如,至少两个单链环)结构的二级结构的RNA的区域,该一个或多个单链环结构可以包括该至少两个单链环之间的双链茎。
该单链寡核苷酸可以具有G-C含量大于30%,G-C含量大于40%,G-C含量大于50%,G-C含量大于60%,G-C含量大于70%或G-C含量大于80%的序列。该单链寡核苷酸可以具有G-C含量高达100%,G-C含量高达95%,G-C含量高达90%或G-C含量高达80%的序列。在其中寡核苷酸的长度为8至10个核苷酸的一些实施例中,该PRC2相关区的互补序列中除1、2、3、4或5个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶或鸟苷核苷酸。在一些实施例中,与该单链寡核苷酸互补的该PRC2相关区的序列包括至多3个选自腺嘌呤和尿嘧啶的核苷酸。
该单链寡核苷酸可以与不同物种(例如,小鼠、大鼠、兔、山羊、猴子等)的染色体在涵盖或接近所述物种的SMN1或SMN2的同源物的位置处互补。该单链寡核苷酸可以与涵盖或接近该SMN1或SMN2基因的人基因组区互补并且还可以与涵盖或接近小鼠的SMN1或SMN2的同源物的小鼠基因组区互补。例如,该单链寡核苷酸可以与如SEQ ID NO:1、2、4或5中给出的、为涵盖或接近该SMN1或SMN2基因的人基因组区的序列互补,并且还可以与如SEQ ID NO:7或8中给出的、为涵盖或接近小鼠的SMN1或SMN2基因的同源物的小鼠基因组区的序列互补。可以在多种物种(例如,人和小鼠)中体内或体外测试具有这些特征的寡核苷酸的功效。这种方法还有助于通过选择疾病存在的适当动物的物种来开发用于治疗人疾病的临床候选物。
在一些实施例中,该单链寡核苷酸的互补区与PRC2相关区的至少8至15、8至30、8至40、或10至50、或5至50、或5至40个碱基,例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续核苷酸互补。在一些实施例中,该互补区与PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补。在一些实施例中,该单链寡核苷酸的序列是基于结合至PRC2的一个RNA序列,或其一部分,所述部分具有从5至40个连续碱基对,或约8至40个碱基,或约5至15,或约5至30,或约5至40个碱基,或约5至50个碱基的长度。如本领域中所使用的术语互补是指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如,如果寡核苷酸的某一位置处的核苷酸能够与PRC2相关区的相同位置处的核苷酸氢键合,那么该单链核苷酸和PRC2相关区被认为彼此在那个位置处互补。该单链核苷酸和PRC2相关区在每个分子中足量的相应位置被可以通过它们的碱基彼此氢键合的核苷酸占据时彼此互补。因此,“互补”为以下这样的术语:用于指示足够程度的互补性或精确配对,以使得在该单链核苷酸与PRC2相关区之间发生稳定且特异性的结合。例如,如果单链核苷酸的位置处的碱基能够与PRC2相关区的相应位置处的碱基氢键合,那么这些碱基被认为彼此在那个位置处互补。100%互补性是不需要的。
该单链寡核苷酸可以与PRC2相关区的连续核苷酸至少80%(任选地,至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%中的一个)互补。在一些实施例中,与PRC2相关区的连续核苷酸的部分相比较,该单链寡核苷酸可以含有1、2或3个碱基错配。在一些实施例中,该单链寡核苷酸在15个碱基上可以具有至多3个错配,或在10个碱基上具有至多2个错配。
本领域中应理解,互补核苷酸序列不必与其可特异性杂交的靶标的核苷酸100%互补。在一些实施例中,出于本披露的目的,互补核酸序列在该序列与靶分子(例如,lncRNA)的结合干扰靶标(例如,lncRNA)的正常功能以致损失活性(例如,抑制PRC2相关阻抑作用,从而导致基因表达上调)时是可特异性杂交的,并且在以下条件下存在足够程度的互补性来避免该序列与非靶序列的非特异性结合:其中非特异性结合的避免是希望的,例如,在体内测定或治疗性治疗情况下以及体外测定情况下的生理条件下,在测定在适合的严格条件下进行时的条件下。
在一些实施例中,该单链寡核苷酸的长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。在优选的实施例中,该寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。
在一些实施例中,该PRC2相关区出现在与基因序列(有义)相同的DNA链上。在一些实施例中,该PRC2相关区出现在与基因序列(反义)相反的DNA链上。与PRC2相关区互补的寡核苷酸可以结合有义或反义序列。碱基配对可以包括标准的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对和非沃森-克里克碱基配对(例如,摇摆碱基配对(Wobble base pairing)和胡斯坦碱基配对(Hoogsteenbase pairing))两者。应理解,对于互补碱基配对,腺苷型碱基(A)与胸苷型碱基(T)或尿嘧啶型碱基(U)互补,胞嘧啶型碱基(C)与鸟苷型碱基(G)互补,并且通用碱基如3-硝基吡咯或5-硝基吲哚可以杂交至任何A、C、U或T并且被认为与它们互补。肌苷(I)在本领域中也被认为是通用碱基并且被认为与任何A、C、U或T互补。
在一些实施例中,在此提供的序列、包括序列表中提供的序列中的任何一个或多个胸苷(T)核苷酸(或其修饰的核苷酸)或尿苷(U)核苷酸(或其修饰的核苷酸)可以用适于与腺苷核苷酸碱基配对(例如,经由沃森-克里克碱基配对)的任何其他核苷酸来置换。在一些实施例中,在此提供的序列、包括序列表中提供的序列中的任何一个或多个胸苷(T)核苷酸(或其修饰的核苷酸)或尿苷(U)核苷酸(或其修饰的核苷酸)可以用不同的嘧啶核苷酸来适当地置换或反之亦然。在一些实施例中,在此提供的序列、包括序列表中提供的序列中的任何一个或多个胸苷(T)核苷酸(或其修饰的核苷酸)可以用尿苷(U)核苷酸(或其修饰的核苷酸)来适当地置换或反之亦然。在一些实施例中,该单链寡核苷酸的GC含量优选地在约30%至60%之间。三个或更多个G或C的连续延伸段在一些实施例中可能不是优选的。因此,在一些实施例中,该寡核苷酸不包括三个或更多个鸟苷核苷酸的伸展段。
在一些实施例中,该单链寡核苷酸特异性结合至在基因组(例如,人基因组)中编码作为单一的连续转录物(例如,非剪接RNA)的RNA或与其互补。在一些实施例中,该单链寡核苷酸特异性结合至在基因组(例如,人基因组)中编码的RNA或与其互补,其中基因组中在该RNA的编码区的5’端与该RNA的编码区的3’端之间的距离小于1kb,小于2kb,小于3kb,小于4kb,小于5kb,小于7kb,小于8kb,小于9kb,小于10kb或小于20kb。
应理解,可以排除在此提供的任何寡核苷酸。
在一些实施例中,在此披露的单链寡核苷酸可以将与基因对应的mRNA的表达提高至少约50%(即,正常值150%或1.5倍)或约2倍至约5倍。在一些实施例中,表达可以提高至少约15倍、20倍、30倍、40倍、50倍或100倍,或任何前述数字之间的任何范围。还发现,提高的mRNA表达已被示出与提高的蛋白表达相关。
在在此描述的寡核苷酸的一些或任何实施例或用于设计或合成它们的方法中,这些寡核苷酸将上调基因表达并且可以特异性结合至或特异性杂交至转录自与蛋白编码参考基因相同的链的PRC2结合RNA或与其互补。该寡核苷酸可以结合至PRC2结合RNA的区,该区起源于参考基因(refGene)的蛋白编码有义链的内含子、外显子、内含子外显子接点、5′UTR、3′UTR、翻译起始区或翻译终止区或与它们重叠。
在在此描述的寡核苷酸的一些或任何实施例或用于设计或合成它们的方法中,这些寡核苷酸将上调基因表达并且可以特异性结合至或特异性杂交至转录自蛋白编码参考基因的相反链(反义链)的PRC2结合RNA或与其互补。该寡核苷酸可以结合至PRC2结合RNA的区,该区起源于参考基因的蛋白编码反义链的内含子、外显子、内含子外显子接点、5′UTR、3′UTR、翻译起始区或翻译终止区或与它们重叠。
可以修饰在此描述的寡核苷酸,寡核苷酸例如包括修饰的糖部分、修饰的核苷间键、修饰的核苷酸和/或其组合。此外,这些寡核苷酸可以展现出以下特性中的一种或多种:不诱导靶RNA的实质性裂解或降解;不引起靶RNA的基本完全的裂解或降解;不激活RNA酶H路径;不激活RISC:不募集任何Argonaute家族蛋白;不被Dicer裂解;不介导替代的剪接;没有免疫刺激性;具有核酸酶抗性;与未修饰的寡核苷酸相比较,具有提高的细胞吸收;对细胞或哺乳动物无毒;可以具有改进的内体排出(endosomal exit);干扰lncRNA与PRC2、优选地Ezh2亚单位,但任选地Suz12、Eed、RbAp46/48亚单位或辅助因子如Jarid2的相互作用;减少组蛋白H3赖氨酸27甲基化和/或上调基因表达。
设计来与RNA相互作用以调节基因表达的寡核苷酸为与设计来结合DNA靶标(例如,与转录RNA的潜在的基因组DNA序列互补)的那些相异的一个碱基序列的子集。
剪接转换寡核苷酸
本发明的方面提供用于靶向SMN1或SMN2前体mRNA以影响剪接,从而使外显子跳过最小化的策略。因此,本发明的方面提供可用于治疗SMA的治疗化合物。在一些实施例中,提供了在此称为“剪接转换寡核苷酸”、调节SMN2剪接的寡核苷酸。在一些实施例中,提供了可用于提高全长SMN蛋白在细胞内的表达的方法和相关组合物、化合物以及试剂盒。这些方法通常包括向细胞递送与SMN2的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的第一单链寡核苷酸,以及与SMN2的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸,量足以提高SMN2的包含(或包括)外显子7的成熟mRNA在细胞内的表达。可以使用与SMN1或SMN2的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的任何单链寡核苷酸。应认识到,与剪接控制序列互补的单链寡核苷酸可以在此可替代地称为剪接转换寡核苷酸。
剪接转换寡核苷酸典型地包括与前体mRNA的剪接控制序列(例如,内含子剪接沉默序列)互补的序列,并且能够结合至并影响该前体mRNA的加工。剪接转换寡核苷酸可以与外显子的区、内含子的区或内含子/外显子接点互补。在一些实施例中,该剪接控制序列包括序列:CAGCAUUAUGAAAG(SEQID NO:13100)或其一部分。在一些实施例中,该剪接控制序列包括至少一个hnRNAP结合序列。在一些实施例中,由于靶向SMN1或SMN2的剪接转换寡核苷酸基于以下前提起作用:外显子7和8的3′剪接位点之间存在与外显子6的5′剪接位点之间存在竞争,因此损害外显子8的3′剪接位点的识别有利于含入外显子7。在一些实施例中,提供促进含入SMN2外显子7以及全长SMN蛋白表达的剪接转换寡核苷酸,其中这些寡核苷酸与内含子7/外显子8接点互补。在一些实施例中,剪接转换寡核苷酸由与SMN1或SMN2的外显子(例如,外显子7)互补的区段构成。在一些实施例中,剪接转换寡核苷酸包括由具有由富含丝氨酸/精氨酸(SR)的蛋白质识别的结合基序的RNA序列组成的尾(例如,非互补性尾)。在一些实施例中,剪接转换寡核苷酸与内含子剪接沉默子(ISS)(至少部分)互补。在一些实施例中,该ISS位于SMN1或SMN2的内含子6或内含子7内。在一些实施例中,剪接转换寡核苷酸包括与(例如,SMN1或SMN2的)靶外显子或内含子互补的反义部分以及与SR蛋白的剪接激活结构域类似的最小RS结构域肽。在一些实施例中,该剪接转换寡核苷酸的长度为7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50或更多个核苷酸。在一个实施例中,该寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。
接头
在此披露的任何寡核苷酸可以通过接头例如可裂解接头来连接至在此披露的一个或多个其他寡核苷酸。因此,在一些实施例中,提供化合物,其包含与基因的PRC2相关区互补的单链寡核苷酸,该单链寡核苷酸经由接头而连接至与该基因的前体mRNA的剪接控制序列互补的单链寡核苷酸。在一些实施例中,提供具有通式A-B-C的化合物,其中A为与基因的PRC2相关区互补的单链寡核苷酸,B为接头,并且C为与该基因的前体mRNA的剪接控制序列互补的单链寡核苷酸。在一些实施例中,接头B包括寡核苷酸、肽、低pH不稳定键或二硫键。在一些实施例中,这些化合物定向为5’-A-B-C-3’。在一些实施例中,该化合物定向为3’-A-B-C-5’。在一些实施例中,在B为寡核苷酸时,A的3’端连接至B的5’端,并且B的3’端连接至C的5’端。在一些实施例中,在B为寡核苷酸时,A的5’端连接至B的3’端,并且B的5’端连接至C的3’端。在一些实施例中,在B为寡核苷酸时,A的5’端连接至B的5’端,和/或B的3’端连接至C的3’端。在一些实施例中,在B为寡核苷酸时,A的3’端连接至B的3’端,和/或B的5’端连接至C的5’端。
术语“接头”通常是指能够共价连接两个或更多个寡核苷酸的化学部分。在一些实施例中,该接头内包括或含有的至少一个键能够被裂解(例如,在生物背景中,如在哺乳动物提取物如内体提取物中),这样使得至少两个寡核苷酸在键裂解之后不再共价连接至彼此。将认识到,在一些实施例中,所提供的接头可以包括不可裂解的区域,只要该接头也包括可裂解的至少一个键即可。
在一些实施例中,该接头包括在哺乳动物提取物中比寡核苷酸更易于通过内肽酶裂解的多肽。该内肽酶可以为胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胃蛋白酶或内肽酶V8。该内肽酶可以为组织蛋白酶B、组织蛋白酶D、组织蛋白酶L、组织蛋白酶C、木瓜蛋白酶、组织蛋白酶S或内体酸性胰岛素酶。例如,该接头包括具有选自以下的氨基酸序列的肽:ALAL、APISFFELG、FL、GFN、R/KXX、GRWHTVGLRWE、YL、GF以及FF,其中X为任何氨基酸。
在一些实施例中,该接头包括式-(CH2)nS-S(CH2)m-,其中n和m独立地为从0至10的整数。
在一些实施例中,该接头可以包括在哺乳动物提取物中比这些寡核苷酸更易于通过核酸内切酶裂解的寡核苷酸。该接头可以具有包括从1至10个胸苷或尿苷的核苷酸序列。该接头可以具有包括通过磷酸二酯核苷酸间键连接的脱氧核糖核苷酸的核苷酸序列。该接头可以具有包括通过磷酸二酯核苷酸间键连接的从1至10个胸苷或尿苷的核苷酸序列。该接头可以具有包括通过硫代磷酸酯核苷酸间键连接的从1至10个胸苷或尿苷的核苷酸序列。
在一些实施例中,至少一个接头在哺乳动物提取物存在下对酶促裂解的敏感性是至少两个寡核苷酸的2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍。应认识到,在包含两个或更多个接头的化合物中,不同的接头可以被设计来以不同的速率和/或通过不同的酶裂解。类似地,在包含两个或更多个接头的化合物中,不同的接头可以被设计来在不同组织、细胞或亚细胞区室中对裂解敏感。这可以有利地允许化合物具有以不同的速率、通过不同的酶、或在不同的组织、细胞或亚细胞区室中从化合物释放的寡核苷酸,从而控制将单体寡核苷酸释放至希望的体内位置或在给药之后希望的时间控制单体寡核苷酸的释放。
在某些实施例中,接头在较富含核酸外切酶的血浆、血液或血清中是稳定的(例如,比它们连接在一起的寡核苷酸更稳定),并且在相对富含核酸内切酶的细胞内环境中是不太稳定的。在一些实施例中,如果接头的半衰期在此处描述的条件下如在肝匀浆中为至少24、或28、32、36、48、72、96小时或更长,该接头被认为是“不可裂解的”。相反地,在一些实施例中,如果接头的半衰期为至多10、或8、6、5小时或更短,该接头被认为是“可裂解的”。
在一些实施例中,该接头为核酸酶可裂解的寡核苷酸接头。在一些实施例中,该核酸酶可裂解接头在寡核苷酸主链中含有一个或多个磷酸二酯键。例如,在RNA接头情况下,该接头可以含有单个磷酸二酯桥或2、3、4、5、6、7或更多个磷酸二酯键,例如作为具有1至10个脱氧核苷酸的串,例如dT,或具有1至10个核糖核苷酸的串,例如rU。在接头中有dT或其他DNA核苷酸dN情况下,在某些实施例中,该可裂解的接头含有一个或多个磷酸二酯键。在其他实施例中,在rU或其他RNA核苷酸rN情况下,该可裂解的接头可以仅由硫代磷酸酯键组成。与硫代磷酸酯连接的、在一些实施例中通过核酸酶相对缓慢地裂解的(因此称为“不可裂解的”)脱氧核苷酸相比,硫代磷酸酯连接的rU在一些实施例中通过核糖核酸酶经受相对快速的裂解,并且因此在此被认为是可裂解的。还可能通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键连接来将dN和rN组合到接头区域中。在其他实施例中,该接头还可以含有通过核酸酶仍可裂解的化学修饰的核苷酸,例如像2’-O-修饰的类似物。具体而言,2’-O-甲基或2’-氟核苷酸可以彼此组合或与dN或rN核苷酸组合。一般而言,在核苷酸接头情况下,该接头为通常不与靶标互补的化合物的一部分,但该化合物可以与靶标互补。这是因为该接头在寡核苷酸对该靶标起作用之前通常已被裂解,并且因此接头身份相对于靶标是无关紧要的。因此,在一些实施例中,接头为不与所设计寡核苷酸所针对的任何靶标互补的(寡)核苷酸接头。
在一些实施例中,该可裂解接头为含有具有有意引入的Rp硫代磷酸酯立体异构体的连续伸展段(例如,4、5、6、7或更长的伸展段)的寡核苷酸接头。不同于Sp同工型,已知Rp立体异构体对核酸酶裂解敏感(克里格(Krieg)等人,2003,寡核苷酸(Oligonucleotides),13:491-499)。这种接头不包括PS键联的寡核苷酸的外消旋混合物,因为混合键是相对稳定的并且不可能含有具有Rp立体异构体的长的伸展段,并且因此在此被认为是“不可裂解的”。因此,在一些实施例中,接头包括具有4、5、6、7个或更多个硫代磷酸化核苷酸的伸展段,其中伸展段不含有大量或任何Sp立体同工型(stereoisoform)。如果数量以每摩尔计超过10%,该数量可被认为是大量的。
在一些实施例中,该接头为非核苷酸接头,例如,单个磷酸二酯桥。这类可裂解接头的另一个实例为包括二硫键的化学基团,例如,-(CH2)nS-S(CH2)m-,其中n和m为从0至10的整数。在说明性实施例中,n=m=6。下文描述了非核苷酸接头的另外的实例。
该接头可以被设计来经受化学或酶促裂解反应。化学反应包括例如酸性环境中的裂解(例如,内体)、还原性裂解(例如,胞质裂解)或氧化性裂解(例如,在肝微粒体中)。该裂解反应还可以通过重排反应来引发。酶促反应可以包括由核酸酶、肽酶、蛋白酶、磷酸酶、氧化酶、还原酶等介导的反应。例如,接头可以是pH敏感的,组织蛋白酶敏感的,或主要在内体和/或胞质中裂解。
在一些实施例中,该接头为肽。在某些实施例中,该接头包括肽,该肽包括通过内肽酶可裂解的序列。除可裂解的肽序列之外,该接头可以包括另外的氨基酸残基和/或非肽化学部分如烷基链。在某些实施例中,该接头包括Ala-Leu-Ala-Leu,其为组织蛋白酶B的底物。参见例如施密德(Schmid)等人,生物缀合化学(Bioconjug Chem)2007,18,702-716中描述的马来酰亚氨基己酰基-Arg-Arg-Ala-Leu-Ala-Leu接头。在某些实施例中,组织蛋白酶B可裂解接头在肿瘤细胞中裂解。在某些实施例中,该接头包括Ala-Pro-Ile-Ser-Phe-Phe-Glu-Leu-Gly,其为组织蛋白酶D、L以及B的底物(参见,例如,费歇尔(Fischer)等人,生物化学杂志(Chembiochem)2006,7,1428-1434)。在某些实施例中,组织蛋白酶可裂解接头在HeLA细胞中裂解。在一些实施例中,该接头包括Phe-Lys,其为组织蛋白酶B的底物。例如,在某些实施例中,该接头包括Phe-Lys-p-氨基苯甲酸(PABA)。参见,例如沃克(Walker)等人,生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg.Med.Chem.Lett.)2002,12,217-219中描述的马来酰亚氨基己酰基-Phe-Lys-PABA接头。在某些实施例中,该接头包括Gly-Phe-2-萘基酰胺,其为组织蛋白酶C的底物(参见,例如,伯格(Berg)等人,生物化学杂志1994,300,229-235)。在某些实施例中,组织蛋白酶C可裂解接头在肝细胞中裂解。在一些实施例中,该接头包括组织蛋白酶S裂解位点。例如,在一些实施例中,该接头包括例如在吕茨纳(Lutzner)等人,生物化学杂志2008,283,36185-36194中描述的Gly-Arg-Trp-His-Thr-Val-Gly-Leu-Arg-Trp-Glu、Gly-Arg-Trp-Pro-Pro-Met-Gly-Leu-Pro-Trp-Glu或Gly-Arg-Trp-His-Pro-Met-Gly-Ala-Pro-Trp-Glu。在某些实施例中,组织蛋白酶S可裂解接头在抗原呈递细胞中裂解。在一些实施例中,该接头包括木瓜蛋白酶裂解位点。木瓜蛋白酶典型地裂解具有序列-R/K-X-X的肽(参见,查普曼(Chapman)等人,生理学年评(Annu.Rev.Physiol.)1997,59,63-88)。在某些实施例中,木瓜蛋白酶可裂解接头在内体中裂解。在一些实施例中,该接头包括内体酸性胰岛素酶裂解位点。例如,在一些实施例中,该接头包括Tyr-Leu、Gly-Phe或Phe-Phe(参见,例如,Authier等人,欧洲生物化学学会联盟简讯(FEBS Lett.)1996,389,55-60)。在某些实施例中,内体酸性胰岛素酶可裂解接头在肝细胞中裂解。
在一些实施例中,该接头是pH敏感的。在某些实施例中,该接头包括低pH不稳定键。如在此所使用,低pH不稳定键为在酸性条件(H<7)下选择性分解的键。这类键还可以称为内体不稳定键,因为细胞内体和溶酶体具有小于7的pH。例如,在某些实施例中,该接头包括胺、亚胺、酯、苯甲酸亚胺、氨基酯、二邻酯、聚磷酸酯、聚磷腈、缩醛、乙烯基醚、腙、叠氮基甲基-甲基马来酸酐、硫代丙酸酯、掩蔽的内体溶解剂或柠康酰基。
在某些实施例中,该接头包括选自以下的低pH不稳定键:在酸性环境(例如,pH小于7,大于约4)中不稳定、从而形成二醇和酮的缩酮类;在酸性环境(例如,pH小于7,大于约4)中不稳定、从而形成二醇和醛的缩醛类;在酸性环境(例如,pH小于7,大于约4)中不稳定、从而形成胺和醛或酮的亚胺类或亚胺鎓类(iminiums);在酸性条件下不稳定的硅-氧-碳键;硅-氮(硅氮烷)键;硅-碳键(例如,芳基硅烷、乙烯基硅烷以及烯丙基硅烷);马来酰胺酸(maleamate)(从马来酸酐衍生物和胺合成的酰胺键);原酸酯;腙;设计来经受酸催化的水解的活化羧酸衍生物(例如酯、酰胺);或乙烯基醚。另外的实例可见国际专利申请公开号WO 2008/022309,名称为用于体内递送多核苷酸的多聚缀合物(POLYCONJUGATES FOR IN VIVO DELIVERY OFPOLYNUCLEOTIDES),该专利申请的内容通过引用结合在此。。
在一些实施例中,该接头包括掩蔽的内体溶解剂(endosomolytic agent)。内体溶解聚合物为以下这样的聚合物:响应于pH的变化,能够引起内体的破裂或溶解,或使正常不渗透膜的化合物如多核苷酸或蛋白质从细胞内膜包被的囊泡如内体或溶酶体逃离。内体溶解化合物的子集为融合化合物,包括融合肽。融合肽可以促进试剂如低聚化合物内体释放至胞质。参见,例如,美国专利申请公开号20040198687、20080281041、20080152661以及20090023890,它们通过引用结合在此。
该接头还可以被设计来经受器官/组织特异性裂解。例如,对于在多个组织中表达的某些靶标,仅肝中的敲低可能是希望的,因为其他器官中的敲低可能导致不希望的副作用。因此,对肝特异性酶如吡咯酶(TPO)和葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P酶)敏感的接头可以被工程化,以便于将反义作用主要限制至肝。可替代地,对肝酶不敏感、但对肾特异性酶如γ-谷氨酰转肽酶敏感的接头可以被工程化,这样使得将反义作用主要限制至肾。类似地,可以考虑裂解Phe-Ala和Leu-Ala的肠道特异性肽酶用于口服给予的多聚寡核苷酸。类似地,通过将酶识别位点放入由肿瘤中过度表达的酶如纤溶酶(例如,PHEA-D-Val-Leu-Lys识别位点)识别的接头中,肿瘤特异性敲低应是可行的。通过选择接头中的正确的酶识别位点,特异性裂解和敲低在许多器官中应是可实现的。此外,该接头还可以含有靶向信号,如针对肝靶向的N-乙酰半乳糖胺,或肿瘤或活化巨噬细胞靶向情况下的叶酸、维生素A或RGD-肽。因此,在一些实施例中,该可裂解接头为器官或组织特异性的,例如,肝特异性、肾特异性、肠道特异性等。
寡核苷酸可以通过单个寡核苷酸的任何部分例如经由磷酸酯、糖(例如,核糖、脱氧核糖)或核碱基来连接。在某些实施例中,在将两个寡核苷酸连接在一起时,该接头可以附接至例如第一寡核苷酸的5’端和第二核苷酸的3’端,第一寡核苷酸的5’端和第二核苷酸的5’端,第一寡核苷酸的3’端和第二核苷酸的3’端。在其他实施例中,在将两个寡核苷酸连接在一起时,该接头可以例如经由修饰的核碱基来附接每个寡核苷酸的内部残基。本领域普通技术人员将理解,许多这类排列对于多聚物而言是可行的。国际专利申请号PCT/US2012/05535,名称为多聚寡核苷酸化合物(MULTIMERIC OLIGONUCLEOTIDECOMPOUNDS)中披露了适当的接头的另外的实例以及用于产生具有这类接头的化合物的方法,该专利申请中与接头和相关化学性质有关的内容通过引用以其全部内容结合在此。
用于选择用于激活SMN1或SMN2的表达的候选寡核苷酸的方法
在此提供了用于选择用于激活或增强SMN1或SMN2的表达的候选寡核苷酸的方法。目标选择方法通常可以包括用于选择具有在此披露的任何结构和功能特征的单链寡核苷酸的步骤。典型地,这些方法包括旨在鉴别寡核苷酸的一个或多个步骤,这些寡核苷酸靶向与SMN1或SMN2功能相关的PRC2相关区,例如,lncRNA的PRC2相关区,该lncRNA通过促进(例如,以顺式调控方式)将PRC2募集至SMN1或SMN2基因来调控SMN1或SMN2的表达。这类寡核苷酸有望成为用于激活SMN1或SMN2的表达的候选物,因为它们具有与核酸(例如,lncRNA)的PRC2相关区杂交的能力。在一些实施例中,这种杂交事件被理解成是破坏PRC2与该核酸(例如,lncRNA)的相互作用,并且因此破坏了PRC2以及其相关共阻抑物(例如,染色质重建因子)至SMN1或SMN2基因座的募集。
选择候选寡核苷酸的方法可以包括选择定位至涵盖或接近SMN1或SMN2基因的染色***置(例如,具有如SEQ ID NO:1至8中任一个中给出的序列的染色***置)的PRC2相关区(例如,如SEQ ID NO:9至29中任一个中给出的核苷酸序列)。该PRC2相关区可以定位至染色体的包括SMN1或SMN2基因的有义链的链,在这种情况下,候选寡核苷酸与SMN1或SMN2基因的有义链互补(即,对于该SMN1或SMN2基因反义)。可替代地,该PRC2相关区可以定位至第一染色体的包括该SMN1或SMN2基因的反义链的链,在这种情况下,寡核苷酸与该SMN1或SMN2基因的反义链(模板链)互补(即,对于该SMN1或SMN2基因有义)。
用于选择富集了激活SMN1或SMN2的表达的寡核苷酸的一组候选寡核苷酸的方法可以包括选择定位至涵盖或接近该SMN1或SMN2基因的染色***置的一个或多个PRC2相关区,并且选择一组寡核苷酸,其中该组中的每个寡核苷酸包括与该一个或多个PRC2相关区互补的一个核苷酸序列。如在此所使用,短语“富集了激活...的表达的寡核苷酸的一组寡核苷酸”是指与具有与富集组相同的物理化学特性(例如,相同的GC含量、Tm、长度等)的随机选择的寡核苷酸相比较,激活靶基因(例如,SMN1或SMN2)的表达的寡核苷酸的数量更大的一组寡核苷酸。
在单链寡核苷酸的设计和/或合成包括与通过这类序列信息描述的核酸或PRC2相关区互补的序列的设计和/或合成时,技术人员能够容易地例如通过对形成本领域中公知的常识的一部分的沃森-克里克碱基配对规则的理解来确定互补序列。
在一些实施例中,单链寡核苷酸的设计和/或合成包括通过本领域技术人员已知的技术来从起始材料制备寡核苷酸,其中该合成可以是基于PRC2相关区的序列或其一部分。
单链寡核苷酸的设计和/或合成的方法包括以下一个或多个步骤:
鉴别和/或选择PRC2相关区;
设计具有希望程度的与PRC2相关区或其一部分的序列一致性或互补性的核酸序列;
将单链寡核苷酸合成为所希望的序列;
纯化该合成的单链寡核苷酸;并且
任选地将该合成的单链寡核苷酸与至少一种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂混合以形成药物组合物或药剂。
如此设计和/合成的单链寡核苷酸可以在如在此所描述调节基因表达的方法中使用。
优选地,本发明的单链寡核苷酸为化学合成的。用于实践本发明的寡核苷酸可以通过众所周知的化学合成技术来体内合成。
本发明的寡核苷酸可以如通过结合修饰例如核苷酸修饰来稳定化而免于溶核降解。例如,本发明的核酸序列包括核苷酸序列的5′或3′端处的硫代磷酸酯的至少第一、第二或第三核苷酸间键。作为另一个实例,该核酸序列可以包括2′-修饰的核苷酸,例如,2′-脱氧、2′-脱氧-2′-氟、2′-O-甲基、2′-O-甲氧基乙基(2′-O-MOE)、2′-O-氨基丙基(2′-O-AP)、2′-O-二甲基氨基乙基(2′-O-DMAOE)、2′-O-二甲基氨基丙基(2′-O-DMAP)、2′-O-二甲基氨基乙基氧基乙基(2′-O-DMAEOE)或2′-O--N-甲基乙酰胺基(2′-O-NMA)。作为另一个实例,该核酸序列可以包括至少一个2′-O-甲基-修饰的核苷酸,并且在一些实施例中,所有核苷酸包括2′-O-甲基修饰。在一些实施例中,核酸为“锁定的”,即,包括其中核糖环通过连接2’-O原子和4’-C原子的亚甲基桥“锁定”的核酸类似物。
应理解,在此描述的单链寡核苷酸的任何修饰的化学性质或形式可以彼此组合,并且一个、两个、三个、四个、五个或更多个不同类型的修饰可以被包括在同一分子中。
在一些实施例中,该方法可以进一步包括以下步骤:扩增该合成的单链寡核苷酸,和/或纯化单链寡核苷酸(或扩增的单链寡核苷酸)和/或对如此获得的单链寡核苷酸测序。
因此,制备一种单链寡核苷酸的方法可以为用于制备治疗疾病中使用的药物组合物或药剂的一种方法,任选地,其中该治疗包括调节与PRC2相关区相关联的基因的表达。
在上文所述方法中,PRC2相关区可以是或已通过包括鉴别结合至PRC2的RNA的方法来鉴别或获得。
这类方法可以包括以下步骤:提供含有核糖核酸的样品,将该样品与特异性结合至PRC2或其亚单位的试剂接触,允许在该试剂与该样品中的蛋白之间形成复合物,分配这些复合物,合成与这些复合物中存在的核酸互补的核酸。
在该单链寡核苷酸是基于PRC2相关区或这种序列的一部分时,该单链寡核苷酸可能是基于与那个序列有关的信息,例如,书面形式或电子形式可获得的序列信息,这些信息可以包括公开可获得的科学出版物或序列数据库中含有的序列信息。
核苷酸类似物
在一些实施例中,该寡核苷酸可以包括至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸和/或至少一个桥连核苷酸。在一些实施例中,该寡核苷酸可以包括桥连核苷酸如锁定核酸(LNA)核苷酸、约束的乙基(cEt)核苷酸或亚乙基桥连核酸(ENA)核苷酸。这类核酸的实例在此披露并且在本领域中是已知的。在一些实施例中,该寡核苷酸包括以下美国专利或专利申请公开中的一个中披露的核苷酸类似物:US 7,399,845、US 7,741,457、US 8,022,193、US7,569,686、US 7,335,765、US 7,314,923、US 7,335,765以及US 7,816,333、US20110009471,每个专利申请的全部内容出于所有目的通过引用结合在此。该寡核苷酸可以具有一个或多个2’O-甲基核苷酸。该寡核苷酸可以完全由2’O-甲基核苷酸组成。
该单链寡核苷酸经常具有一个或多个核苷酸类似物。例如,与不具有至少一个核苷酸类似物的寡核苷酸相比较,该单链寡核苷酸可以具有导致该寡核苷酸的Tm在1℃、2℃、3℃、4℃或5℃范围内的升高的至少一种核苷酸类似物。与不具有核苷酸类似物的寡核苷酸相比较,该单链寡核苷酸可以具有导致该寡核苷酸的Tm在2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃或更大的范围内的总升高的多种核苷酸类似物。
该寡核苷酸可以具有的长度为多达50个核苷酸,其中该寡核苷酸的2至10、2至15、2至16、2至17、2至18、2至19、2至20、2至25、2至30、2至40、2至45个或更多个核苷酸为核苷酸类似物。该寡核苷酸可以具有的长度为8至30个核苷酸,其中该寡核苷酸的2至10、2至15、2至16、2至17、2至18、2至19、2至20、2至25、2至30个核苷酸为核苷酸类似物。
该寡核苷酸可以具有的长度为8至15个核苷酸,其中该寡核苷酸的2至4、2至5、2至6、2至7、2至8、2至9、2至10、2至11、2至12、2至13、2至14个核苷酸为核苷酸类似物。任选地,这些寡核苷酸可以具有每个核苷酸,除了1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰的核苷酸。
该寡核苷酸可以完全由桥连核苷酸(例如,LNA核苷酸、cEt核苷酸、ENA核苷酸)组成。该寡核苷酸可以包括交替的脱氧核糖核苷酸与2’-氟-脱氧核糖核苷酸。该寡核苷酸可以包括交替的脱氧核糖核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。该寡核苷酸可以包括交替的脱氧核糖核苷酸与ENA核苷酸类似物。该寡核苷酸可以包括交替的脱氧核糖核苷酸与LNA核苷酸。该寡核苷酸可以包括交替的LNA核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。该寡核苷酸可以具有为桥连核苷酸(例如,LNA核苷酸,cEt核苷酸,ENA核苷酸)的5’核苷酸。该寡核苷酸可以具有为脱氧核糖核苷酸的5’核苷酸。
该寡核苷酸可以包括通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的至少一个桥连核苷酸(例如,LNA核苷酸、cEt核苷酸、ENA核苷酸)侧接的脱氧核糖核苷酸。该寡核苷酸可以包括通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的1、2、3、4、5、6、7、8或更多个桥连核苷酸(例如,LNA核苷酸、cEt核苷酸、ENA核苷酸)侧接的脱氧核糖核苷酸。该寡核苷酸的3’位置可以具有3’羟基。该寡核苷酸的3’位置可以具有3’硫代磷酸酯。
该寡核苷酸可以用标签缀合。例如,该寡核苷酸可以用生物素部分、胆固醇、维生素A、叶酸、σ受体配体、适体、肽如CPP、疏水性分子如脂质、ASGPR或动态多聚缀合物以及其变体在5’或3’端处缀合。
优选地,该单链寡核苷酸包括一个或多个修饰,包括:修饰的糖部分、和/或修饰的核苷间键、和/或修饰的核苷酸和/或其组合。给定寡核苷酸的所有位置不必是均匀修饰的,并且事实上在此描述的一个以上修饰可以结合在单个寡核苷酸中或甚至是寡核苷酸的单个核苷内。
在一些实施例中,这些单链寡核苷酸为含有各自由至少一个核苷酸构成的两个或更多个化学相异区域的嵌合寡核苷酸。这些寡核苷酸典型地含有具有修饰的核苷酸的至少一个区域,这些修饰的核苷酸赋予一个或多个有益特性(例如像,提高的核酸酶抗性、提高的细胞吸收、对靶标的提高的结合亲和力);以及为能够裂解RNA:DNA或RNA:RNA杂合体的酶的底物的区域。本发明的嵌合的单链寡核苷酸可以形成为具有两个或更多个寡核苷酸、修饰的寡核苷酸、寡核苷和/或如上所述的寡核苷酸模拟物的复合结构。这类化合物在本领域中还被称为杂合体或缺口体(gapmer)。传授这类杂合结构的制备的代表性美国专利包括但不限于US专利号5,013,830;5,149,797;5,220,007;5,256,775;5,366,878;5,403,711;5,491,133;5,565,350;5,623,065;5,652,355;5,652,356以及5,700,922,每个专利通过引用结合在此。
在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括在糖的2′位置处修饰的至少一个核苷酸,最优选地为2′-O-烷基、2′-O-烷基-O-烷基或2′-氟修饰的核苷酸。在其他优选的实施例中,RNA修饰包括嘧啶的核糖、RNA的3′端处的无碱基残基或倒置碱基上的2′-氟、2′-氨基以及2′O-甲基修饰。这类修饰按照常规结合到寡核苷酸中并且这些寡核苷酸已显示针对给定靶标具有比2′-脱氧寡核苷酸更高的Tm(即,更高的靶标结合亲和力)。
多个核苷酸和核苷修饰已显示使得结合它们的寡核苷酸对核酸酶消化比天然寡聚脱氧核苷酸具有更大的抗性;这些修饰的寡核苷酸比未修饰的寡核苷酸完整存留更长的时间。修饰的寡核苷酸的具体的实例包括以下那些,它们包括修饰的主链,例如,硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间键或短链杂原子或杂环糖间键。最优选的是具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的那些,尤其是CH2-NH-O-CH2、CH、~N(CH3)~O~CH2(已知为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链,CH2--O--N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2以及O-N(CH3)-CH2-CH2主链,其中天然的磷酸二酯主链表示为O-P--O-CH);酰胺主链(参见De Mesmaeker等人,化学研究述评(Ace.Chem.Res.)1995,28:366-374);吗啉代主链结构(参见萨默顿(Summerton)和韦勒(Weller),美国专利号5,034,506);肽核酸(PNA)主链(其中寡核苷酸的磷酸二酯主链由聚酰胺主链置换,核苷酸直接或间接地结合至该聚酰胺主链的氮杂氮原子,参见尼尔森(Nielsen)等人,科学(Science)1991,254,1497)。含磷的键包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基以及其他烷基膦酸酯(包括3′-亚烷基膦酸酯以及手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯以及氨基烷基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯,以及具有正常3′-5′键的硼烷磷酸酯、这些硼烷磷酸酯的2′-5′连接类似物,以及其中相邻对的核苷单位以3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′来连接的、具有反向极性的那些,参见美国专利号3,687,808;4,469,863;4,476,301;5,023,243;5,177,196;5,188,897;5,264,423;5,276,019;5,278,302;5,286,717;5,321,131;5,399,676;5,405,939;5,453,496;5,455,233;5,466,677;5,476,925;5,519,126;5,536,821;5,541,306;5,550,111;5,563,253;5,571,799;5,587,361以及5,625,050。
基于吗啉代的低聚化合物在达万·A·布万其(Dwaine A.Braasch)和大卫·R·科里(David R.Corey),生物化学(Biochemistry),2002,41(14),4503-4510);发生学(Genesis),第30卷,第3期,2001;希斯曼(Heasman),发育生物学期刊(J.,Dev.Biol.),2002,243,209-214;纳维斯(Nasevicius)等人,自然-遗传学(Nat.Genet.),2000,26,216-220;拉切拉(Lacerra)等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.),2000,97,9591-9596;以及1991年7月23日颁予的美国专利号5,034,506中进行描述。在一些实施例中,基于吗啉代的低聚化合物为二氨基磷酸酯吗啉代寡聚物(PMO)(例如,如在艾弗森(Iverson),分子治疗学新见(Curr.Opin.Mol.Ther.),3:235-238,2001以及王(Wang)等人,基因医学杂志(J.Gene Med.),12:354-364,2010中进行描述;这些参考文献的披露内容通过引用以其全部内容结合在此)。
王等人,美国化学学会期刊(J.Am.Chem.Soc.),2000,122,8595-8602中描述了环己烯基核酸寡核苷酸模拟物。
其中不包括磷原子的修饰的寡核苷酸主链具有通过短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子以及烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些主链包括具有吗啉代键(部分地由核苷的糖部分形成)的那些主链;硅氧烷主链;硫化物、亚砜以及砜主链;甲酰乙酰基以及硫代甲酰乙酰基主链;亚甲基甲酰乙酰基以及硫代甲酰乙酰基主链;含有烯烃的主链;氨基磺酸酯主链;亚甲基亚氨基以及亚甲基肼基主链;磺酸酯以及磺酰胺主链;酰胺主链;以及具有混合N、O、S以及CH2组成部分的其他主链,参见美国专利号5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,214,134;5,216,141;5,235,033;5,264,562;5,264,564;5,405,938;5,434,257;5,466,677;5,470,967;5,489,677;5,541,307;5,561,225;5,596,086;5,602,240;5,610,289;5,602,240;5,608,046;5,610,289;5,618,704;5,623,070;5,663,312;5,633,360;5,677,437;以及5,677,439,每个专利通过引用结合在此。
还已知包括基于阿糖核苷酸(arabinonucleotide)或修饰的阿糖核苷酸残基或由它们构建的寡核苷酸的修饰的寡核苷酸。阿糖核苷为核糖核苷的立体异构体,不同之处仅在于糖环的2′位置处的构型。在一些实施例中,2′-阿糖修饰为2′-F阿糖。在一些实施例中,修饰的寡核苷酸为2’-氟-D-阿糖核酸(FANA)(如例如在洛恩(Lon)等人,生物化学,41:3457-3467,2002和Min等人,生物有机化学与医药化学通讯,12:2651-2654,2002中所描述;这些参考文献的披露内容通过引用以其全部内容结合在此)。类似的修饰还可以在糖的其他位置处、尤其是3′末端核苷上糖的3′位置或在2′-5′连接的寡核苷酸以及5′末端核苷酸的5′位置上进行。
PCT公开号WO 99/67378披露了经由缔合至互补信使RNA而用于基因表达的提高的序列特异性抑制的阿糖核酸(ANA)低聚物以及其类似物。
其他优选的修饰包括亚乙基桥连的核酸(ENA)(例如,国际专利公开号WO 2005/042777,森田(Morita)等人,核酸研究(Nucleic Acid Res.),增刊1:241-242,2001;苏罗诺(Surono)等人,人类基因治疗(Hum.Gene Ther.),15:749-757,2004;小泉(Koizumi),分子治疗学新见,8:144-149,2006以及堀江(Horie)等人,核酸研讨会丛刊(Nucleic Acids Symp.Ser)(Oxf),49:171-172,2005;这些参考文献的披露内容通过引用以其全部内容结合在此)。优选的ENA包括但不限于2′-O,4′-C-亚乙基-桥连的核酸。
LNA的实例在WO/2008/043753中进行描述并且包括具有以下通式的化合物。
其中X和Y独立地选自基团-O-、
-S-、-N(H)-、N(R)-、-CH2-或-CH-(如果是双键的一部分),
-CH2-O-、-CH2-S-、-CH2-N(H)-、-CH2-N(R)-、-CH2-CH2-或-CH2-CH-(如果是双键的一部分),
-CH=CH-,其中R选自氢和C1-4-烷基;Z和Z*独立地选自核苷间键、末端基团或保护基团;B构成天然或非天然的核苷酸碱基部分;并且在任一取向上都可以找到不对称的基团。
优选地,在此描述的寡核苷酸中所使用的LNA包括至少一个根据以下任一式的LNA单位
其中Y为-O-、-S-、-NH-或N(RH);Z和Z*独立地选自核苷间键、末端基团或保护基团;B构成天然或非天然的核苷酸碱基部分,并且RH选自氢和C1-4-烷基。
在一些实施例中,在此描述的寡核苷酸中所使用的锁定核酸(LNA)根据PCT/DK 2006/000512的方案2中所示的任一式包括至少一个锁定核酸(LNA)单位。
在一些实施例中,本发明的低聚物中所使用的LNA包括选自-O-P(O)2-O-、-O-P(O,S)-O-、-O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O,S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、-O-P(O,S)-S-、-S-P(O)2-S-、-O-PO(RH)-O-、O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(NRH)-O-、-O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRH)-O-、-O-P(O)2-NRH-、-NRH-P(O)2-O-、-NRH-CO-O-的核苷间键,其中RH选自氢和C1-4-烷基。
方案2中示出了特别优选的LNA单位:
方案2
术语“硫代-LNA”包括锁定核苷酸,其中以上通式中X或Y中的至少一个选自S或-CH2-S-。硫代-LNA可以为β-D和α-L-构型两者。
术语“氨基-LNA”包括锁定核苷酸,其中以上通式中X或Y中的至少一个选自-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-以及-CH2-N(R)-,其中R选自氢和C1-4-烷基。氨基-LNA可以为β-D和α-L-构型两者。
术语“氧基-LNA”包括锁定核苷酸,其中以上通式中X或Y中的至少一个表示-O-或-CH2-O-。氧基-LNA可以为β-D和α-L-构型两者。
术语“ena-LNA”包括锁定核苷酸,其中以上通式中的Y为-CH2-O-(其中-CH2-O-的氧原子相对于碱基B附接至2′-位置上)。
在此描述了LNA的另外的细节。
还可以包括一个或多个取代的糖部分,例如,在2′位置上的以下各项中的一个:OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3OCH3、OCH3O(CH2)nCH3、O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3,其中n为从1至约10;C1至C10低级烷基、烷氧基烷氧基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基;Cl;Br;CN;CF3;OCF3;O-、S-或N-烷基;O-、S-或N-烯基;SOCH3;SO2CH3;ONO2;NO2;N3;NH2;杂环烷基;杂环烷芳基;氨基烷基氨基;多烷基氨基;取代的甲硅烷基;RNA裂解基团;报告子基团;***子;用于提高寡核苷酸的药物代谢动力学特性的基团;或用于提高寡核苷酸的药效学特性的基团以及具有类似特性的其他取代基。优选的修饰包括2′-甲氧基乙氧基[2′-O-CH2CH2OCH3,又称为2′-O-(2-甲氧基乙基)](马丁(Martin)等人,瑞士化学学报(HeIv.Chim.Acta),1995,78,486)。其他优选的修饰包括2′-甲氧基(2′-O-CH3)、2′-丙氧基(2′-OCH2CH2CH3)以及2′-氟(2′-F)。类似的修饰还可以在该寡核苷酸的其他位置处、尤其是3′末端核苷酸上糖的3′位置以及5′末端核苷酸的5′位置上进行。寡核苷酸还可以具有糖模拟物如环丁基来代替戊呋喃糖基。
单链寡核苷酸还可以另外或可替代地包括核碱基(本领域中经常简单地称为“碱基”)修饰或取代。如在此所使用,“未修饰的”或“天然的”核碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括在天然核酸中仅偶尔或短暂地发现的核碱基,例如,次黄嘌呤,6-甲基腺嘌呤,5-Me嘧啶,尤其是5-甲基胞嘧啶(又称为5-甲基-2′脱氧胞嘧啶并且在本领域中经常称为5-Me-C)、5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC以及龙胆二糖基(gentobiosyl)HMC、异胞嘧啶、假异胞嘧啶以及合成核碱基,例如,2-氨基腺嘌呤、2-(甲基氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其他杂取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氯-6-氨基嘌呤以及2,6-二氨基嘌呤或其他二氨基嘌呤。参见,例如,科恩伯格(Kornberg),“DNA复制(DNA Replication)”,W.H.弗里曼出版社(W.H.Freeman&Co.),旧金山(San Francisco),1980,第75至77页;以及格贝耶胡·冈加(Gebeyehu,G.)等人,核酸研究,15:4513(1987))。还可以包括本领域中已知的“通用”碱基例如肌苷。已显示5-Me-C取代可将核酸双链体稳定性提高0.6℃至1.2℃。(赛格维(Sanghvi)在克鲁克(Crooke)和勒布勒(Lebleu)编著的反义研究与应用(Antisense Research and Applications),CRC出版社(CRC Press),博卡拉顿(Boca Raton),1993,第276至278页)并且可以用作碱基取代。
给定寡核苷酸的所有位置不必是均匀修饰的,并且事实上在此描述的一个以上修饰可以结合在单个寡核苷酸中或甚至是寡核苷酸的单个核苷内。
在一些实施例中,核苷酸单位的糖和核苷间键(即,主链)都被新基团置换。保持碱基单位以便与适当的核酸靶化合物杂交。已显示具有优异的杂交特性的一种寡核苷酸模拟物的这样一种低聚化合物称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中,寡核苷酸的糖主链被含酰胺的主链例如氨基乙基甘氨酸主链置换。核碱基被保持并且直接或间接地结合至主链的酰胺部分的氮杂氮原子。传授PNA化合物的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082;5,714,331以及5,719,262,每个专利通过引用结合在此。PNA化合物的另外的传授可以见尼尔森等人,科学,1991,254,1497-1500。
单链寡核苷酸还可以包括一个或多个核碱基(本领域中经常简单地称为“碱基”)修饰或取代。如在此所使用,“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G),以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)以及尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成以及天然的核碱基,如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶以及2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶以及胞嘧啶,6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶以及胸腺嘧啶,5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶,8-卤基、8-氨基、8-氢硫基、8-硫烷基、8-羟基以及其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤,5-卤基尤其5-溴、5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤、以及3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱杂氮腺嘌呤。
另外,核碱基包括在美国专利号3,687,808中披露的那些核碱基、在“聚合物科学与工程简明百科全书(The Concise Encyclopedia Of Polymer Science andEngineering)”,第858至859页,克洛舍维奇(Kroschwitz)编著,约翰威利出版公司(John Wiley&Sons),1990年中披露的那些核碱基、在英利奇(Englisch)等人,应用化学(Angewandte Chemie),国际版,1991,30,第613页中披露的那些核碱基、以及在赛格维,第15章,反义研究与应用,第289至302页,克鲁克和勒布勒编著,CRC出版社,1993中披露的那些核碱基。这些核碱基中的某一些尤其适用于增加本发明的低聚化合物的结合亲和力。这些核碱基包括5-取代嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6以及O-6取代的嘌呤,包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代可将核酸双链体稳定性提高0.6℃至1.2℃(赛格维等人编著,“反义研究与应用”,CRC出版社,博卡拉顿,1993,第276至278页)并且是目前优选的碱基取代,在与2′-O-甲氧基乙基糖修饰相结合时甚至更特别如此。修饰的核碱基在美国专利号3,687,808以及4,845,205;5,130,302;5,134,066;5,175,273;5,367,066;5,432,272;5,457,187;5,459,255;5,484,908;5,502,177;5,525,711;5,552,540;5,587,469;5,596,091;5,614,617;5,750,692以及5,681,941中进行描述,每个专利通过引用结合在此。
在一些实施例中,单链寡核苷酸化学连接至增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞吸收的一种或多种部分或缀合物。例如,类型相同或不同的一种或多种单链寡核苷酸可以彼此缀合;或单链寡核苷酸可以缀合至对细胞类型或组织类型具有增强的特异性的靶向部分。这类部分包括但不限于脂质部分如胆固醇部分(勒辛格(Letsinger)等人,美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),1989,86,6553-6556);胆酸(马诺哈兰(Manoharan)等人,生物有机化学与医药化学通讯,1994,4,1053-1060);硫醚,例如,己基-S-三苯甲基硫醇(马诺哈兰等人,纽约科学院年报(Ann.N.Y.Acad.Sci.),1992,660,306-309;马诺哈兰等人,生物有机化学与医药化学通讯,1993,3,2765-2770);硫代胆固醇(奥伯豪泽尔(Oberhauser)等人,核酸研究,1992,20,533-538);脂族链,例如,十二烷二醇或十一烷基残基(卡巴诺夫(Kabanov)等人,欧洲生物化学学会联盟简讯,1990,259,327-330;斯伍那区克(Svinarchuk)等人,法国生物化学杂志(Biochimie),1993,75,49-54);磷脂,例如,二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-邻-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酯(马诺哈兰等人,四面体快报(Tetrahedron Lett.),1995,36,3651-3654;谢伊(Shea)等人,核酸研究,1990,18,3777-3783);聚胺或聚乙二醇链(马诺哈兰等人,核苷与核苷酸(Nucleosides&Nucleotides),1995,14,969-973)或金刚烷乙酸(马诺哈兰等人,四面体快报,1995,36,3651-3654);棕榈基部分(米谢拉(Mishra)等人,生物化学与生物物理学学报,1995,1264,229-237)或十八烷基胺或己基氨基-羰基-t羟胆固醇部分(克鲁克等人,药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.),1996,277,923-937)。还参见美国专利号4,828,979;4,948,882;5,218,105;5,525,465;5,541,313;5,545,730;5,552,538;5,578,717;5,580,731;5,580,731;5,591,584;5,109,124;5,118,802;5,138,045;5,414,077;5,486,603;5,512,439;5,578,718;5,608,046;4,587,044;4,605,735;4,667,025;4,762,779;4,789,737;4,824,941;4,835,263;4,876,335;4,904,582;4,958,013;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,245,022;5,254,469;5,258,506;5,262,536;5,272,250;5,292,873;5,317,098;5,371,241;5,391,723;5,416,203;5,451,463;5,510,475;5,512,667;5,514,785;5,565,552;5,567,810;5,574,142;5,585,481;5,587,371;5,595,726;5,597,696;5,599,923;5,599,928以及5,688,941,每个专利通过引用结合在此。
这些部分或缀合物可以包括共价结合至官能团如伯或仲羟基的缀合基团。本发明的缀合基团包括***子、报告子分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强低聚物的药效学特性的基团以及增强低聚物的药物代谢动力学特性的基团。典型的缀合基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素以及染料。在本发明的背景中增强药效学特性的基团包括提高吸收、增强对降解的抗性和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本发明的背景中增强药物代谢动力学特性的基团包括提高对本发明的化合物的吸收、分布、代谢或分泌的基团。代表性缀合基团在1992年10月23日提交的国际专利申请号PCT/US 92/09196以及美国专利号6,287,860中披露,这些专利通过引用结合在此。缀合部分包括但不限于脂质部分(如胆固醇部分)、胆酸、硫醚(例如,己基-5-三苯甲基硫醇)、硫代胆固醇、脂族链(例如,十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如,二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-邻-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯)、聚胺或聚乙二醇链,或金刚烷乙酸、棕榈基部分,或十八烷基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分。参见,例如,美国专利号4,828,979;4,948,882;5,218,105;5,525,465;5,541,313;5,545,730;5,552,538;5,578,717;5,580,731;5,580,731;5,591,584;5,109,124;5,118,802;5,138,045;5,414,077;5,486,603;5,512,439;5,578,718;5,608,046;4,587,044;4,605,735;4,667,025;4,762,779;4,789,737;4,824,941;4,835,263;4,876,335;4,904,582;4,958,013;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,082,830;5,112,963;5,214,136;5,245,022;5,254,469;5,258,506;5,262,536;5,272,250;5,292,873;5,317,098;5,371,241;5,391,723;5,416,203;5,451,463;5,510,475;5,512,667;5,514,785;5,565,552;5,567,810;5,574,142;5,585,481;5,587,371;5,595,726;5,597,696;5,599,923;5,599,928以及5,688,941。
在一些实施例中,单链寡核苷酸修饰包括该寡核苷酸的5’或3’端的修饰。在一些实施例中,该寡核苷酸的3’端包括羟基或硫代磷酸酯。应认识到,另外的分子(例如,生物素部分或荧光体)可以缀合至该单链寡核苷酸的5’或3’端。在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括缀合至5’核苷酸的生物素部分。
在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括锁定核酸(LNA)、ENA修饰的核苷酸、2’-O-甲基核苷酸或2’-氟-脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸与2’-氟-脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸与ENA修饰的核苷酸。在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸与锁定核酸核苷酸。在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括交替的锁定核酸核苷酸与2’-O-甲基核苷酸。
在一些实施例中,该寡核苷酸的5’核苷酸为脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中,该寡核苷酸的5’核苷酸为锁定核酸核苷酸。在一些实施例中,该寡核苷酸的核苷酸包括通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的至少一个锁定核酸核苷酸侧接的脱氧核糖核苷酸。在一些实施例中,该寡核苷酸的3’位置处的核苷酸具有3’羟基或3’硫代磷酸酯。
在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括至少两个核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施例中,该单链寡核苷酸包括所有核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。
应认识到,该单链寡核苷酸可以具有如在此所描述的修饰的任何组合。
该寡核苷酸可以包括具有以下修饰模式中的一种或多种的核苷酸序列。
(a)(X)Xxxxxx、(X)xXxxxx、(X)xxXxxx、(X)xxxXxx、(X)xxxxXx以及(X)xxxxxX,
(b)(X)XXxxxx、(X)XxXxxx、(X)XxxXxx、(X)XxxxXx、(X)XxxxxX、(X)xXXxxx、(X)xXxXxx、(X)xXxxXx、(X)xXxxxX、(X)xxXXxx、(X)xxXxXx、(X)xxXxxX、(X)xxxXXx、(X)xxxXxX以及(X)xxxxXX,
(c)(X)XXXxxx、(X)xXXXxx、(X)xxXXXx、(X)xxxXXX、(X)XXxXxx、(X)XXxxXx、(X)XXxxxX、(X)xXXxXx、(X)xXXxxX、(X)xxXXxX、(X)XxXXxx、(X)XxxXXx、(X)XxxxXX、(X)xXxXXx、(X)xXxxXX、(X)xxXxXX、(X)xXxXxX以及(X)XxXxXx,
(d)(X)xxXXX、(X)xXxXXX、(X)xXXxXX、(X)xXXXxX、(X)xXXXXx、(X)XxxXXXX、(X)XxXxXX、(X)XxXXxX、(X)XxXXx、(X)XXxxXX、(X)XXxXxX、(X)XXxXXx、(X)XXXxxX、(X)XXXxXx以及(X)XXXXxx,
(e)(X)xXXXXX、(X)XxXXXX、(X)XXxXXX、(X)XXXxXX、(X)XXXXxX以及(X)XXXXXx,以及
(f)XXXXXX、XxXXXXX、XXxXXXX、XXXxXXX、XXXXxXX、XXXXXxX以及XXXXXXx,其中“X”表示核苷酸类似物,(X)表示任选的核苷酸类似物,并且“x”表示DNA或RNA核苷酸单位。以上所列模式各自可以单独或结合任何其他披露的修饰模式在寡核苷酸内出现一次或多次。
用于调节基因表达的方法
在一些实施例中,提供用于提高细胞内SMN蛋白的表达的方法。在一些实施例中,这些方法包括向细胞递送与SMN1或SMN2的PRC2相关区互补的第一单链寡核苷酸,以及与SMN1或SMN2的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸,量足以提高SMN1或SMN2的包含(或包括)外显子7的成熟的mRNA在细胞内的表达。该第一单链寡核苷酸和第二单链寡核苷酸可以一起递送或分开递送。该第一单链寡核苷酸和第二单链寡核苷酸可以连接在一起或不连接即分开。
在一些实施例中,提供用于治疗受试者体内脊髓性肌萎缩的方法。在一些实施例中,这些方法包括向受试者给予与SMN1或SMN2的PRC2相关区互补的第一单链寡核苷酸,以及与SMN1或SMN2的前体mRNA的剪接控制序列互补的一种第二单链寡核苷酸,量足以将该受试者体内全长SMN蛋白的表达提高至足以改善与SMA相关联的一种或多种病症的水平。该第一单链寡核苷酸和第二单链寡核苷酸可以一起给予或分开给予。该第一单链寡核苷酸和第二单链寡核苷酸可以连接在一起或不连接即分开。该第一单链寡核苷酸可以在该第二单链寡核苷酸给药的1小时、2小时、3小时、4小时、8小时、12小时、24小时、48小时或更多小时内给予。该第一单链寡核苷酸可以在该第二单链寡核苷酸之前或之后给予。取决于该受试者的需要和/或治疗医师的判断,寡核苷酸可以给予一次或多次。在一些情况下,可以循环给予寡核苷酸。给药循环可以发生变化;例如,给药周期可以为第2寡核苷酸-第1寡核苷酸-第2寡核苷酸-第1寡核苷酸等;或第1寡核苷酸-第2寡核苷酸-第1寡核苷酸-第2寡核苷酸等;或第1寡核苷酸-第2寡核苷酸-第2寡核苷酸-第1寡核苷酸-第1寡核苷酸-第2寡核苷酸-第2寡核苷酸-第1寡核苷酸等。技术人员将能够选择对治疗具体受试者而言适当的给药循环和每次给药之间的间隔。
在一个方面,本发明出于研究目的(例如,研究细胞内基因的功能)涉及用于调节细胞(例如,SMN1或SMN2水平降低的细胞)内基因表达的方法。在另一个方面,本发明涉及用于调节细胞(例如,SMN1或SMN2水平降低的细胞)内基因表达以用于基因或表观遗传治疗的方法。这些细胞可以为体外的、离体的或体内的(例如,因SMN1或SMN2的表达或活性降低而患有疾病的受试者体内)。在一些实施例中,用于调节细胞内基因表达的方法包括递送如在此所描述的一种单链寡核苷酸。在一些实施例中,向细胞递送该单链寡核苷酸导致基因表达的水平比尚未递送该单链寡核苷酸的对照细胞内的基因表达的水平大至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或以上。在某些实施例中,向细胞递送该单链寡核苷酸导致基因表达的水平比尚未递送该单链寡核苷酸的对照细胞内的基因表达的水平大至少50%。
在本发明的另一个方面,方法包括向受试者(例如,人)给予包含如在此所描述提高该受试者体内蛋白水平的单链寡核苷酸的组合物。在一些实施例中,该蛋白水平的提高为比给药之前该受试者体内的蛋白的量高至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或以上。
作为另一个实例,为了提高细胞内SMN1或SMN2的表达,这些方法包括向该细胞引入单链寡核苷酸,该单链寡核苷酸与定位至涵盖或接近SMN1或SMN2基因的基因组位置(例如,长的非编码RNA)的PRC2相关区充分互补。
本发明的另一方面提供治疗与受试者体内SMN1或SMN2的降低的表达水平相关联的病症(例如,脊髓性肌萎缩)的方法,该方法包括给予如在此所描述的单链寡核苷酸。
受试者可以包括非人哺乳动物,例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗、山羊、牛或马。在优选的实施例中,受试者为人。单链寡核苷酸已用作治疗动物(包括人)的疾病病况的治疗部分。单链寡核苷酸可以为有用的治疗模态,这些治疗模态可以被配置成在用于治疗细胞、组织以及动物特别是人的治疗方案中有用。
对于治疗法,怀疑患有脊髓性肌萎缩的动物优选为人通过给予根据本发明的单链寡核苷酸来治疗。例如,在一个非限制性实施例中,这些方法包括向需要治疗的动物给予治疗有效量的如在此所描述的单链寡核苷酸的步骤。
配制、递送以及给药
在此描述的寡核苷酸可以被配制用于向受试者给药以用于治疗与SMN蛋白水平降低相关联的病症(例如,脊髓性肌萎缩)。应理解,配制品、组合物和方法可以用在此披露的任何寡核苷酸来实践。在一些实施例中,提供配制品,其包含与基因的PRC2相关区互补的第一单链寡核苷酸以及与该基因的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸。在一些实施例中,提供配制品,其包含与基因的PRC2相关区互补的第一单链寡核苷酸,该第一单链寡核苷酸经由接头而与该基因的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸连接。因此,应认识到,在一些实施例中,与基因的PRC2相关区互补的第一单链寡核苷酸与该基因的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸连接,并且在其他实施例中,这些单链寡核苷酸是不连接的。不连接的单链寡核苷酸可以同时(例如,在同一组合物内)或分开地向受试者给予或向细胞递送。
这些配制品可以方便地按单位剂型形式呈现并且可以通过制药领域中熟知的任何方法来制备。可以与载体材料组合以便产生单一剂型的活性成分(例如,本发明的寡核苷酸或化合物)的量将根据所治疗的宿主、具体给药模式例如皮内或吸入而变化。可以与载体材料组合以便产生单一剂型的活性成分的量将通常是产生治疗效果例如肿瘤阻抑的化合物的量。
本发明的药物配制品可以根据本领域已知用于制造药物的任何方法来制备。这类配制品可以含有甜味剂、调味剂、着色剂以及防腐剂。配制品可以与适于制造的无毒的药学上可接受的赋形剂混合。配制品可以包含一种或多种稀释剂、乳化剂、防腐剂、缓冲液、赋形剂等并且可以提供成这类形式如液体、粉末、乳液、冻干粉末、喷雾、乳膏、洗剂、受控释放配制品、片剂、丸剂、凝胶、贴片上、植入物内等。
配制的单链寡核苷酸组合物可以呈现各种状态。在一些实例中,该组合物为至少部分结晶(均匀地结晶)和/或无水的(例如,小于80%、50%、30%、20%或10%水)。在另一个实例中,该单链寡核苷酸处于水相,例如处于包括水的溶液中。该水相或结晶组合物可以例如结合到递送媒介物例如脂质体(特别是针对水相)或颗粒(例如,对结晶组合物而言微粒可能是适当的)中。一般而言,该单链寡核苷酸组合物以与目标给药方法相容的方式配制。
在一些实施例中,该组合物通过以下方法中的至少一种来制备:喷雾干燥、冻干、真空干燥、蒸发、流化床干燥或这些技术的组合;或与脂质一起超声处理、冷冻干燥、冷凝以及其他自组装技术。
单链寡核苷酸制剂可以与另一种试剂组合配制或给予(一起或分开),另一种试剂例如另一种治疗剂或稳定单链寡核苷酸的试剂,例如与单链寡核苷酸复合的蛋白质。其他试剂包括螯合剂,例如,EDTA(例如,以去除二价阳离子如Mg2+),盐,RNA酶抑制剂(例如,宽特异性RNA酶抑制剂如RNAsin)等。在一些实施例中,结合该单链寡核苷酸使用的其他试剂为也调控SMN表达的试剂。在一些实施例中,其他试剂为生长激素、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、羟基尿素(羟基脲)、天然多酚化合物(例如,芪三酚、姜黄素)、促乳素或沙丁胺醇。可以使用的组蛋白去乙酰化酶抑制剂的实例包括脂族化合物(例如,丁酸盐(例如,丁酸钠和苯基丁酸钠)以及丙戊酸),苯甲酰胺(例如,M344)以及异羟肟酸(例如,CBHA、SBHA、恩替诺特(Entinostat)(MS-275)、帕比司他(Panobinostat)(LBH-589)、曲古抑菌素(Trichostatin)A、伏立诺他(SAHA)),
在一个实施例中,该单链寡核苷酸制剂包括另一种单链寡核苷酸,例如,调节第二基因的表达和/或mRNA加工的第二单链寡核苷酸或调节第一基因的表达的第二单链寡核苷酸。其他制剂可以包括至少3个、5个、十个、二十个、五十个或一百个或更多个不同的单链寡核苷酸种类。这类单链寡核苷酸相对于类似数量的不同基因可以介导基因表达。在一个实施例中,该单链寡核苷酸制剂包括至少一种第二治疗剂(例如,除寡核苷酸之外的试剂)。
递送途径
包括单链寡核苷酸的组合物可以通过各种途径递送至受试者。示例性途径包括:静脉内、皮内、局部、经直肠、肠胃外、***内、***内、鼻内、经肺、经眼。术语“治疗有效量”为在有待治疗的受试者体内提供所希望水平的SMN1或SMN2表达以便给出期望的生理反应所需的组合物中存在的寡核苷酸的量。术语“生理学有效量”为递送至受试者以便给出所希望的缓解性或治愈性效果的量。术语“药学上可接受的载体”意指可以向受试者给予而不对该受试者产生显著的不良的毒理学作用的载体。
本发明的单链寡核苷酸分子可以结合到适于给药的药物组合物中。这类组合物典型地包括一种或多种单链寡核苷酸种类以及药学上可接受的载体。如在此所使用,词语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物给药相容的任何以及所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。对于药物活性物质使用此类介质与试剂在本领域内是熟知的。除了任何常规的与活性成分不相容的介质或试剂之外,将涵盖此类介质和试剂在组合物中的使用。辅助活性化合物也可以结合到组合物中。
本发明的药物组合物能够以多种方式给予,这取决于希望是局部治疗还是***治疗以及有待治疗的区域。给药可以为局部的(包括眼部给药、***给药、直肠给药、鼻内给药、经皮给药)、口服或肠胃外的。肠胃外给药包括静脉滴注、皮下注射、腹膜内注射或肌内注射、或鞘内给药或心室内给药。
给药途径和部位可以被选择来增强靶向作用。例如,为了靶向肌细胞,肌内注射到相关肌肉内将是合理的选择。可以通过给予呈气溶胶形式的单链寡核苷酸来靶向肺细胞。血管内皮细胞可以通过对气囊导管涂布单链寡核苷酸并机械地引入寡核苷酸来靶向。
局部给药是指通过使该配制品直接接触受试者的表面来向该受试者递送。局部递送的最常见形式为递送至皮肤,但在此披露的组合物也可以直接涂覆至身体的其他表面,例如,涂覆至眼睛、粘膜,体腔的表面或内表面。如上所述,最常见的局部递送为递送至皮肤。该术语涵盖若干给药途径,包括但不限于局部给药和经皮。这些给药模式典型地包括穿透皮肤的可渗透性屏障并且有效递送至靶组织或组织层。局部给药可以用作穿透表皮和真皮并最终实现组合物的***递送的手段。局部给药还可以用作向受试者的表皮或真皮,或其特定组织层或底层组织选择性递送寡核苷酸的手段。
用于局部给药的配制品可以包括经皮贴片、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴液、栓剂、喷雾、液体以及粉末。常规的药物载体、水性基质、粉末基质或油性基质、增稠剂等可能是需要的或希望的。涂布的避孕套、手套等也可能是有用的。
皮内递送为用于脂溶性治疗剂的给药的有用途径。真皮比表皮更易渗透,并且因此吸收更为迅速地通过擦伤、烧伤或剥离后的皮肤。炎症和增加流向皮肤的血流的其他生理病症也增强经皮吸收。经由这种途径的吸收可以通过使用油性媒介物(涂擦)或通过使用一种或多种渗透增强剂来增强。经由经皮途径递送在此披露的组合物的其他有效方式包括皮肤的水合作用以及受控释放局部贴片的使用。经皮途径提供递送在此披露的组合物以用于***和/或局部治疗的潜在有效的手段。此外,离子电渗疗法(在电场影响下,通过生物膜传递离子溶质)、超声透入疗法或超声导入疗法(使用超声波来增强整个生物膜特别是皮肤和角膜上的各种治疗剂的吸收)以及媒介物特征相对于给药部位处剂量位置和保持时间的优化可能是用于增强局部涂覆的组合物在整个皮肤和粘膜部位上的传送的有用方法。
经口和经鼻膜两者提供优于其他给药途径的优点。例如,通过这些膜给予的寡核苷酸可以具有快速起效的作用,提供治疗性血浆水平,避免肝脏的首过代谢作用,并且避免寡核苷酸在有害胃肠(GI)环境中的暴露。另外的优点包括易于进入膜部位以使得寡核苷酸可以容易地涂覆、局部化和去除。
在口服递送中,组合物可以靶向口腔的表面,例如,舌下黏膜,舌下黏膜包括舌部的腹面的膜和口腔底部或构成颊部的内层的颊粘膜。舌下黏膜为相对可渗透的,从而给出对许多试剂的快速吸收和可接受的生物可利用性。另外,舌下黏膜为方便的、可接受的以及易于接近的。
单链寡核苷酸的药物组合物还可以通过将如上所述的混合的胶束药物配制品以及推进剂从计量的剂量喷雾分配器喷入到(而非吸入到)腔中来向人类的颊腔给药。在一个实施例中,在将药物配制品和推进剂喷入到颊腔中之前,首先振荡该分配器。
用于口服给药的组合物包括粉末或颗粒、水性悬浮液或溶液、糖浆、浆料、乳液、酏剂或非水性介质、片剂、胶囊、锭剂或含片。在片剂的情况下,可以使用的载体包括乳糖、柠檬酸钠以及磷酸盐。各种崩解剂(如淀粉)和润滑剂(如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠以及滑石)普遍用于片剂中。对于胶囊形式的口服给药,可用稀释剂为乳糖和高分子量聚乙二醇。当需要用于口服使用的水性悬浮液时,可以将核酸组合物与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要,可以添加某些甜味剂和/或调味剂。
肠胃外给药包括静脉滴注、皮下注射、腹膜内注射或肌内注射、鞘内给药或心室内给药。在一些实施例中,肠胃外给药包括直接给药至疾病部位(例如,注射到肿瘤中)。
用于肠胃外给药的配制品可以包括也可以含有缓冲液、稀释剂以及其他适合的添加剂的无菌水溶液。可以通过例如附接至贮药库(reservoir)的心室内导管来帮助心室内注射。对于静脉内使用,应控制溶质的总浓度以便使制剂等渗。
可以向眼部组织给予在此描述的任何单链寡核苷酸。例如,可以将组合物涂覆至眼睛或邻近组织的表面,例如,眼睑内部。对于眼部给药,可以通过本领域已知的眼部递送***如涂药器或滴眼瓶来递送软膏或滴眼液。这类组合物可以包括粘液模拟物质(mucomimetics)如透明质酸、硫酸软骨素、羟丙基甲基纤维素或聚(乙烯醇),防腐剂如山梨酸、EDTA或苄基氯化铬以及常用量的稀释剂和/或载体。还可以向眼睛的内部给予该单链寡核苷酸,并且可以通过针或可以将该单链寡核苷酸引至选定区域或结构的其他递送装置来引入该单链寡核苷酸。
肺部递送组合物可以由患者吸入分散剂来递送,这样使得该分散剂内的该组合物(优选地为单链寡核苷酸)可以抵达该组合物可以容易地通过肺泡段而直接吸收进入血液循环的肺部。肺部递送可以有效用于***递送和局部递送两者以用于治疗肺部疾病。
可以通过不同的方法来实现肺部递送,包括使用基于气雾化、气溶胶化、胶束以及干粉的配制品。可以用液体气雾器、基于气溶胶的吸入器以及干粉分配装置来实现递送。计量剂量装置是优选的。使用雾化器或吸入器的一个益处在于污染的可能性被最小化,因为装置是独立的。干粉分配装置例如递送可以容易地配制成干粉的试剂。单链寡核苷酸组合物可以独自或结合适合的粉末载体稳定地存储为冻干或喷雾干燥的粉末。组合物的吸入递送可以通过给药计时元件来介导,该给药计时元件可以包括计时器、剂量计数器、测时装置或时间指示器,在它们结合到装置中时在气溶胶药剂的给药过程中实现剂量追踪、依从性监测和/或触发剂量给患者。
术语“粉末”意指由细微分散的固体颗粒组成的组合物,这些固体颗粒是自由流动的,并且能够容易地分散在吸入装置中,并且随后由受试者吸入,以使得颗粒抵达肺部以便允许穿透到肺泡中。因此,粉末被称为“可呼吸的”。优选地,平均粒度小于约10μm的直径,优选地具有相对均匀的球形分布。更优选地,直径小于约7.5μm并且最优选地小于约5.0μm。通常,粒度分布为在约0.1μm与约5μm的直径之间,特别是约0.3μm至约5μm。
术语“干燥”意指组合物按水的重量计(w%)具有低于约10%,通常低于约5w%并且优选地低于约3w%的含水量。干燥组合物可以使得颗粒能够容易地分散在吸入装置中以便形成气溶胶。
可用作载体的药物赋形剂的类型包括稳定剂如人血清白蛋白(HSA)、增量剂如糖类、氨基酸以及多肽;pH调节剂或缓冲液;盐如氯化钠;等。这些载体可以为结晶形式或无定形形式或者可以为两者的混合物。
适合的pH调节剂或缓冲液包括由有机酸和碱制备的有机盐,如柠檬酸钠、抗坏血酸钠等;柠檬酸钠是优选的。胶束单链寡核苷酸配制品的肺部给药可以通过具有推进剂的计量剂量喷雾装置来实现,这些推进剂如四氟乙烷、七氟乙烷、二甲基氟丙烷、四氟丙烷、丁烷、异丁烷、二甲基醚以及其他非CFC和CFC推进剂。
示例性装置包括引入到脉管***中的装置,例如,***到血管组织的内腔中的装置,或装置自身形成脉管结构一部分的装置,包括支架、导管、心脏瓣膜以及其他血管装置。这些装置例如导管或支架可以放置在肺部、心脏或腿部的脉管结构中。
其他装置包括非血管装置,例如,植入到腹膜中,或器官或腺组织中的装置,例如人造器官。该装置可以释放除单链寡核苷酸之外的治疗物质,例如,装置可以释放胰岛素。
在一个实施例中,包括单链寡核苷酸的组合物的单位剂量或测量剂量通过植入装置来分配。该装置可以包括监控受试者体内参数的传感器。例如,该装置可以包括泵以及例如任选地相关联的电子器件。
组织例如细胞或器官可以离体用单链寡核苷酸治疗,并且之后给予或植入到受试者体内。该组织可以为自体组织、异体组织或异种组织。例如,可以治疗组织来减少移植物对抗宿主病。在其他实施例中,该组织为异体的并且治疗该组织来治疗特征在于所述组织中的不想要的基因表达的失调。例如,可以治疗组织例如造血干细胞(例如,骨髓造血干细胞)来抑制不想要的细胞增殖。引入无论是自体的还是移植的治疗组织都可以与其他疗法结合。在一些实施方案中,单链寡核苷酸处理的细胞例如通过半渗透多孔屏障与其他细胞分离开来,该半渗透多孔屏障防止细胞离开移植体,但使得来自身体的分子能够到达细胞并且使得由细胞产生的分子进入身体。在一个实施例中,该多孔屏障由藻酸盐形成。
在一个实施例中,避孕装置涂布有或含有单链寡核苷酸。示例性装置包括避孕套、子宫帽、IUD(植入式子宫装置)、海绵体、***用套以及节育装置。
剂量
在一个方面,本发明的特征为向受试者(例如,人受试者)给予单链寡核苷酸(例如,作为化合物或作为组合物的组分)的方法。在一些实施例中,这些方法包括向受试者给予单位剂量的化合物(例如,如在此披露具有通式A-B-C的化合物,或单链寡核苷酸)。在一个实施例中,该单位剂量在约10mg与25mg/kg体重之间。在一个实施例中,该单位剂量在约1mg与100mg/kg体重之间。在一个实施例中,该单位剂量在约0.1mg与500mg/kg体重之间。在一些实施例中,该单位剂量超过0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、25、50或100mg/kg体重。
所定义的量可以为有效用于治疗或预防疾病或失调例如与SMN1或SMN2相关联的疾病或失调的量。单位剂量例如可以通过注射(例如,静脉内或肌内)、吸入剂量或局部涂覆来给予。
在一些实施例中,每天给予该单位剂量。在一些实施例中,小于每天一次的频率,例如小于每2、4、8或30天一次的频率给予该单位剂量。在另一个实施例中,该单位剂量不按频率给予(例如,非规律的频率)。例如,可以单次给予该剂量单位。在一些实施例中,该单位剂量一天可以给予一次以上,例如,一个小时、两个小时、四个小时、八个小时、十二个小时等给予一次。
在一个实施例中,向受试者给予单链寡核苷酸的初始剂量以及一个或多个维持剂量。一个或多个维持剂量通常低于该初始剂量,例如,比该初始剂量小一半。维持方案可以包括用在从每天0.0001至100mg/kg体重范围内,例如每天100、10、1、0.1、0.01、0.001或0.0001mg/kg体重的一个或多个剂量治疗受试者。每1、5、10或30天可以给予不超过一次的维持剂量。另外,治疗方案可以持续一段时间,该治疗方案将根据具体疾病的性质、严重程度以及患者的总体情况来变化。在一些实施例中,每天可以递送不超过一次的剂量,例如,每24、36、48小时或更多小时不超过一次,例如,每5或8天不超过一次。在治疗之后,可以监控患者的病症变化以及疾病病况的症状的缓解。寡核苷酸的剂量可以在患者对当前剂量水平未作出显著响应的情况下增加,或者剂量可以在观察到疾病病况的症状的缓解的情况下,在疾病病况消除的情况下或在观察到不希望的副作用的情况下减小。
在特定情况下根据需要或认为适当时,有效剂量能够以单次剂量或两次或更多次剂量给予。如果希望促进重复或频繁的输注,可建议植入递送装置,例如,泵、半永久性支架(例如,静脉内、腹膜内、脑池内或囊内)或贮药库。
在一些实施例中,该药物组合物包括多个单链寡核苷酸种类。在一些实施例中,该药物组合物包含与基因(例如,SMN1或SMN2)的PRC2相关区互补的第一单链寡核苷酸以及与基因(例如,SMN1或SMN2)的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸。在一些实施例中,该药物组合物包括化合物,该化合物包括通式A-B-C,其中A为与基因的PRC2相关区互补的单链寡核苷酸,B为接头,并且C为与该基因的前体mRNA的剪接控制序列互补的单链寡核苷酸。
在另一个实施例中,单链寡核苷酸种类相对于天然存在的靶序列(例如,PRC2相关区)具有与另一个种类不重叠并且不邻近的序列。在另一个实施例中,多个单链寡核苷酸种类对不同的PRC2相关区具有特异性。在另一个实施例中,该单链寡核苷酸是等位基因特异性的。在一些情况下,用一种单链寡核苷酸结合其他治疗模态来治疗患者。
在成功治疗之后,可能希望使该患者经受维持治疗以便防止疾病病况的复发,其中以从0.0001mg至100mg/kg体重的范围内的维持剂量给予本发明的化合物。
该单链寡核苷酸组合物的浓度为足以在人体内有效治疗或预防失调或调控生理病症的量。所给予的单链寡核苷酸的浓度或量将取决于针对试剂和给药方法例如经鼻、经颊、经肺确定的参数。例如,鼻用配制品可能倾向于要求一些成分的浓度较低以便避免对鼻腔通道的刺激或烧伤。有时希望将口服配制品稀释多达10至100倍以便提供适合的鼻用配制品。
某些因素可能会影响有效治疗受试者所需的剂量,包括但不限于疾病或失调的严重程度、先前治疗、受试者的总体健康和/或年龄以及存在的其他疾病。此外,使用治疗有效量的单链寡核苷酸对受试者治疗可以包括单一治疗、或优选地可以包括一系列治疗。还将认识到,用于治疗的单链寡核苷酸的有效剂量可以在具体治疗的过程中增大或减小。例如,可以在给予单链寡核苷酸组合物之后监控该受试者。基于来自监控的信息,可以给予另外的量的该单链寡核苷酸组合物。
给药取决于有待治疗的疾病病症的严重程度和响应性,其中治疗过程持续从数天至数月,直到实现治愈或者实现疾病病况减轻。最佳给药计划可以从对患者体内的SMN1或SMN2表达水平的测量来计算。普通技术人员可以容易地测定最佳剂量、给药方法以及重复率。最佳剂量可以根据单独化合物的相对效力来变化,并且通常可以基于在体外和体内动物模型中发现有效的EC50来估算。在一些实施例中,动物模型包括表达人SMN1或SMN2的转基因动物。在另一个实施例中,用于测试的组合物包括至少在内部区域中与序列互补的单链寡核苷酸,该序列在动物模型中的SMN1或SMN2与人体中的SMN1或SMN2之间保守。
在一个实施例中,单链寡核苷酸组合物的给药为肠胃外的,例如,静脉内(例如,作为推注或作为可扩散的输注)、皮内、腹膜内、肌内、鞘内、心室内、颅内、皮下、经粘膜、经颊、舌下、经内窥镜、经直肠、口服、***内、局部、经肺、鼻内、经尿道或经眼。可以通过受试者或通过另一个人例如卫生保健提供者来提供给药。该组合物能够以测量剂量或递送计量剂量的分配器提供。下文更详细地论述了选择的递送模式。
试剂盒
在本发明的某些方面,提供试剂盒,其包括容纳包含单链寡核苷酸的组合物的容器。在一些实施例中,这些试剂盒包括容器,该容器容纳与基因的PRC2相关区互补的单链寡核苷酸;以及第二容器,该第二容器容纳与该基因的前体mRNA的剪接控制序列互补的单链寡核苷酸。在一些实施例中,这些试剂盒包括容器,该容器容纳与基因的PRC2相关区互补的单链寡核苷酸,以及与该基因的前体mRNA的剪接控制序列互补的单链寡核苷酸。在一些实施例中,该组合物为包含单链寡核苷酸和药学上可接受的载体的药物组合物。在一些实施例中,该药物组合物的单独组分可以提供在一个容器中。可替代地,可能希望将该药物组合物的组分分开提供在两个或更多个容器中,例如,一个容器用于单链寡核苷酸,并且至少另一个用于载体化合物。该试剂盒可以封装在多个不同的构型如单个盒子内的一个或多个容器中。不同的组分可以例如根据试剂盒所提供的说明书来组合。组分可以根据在此描述例如用于制备和给予药物组合物的方法来组合。该试剂盒还可以包括一种递送装置。
通过以下实例来进一步说明本发明,这些实例绝不应解释为进一步的限制。在本发明通篇引用的所有参考(包括文献参考、颁予的专利、公开专利申请以及共同待决专利申请)的全部内容清楚地通过引用结合在此。
实例
以下实例将进一步描述本发明,这些实例不限制权利要求书中描述的本发明的范围。
实例1:上调SMN1的靶向PRC2相关区的寡核苷酸。
材料与方法:
实时PCR
使用Promega SV 96总RNA分离***或Trizol,省略DNA酶步骤来从细胞收获RNA。在单独的中试实验中,确定50ng RNA是用于逆转录酶反应的足够的模板。将从细胞收获的RNA归一化以使得50ng RNA输入至每个逆转录反应中。对于太稀而不能达到这个限值的少数样品,添加最大输入体积。使用Superscript II试剂盒进行逆转录酶反应,并且使用icycler SYBR绿化学法(伯乐(Biorad))对cDNA样品进行实时PCR。通过如上所概述的定量PCR确定每个靶基因的mRNA表达的基线水平。还确定组成性表达的不同管家基因的mRNA的基线水平。出于比较目的选择具有与靶基因近似相同的基线表达水平的“对照”管家基因。
蛋白表达(ELISA)
根据制造商的说明书(SMN ELISA试剂盒#ADI-900-209,恩佐生命科学(Enzo Life Sciences))执行ELISA以测定SMN蛋白。
细胞培养
使用本领域中已知的条件(参见,例如,细胞生物学实验指南(CurrentProtocols in Cell Biology))培养人肝细胞Hep3B、人肝细胞HepG2细胞、小鼠肝细胞瘤Hepa1-6细胞以及人肾脏近端小管上皮细胞(RPTEC)。测试的其他细胞系为神经元细胞系(SK-N-AS,U-87)以及SMN患者成纤维细胞。表8中提供了在此描述的实验中所使用的细胞系的细节。
表8.细胞系
寡核苷酸设计
在PRC2-相互作用区内设计寡核苷酸以便上调SMN1。表2中示出了每个寡核苷酸的序列和结构。下表提供了用于所测试的并且表2中描述的某些寡核苷酸的核苷酸类似物、修饰以及核苷酸内键的描述。
用寡核苷酸进行细胞的体外转染
以25,000细胞/500uL的密度将细胞接种到24孔板中的每个孔中,并且用脂质转染胺和单链寡核苷酸进行转染。对照细胞只含有脂质转染胺。在转染48小时后,在-80℃下,存储约200uL细胞培养物上清液以用于ELISA。在转染48小时后,从细胞收获RNA,并且如上所概述的执行定量PCR。通过每个寡核苷酸诱导的靶mRNA表达的百分比是通过将在寡核苷酸存在下的mRNA水平相对于在对照(脂质转染胺单独)存在下的mRNA水平归一化来确定。将这与“对照”管家基因的mRNA表达的提高并行比较。
结果:
体外递送单链寡核苷酸上调SMN1表达
寡核苷酸被设计为用于上调SMN1表达的候选物。总共52个单链寡核苷酸被设计成与如SEQ ID NO:1、2、4或5中给出的序列内的PRC2相互作用区互补。至少重复两次测试寡核苷酸。表2中给出了寡核苷酸的序列和结构特征。简单地说,用如上所述的寡核苷酸对细胞进行体外转染。通过qRT-PCR评价处理之后细胞内的SMN1表达。鉴别上调SMN1表达的寡核苷酸。表2中概括了另外的细节。
表5示出了来自实验的另外的结果,在实验中,以特定的浓度[寡核苷酸]将寡核苷酸转染到细胞中,并且在48或72小时之后,制备RNA并且执行qRTPCR测定以确定全长(FL)或Δ7 SMN的mRNA水平。在其他情况下,以10μM将寡核苷酸以剥裸方式给予细胞,并且在处理后9天收获RNA。测试的细胞系为神经元细胞系(SK-N-AS,U-87)以及SMN患者成纤维细胞。
表6示出了来自实验的结果,在实验中,以特定的浓度([寡核苷酸]、[第2种]、[第3种])结合一种或两种以上寡核苷酸或小分子化合物将寡核苷酸转染到细胞中,并且在48或72小时之后,制备RNA并且执行qRTPCR测定以确定全长(FL)或Δ7 SMN的mRNA水平。测试的细胞系为SMN患者成纤维细胞。
表7示出了来自实验的结果,在实验中,以特定的浓度([寡核苷酸]、[第2种]、[第3种])结合一种或两种以上寡核苷酸或作为二聚物或通过剥裸处理(gymnotic treatment)将寡核苷酸转染到细胞中,并且在24、48、72或216小时之后,制备细胞溶解液并且执行ELISA测定以确定SMN蛋白水平。测试的细胞系为SMN患者成纤维细胞。
表
表1:非种子六聚物序列。
AAAAAA、AAAAAG、AAAACA、AAAAGA、AAAAGC、AAAAGG、AAAAUA、AAACAA、AAACAC、AAACAG、AAACAU、AAACCC、AAACCU、AAACGA、AAACGC、AAACGU、AAACUA、AAACUC、AAACUU、AAAGAU、AAAGCC、AAAGGA、AAAGGG、AAAGUC、AAAUAC、AAAUAU、AAAUCG、AAAUCU、AAAUGC、AAAUGU、AAAUUA、AAAUUG、AACAAC、AACAAG、AACAAU、AACACA、AACACG、AACAGA、AACAGC、AACAGG、AACAUC、AACAUG、AACCAA、AACCAC、AACCAG、AACCAU、AACCCC、AACCCG、AACCGA、AACCGC、AACCGG、AACCUA、AACCUU、AACGAA、AACGAC、AACGAG、AACGAU、AACGCU、AACGGG、AACGGU、AACGUA、AACGUC、AACGUG、AACGUU、AACUAU、AACUCA、AACUCC、AACUCG、AACUGA、AACUGC、AACUGU、AACUUA、AACUUC、AACUUG、AACUUU、AAGAAA、AAGAAG、AAGAAU、AAGACG、AAGAGA、AAGAGC、AAGAGG、AAGAGU、AAGAUU、AAGCAA、AAGCAC、AAGCAG、AAGCAU、AAGCCA、AAGCCC、AAGCCG、AAGCCU、AAGCGA、AAGCGG、AAGCGU、AAGCUA、AAGGAA、AAGGAC、AAGGCU、AAGGGC、AAGGGU、AAGGUU、AAGUAA、AAGUAC、AAGUAU、AAGUCC、AAGUCG、AAGUGA、AAGUGG、AAGUUA、AAGUUU、AAUAAA、AAUAAC、AAUAAG、AAUAAU、AAUACA、AAUACC、AAUACG、AAUAGA、AAUAGC、AAUAGG、AAUAGU、AAUAUC、AAUAUU、AAUCAA、AAUCAU、AAUCCA、AAUCCC、AAUCCG、AAUCGA、AAUCGC、AAUCGU、AAUCUA、AAUCUG、AAUCUU、AAUGAA、AAUGAC、AAUGAG、AAUGAU、AAUGCG、AAUGCU、AAUGGA、AAUGGU、AAUGUA、AAUGUC、AAUGUG、AAUUAA、AAUUAC、AAUUAG、AAUUCC、AAUUCG、AAUUGA、AAUUGG、AAUUGU、AAUUUC、AAUUUG、ACAAAA、ACAAAC、ACAAAG、ACAAAU、ACAACC、ACAACG、ACAACU、ACAAGA、ACAAGC、ACAAGU、ACAAUC、ACAAUG、ACAAUU、ACACAG、ACACCA、ACACCC、ACACCG、ACACCU、ACACGA、ACACGC、ACACGU、ACACUC、ACACUG、ACACUU、ACAGAA、ACAGAC、ACAGCC、ACAGCG、ACAGCU、ACAGGG、ACAGUC、ACAGUG、ACAGUU、ACAUAA、ACAUAC、ACAUCC、ACAUCG、ACAUCU、ACAUGA、ACAUGC、ACAUGU、ACAUUG、ACAUUU、ACCAAA、ACCAAC、ACCAAG、ACCAAU、ACCACC、ACCACG、ACCAGA、ACCAGU、ACCAUA、ACCAUG、ACCAUU、ACCCAA、ACCCAC、ACCCCA、ACCCCG、ACCCGA、ACCCGC、ACCCUA、ACCCUC、ACCCUU、ACCGAA、ACCGAC、ACCGAU、ACCGCA、ACCGCC、ACCGCG、ACCGCU、ACCGGA、ACCGGC、ACCGGU、ACCGUA、ACCGUC、ACCGUG、ACCGUU、ACCUAA、ACCUAC、ACCUAG、ACCUAU、ACCUCA、ACCUCC、ACCUCG、ACCUCU、ACCUGA、ACCUGC、ACCUGU、ACCUUA、ACCUUC、ACCUUU、ACGAAA、ACGAAC、ACGAAG、ACGAAU、ACGACA、ACGACC、ACGACG、ACGACU、ACGAGA、ACGAGC、ACGAGG、ACGAGU、ACGAUA、ACGAUC、ACGAUG、ACGAUU、ACGCAA、ACGCAG、ACGCAU、ACGCCC、ACGCCG、ACGCCU、ACGCGA、ACGCGG、ACGCGU、ACGCUA、ACGCUG、ACGCUU、ACGGAA、ACGGAC、ACGGAG、ACGGAU、ACGGCC、ACGGCG、ACGGCU、ACGGGC、ACGGGG、ACGGGU、ACGGUA、ACGGUC、ACGGUG、ACGGUU、ACGUAA、ACGUAC、ACGUAU、ACGUCC、ACGUCG、ACGUCU、ACGUGA、ACGUGC、ACGUGG、ACGUGU、ACGUUA、ACGUUC、ACGUUG、ACGUUU、ACUAAA、ACUAAG、ACUAAU、ACUACA、ACUACC、ACUACG、ACUACU、ACUAGG、ACUAUC、ACUAUG、ACUAUU、ACUCAU、ACUCCC、ACUCCG、ACUCCU、ACUCGA、ACUCGC、ACUCGG、ACUCUC、ACUCUU、ACUGAG、ACUGAU、ACUGCC、ACUGCG、ACUGCU、ACUGGG、ACUGGU、ACUGUC、ACUUAA、ACUUAC、ACUUAU、ACUUCA、ACUUCC、ACUUCG、ACUUCU、ACUUGA、ACUUGC、ACUUGU、ACUUUA、ACUUUC、ACUUUG、AGAAAA、AGAAAC、AGAAAG、AGAACC、AGAACG、AGAACU、AGAAGC、AGAAGU、AGAAUA、AGAAUC、AGAAUG、AGAAUU、AGACAA、AGACAC、AGACAU、AGACCA、AGACCC、AGACCG、AGACCU、AGACGA、AGACGC、AGACGU、AGACUA、AGACUC、AGACUU、AGAGAC、AGAGAG、AGAGAU、AGAGCC、AGAGCG、AGAGCU、AGAGGC、AGAGGG、AGAGGU、AGAGUA、AGAGUU、AGAUAC、AGAUAG、AGAUAU、AGAUCC、AGAUCG、AGAUCU、AGAUGA、AGAUGC、AGAUGG、AGAUUA、AGAUUC、AGAUUG、AGAUUU、AGCAAC、AGCACA、AGCACG、AGCACU、AGCAGA、AGCAUA、AGCAUC、AGCAUG、AGCCAA、AGCCAU、AGCCCA、AGCCGA、AGCCGC、AGCCGG、AGCCGU、AGCCUA、AGCCUC、AGCGAA、AGCGAG、AGCGAU、AGCGCA、AGCGCC、AGCGCG、AGCGCU、AGCGGA、AGCGGC、AGCGGU、AGCGUA、AGCGUC、AGCGUG、AGCGUU、AGCUAA、AGCUAC、AGCUAG、AGCUAU、AGCUCA、AGCUCC、AGCUCG、AGCUCU、AGCUGA、AGCUGG、AGCUGU、AGCUUC、AGCUUU、AGGAAU、AGGACC、AGGACG、AGGAGA、AGGAGU、AGGAUA、AGGCAA、AGGCAU、AGGCCG、AGGCGA、AGGCGC、AGGCGG、AGGCUA、AGGCUC、AGGCUU、AGGGAC、AGGGAU、AGGGGA、AGGGGU、AGGGUA、AGGGUG、AGGUAA、AGGUAC、AGGUCA、AGGUCC、AGGUCU、AGGUGA、AGGUGC、AGGUGG、AGGUGU、AGGUUC、AGGUUG、AGUAAA、AGUAAG、AGUAAU、AGUACA、AGUACG、AGUAGC、AGUAGG、AGUAUA、AGUAUC、AGUAUG、AGUAUU、AGUCAA、AGUCAC、AGUCAG、AGUCAU、AGUCCA、AGUCCG、AGUCCU、AGUCGA、AGUCGC、AGUCGG、AGUCGU、AGUCUA、AGUCUC、AGUCUG、AGUCUU、AGUGAA、AGUGAC、AGUGCG、AGUGGG、AGUGUC、AGUUAA、AGUUAC、AGUUAG、AGUUCC、AGUUCG、AGUUGA、AGUUGC、AGUUGU、AGUUUA、AGUUUC、AGUUUG、AGUUUU、AUAAAC、AUAAAU、AUAACA、AUAACC、AUAACG、AUAACU、AUAAGA、AUAAGC、AUAAGG、AUAAGU、AUAAUC、AUAAUG、AUAAUU、AUACAC、AUACAG、AUACAU、AUACCA、AUACCC、AUACCG、AUACGA、AUACGC、AUACGG、AUACGU、AUACUA、AUACUC、AUACUG、AUACUU、AUAGAA、AUAGAC、AUAGAU、AUAGCA、AUAGCG、AUAGCU、AUAGGA、AUAGGU、AUAGUA、AUAGUC、AUAGUG、AUAGUU、AUAUAC、AUAUAG、AUAUCC、AUAUCG、AUAUCU、AUAUGA、AUAUGC、AUAUGG、AUAUGU、AUAUUC、AUAUUG、AUAUUU、AUCAAA、AUCAAC、AUCAAG、AUCAAU、AUCACA、AUCACC、AUCACG、AUCAGC、AUCAGG、AUCCAA、AUCCAU、AUCCCC、AUCCCG、AUCCGA、AUCCGC、AUCCGG、AUCCUA、AUCCUC、AUCCUG、AUCGAA、AUCGAC、AUCGAG、AUCGAU、AUCGCA、AUCGCC、AUCGCG、AUCGCU、AUCGGC、AUCGGG、AUCGGU、AUCGUC、AUCGUG、AUCGUU、AUCUAA、AUCUAC、AUCUAG、AUCUAU、AUCUCC、AUCUCG、AUCUGU、AUCUUG、AUCUUU、AUGAAA、AUGAAC、AUGAAG、AUGAAU、AUGACC、AUGACU、AUGAGG、AUGAGU、AUGAUA、AUGAUC、AUGAUU、AUGCAA、AUGCAG、AUGCCA、AUGCCC、AUGCCG、AUGCGA、AUGCGG、AUGCGU、AUGCUC、AUGCUU、AUGGAC、AUGGCC、AUGGGA、AUGGGC、AUGGGU、AUGGUC、AUGGUG、AUGUAC、AUGUAU、AUGUCA、AUGUCC、AUGUCG、AUGUGU、AUGUUA、AUGUUC、AUUAAA、AUUAAC、AUUAAG、AUUAAU、AUUACA、AUUACC、AUUACG、AUUACU、AUUAGA、AUUAGC、AUUAGG、AUUAGU、AUUAUA、AUUAUC、AUUAUG、AUUCAC、AUUCCA、AUUCCG、AUUCCU、AUUCGA、AUUCGC、AUUCGG、AUUCGU、AUUCUA、AUUCUC、AUUCUU、AUUGAA、AUUGAC、AUUGAU、AUUGCC、AUUGCG、AUUGCU、AUUGGA、AUUGGC、AUUGGG、AUUGGU、AUUGUA、AUUGUC、AUUGUG、AUUGUU、AUUUAA、AUUUAG、AUUUAU、AUUUCC、AUUUCG、AUUUCU、AUUUGA、AUUUGC、AUUUGU、AUUUUA、AUUUUC、AUUUUG、AUUUUU、CAAAAG、CAAACA、CAAACC、CAAACG、CAAACU、CAAAGA、CAAAGG、CAAAUA、CAAAUU、CAACAC、CAACAU、CAACCA、CAACCC、CAACCG、CAACGA、CAACGC、CAACGG、CAACGU、CAACUA、CAACUC、CA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CG、CUUGCU、CUUGGC、CUUGGU、CUUGUU、CUUUAC、CUUUAG、CUUUAU、CUUUCA、CUUUCG、CUUUCU、CUUUGA、CUUUGC、CUUUGU、CUUUUA、CUUUUC、CUUUUG、CUUUUU、GAAAAA、GAAAAG、GAAAAU、GAAACC、GAAACG、GAAAGA、GAAAGC、GAAAGU、GAAAUA、GAAAUC、GAAAUG、GAAAUU、GAACAA、GAACAC、GAACAG、GAACAU、GAACCA、GAACCC、GAACCG、GAACCU、GAACGA、GAACGC、GAACGG、GAACGU、GAACUA、GAACUG、GAACUU、GAAGAC、GAAGAG、GAAGCA、GAAGCG、GAAGCU、GAAGUC、GAAUAA、GAAUAC、GAAUAG、GAAUAU、GAAUCC、GAAUCG、GAAUCU、GAAUGA、GAAUGC、GAAUGU、GAAUUA、GAAUUC、GAAUUU、GACAAA、GACAAG、GACAAU、GACACC、GACAGA、GACAGG、GACAUA、GACAUG、GACAUU、GACCAA、GACCAC、GACCAG、GACCCA、GACCCC、GACCCG、GACCGC、GACCGG、GACCGU、GACCUA、GACCUC、GACCUU、GACGAA、GACGAC、GACGAG、GACGAU、GACGCA、GACGCC、GACGCG、GACGCU、GACGGA、GACGGC、GACGGG、GACGGU、GACGUA、GACGUC、GACGUG、GACGUU、GACUAA、GACUAC、GACUAG、GACUAU、GACUCA、GACUCC、GACUCG、GACUGG、GACUGU、GACUUA、GACUUG、GACUUU、GAGAAU、GAGAGA、GAGAGC、GAGAGG、GAGAUA、GAGAUC、GAGCAA、GAGCAU、GAGCCA、GAGCGA、GAGCGG、GAGCGU、GAGGGU、GAGGUC、GAGGUG、GAGUAA、GAGUAG、GAGUCC、GAGUUC、GAGUUU、GAUAAA、GAUAAC、GAUAAG、GAUAAU、GAUACA、GAUACC、GAUACG、GAUACU、GAUAGA、GAUAGC、GAUAGG、GAUAGU、GAUAUA、GAUCAA、GAUCAC、GAUCAU、GAUCCA、GAUCCC、GAUCCU、GAUCGC、GAUCGG、GAUCGU、GAUCUA、GAUCUG、GAUCUU、GAUGAA、GAUGAC、GAUGAG、GAUGCA、GAUGCC、GAUGCG、GAUGCU、GAUGGC、GAUGGG、GAUGGU、GAUGUG、GAUGUU、GAUUAA、GAUUAC、GAUUAG、GAUUAU、GAUUCA、GAUUCG、GAUUCU、GAUUGA、GAUUGC、GAUUUA、GAUUUC、GAUUUG、GAUUUU、GCAAAC、GCAAAG、GCAAAU、GCAACA、GCAACC、GCAAGC、GCAAGU、GCAAUA、GCAAUC、GCAAUG、GCAAUU、GCACAA、GCACAC、GCACAG、GCACCC、GCACCG、GCACCU、GCACGA、GCACGC、GCACGU、GCACUA、GCACUC、GCACUG、GCACUU、GCAGAU、GCAGCC、GCAGCG、GCAGGC、GCAGUA、GCAGUC、GCAGUG、GCAGUU、GCAUAA、GCAUAG、GCAUAU、GCAUCG、GCAUCU、GCAUGA、GCAUGC、GCAUGG、GCAUGU、GCAUUA、GCAUUC、GCAUUG、GCAUUU、GCCAAA、GCCAAC、GCCAAU、GCCACA、GCCACC、GCCACG、GCCAGA、GCCAGU、GCCAUA、GCCAUC、GCCAUG、GCCAUU、GCCCAA、GCCCAC、GCCCAG、GCCCCG、GCCCGA、GCCCGG、GCCCGU、GCCGAA、GCCGAC、GCCGAG、GCCGAU、GCCGCA、GCCGCU、GCCGGA、GCCGGC、GCCGGG、GCCGGU、GCCGUA、GCCGUC、GCCGUG、GCCGUU、GCCUAA、GCCUAU、GCCUCA、GCCUCC、GCCUCG、GCCUGA、GCCUUA、GCCUUU、GCGAAA、GCGAAC、GCGAAG、GCGAAU、GCGACC、GCGACG、GCGACU、GCGAGA、GCGAGC、GCGAGG、GCGAGU、GCGAUA、GCGAUC、GCGAUG、GCGAUU、GCGCAA、GCGCAC、GCGCAG、GCGCAU、GCGCCA、GCGCCC、GCGCCU、GCGCGA、GCGCGU、GCGCUA、GCGCUC、GCGCUG、GCGCUU、GCGGAA、GCGGAC、GCGGAU、GCGGCA、GCGGCC、GCGGCU、GCGGGA、GCGGUA、GCGGUC、GCGGUU、GCGUAA、GCGUAC、GCGUAG、GCGUAU、GCGUCA、GCGUCC、GCGUCG、GCGUCU、GCGUGA、GCGUGC、GCGUGG、GCGUGU、GCGUUA、GCGUUC、GCGUUG、GCGUUU、GCUAAA、GCUAAC、GCUAAG、GCUAAU、GCUACC、GCUACG、GCUACU、GCUAGA、GCUAGG、GCUAGU、GCUAUA、GCUAUC、GCUAUU、GCUCAA、GCUCAC、GCUCAG、GCUCAU、GCUCCA、GCUCCC、GCUCCG、GCUCGA、GCUCGC、GCUCGU、GCUCUA、GCUCUC、GCUCUU、GCUGAA、GCUGAC、GCUGAU、GCUGCA、GCUGCC、GCUGCG、GCUGCU、GCUGUG、GCUGUU、GCUUAC、GCUUAG、GCUUAU、GCUUCA、GCUUCG、GCUUGA、GCUUGG、GCUUGU、GCUUUA、GCUUUG、GGAAAG、GGAACA、GGAACC、GGAACG、GGAACU、GGAAGU、GGAAUA、GGAAUC、GGAAUU、GGACAA、GGACAC、GGACAG、GGACAU、GGACCG、GGACGA、GGACGC、GGACGU、GGACUA、GGACUC、GGACUU、GGAGAC、GGAGCA、GGAGCG、GGAGGG、GGAGUA、GGAUAA、GGAUAC、GGAUCA、GGAUCC、GGAUCG、GGAUCU、GGAUGC、GGAUUA、GGAUUG、GGCAAU、GGCACA、GGCACU、GGCAGA、GGCAUA、GGCAUC、GGCCAC、GGCCAG、GGCCCC、GGCCGA、GGCCGC、GGCCGU、GGCCUA、GGCCUG、GGCCUU、GGCGAA、GGCGAG、GGCGAU、GGCGCA、GGCGCU、GGCGGU、GGCGUA、GGCGUC、GGCGUG、GGCGUU、GGCUAA、GGCUAC、GGCUAG、GGCUAU、GGCUCC、GGCUCG、GGCUGA、GGCUUA、GGCUUC、GGCUUG、GGGAAU、GGGACA、GGGAGA、GGGAGU、GGGAUA、GGGAUU、GGGCAA、GGGCAC、GGGCAG、GGGCCG、GGGCGG、GGGGCC、GGGGGG、GGGGGU、GGGGUA、GGGUAC、GGGUAU、GGGUCA、GGGUCC、GGGUCG、GGGUGA、GGGUGC、GGGUUA、GGGUUG、GGUAAA、GGUAAC、GGUAAG、GGUAAU、GGUACA、GGUACC、GGUACG、GGUACU、GGUAGC、GGUAGG、GGUAGU、GGUAUA、GGUAUC、GGUAUG、GGUCAA、GGUCAC、GGUCAG、GGUCAU、GGUCCA、GGUCCG、GGUCCU、GGUCGA、GGUCGC、GGUCGG、GGUCGU、GGUCUC、GGUCUU、GGUGAA、GGUGAC、GGUGAU、GGUGCA、GGUGCC、GGUGGC、GGUGUA、GGUGUC、GGUUAA、GGUUAG、GGUUAU、GGUUCA、GGUUCC、GGUUCG、GGUUGC、GGUUUC、GGUUUU、GUAAAA、GUAAAG、GUAAAU、GUAACC、GUAACG、GUAACU、GUAAGA、GUAAGC、GUAAGG、GUAAGU、GUAAUA、GUAAUC、GUAAUG、GUAAUU、GUACAA、GUACAC、GUACAG、GUACAU、GUACCA、GUACCC、GUACCG、GUACCU、GUACGA、GUACGC、GUACGG、GUACGU、GUACUA、GUACUC、GUACUG、GUACUU、GUAGAA、GUAGAC、GUAGCA、GUAGCC、GUAGCG、GUAGCU、GUAGGA、GUAGGC、GUAGGG、GUAGGU、GUAGUA、GUAGUC、GUAUAA、GUAUAC、GUAUAG、GUAUAU、GUAUCA、GUAUCG、GUAUCU、GUAUGA、GUAUGC、GUAUGG、GUAUUA、GUAUUG、GUAUUU、GUCAAA、GUCAAG、GUCAAU、GUCACA、GUCACC、GUCACG、GUCAGA、GUCAGC、GUCAGG、GUCAUA、GUCAUC、GUCAUG、GUCCAA、GUCCAC、GUCCAU、GUCCCC、GUCCCU、GUCCGA、GUCCGC、GUCCGG、GUCCGU、GUCCUA、GUCCUG、GUCCUU、GUCGAA、GUCGAC、GUCGAG、GUCGAU、GUCGCA、GUCGCC、GUCGCG、GUCGCU、GUCGGA、GUCGGC、GUCGGG、GUCGGU、GUCGUA、GUCGUC、GUCGUU、GUCUAA、GUCUAG、GUCUCA、GUCUCC、GUCUCG、GUCUGA、GUCUGG、GUCUGU、GUCUUC、GUCUUU、GUGAAA、GUGAAC、GUGAAG、GUGACC、GUGACG、GUGAGA、GUGAGC、GUGAGU、GUGAUC、GUGAUG、GUGAUU、GUGCAC、GUGCAU、GUGCCC、GUGCCG、GUGCGA、GUGCGG、GUGCGU、GUGCUA、GUGCUC、GUGCUG、GUGGAG、GUGGCG、GUGGCU、GUGGGU、GUGGUC、GUGGUG、GUGUAA、GUGUAG、GUGUCG、GUGUGA、GUGUGC、GUGUGU、GUGUUG、GUGUUU、GUUAAA、GUUAAC、GUUAAG、GUUACA、GUUACC、GUUACG、GUUACU、GUUAGA、GUUAGC、GUUAGU、GUUAUA、GUUAUC、GUUAUG、GUUAUU、GUUCAA、GUUCAC、GUUCAG、GUUCCA、GUUCCG、GUUCGA、GUUCGC、GUUCGG、GUUCGU、GUUCUA、GUUCUG、GUUGAA、GUUGAC、GUUGAG、GUUGAU、GUUGCG、GUUGCU、GUUGGA、GUUGGC、GUUGGU、GUUGUC、GUUGUG、GUUGUU、GUUUAA、GUUUAC、GUUUAG、GUUUAU、GUUUCA、GUUUCC、GUUUCU、GUUUGA、GUUUGC、GUUUGG、GUUUGU、GUUUUA、GUUUUC、GUUUUU、UAAAAA、UAAAAC、UAAAAG、UAAAAU、UAAACA、UAAACC、UAAACG、UAAACU、UAAAGA、UAAAGG、UAAAGU、UAAAUA、UAAAUC、UAAAUG、UAAAUU、UAACAA、UAACAC、UAACAG、UAACCA、UAACCC、UAACCG、UAACCU、UAACGA、UAACGC、UAACGG、UAACGU、UAACUA、UAACUG、UAACUU、UAAGAG、UAAGAU、UAAGCA、UAAGCC、UAAGCG、UAAGCU、UAAGGA、UAAGGC、UAAGGG、UAAGGU、UAAGUA、UAAGUC、UAAGUG、UAAGUU、UAAUAA、UAAUCA、UAAUCC、UAAUCG、UAAUCU、UAAUGA、UAAUGG、UAAUGU、UAAUUA、UAAUUC、UAAUUG、UACAAC、UACAAG、UACAAU、UACACC、UACACG、UACACU、UACAGA、UACAGC、UACAUA、UACAUC、UACAUU、UACCAA、UACCAC、UACCAG、UACCAU、UACCCC、UACCCG、UACCCU、UACCGA、UACCGC、UACCGG、UACCGU、UACCUA、UACCUG、UACGAA、UACGAC、UACGAG、UACGAU、UACGCA、UACGCC、UACGCG、UACGCU、UACGGC、UACGGG、UACGGU、UACGUA、UACGUC、UACGUG、UACGUU、UACUAA、UACUAC、UACUAG、UACUAU、UACUCA、UACUCC、UACUCG、UACUCU、UACUGA、UACUGC、UACUGG、UACUUA、UACUUG、UACUUU、UAGAAA、UAGAAG、UAGAAU、UAGACA、UAGACG、UAGAGA、UAGAGC、UAGAGU、UAGAUA、UAGAUC、UAGAUG、UAGCAU、UAGCCC、UAGCCG、UAGCCU、UAGCGA、UAGCGC、UAGCGU、UAGCUA、UAGCUC、UAGCUG、UAGGAA、UAGGAU、UAGGCG、UAGGCU、UAGGGU、UAGGUC、UAGGUG、UAGGUU、UAGUAA、UAGUAC、UAGUAG、UAGUAU、UAGUCA、UAGUCG、UAGUGU、UAGUUA、UAGUUC、UAGUUG、UAGUUU、UAUAAC、UAUAAG、UAUACU、UAUAGA、UAUAGC、UAUAGG、UAUAGU、UAUAUA、UAUAUC、UAUAUG、UAUAUU、UAUCAA、UAUCAC、UAUCAU、UAUCCA、UAUCCC、UAUCCG、UAUCCU、UAUCGA、UAUCGC、UAUCGG、UAUCGU、UAUCUA、UAUCUC、UAUCUG、UAUCUU、UAUGAA、UAUGAC、UAUGAG、UAUGAU、UAUGCA、UAUGCG、UAUGCU、UAUGGA、UAUGGC、UAUGUC、UAUGUG、UAUGUU、UAUUAG、UAUUCA、UAUUCC、UAUUCG、UAUUCU、UAUUGA、UAUUGG、UAUUUA、UAUUUC、UAUUUG、UAUUUU、UCAAAA、UCAAAC、UCAAAG、UCAACC、UCAACU、UCAAGA、UCAAGC、UCAAUA、UCAAUC、UCAAUG、UCAAUU、UCACCC、UCACCG、UCACCU、UCACGA、UCACGC、UCACGG、UCACGU、UCACUA、UCACUC、UCACUU、UCAGAA、UCAGAC、UCAGAG、UCAGCG、UCAGCU、UCAGGA、UCAGGC、UCAGGU、UCAGUC、UCAGUU、UCAUAA、UCAUCA、UCAUCC、UCAUCG、UCAUGC、UCAUGG、UCAUGU、UCAUUA、UCAUUG、UCCAAA、UCCAAC、UCCAAG、UCCAAU、UCCACA、UCCACC、UCCACG、UCCAGC、UCCAGG、UCCAUA、UCCAUC、UCCAUU、UCCCAA、UCCCAG、UCCCAU、UCCCCC、UCCCCG、UCCCCU、UCCCGA、UCCCGC、UCCCGG、UCCCGU、UCCCUA、UCCCUC、UCCGAA、UCCGAC、UCCGAG、UCCGAU、UCCGCA、UCCGCC、UCCGGA、UCCGGC、UCCGGU、UCCGUA、UCCGUC、UCCGUG、UCCUAA、UCCUCA、UCCUCG、UCCUCU、UCCUGC、UCCUGU、UCCUUA、UCCUUC、UCCUUU、UCGAAA、UCGAAC、UCGAAG、UCGAAU、UCGACA、UCGACC、UCGACG、UCGACU、UCGAGA、UCGAGC、UCGAGG、UCGAUA、UCGAUC、UCGAUG、UCGAUU、UCGCAA、UCGCAC、UCGCAG、UCGCAU、UCGCCA、UCGCCC、UCGCCG、UCGCCU、UCGCGA、UCGCGC、UCGCGU、UCGCUA、UCGCUC、UCGGAA、UCGGAC、UCGGAG、UCGGAU、UCGGCA、UCGGCU、UCGGGG、UCGGGU、UCGGUC、UCGGUG、UCGGUU、UCGUAA、UCGUAC、UCGUAG、UCGUAU、UCGUCA、UCGUCC、UCGUCG、UCGUCU、UCGUGA、UCGUGU、UCGUUA、UCGUUC、UCGUUG、UCGUUU、UCUAAC、UCUAAG、UCUAAU、UCUACA、UCUACC、UCUACG、UCUACU、UCUAGC、UCUAGG、UCUAGU、UCUAUA、UCUAUC、UCUAUG、UCUAUU、UCUCAG、UCUCAU、UCUCCG、UCUCGC、UCUCGG、UCUCGU、UCUCUC、UCUGAA、UCUGAU、UCUGCA、UCUGCG、UCUGCU、UCUGGC、UCUGGU、UCUGUC、UCUGUG、UCUGUU、UCUUAA、UCUUAC、UCUUAG、UCUUAU、UCUUCA、UCUUCC、UCUUCG、UCUUCU、UCUUGC、UCUUGG、UCUUGU、UCUUUA、UCUUUC、UCUUUG、UCUUUU、UGAAAA、UGAAAC、UGAACA、UGAACC、UGAAGG、UGAAUC、UGAAUG、UGACAA、UGACAC、UGACAG、UGACCA、UGACCC、UGACCG、UGACGA、UGACGC、UGACGG、UGACGU、UGACUA、UGACUC、UGACUU、UGAGAG、UGAGAU、UGAGCA、UGAGCC、UGAGCU、UGAGGC、UGAGGU、UGAGUA、UGAGUU、UGAUAC、UGAUAG、UGAUAU、UGAUCA、UGAUCG、UGAUCU、UGAUGA、UGAUGC、UGAUGG、UGAUGU、UGAUUA、UGAUUC、UGAUUG、UGAUUU、UGCAAC、UGCAAG、UGCACA、UGCACG、UGCAGG、UGCAGU、UGCAUC、UGCCCA、UGCCCC、UGCCCG、UGCCGA、UGCCGC、UGCCGG、UGCCGU、UGCCUA、UGCCUC、UGCCUG、UGCCUU、UGCGAA、UGCGAC、UGCGAU、UGCGCC、UGCGCG、UGCGCU、UGCGGC、UGCGGG、UGCGGU、UGCGUA、UGCGUC、UGCGUG、UGCGUU、UGCUAC、UGCUAU、UGCUCC、UGCUCG、UGCUGC、UGCUGG、UGCUGU、UGCUUA、UGCUUU、UGGAAC、UGGAAG、UGGAGC、UGGAUC、UGGAUU、UGGCAA、UGGCAC、UGGCAG、UGGCCG、UGGCCU、UGGCGA、UGGCGC、UGGCGU、UGGCUA、UGGCUC、UGGCUU、UGGGAA、UGGGCA、UGGGCC、UGGGGC、UGGGUC、UGGUAA、UGGUAG、UGGUAU、UGGUCC、UGGUCG、UGGUCU、UGGUGA、UGGUGC、UGGUGG、UGGUGU、UGGUUA、UGGUUG、UGUAAA、UGUAAC、UGUAAG、UGUACC、UGUACG、UGUACU、UGUAGA、UGUAGC、UGUAGU、UGUAUC、UGUAUU、UGUCAA、UGUCAC、UGUCAG、UGUCAU、UGUCCA、UGUCCC、UGUCCG、UGUCGA、UGUCGC、UGUCGG、UGUCGU、UGUCUA、UGUCUC、UGUGAC、UGUGAG、UGUGAU、UGUGCA、UGUGGU、UGUGUA、UGUGUU、UGUUAC、UGUUAG、UGUUAU、UGUUCA、UGUUCC、UGUUCG、UGUUGG、UGUUGU、UGUUUA、UGUUUC、UGUUUG、UGUUUU、UUAAAA、UUAAAC、UUAAAG、UUAAAU、UUAACC、UUAACG、UUAACU、UUAAGU、UUAAUA、UUAAUC、UUAAUG、UUAAUU、UUACAA、UUACAC、UUACAG、UUACAU、UUACCA、UUACCC、UUACCG、UUACCU、UUACGA、UUACGC、UUACGG、UUACGU、UUACUA、UUACUC、UUACUG、UUACUU、UUAGAA、UUAGAC、UUAGCC、UUAGCG、UUAGCU、UUAGGC、UUAGGU、UUAGUA、UUAGUC、UUAGUU、UUAUAA、UUAUAC、UUAUAG、UUAUAU、UUAUCC、UUAUCG、UUAUCU、UUAUGA、UUAUGG、UUAUGU、UUAUUA、UUAUUC、UUAUUG、UUAUUU、UUCAAC、UUCAAU、UUCACA、UUCACC、UUCACG、UUCACU、UUCAGC、UUCAGG、UUCAGU、UUCAUA、UUCAUC、UUCAUG、UUCAUU、UUCCAA、UUCCCA、UUCCCG、UUCCGA、UUCCGU、UUCCUU、UUCGAA、UUCGAC、UUCGAG、UUCGAU、UUCGCA、UUCGCC、UUCGCG、UUCGCU、UUCGGA、UUCGGC、UUCGGG、UUCGGU、UUCGUA、UUCGUC、UUCGUG、UUCGUU、UUCUAC、UUCUAG、UUCUCA、UUCUCG、UUCUGG、UUCUUA、UUCUUU、UUGAAA、UUGAAC、UUGAAG、UUGAAU、UUGACC、UUGACG、UUGACU、UUGAGA、UUGAGC、UUGAGU、UUGAUA、UUGAUC、UUGAUG、UUGAUU、UUGCAA、UUGCAC、UUGCAG、UUGCAU、UUGCCC、UUGCCG、UUGCGA、UUGCGC、UUGCGG、UUGCGU、UUGCUA、UUGCUC、UUGCUG、UUGCUU、UUGGAA、UUGGAG、UUGGCC、UUGGCG、UUGGCU、UUGGGC、UUGGGU、UUGGUA、UUGGUG、UUGUAA、UUGUAC、UUGUCA、UUGUCG、UUGUCU、UUGUGC、UUGUGG、UUGUUA、UUGUUG、UUGUUU、UUUAAA、UUUAAC、UUUAAG、UUUAAU、UUUACA、UUUACC、UUUACG、UUUACU、UUUAGA、UUUAGC、UUUAGG、UUUAGU、UUUAUA、UUUAUC、UUUAUG、UUUAUU、UUUCAU、UUUCCA、UUUCCG、UUUCCU、UUUCGA、UUUCGC、UUUCGG、UUUCGU、UUUCUA、UUUCUC、UUUCUG、UUUCUU、UUUGAA、UUUGAC、UUUGAG、UUUGAU、UUUGCC、UUUGCU、UUUGGA、UUUGGC、UUUGGG、UUUGGU、UUUGUA、UUUGUC、UUUGUU、UUUUAA、UUUUAG、UUUUAU、UUUUCC、UUUUCG、UUUUCU、UUUUGA、UUUUGC、UUUUGG、UUUUGU、UUUUUA、UUUUUC、UUUUUU
表2:为测试制备的寡核苷酸序列
表3:寡核苷酸修饰
序列表简要说明
单链寡核苷酸(靶基因的反义链)
SeqID范围:30至8329,13088至13094
SeqIDs,没有G延伸:
30-142、156-560、575-780、794-912、926-1013、1027-1078、1092-1286、1300-1335、1349-1385、1399-1453、1460-1527、1548-1555、1571-1653、1675-1691、1706-1802、1816-1883、1897-2009、2023-2141、2165-2289、2303-2320、2334-2447、2461-2494、2508-2526、2540-2545、2571-2635、2651-2670、2689-2763、2772-2814、2828-2854、2868-3030、3044-3256、3270-3360、3374-3400、3414-3722、3737、3759-3783、3797-3970、3986-4059、4073-4153、4175-4240、4255-4415、4438-4441、4456-4472、4484-4505、4513-4516、4531-4546、4560-4650、4664-4751、4766-4918、4932-5035、5049-5064、5091-5189、5203-5448、5459-5503、5508-5520、5535-5654、5668-5863、5877-6016、6025-6029、6054-6063、6078-6215、6229-6701、6715-6729、6744-6869、6883-6945、6959-6968、6982-7085、7099-7173、7195-7247、7255-7268、7273-7309、7320-7335、7349-7442、7456-7465、7479-7727、7740-7951、7977-8208、8223-8255、8257-8296、8304-8312、8319-8329、13093-13094
SeqID,没有miR种子:
30-32、34-39、45-62、64-72、77-142、145-151、153、157-184、186-202、205-246、249、251-260、263、266-320、322、326-328、331、333-341、343-344、346-394、396-445、447-541、543-562、564-596、599-605、607-646、648-673、677-701、703-735、737-772、774-781、785、787-793、795-809、812、814-815、819-820、822-827、833-834、836、838-850、852-876、879、883-886、889-890、892、894、897、899、901-906、909、911、919、921-935、940、942-1012、1016-1063、1065-1067、1069-1095、1097-1147、1149-1166、1168-1190、1193-1214、1217、1227-1237、1240、1244、1246-1251、1258-1281、1283-1312、1314-1333、1335、1337-1356、1358-1364、1367、1369-1381、1384、1388-1389、1392-1404、1406-1417、1421-1441、1443、1445、1447-1460、1462-1492、1494-1500、1502、1506-1512、1514-1531、1533、1535-1539、1543-1558、1561-1562、1564-1601、1603-1614、1616-1633、1635-1646、1648-1656、1658、1661-1675、1678-1716、1718-1740、1742-1750、1752-1785、1788-1795、1798、1804-1871、1873-1884、1892-1973、1976-1992、1998-2032、2034-2053、2055-2077、2079-2116、2118-2135、2138、2142、2149、2151-2153、2155-2162、2165-2174、2178、2181-2254、2256-2268、2271-2293、2296-2298、2301-2312、2314-2323、2325-2427、2429-2438、2441、2445、2450-2476、2478-2489、2492-2494、2497-2513、2515、2521-2526、2529-2545、2547-2571、2573-2610、2613-2620、2622-2639、2641、2644、2651-2743、2745、2747-2755、2760-2775、2777-2825、2828-2841、2844-2861、2864-2888、2894-2954、2956-2988、2991-3006、3008-3043、3046、3048-3239、3241-3253、3256-3268、3270-3273、3276-3320、3322-3355、3357-3404、3406-3428、3430-3488、3490-3491、3493-3522、3524-3552、3554-3569、3571-3650、3653-3670、3672-3688、3690-3717、3719-3724、3727-3736、3743、3746、3749、3751-3821、3823-3842、3844、3846、3848、3851、3855、3858、3861-3863、3866-3881、3883、3887-3907、3909-3917、3919-3924、3926-3942、3944-3952、3956-3970、3976-3988、3991-3998、4001-4008、4010-4022、4026、4028-4039、4041-4048、4051-4059、4063-4070、4072-4073、4075、4078、4080-4104、4106-4124、4126、4129-4140、4143-4153、4156-4162、4166-4171、4174-4196、4201-4241、4244-4252、4254-4285、4289-4318、4320-4324、4327、4330-4331、4333-4335、4337-4351、4353-4414、4417、4419-4425、4427-4433、4435、4438-4446、4449-4450、4452-4462、4470-4472、4474-4510、4512-4517、4520-4546、4548、4551-4590、4592-4619、4623-4696、4699、4701、4703-4752、4755-4877、4879-4949、4951-5007、5010、5013-5046、5049-5059、5061-5063、5066、5069-5078、5080-5119、5121-5131、5134-5168、5171-5189、5191-5228、5230-5341、5343-5405、5407-5426、5429-5437、5439-5476、5478-5491、5494-5516、5518-5556、5558-5572、5574-5647、5649、5652-5653、5657-5729、5731-5742、5744-5769、5771-5780、5782-5866、5868、5870-5876、5879-5881、5884-5899、5902-5951、5954-5993、6000-6006、6009-6016、6019-6033、6035-6065、6067-6073、6080-6165、6168-6249、6252-6257、6261-6282、6284-6289、6291-6301、6305-6367、6369-6378、6380-6398、6401-6412、6415、6417-6447、6449-6456、6458-6500、6502-6563、6565-6589、6591-6612、6616-6660、6663-6702、6704-6748、6753、6758-6763、6765、6768-6807、6810、6812-6872、6874-6877、6879-6913、6915-6916、6919、6922、6924-6926、6928、6930-6936、6940-6959、6962、6964-6990、6992、6996、6998-6999、7004-7038、7042-7085、7087、7089、7092-7134、7136-7140、7142-7143、7146-7150、7152-7157、7159-7171、7175、7177-7178、7180-7196、7198-7220、7223、7231-7237、7239、7242-7246、7250-7273、7275-7308、7310-7312、7314-7317、7319-7330、7332-7400、7402-7437、7439、7441-7466、7470-7491、7493、7495、7497、7499、7502-7614、7622-7628、7631-7646、7649-7651、7655-7657、7661-7672、7676、7679-7721、7723-7800、7802-7803、7805-7906、7908、7910-7939、7943-7953、7956-7964、7966-7981、7983、7985-7999、8002、8004-8034、8036-8046、8048-8080、8084-8094、8096-8112、8114-8115、8117-8139、8141-8143、8146-8148、8150-8187、8190-8216、8218-8229、8232-8238、8240-8250、8253-8255、8257-8275、8278-8296、8299-8304、8306-8329、13093-13094
单链寡核苷酸(靶基因的有义链)
SeqID范围:1158-1159、1171、1482-1483、1485-1486、2465-2471、2488-2490、2542-2546、2656-2657、2833-2835、3439-3440、3916-3918、4469-4472、4821、5429、5537、6061、7327、8330-13061、13062-13087
SeqID,没有G延伸:
1158-1159、1171、1482-1483、1485-1486、2465-2471、2488-2490、2542-2545、2656-2657、2833-2835、3439-3440、3916-3918、4469-4472、4821、5429、5537、6061、7327、8330-8495、8520-8560、8574-8837、8857-8882、8907-8964、8978-9298、9312-9382、9394-9640、9656-9753、9767-9974、9988-10261、10275-10276、10290-10301、10315-10434、10448-10613、10623-10641、10644-10676、10678-10704、10714-10802、10822-11161、11175-11192、11207-11386、11400-11730、11744-11745、11759-11852、11857-11900、11914-11984、11999-12011、12026-12153、12163-12175、12178-12195、12198-12212、12216-12536、12547-12564、12575-12664、12674-12758、12772-12797、12800-12840、12854-13061、13062-13069
SeqID,没有miR种子:
1158-1159、1171、1482-1483、1485-1486、2465-2471、2488-2489、2542-2545、2656-2657、2833-2835、3439-3440、3916-3917、4470-4472、4821、5429、5537、6061、7327、8330-8334、8336-8345、8347、8351-8373、8375-8390、8392-8399、8401-8413、8415-8455、8457-8493、8495、8497-8502、8510-8517、8520、8525、8527-8634、8637-8653、8655-8671、8673-8718、8721-8822、8824-8825、8827-8842、8849-8879、8881-8892、8894-8902、8905-8906、8914-8927、8929、8931、8935、8937-8975、8980-8992、8994、8996-8997、8999-9001、9003、9005-9086、9089-9124、9126-9286、9288-9307、9310-9359、9362-9420、9425-9427、9429-9432、9434、9436-9437、9439-9461、9464-9483、9486、9488-9498、9500-9511、9513、9515-9650、9653-9667、9669、9671-9723、9725-9869、9871-9872、9874-9879、9881-9889、9891-9973、9975-10077、10080-10097、10099、10101-10127、10129-10166、10168-10170、10172-10184、10186-10230、10232-10237、10239-10260、10262-10272、10274-10342、10344-10400、10402-10423、10426-10441、10445-10556、10560、10562-10580、10582-10606、10609-10647、10650、10652-10704、10706、10710-10713、10716-10731、10733-10824、10826-10842、10844-10903、10906-10907、10909-11101、11104、11106-11134、11137-11138、11145-11161、11164-11173、11175-11181、11184、11186-11203、11207-11212、11214-11239、11243-11259、11261-11347、11351-11397、11399-11740、11742-11747、11749-11790、11792-11817、11821-11852、11854-11904、11908-11944、11946-11959、11961、11964-11984、11986-12007、12009-12022、12024-12092、12095-12119、12121-12133、12135-12144、12146-12157、12159-12225、12227-12231、12233-12300、12302-12329、12332-12333、12335-12382、12385-12411、12414-12416、12418-12444、12446-12455、12457-12461、12465、12468-12474、12476-12499、12501-12536、12538-12544、12547-12553、12559-12610、12612-12626、12628-12631、12633-12637、12640-12645、12648-12657、12659-12671、12673-12679、12683-12710、12712、12714-12747、12750、12752-12766、12769、12771-12806、12808-12826、12828-12829、12831、12833-12846、12848-12849、12854-12931、12933-12946、12948-13061、13064、13066-13068、13071-13072、13075、13077-13081、13083、13085、13087
实例2:使用靶向PRC2相互作用区的、上调SMN2的寡核苷酸和剪接转换寡核苷酸选择性上调含有外显子7的SMN2转录物
寡核苷酸设计:
设计靶向SMN1/2基因座内PRC2相互作用区(lncRNA峰)的寡核苷酸。这些寡核苷酸被合成具有如表4中概括的不同的DNA碱基修饰、修饰位置、核苷间键以及寡核苷酸间接头(寡核苷酸1至52和59至101)。
基于SMN2的序列来设计剪接转换寡核苷酸(SSO)。制备在长度和化学性质方面进行不同修饰的这类SSO(寡核苷酸53至58)。
还使用生物信息学分析设计通用阴性对照寡核苷酸(寡核苷酸232和293)。
方法:
细胞培养:
从柯瑞尔医学研究所获得六个SMA成纤维细胞细胞系和一个淋巴母细胞细胞系(图2)。使用脂质转染胺2000(成纤维细胞)或通过电穿孔法或无辅助递送(淋巴母细胞)用寡核苷酸转染细胞以便确定寡核苷酸对SMN1/2mRNA和蛋白表达的影响。在生物学上重复三次执行所有实验。
mRNA和蛋白表达:
mRNA表达-
1.在第1天,以5,000细胞/100uL的密度将SMA成纤维细胞接种到96孔板的每个孔中。
2.在第2天,按照制造商的说明书使用脂质转染胺2000用10nM或30nM的寡核苷酸进行转染。
3.在转染48小时后,按照制造商的说明书,Ambion Cells-to-CT试剂盒用于直接从细胞获得qRT-PCR结果。
4.在StepOne Plus上使用Taqman FAST qPCR来完成定量PCR评价,并且使用ΔΔCt方法通过将SMN表达相对于管家基因(B2M)归一化来量化mRNA表达的变化。
蛋白表达(ELISA)-
根据制造商的说明书(SMN ELISA试剂盒#ADI-900-209,恩佐生命科学)执行ELISA,以测定SMN蛋白。简单地说,SMN成纤维细胞在第1天以24孔组织培养物涂布的培养板上40,000细胞/孔进行培养。在第2天,使用脂质转染胺2000,用寡核苷酸转染细胞,并且在处理24小时和48小时后制备细胞溶解液。按照制造商的说明书执行ELISA。随后,通过将寡核苷酸诱导的SMN蛋白水平相对于脂质转染胺处理单独诱导的SMN蛋白水平归一化来确定SMN蛋白的诱导倍数。
剪接转换测定(DdeI测定)-
SMN2来源的转录物含有因SMN1中不存在的核苷酸多态性而诱导的独特的DdeI限制元件,并且因SMN2产物的较快迁移而不同于SMN1来源的转录物。简单地说,在存在或不存在如前文所述的SSO下,用靶向PRC2相互作用区的寡核苷酸处理SMA成纤维细胞,SSO与寡核苷酸各自为30nM。用SMN外显子5正向引物和外显子8反向引物执行RT-PCR以便生成cDNA,它之后用DdeI消化。SMN1转录物(在存在时)以比DdeI消化的SMN2转录物更低的速率迁移,并且视作是凝胶上部的第一条带。上部的第二条带指示全长SMN2(准确剪接形式)并且第三条带指示错误剪接的SMN2Δ7。(图5)
结果
在脊髓性肌萎缩患者中,SMN1基因经常发生突变,其方式使得无法正确地编码SMN蛋白,因为涵盖外显子7的至少一部分的缺失或其他突变。然而,SMA患者通常保留仍表达少量SMN蛋白的SMN2基因的至少一个拷贝(其中许多具有2个或更多个拷贝)。SMN2基因具有外显子7内的C至T突变(与SMN1相比较),该突变改变其前体mRNA的剪接以使得外显子7被以高频率剪切掉。因此,全长SMN蛋白的仅约10%的正常水平产生自SMN2。(参见图1)
从柯瑞尔医学研究所获得六个SMA成纤维细胞细胞系和一个淋巴母细胞细胞系(图2)。用针对SMN2的PRC2相关区的寡核苷酸(寡核苷酸1至52和59至101)转染细胞,并且实施RT-PCR测定以评价对SMN mRNA表达的影响。(参见图3和图4中细胞系3814和3813的结果)。在单独的实验中,用针对SMN2的内含子7内的剪接控制序列的寡核苷酸(寡核苷酸53至58)转染细胞,并且实施RT-PCR测定以评价对SMN mRNA表达的影响。(参见图3和图4中细胞系3814和3813的结果)。基于DdeI限制性消化之后获得的PCR产物的凝胶分离分析,发现剪接转换寡核苷酸(寡核苷酸53至58)提高全长SMN2的表达;而针对SMN2的PRC2相关区的某些寡核苷酸却并非如此。(图5)
实施SMN ELISA(恩佐)测定,并且测定揭示了在某些SMA患者成纤维细胞中转染24小时后,针对SMN2的PRC2相关区的某些寡核苷酸单独并未显著提高全长SMN蛋白。(图6)然而,相同的SMN ELISA测定显示出针对SMN2的PRC2相关区的寡核苷酸结合剪接转换寡核苷酸(寡核苷酸53或54)在SMA患者成纤维细胞中转染24小时之后显著提高了全长SMN蛋白,这要高于剪接转换寡核苷酸单独情况下观察到的。(图7和图8)。实施RT-PCR测定,并且测定显示出针对SMN2的PRC2相关区的寡核苷酸结合剪接转换寡核苷酸(寡核苷酸53或54)在SMA患者成纤维细胞中转染24小时之后显著提高了SMN2蛋白。(图9。)用交替的LNA和2’OMe核苷酸或交替的DNA和LNA核苷酸来实施这些修饰寡核苷酸的实验。
总而言之,实例2的结果显示出靶向SMN2的PRC2相关区的某些寡核苷酸在SMA患者来源的成纤维细胞中诱导(例如SMNΔ7转录物的)SMN RNA表达。结果还显示出在一些实施例中,剪接转换寡核苷酸可能不诱导SMN RNA表达,但会将SMN RNA剪接移动至全长转录物。最终,结果显示出剪接转换寡核苷酸结合靶向PRC2相关区的寡核苷酸显著提高了来自SMA患者的细胞内的全长SMN蛋白。
表4:
为测试从患有脊髓性肌萎缩的受试者获得的人细胞而制备的寡核苷酸序列(参见表3中格式化序列的结构特征)。
前述书面说明书被认为足以使本领域的技术人员能够实践本发明。本发明不限于所提供的实例的范围,因为实例意图作为本发明的一个方面的单一说明,并且其他功能上等效的实施例也属于本发明的范围。根据前述说明,除了那些在此显示并且描述的内容之外的本发明的不同修改对于本领域的技术人员将变得很清楚,并且属于随附权利要求书的范围。本发明的每个实施例不必涵盖本发明的优点和目的。
Claims (161)
1.一种具有序列5’-X-Y-Z的单链寡核苷酸,其中X为任何核苷酸,Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列,并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列,其中该单链寡核苷酸与SMN基因的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补。
2.如权利要求1所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸不包含三个或更多个连续乌苷核苷酸。
3.如权利要求1所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸不包含四个或更多个连续乌苷核苷酸。
4.如权利要求1至3中任一项所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。
5.如权利要求1至3中任一项所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸的长度为8至10个核苷酸,并且该PRC2相关区的该互补序列中除1、2或3个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶或乌苷核苷酸。
6.如权利要求1至5中任一项所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸的至少一个核苷酸为核苷酸类似物。
7.如权利要求7所述的单链寡核苷酸,其中与不具有该至少一个核苷酸类似物的一种寡核苷酸相比较,该至少一个核苷酸类似物导致该寡核苷酸的Tm在1℃至5℃的范围内的升高。
8.如权利要求1至7中任一项所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸的至少一个核苷酸包含2’O-甲基。
9.如权利要求1至9中任一项所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸的每个核苷酸包含2’O-甲基。
10.如权利要求1至9中任一项所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸或至少一个桥连核苷酸。
11.如权利要求10所述的单链寡核苷酸,其中该桥连核苷酸为LNA核苷酸、cEt核苷酸或ENA修饰的核苷酸。
12.如权利要求1至6中任一项所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸的每个核苷酸为LNA核苷酸。
13.如权利要求1至6中任一项所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸的这些核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸以及2’-氟-脱氧核糖核苷酸。
14.如权利要求1至6中任一项所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸的这些核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸以及2’-O-甲基核苷酸。
15.如权利要求1至6中任一项所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸的这些核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸以及ENA核苷酸类似物。
16.如权利要求1至6中任一项所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸的这些核苷酸包括交替的脱氧核糖核苷酸以及LNA核苷酸。
17.如权利要求13至16中任一项所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸的5’核苷酸为脱氧核糖核苷酸。
18.如权利要求1至6中任一项所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸的这些核苷酸包括交替的LNA核苷酸以及2’-O-甲基核苷酸。
19.如权利要求19所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸的该5’核苷酸为LNA核苷酸。
20.如权利要求1至8中任一项所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸的这些核苷酸包括通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的至少一个LNA核苷酸侧接的这些脱氧核糖核苷酸。
21.如权利要求1至20中任一项所述的单链寡核苷酸,进一步包含至少两个核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。
22.如权利要求21所述的单链寡核苷酸,进一步包含所有核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。
23.如权利要求1至22中任一项所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸的3’位置处的核苷酸具有3’羟基。
24.如权利要求1至22中任一项所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸的3’位置处的核苷酸具有3’硫代磷酸酯。
25.如权利要求1至24中任一项所述的单链寡核苷酸,进一步包含缀合至该5’核苷酸的生物素部分。
26.一种单链寡核苷酸,包含与SMN基因的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的互补区,其中该寡核苷酸具有以下各项中的至少一个:
a)为5’X-Y-Z的序列,其中X为任何核苷酸并且其中X锚定在该寡核苷酸的5’端上,Y为非为微小RNA的人种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列,并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列;
b)不包含三个或更多个连续乌苷核苷酸的序列;
c)与具有相等长度的核苷酸的每个序列具有阈值水平以下的序列一致性的序列,这些核苷酸处在脱靶基因的5’端上游的50千碱基与该脱靶基因的3’端下游的50千碱基之间;
d)与编码RNA的PRC2相关区互补的序列,该RNA形成包含至少两个单链环的二级结构;和/或
e)具有60%以上G-C含量的序列。
27.如权利要求26所述的单链寡核苷酸,其中该寡核苷酸具有该序列5’X-Y-Z并且其中该寡核苷酸的长度为8至50个核苷酸。
28.一种包含如权利要求1至27中任一项所述的单链寡核苷酸以及载体的组合物。
29.一种在缓冲溶液中的包含如权利要求1至27中任一项所述的单链寡核苷酸的组合物。
30.如权利要求29所述的组合物,其中该寡核苷酸缀合至该载体。
31.如权利要求30所述的组合物,其中该载体为肽。
32.如权利要求30所述的组合物,其中该载体为类固醇。
33.一种包含如权利要求28至32中任一项所述的组合物以及药学上可接受的载体的药物组合物。
34.一种包括容纳如权利要求28至33中任一项所述的组合物的容器的试剂盒。
35.一种提高细胞内SMN1或SMN2的表达的方法,该方法包括将如权利要求1至28中任一项所述的单链寡核苷酸递送到该细胞中。
36.如权利要求35所述的方法,其中将该单链寡核苷酸递送到该细胞中导致SMN1或SMN2的表达水平比不包含该单链寡核苷酸的对照细胞中的SMN1或SMN2的表达水平大至少50%。
37.一种提高受试者体内SMN1或SMN2的水平的方法,该方法包括向该受试者给予如权利要求1至27中任一项所述的单链寡核苷酸。
38.一种治疗与受试者体内SMN1或SMN2的降低的水平相关联的病症的方法,该方法包括向该受试者给予如权利要求1至27中任一项所述的单链寡核苷酸。
39.如权利要求38所述的方法,其中该病症为脊髓性肌萎缩。
40.一种提高细胞内SMN蛋白的表达的方法,该方法包括:
向该细胞递送与SMN2的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的第一单链寡核苷酸,以及与SMN2的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸,递送的量足以提高SMN2的包含外显子7的成熟的mRNA在该细胞内的表达。
41.如权利要求40所述的方法,其中该剪接控制序列驻留在SMN2的外显子中。
42.如权利要求41所述的方法,其中该外显子为外显子7或外显子8。
43.如权利要求40所述的方法,其中该剪接控制序列横跨SMN2的内含子-外显子接点。
44.如权利要求43所述的方法,其中该内含子-外显子接点为内含子6/外显子7接点或内含子7/外显子8接点。
45.如权利要求40所述的方法,其中该剪接控制序列驻留在SMN2的内含子中。
46.如权利要求45所述的方法,其中该内含子为内含子6或内含子7。
47.如权利要求40至46中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸具有序列5’X-Y-Z,其中X为任何核苷酸,Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列,并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列。
48.如权利要求40至47中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸不包含三个或更多个连续乌苷核苷酸。
49.如权利要求40至47中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸不包含四个或更多个连续乌苷核苷酸。
50.如权利要求40至49中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。
51.如权利要求40至50中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸的长度为8至10个核苷酸,并且该PRC2相关区的该互补序列中除1、2或3个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶或乌苷核苷酸。
52.如权利要求40至51中任一项所述的方法,其中同时向该细胞递送该第一单链寡核苷酸和该第二单链寡核苷酸。
53.如权利要求40至52中任一项所述的方法,其中该细胞处于受试者体内并且向该细胞递送的该步骤包括向该受试者给予作为共同配制品的该第一单链寡核苷酸和该第二单链寡核苷酸。
54.如权利要求40至53中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸通过接头共价连接至该第二单链寡核苷酸。
55.如权利要求54所述的方法,其中该接头包括寡核苷酸、肽、低pH不稳定键或二硫键。
56.如权利要求54或55所述的方法,其中该接头包括寡核苷酸,任选地,其中该寡核苷酸包含1至10个胸苷或尿苷。
57.如权利要求54至56中任一项所述的方法,其中该接头在哺乳动物提取物中比该第一单链寡核苷酸和该第二单链寡核苷酸更易于裂解。
58.如权利要求40至53中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸不共价连接至该第二单链寡核苷酸。
59.如权利要求40至51以及58中任一项所述的方法,其中分开向该细胞递送该第一单链寡核苷酸和该第二单链寡核苷酸。
60.如权利要求40至59中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的至少一个核苷酸为核苷酸类似物。
61.如权利要求60所述的方法,其中与不具有该至少一个核苷酸类似物的寡核苷酸相比较,该至少一个核苷酸类似物导致该寡核苷酸的Tm在1℃至5℃的范围内的升高。
62.如权利要求40至61中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的至少一个核苷酸包含2’O-甲基。
63.如权利要求40至62中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的每个核苷酸包含2’O-甲基。
64.如权利要求40至62中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸或至少一个桥连核苷酸。
65.如权利要求64所述的方法,其中该桥连核苷酸为LNA核苷酸、cEt核苷酸或ENA修饰的核苷酸。
66.如权利要求40至60中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的每个核苷酸为LNA核苷酸。
67.如权利要求40至60中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的这些核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸以及2’-氟-脱氧核糖核苷酸。
68.如权利要求40至60中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的这些核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸以及2’-O-甲基核苷酸。
69.如权利要求40至60中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的这些核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸以及ENA核苷酸类似物。
70.如权利要求40至60中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的这些核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸以及LNA核苷酸。
71.如权利要求67至70中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的5’核苷酸为脱氧核糖核苷酸。
72.如权利要求40至60中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的这些核苷酸包含交替的LNA核苷酸以及2’-O-甲基核苷酸。
73.如权利要求72所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的该5’核苷酸为LNA核苷酸。
74.如权利要求40至60中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的这些核苷酸包含通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的至少一个LNA核苷酸侧接的这些脱氧核糖核苷酸。
75.如权利要求40至74中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸进一步包含至少两个核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。
76.如权利要求75所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸进一步包含所有核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。
77.如权利要求40至76中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的3’位置处的核苷酸具有3’羟基。
78.如权利要求40至76中任一项所述的方法,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的3’位置处的核苷酸具有3’硫代磷酸酯。
79.如权利要求40至78中任一项所述的方法,生物素部分缀合至该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸的5’或3’核苷酸。
80.一种治疗受试者体内脊髓性肌萎缩的方法,该方法包括:
向该受试者给予与SMN2的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的第一单链寡核苷酸,以及与SMN2的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸,给予的量足以提高该受试者体内SMN蛋白的表达。
81.一种组合物,包含:
与SMN2的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的第一单链寡核苷酸,以及与SMN2的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸。
82.如权利要求81所述的组合物,其中该剪接控制序列驻留在SMN2的外显子中。
83.如权利要求82所述的组合物,其中该外显子为外显子7或外显子8。
84.如权利要求81所述的组合物,其中该剪接控制序列横跨SMN2的内含子-外显子接点。
85.如权利要求84所述的组合物,其中该内含子-外显子接点为内含子6/外显子7接点或内含子7/外显子8接点。
86.如权利要求81所述的组合物,其中该剪接控制序列驻留在SMN2的内含子中。
87.如权利要求86所述的组合物,其中该内含子为内含子6或内含子7。
88.如权利要求81至87中任一项所述的组合物,其中该剪接控制序列包括至少一个hnRNAP结合序列。
89.如权利要求81至88中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸具有序列5’X-Y-Z,其中X为任何核苷酸,Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列,并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列。
90.如权利要求81至89中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸不包含三个或更多个连续乌苷核苷酸。
91.如权利要求81至90中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸不包含四个或更多个连续乌苷核苷酸。
92.如权利要求81至91中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。
93.如权利要求81至92中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸的长度为8至10个核苷酸,并且该PRC2相关区的该互补序列中除1、2或3个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶或乌苷核苷酸。
94.如权利要求81至93中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸通过接头共价连接至该第二单链寡核苷酸。
95.如权利要求94所述的组合物,其中该接头包括寡核苷酸、肽、低pH不稳定键或二硫键。
96.如权利要求94或95所述的组合物,其中该接头包括寡核苷酸,任选地,其中该寡核苷酸包含1至10个胸苷或尿苷。
97.如权利要求94至96中任一项所述的组合物,其中该接头在哺乳动物提取物中比该第一单链寡核苷酸和该第二单链寡核苷酸更易于裂解。
98.如权利要求81至93中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸不共价连接至该第二单链寡核苷酸。
99.如权利要求81至98中任一项所述的组合物,进一步包含载体。
100.如权利要求99所述的组合物,其中该载体为药学上可接受的载体。
101.如权利要求81至100中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的至少一个核苷酸为核苷酸类似物。
102.如权利要求101所述的组合物,其中与不具有该至少一个核苷酸类似物的寡核苷酸相比较,该至少一个核苷酸类似物导致该寡核苷酸的Tm在1℃至5℃的范围内的升高。
103.如权利要求81至101中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的至少一个核苷酸包含2’O-甲基。
104.如权利要求81至103中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的每个核苷酸包含2’O-甲基。
105.如权利要求81至103中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸或至少一个桥连核苷酸。
106.如权利要求105所述的组合物,其中该桥连核苷酸为LNA核苷酸、cEt核苷酸或ENA修饰的核苷酸。
107.如权利要求81至101中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的每个核苷酸为LNA核苷酸。
108.如权利要求81至101中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的这些核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸以及2’-氟-脱氧核糖核苷酸。
109.如权利要求81至101中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的这些核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸以及2’-O-甲基核苷酸。
110.如权利要求81至101中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的这些核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸以及ENA核苷酸类似物。
111.如权利要求81至101中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的这些核苷酸包含交替的脱氧核糖核苷酸以及LNA核苷酸。
112.如权利要求108至111中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的5’核苷酸为脱氧核糖核苷酸。
113.如权利要求81至101中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的这些核苷酸包含交替的LNA核苷酸以及2’-O-甲基核苷酸。
114.如权利要求113所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的该5’核苷酸为LNA核苷酸。
115.如权利要求81至101中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的这些核苷酸包含通过脱氧核糖核苷酸的5’端和3’端中的每一个上的至少一个LNA核苷酸侧接的这些脱氧核糖核苷酸。
116.如权利要求81至115中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸进一步包含至少两个核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。
117.如权利要求115或116所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸进一步包含所有核苷酸之间的硫代磷酸酯核苷酸间键。
118.如权利要求81至117中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的3’位置处的核苷酸具有3’羟基。
119.如权利要求81至118中任一项所述的组合物,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的3’位置处的核苷酸具有3’硫代磷酸酯。
120.如权利要求81至119中任一项所述的组合物,进一步包含缀合至该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸的5’或3’核苷酸的生物素部分。
121.一种包括通式A-B-C的化合物,
其中A为与基因的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的单链寡核苷酸,B为接头,并且C为与该基因的前体mRNA的剪接控制序列互补的单链寡核苷酸。
122.如权利要求121所述的化合物,其中B包括寡核苷酸、肽、低pH不稳定键或二硫键。
123.如权利要求121或122所述的化合物,其中该剪接控制序列驻留在该基因的外显子中。
124.如权利要求121或122所述的化合物,其中该剪接控制序列横跨该基因的内含子-外显子接点。
125.如权利要求121或122所述的化合物,其中该剪接控制序列驻留在该基因的内含子中。
126.如权利要求121至125中任一项所述的化合物,其中该剪接控制序列包括至少一个hnRNAP结合序列。
127.如权利要求121至126中任一项所述的化合物,其中具有C的序列的寡核苷酸与该前体mRNA的该剪接控制序列在细胞内的杂交导致特定的外显子含入由该细胞内该前体mRNA的加工产生的成熟mRNA中。
128.如权利要求121至126中任一项所述的化合物,其中具有C的序列的寡核苷酸与该前体mRNA的该剪接控制序列在细胞内的杂交导致在由该细胞内该前体mRNA的加工产生的成熟mRNA中排除特定的内含子或外显子。
129.如权利要求121至128中任一项所述的化合物,其中该基因为SMN2。
130.如权利要求129所述的化合物,其中该剪接控制序列驻留在内含子6、内含子7、外显子7、外显子8内或内含子7与外显子8的接点处。
131.如权利要求121至130中任一项所述的化合物,其中A具有序列5’X-Y-Z,其中X为任何核苷酸,Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列,并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列。
132.如权利要求121至131中任一项所述的化合物,其中A不包含三个或更多个连续乌苷核苷酸。
133.如权利要求121至132中任一项所述的化合物,其中A不包含四个或更多个连续乌苷核苷酸。
134.如权利要求121至133中任一项所述的化合物,其中A的长度为8至30个核苷酸。
135.如权利要求121至134中任一项所述的化合物,其中A的长度为8至10个核苷酸,并且该PRC2相关区的该互补序列中除1、2或3个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶或乌苷核苷酸。
136.如权利要求121至135中任一项所述的化合物,其中该B为包含1至10个胸苷或尿苷的寡核苷酸。
137.如权利要求121至136中任一项所述的化合物,其中B在哺乳动物提取物中比A和C更易于裂解。
138.如权利要求121至137中任一项所述的化合物,其中该化合物的至少一个核苷酸为核苷酸类似物。
139.如权利要求121至138中任一项所述的化合物,其中该化合物的至少一个核苷酸包含2’O-甲基。
140.如权利要求121至139中任一项所述的化合物,其中该化合物的每个核苷酸包含2’O-甲基。
141.如权利要求121至140中任一项所述的化合物,其中该化合物包含至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸或至少一个桥连核苷酸。
142.如权利要求141所述的化合物,其中该桥连核苷酸为LNA核苷酸、cEt核苷酸或ENA修饰的核苷酸。
143.一种试剂盒,该试剂盒包括:
第一容器,该第一容器容纳与基因的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补的第一单链寡核苷酸;以及
第二容器,该第二容器容纳与该基因的前体mRNA的剪接控制序列互补的第二单链寡核苷酸。
144.如权利要求143所述的试剂盒,其中该剪接控制序列驻留在该基因的外显子中。
145.如权利要求143所述的试剂盒,其中该剪接控制序列横跨该基因的内含子-外显子接点。
146.如权利要求145所述的试剂盒,其中该剪接控制序列驻留在该基因的内含子中。
147.如权利要求143至146中任一项所述的试剂盒,其中该剪接控制序列包括至少hnRNAP结合序列。
148.如权利要求143至147中任一项所述的试剂盒,其中具有C的序列的寡核苷酸与该前体mRNA的该剪接控制序列在细胞内的杂交导致特定的外显子含入由该细胞内该前体mRNA的加工产生的成熟mRNA中。
149.如权利要求143至149中任一项所述的试剂盒,其中具有C的序列的寡核苷酸与该前体mRNA的该剪接控制序列在细胞内的杂交导致在由该细胞内该前体mRNA的加工产生的成熟mRNA中排除特定的内含子或外显子。
150.如权利要求143至149中任一项所述的试剂盒,其中该基因为SMN2。
151.如权利要求150所述的试剂盒,其中该剪接控制序列驻留在内含子6、内含子7、外显子7、外显子8内或内含子7与外显子8的接点处。
152.如权利要求143至151中任一项所述的试剂盒,其中该第一单链寡核苷酸具有序列5’X-Y-Z,其中X为任何核苷酸,Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列,并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列。
153.如权利要求143至152中任一项所述的试剂盒,其中该第一单链寡核苷酸不包含三个或更多个连续乌苷核苷酸。
154.如权利要求143至153中任一项所述的试剂盒,其中该第一单链寡核苷酸不包含四个或更多个连续乌苷核苷酸。
155.如权利要求143至154中任一项所述的试剂盒,其中该第一单链寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。
156.如权利要求143至155中任一项所述的试剂盒,其中该第一单链寡核苷酸的长度为8至10个核苷酸,并且该PRC2相关区的该互补序列中除1、2或3个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶或乌苷核苷酸。
157.如权利要求143至156中任一项所述的试剂盒,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的至少一个核苷酸为核苷酸类似物。
158.如权利要求143至157中任一项所述的试剂盒,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的至少一个核苷酸包含2’O-甲基。
159.如权利要求143至158中任一项所述的试剂盒,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸中的每个核苷酸包含2’O-甲基。
160.如权利要求143至159中任一项所述的试剂盒,其中该第一单链寡核苷酸或该第二单链寡核苷酸包含至少一个核糖核苷酸、至少一个脱氧核糖核苷酸或至少一个桥连核苷酸。
161.如权利要求160所述的试剂盒,其中该桥连核苷酸为LNA核苷酸、cEt核苷酸或ENA修饰的核苷酸。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021190226A1 (zh) * | 2020-03-24 | 2021-09-30 | 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 | 单碱基编辑介导的剪接修复在制备治疗脊髓性肌萎缩症中的应用 |
WO2023020421A1 (en) * | 2021-08-16 | 2023-02-23 | Hangzhou Jiayin Biotech Ltd. | Regulation of imprinting silenced genes by smn1 and snrpn expression and uses thereof |
Families Citing this family (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9920317B2 (en) | 2010-11-12 | 2018-03-20 | The General Hospital Corporation | Polycomb-associated non-coding RNAs |
WO2012065143A1 (en) | 2010-11-12 | 2012-05-18 | The General Hospital Corporation | Polycomb-associated non-coding rnas |
AP2014008100A0 (en) | 2012-05-16 | 2014-12-31 | Gen Hospital Corp | Compositions and methods for modulating hemoglobingene family expression |
US10837014B2 (en) | 2012-05-16 | 2020-11-17 | Translate Bio Ma, Inc. | Compositions and methods for modulating SMN gene family expression |
EA201492116A1 (ru) | 2012-05-16 | 2015-05-29 | Рана Терапьютикс, Инк. | Композиции и способы для модулирования экспрессии mecp2 |
AU2013262699A1 (en) | 2012-05-16 | 2015-01-22 | Rana Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating ATP2A2 expression |
AU2013262649A1 (en) | 2012-05-16 | 2015-01-22 | Rana Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating smn gene family expression |
SG11201407486PA (en) | 2012-05-16 | 2014-12-30 | Rana Therapeutics Inc | Compositions and methods for modulating utrn expression |
EP2983676B1 (en) | 2013-04-12 | 2019-03-20 | The Curators of the University of Missouri | Smn2 element 1 antisense compositions and methods and uses thereof |
WO2015051283A1 (en) | 2013-10-04 | 2015-04-09 | Rana Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis |
CN103911346B (zh) * | 2014-03-27 | 2016-09-07 | 江苏雄鸣医药科技有限公司 | 一种用于治疗脊髓性肌萎缩症药物筛选的细胞模型 |
WO2016070060A1 (en) | 2014-10-30 | 2016-05-06 | The General Hospital Corporation | Methods for modulating atrx-dependent gene repression |
EP3271460A4 (en) | 2015-03-17 | 2019-03-13 | The General Hospital Corporation | INTERACTOME RNA OF COMPLEX REPRESSIVE POLYCOMB 1 (PRC1) |
WO2016164896A2 (en) | 2015-04-10 | 2016-10-13 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of smn expression |
EP3286310A4 (en) | 2015-04-24 | 2019-01-09 | California Institute of Technology | REACTIVATION OF X-CHROMOSOME GENES |
US10905709B2 (en) | 2015-08-28 | 2021-02-02 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Modified antisense oligomers for exon inclusion in spinal muscular atrophy |
WO2017075030A1 (en) * | 2015-10-26 | 2017-05-04 | Rana Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for increasing smn expression |
EP3377073A4 (en) | 2015-11-16 | 2019-06-26 | Ohio State Innovation Foundation | METHOD AND COMPOSITIONS FOR TREATING DISORDERS AND DISEASES WITH THE SURVIVAL MOTOR NEURON (SMN) PROTEIN |
WO2017218884A1 (en) * | 2016-06-16 | 2017-12-21 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Combinations for the modulation of smn expression |
WO2018081661A1 (en) | 2016-10-27 | 2018-05-03 | California Institute Of Technology | Hdac inhibitor compositions for reactivation of the x chromosome |
AU2017353907B2 (en) | 2016-11-01 | 2023-11-30 | The Research Foundation For The State University Of New York | 5-halouracil-modified microRNAs and their use in the treatment of cancer |
JP2019535839A (ja) | 2016-11-29 | 2019-12-12 | ピュアテック ヘルス エルエルシー | 治療剤の送達のためのエクソソーム |
WO2018226788A1 (en) * | 2017-06-07 | 2018-12-13 | University Of Massachusetts | Anti-adam33 oligonucleotides and related methods |
EP3679140B1 (en) | 2017-09-08 | 2022-11-16 | MiNA Therapeutics Limited | Stabilized cebpa sarna compositions and methods of use |
AU2018330495A1 (en) | 2017-09-08 | 2020-03-26 | Mina Therapeutics Limited | Stabilized hnf4a sarna compositions and methods of use |
US11596646B2 (en) * | 2017-10-12 | 2023-03-07 | Wave Life Sciences Ltd. | Oligonucleotide compositions and methods thereof |
US20220000123A1 (en) | 2018-09-26 | 2022-01-06 | Greenlight Biosciences, Inc. | Control of coleopteran insects |
WO2020097414A1 (en) | 2018-11-08 | 2020-05-14 | Greenlight Biosciences, Inc. | Control of insect infestation |
EP3908671A4 (en) * | 2019-01-09 | 2022-10-05 | Coyote Bioscience USA Inc. | METHODS AND SYSTEMS FOR IDENTIFYING SPINAL MUSD ATROPHY |
EP4013387A4 (en) * | 2019-08-15 | 2023-09-27 | Biogen MA Inc. | COMBINATION THERAPY FOR SPINAL MUSCLE ATROPHY |
CA3151996A1 (en) | 2019-08-19 | 2021-02-25 | Mina Therapeutics Limited | Oligonucleotide conjugate compositions and methods of use |
KR20220148230A (ko) | 2020-02-28 | 2022-11-04 | 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 | Smn2를 조절하기 위한 화합물 및 방법 |
US20240141384A1 (en) * | 2021-02-19 | 2024-05-02 | University Of Florida Research Foundation, Incoporated | Methods and compositions to confer regulation to gene therapy cargoes by heterologous use of alternative splicing cassettes |
CA3230274A1 (en) * | 2021-09-03 | 2023-03-09 | Alfica Sehgal | Modulation of gene transcription using antisense oligonucleotides targeting regulatory rnas |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0999270A1 (en) * | 1998-10-09 | 2000-05-10 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Method of regulating SMN gene expression |
WO2011032109A1 (en) * | 2009-09-11 | 2011-03-17 | Sma Foundation | Biomarkers for spinal muscular atrophy |
US20110086833A1 (en) * | 2008-05-27 | 2011-04-14 | Paushkin Sergey V | Methods for treating spinal muscular atrophy |
Family Cites Families (397)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3687808A (en) | 1969-08-14 | 1972-08-29 | Univ Leland Stanford Junior | Synthetic polynucleotides |
US4469863A (en) | 1980-11-12 | 1984-09-04 | Ts O Paul O P | Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof |
US5023243A (en) | 1981-10-23 | 1991-06-11 | Molecular Biosystems, Inc. | Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same |
JP2547714B2 (ja) | 1981-10-23 | 1996-10-23 | モルキユラ− バイオシステムズ インコ−ポレテツド | オリゴヌクレオチド治療剤及びその製法 |
US4476301A (en) | 1982-04-29 | 1984-10-09 | Centre National De La Recherche Scientifique | Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon |
JPS5927900A (ja) | 1982-08-09 | 1984-02-14 | Wakunaga Seiyaku Kk | 固定化オリゴヌクレオチド |
FR2540122B1 (fr) | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
US4605735A (en) | 1983-02-14 | 1986-08-12 | Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha | Oligonucleotide derivatives |
US4948882A (en) | 1983-02-22 | 1990-08-14 | Syngene, Inc. | Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis |
US4824941A (en) | 1983-03-10 | 1989-04-25 | Julian Gordon | Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems |
DE3329892A1 (de) | 1983-08-18 | 1985-03-07 | Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg | Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden |
US4587044A (en) | 1983-09-01 | 1986-05-06 | The Johns Hopkins University | Linkage of proteins to nucleic acids |
US5118802A (en) | 1983-12-20 | 1992-06-02 | California Institute Of Technology | DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside |
US5550111A (en) | 1984-07-11 | 1996-08-27 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof |
US5367066A (en) | 1984-10-16 | 1994-11-22 | Chiron Corporation | Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites |
US5430136A (en) | 1984-10-16 | 1995-07-04 | Chiron Corporation | Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites |
US5258506A (en) | 1984-10-16 | 1993-11-02 | Chiron Corporation | Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains |
US4828979A (en) | 1984-11-08 | 1989-05-09 | Life Technologies, Inc. | Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection |
FR2575751B1 (fr) | 1985-01-08 | 1987-04-03 | Pasteur Institut | Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques |
US5405938A (en) | 1989-12-20 | 1995-04-11 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
US5166315A (en) | 1989-12-20 | 1992-11-24 | Anti-Gene Development Group | Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids |
US5235033A (en) | 1985-03-15 | 1993-08-10 | Anti-Gene Development Group | Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof |
US5185444A (en) | 1985-03-15 | 1993-02-09 | Anti-Gene Deveopment Group | Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages |
US4762779A (en) | 1985-06-13 | 1988-08-09 | Amgen Inc. | Compositions and methods for functionalizing nucleic acids |
US5317098A (en) | 1986-03-17 | 1994-05-31 | Hiroaki Shizuya | Non-radioisotope tagging of fragments |
JPS638396A (ja) | 1986-06-30 | 1988-01-14 | Wakunaga Pharmaceut Co Ltd | ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体 |
DE3788914T2 (de) | 1986-09-08 | 1994-08-25 | Ajinomoto Kk | Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere. |
US5264423A (en) | 1987-03-25 | 1993-11-23 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
US5276019A (en) | 1987-03-25 | 1994-01-04 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products |
US4904582A (en) | 1987-06-11 | 1990-02-27 | Synthetic Genetics | Novel amphiphilic nucleic acid conjugates |
CA1340032C (en) | 1987-06-24 | 1998-09-08 | Jim Haralambidis | Lucleoside derivatives |
US5585481A (en) | 1987-09-21 | 1996-12-17 | Gen-Probe Incorporated | Linking reagents for nucleotide probes |
US4924624A (en) | 1987-10-22 | 1990-05-15 | Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education | 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof |
US5188897A (en) | 1987-10-22 | 1993-02-23 | Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education | Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates |
US5525465A (en) | 1987-10-28 | 1996-06-11 | Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine | Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same |
DE3738460A1 (de) | 1987-11-12 | 1989-05-24 | Max Planck Gesellschaft | Modifizierte oligonukleotide |
US5403711A (en) | 1987-11-30 | 1995-04-04 | University Of Iowa Research Foundation | Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved |
ATE151467T1 (de) | 1987-11-30 | 1997-04-15 | Univ Iowa Res Found | Durch modifikationen an der 3'-terminalen phosphodiesterbindung stabilisierte dna moleküle, ihre verwendung als nukleinsäuresonden sowie als therapeutische mittel zur hemmung der expression spezifischer zielgene |
US5082830A (en) | 1988-02-26 | 1992-01-21 | Enzo Biochem, Inc. | End labeled nucleotide probe |
JPH03503894A (ja) | 1988-03-25 | 1991-08-29 | ユニバーシィティ オブ バージニア アランミ パテンツ ファウンデイション | オリゴヌクレオチド n‐アルキルホスホラミデート |
US5278302A (en) | 1988-05-26 | 1994-01-11 | University Patents, Inc. | Polynucleotide phosphorodithioates |
US5109124A (en) | 1988-06-01 | 1992-04-28 | Biogen, Inc. | Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine |
US5216141A (en) | 1988-06-06 | 1993-06-01 | Benner Steven A | Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages |
US5175273A (en) | 1988-07-01 | 1992-12-29 | Genentech, Inc. | Nucleic acid intercalating agents |
US5262536A (en) | 1988-09-15 | 1993-11-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides |
US5512439A (en) | 1988-11-21 | 1996-04-30 | Dynal As | Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof |
US5599923A (en) | 1989-03-06 | 1997-02-04 | Board Of Regents, University Of Tx | Texaphyrin metal complexes having improved functionalization |
US5457183A (en) | 1989-03-06 | 1995-10-10 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Hydroxylated texaphyrins |
US5391723A (en) | 1989-05-31 | 1995-02-21 | Neorx Corporation | Oligonucleotide conjugates |
US5256775A (en) | 1989-06-05 | 1993-10-26 | Gilead Sciences, Inc. | Exonuclease-resistant oligonucleotides |
US4958013A (en) | 1989-06-06 | 1990-09-18 | Northwestern University | Cholesteryl modified oligonucleotides |
US5451463A (en) | 1989-08-28 | 1995-09-19 | Clontech Laboratories, Inc. | Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides |
US5134066A (en) | 1989-08-29 | 1992-07-28 | Monsanto Company | Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs |
US5254469A (en) | 1989-09-12 | 1993-10-19 | Eastman Kodak Company | Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures |
US5399676A (en) | 1989-10-23 | 1995-03-21 | Gilead Sciences | Oligonucleotides with inverted polarity |
US5264564A (en) | 1989-10-24 | 1993-11-23 | Gilead Sciences | Oligonucleotide analogs with novel linkages |
US5264562A (en) | 1989-10-24 | 1993-11-23 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide analogs with novel linkages |
US5292873A (en) | 1989-11-29 | 1994-03-08 | The Research Foundation Of State University Of New York | Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe |
US5177198A (en) | 1989-11-30 | 1993-01-05 | University Of N.C. At Chapel Hill | Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates |
US5130302A (en) | 1989-12-20 | 1992-07-14 | Boron Bilogicals, Inc. | Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same |
US5486603A (en) | 1990-01-08 | 1996-01-23 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide having enhanced binding affinity |
US5623065A (en) | 1990-08-13 | 1997-04-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped 2' modified oligonucleotides |
US5459255A (en) | 1990-01-11 | 1995-10-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | N-2 substituted purines |
US5587470A (en) | 1990-01-11 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 3-deazapurines |
US5587361A (en) | 1991-10-15 | 1996-12-24 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
US5914396A (en) | 1990-01-11 | 1999-06-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-O-modified nucleosides and phosphoramidites |
US6005087A (en) | 1995-06-06 | 1999-12-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-modified oligonucleotides |
US5578718A (en) | 1990-01-11 | 1996-11-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Thiol-derivatized nucleosides |
US6395492B1 (en) | 1990-01-11 | 2002-05-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties |
US6753423B1 (en) | 1990-01-11 | 2004-06-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for enhanced biostability and altered biodistribution of oligonucleotides in mammals |
US5681941A (en) | 1990-01-11 | 1997-10-28 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Substituted purines and oligonucleotide cross-linking |
US5149797A (en) | 1990-02-15 | 1992-09-22 | The Worcester Foundation For Experimental Biology | Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides |
US5220007A (en) | 1990-02-15 | 1993-06-15 | The Worcester Foundation For Experimental Biology | Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides |
US5214136A (en) | 1990-02-20 | 1993-05-25 | Gilead Sciences, Inc. | Anthraquinone-derivatives oligonucleotides |
WO1991013080A1 (en) | 1990-02-20 | 1991-09-05 | Gilead Sciences, Inc. | Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers |
US5321131A (en) | 1990-03-08 | 1994-06-14 | Hybridon, Inc. | Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling |
US5470967A (en) | 1990-04-10 | 1995-11-28 | The Dupont Merck Pharmaceutical Company | Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages |
EP0745689A3 (en) | 1990-05-11 | 1996-12-11 | Microprobe Corporation | A dipstick for a nucleic acid hybridization assay |
WO1992000386A1 (en) | 1990-06-27 | 1992-01-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Methods for detecting spinal muscular atrophy type i and types ii/iii and marker therefor |
US5541307A (en) | 1990-07-27 | 1996-07-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof |
US5608046A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds |
EP0544824B1 (en) | 1990-07-27 | 1997-06-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression |
US5623070A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5138045A (en) | 1990-07-27 | 1992-08-11 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5602240A (en) | 1990-07-27 | 1997-02-11 | Ciba Geigy Ag. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
US5218105A (en) | 1990-07-27 | 1993-06-08 | Isis Pharmaceuticals | Polyamine conjugated oligonucleotides |
US5677437A (en) | 1990-07-27 | 1997-10-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Heteroatomic oligonucleoside linkages |
US5610289A (en) | 1990-07-27 | 1997-03-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogues |
US5618704A (en) | 1990-07-27 | 1997-04-08 | Isis Pharmacueticals, Inc. | Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling |
US5688941A (en) | 1990-07-27 | 1997-11-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds |
US5489677A (en) | 1990-07-27 | 1996-02-06 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms |
US5245022A (en) | 1990-08-03 | 1993-09-14 | Sterling Drug, Inc. | Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides |
CA2088673A1 (en) | 1990-08-03 | 1992-02-04 | Alexander L. Weis | Compounds and methods for inhibiting gene expression |
US5177196A (en) | 1990-08-16 | 1993-01-05 | Microprobe Corporation | Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof |
US5512667A (en) | 1990-08-28 | 1996-04-30 | Reed; Michael W. | Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides |
US5214134A (en) | 1990-09-12 | 1993-05-25 | Sterling Winthrop Inc. | Process of linking nucleosides with a siloxane bridge |
US5561225A (en) | 1990-09-19 | 1996-10-01 | Southern Research Institute | Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages |
AU662298B2 (en) | 1990-09-20 | 1995-08-31 | Gilead Sciences, Inc. | Modified internucleoside linkages |
US5432272A (en) | 1990-10-09 | 1995-07-11 | Benner; Steven A. | Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases |
EP0556301B1 (en) | 1990-11-08 | 2001-01-10 | Hybridon, Inc. | Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides |
JP3514779B2 (ja) | 1991-04-17 | 2004-03-31 | 株式会社アズウェル | アポリポプロテインe遺伝子タイプの検査方法及びその検査に好適なプライマー及びプローブ |
WO1994008003A1 (en) | 1991-06-14 | 1994-04-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE INHIBITION OF THE ras GENE |
US5965722A (en) | 1991-05-21 | 1999-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides |
US7015315B1 (en) | 1991-12-24 | 2006-03-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped oligonucleotides |
US5539082A (en) | 1993-04-26 | 1996-07-23 | Nielsen; Peter E. | Peptide nucleic acids |
US5719262A (en) | 1993-11-22 | 1998-02-17 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having amino acid side chains |
US5714331A (en) | 1991-05-24 | 1998-02-03 | Buchardt, Deceased; Ole | Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility |
US5371241A (en) | 1991-07-19 | 1994-12-06 | Pharmacia P-L Biochemicals Inc. | Fluorescein labelled phosphoramidites |
US5571799A (en) | 1991-08-12 | 1996-11-05 | Basco, Ltd. | (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response |
US5661134A (en) | 1991-10-15 | 1997-08-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides for modulating Ha-ras or Ki-ras having phosphorothioate linkages of high chiral purity |
US6831166B2 (en) | 1992-10-23 | 2004-12-14 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties |
US8153602B1 (en) | 1991-11-19 | 2012-04-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Composition and methods for the pulmonary delivery of nucleic acids |
US5484908A (en) | 1991-11-26 | 1996-01-16 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines |
US5700922A (en) | 1991-12-24 | 1997-12-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules |
US20060270624A1 (en) | 1991-12-24 | 2006-11-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped 2' modified oligonucleotides |
EP0618925B2 (en) | 1991-12-24 | 2012-04-18 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides |
US5565552A (en) | 1992-01-21 | 1996-10-15 | Pharmacyclics, Inc. | Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis |
US5595726A (en) | 1992-01-21 | 1997-01-21 | Pharmacyclics, Inc. | Chromophore probe for detection of nucleic acid |
US5633360A (en) | 1992-04-14 | 1997-05-27 | Gilead Sciences, Inc. | Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation |
US5434257A (en) | 1992-06-01 | 1995-07-18 | Gilead Sciences, Inc. | Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages |
US5272250A (en) | 1992-07-10 | 1993-12-21 | Spielvogel Bernard F | Boronated phosphoramidate compounds |
TW244371B (zh) | 1992-07-23 | 1995-04-01 | Tri Clover Inc | |
US5652355A (en) | 1992-07-23 | 1997-07-29 | Worcester Foundation For Experimental Biology | Hybrid oligonucleotide phosphorothioates |
US6346614B1 (en) | 1992-07-23 | 2002-02-12 | Hybridon, Inc. | Hybrid oligonucleotide phosphorothioates |
ATE162198T1 (de) | 1992-07-27 | 1998-01-15 | Hybridon Inc | Oligonukleotid alkylphosphonothiate |
US5574142A (en) | 1992-12-15 | 1996-11-12 | Microprobe Corporation | Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery |
NZ262254A (en) | 1993-01-25 | 1997-10-24 | Hybridon Inc | Oligonucleotide analogue containing a ribonucleotide alkylphosphon(ate or thioate), gene repression |
US5476925A (en) | 1993-02-01 | 1995-12-19 | Northwestern University | Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups |
GB9304618D0 (en) | 1993-03-06 | 1993-04-21 | Ciba Geigy Ag | Chemical compounds |
AU6412794A (en) | 1993-03-31 | 1994-10-24 | Sterling Winthrop Inc. | Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages |
NZ266386A (en) | 1993-05-11 | 1997-11-24 | Univ North Carolina | Use of antisense rna oligonucleotides in regulating gene expression |
US5502177A (en) | 1993-09-17 | 1996-03-26 | Gilead Sciences, Inc. | Pyrimidine derivatives for labeled binding partners |
US5457187A (en) | 1993-12-08 | 1995-10-10 | Board Of Regents University Of Nebraska | Oligonucleotides containing 5-fluorouracil |
ATE196311T1 (de) | 1993-12-09 | 2000-09-15 | Univ Jefferson | Verbindungen und verfahren zur ortsspezifischen mutation in eukaryotischen zellen |
US5596091A (en) | 1994-03-18 | 1997-01-21 | The Regents Of The University Of California | Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides |
US5625050A (en) | 1994-03-31 | 1997-04-29 | Amgen Inc. | Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics |
US5525711A (en) | 1994-05-18 | 1996-06-11 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes |
FR2720757B1 (fr) | 1994-06-03 | 1996-08-02 | Inst Nat Sante Rech Med | Procédé et sondes pour la détection de marqueurs liés au locus des amyotrophies spinales infantiles. |
US5597696A (en) | 1994-07-18 | 1997-01-28 | Becton Dickinson And Company | Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates |
US5580731A (en) | 1994-08-25 | 1996-12-03 | Chiron Corporation | N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith |
EP0708178A1 (en) | 1994-10-19 | 1996-04-24 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Survival motor neuron (SMN) gene: a gene for spinal muscular atrophy |
US6608035B1 (en) | 1994-10-25 | 2003-08-19 | Hybridon, Inc. | Method of down-regulating gene expression |
US5652356A (en) | 1995-08-17 | 1997-07-29 | Hybridon, Inc. | Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides |
US8217015B2 (en) | 2003-04-04 | 2012-07-10 | Arrowhead Madison Inc. | Endosomolytic polymers |
EP0882061B1 (en) | 1996-02-14 | 2004-05-19 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Sugar-modified gapped oligonucleotides |
US6015710A (en) | 1996-04-09 | 2000-01-18 | The University Of Texas System | Modulation of mammalian telomerase by peptide nucleic acids |
US5898031A (en) | 1996-06-06 | 1999-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides for cleaving RNA |
US5912332A (en) | 1996-07-26 | 1999-06-15 | Hybridon, Inc. | Affinity-based purification of oligonucleotides using soluble multimeric oligonucleotides |
EP1005327A1 (en) | 1997-07-02 | 2000-06-07 | Sdg, Inc. | Targeted liposomal constructs for diagnostic and therapeutic uses |
JPH1133863A (ja) | 1997-07-23 | 1999-02-09 | Howa Mach Ltd | 工具交換装置及び工具交換用の押出し装置 |
US6794499B2 (en) * | 1997-09-12 | 2004-09-21 | Exiqon A/S | Oligonucleotide analogues |
US7572582B2 (en) | 1997-09-12 | 2009-08-11 | Exiqon A/S | Oligonucleotide analogues |
US7715989B2 (en) | 1998-04-03 | 2010-05-11 | Elitech Holding B.V. | Systems and methods for predicting oligonucleotide melting temperature (TmS) |
WO1999067378A1 (en) | 1998-06-19 | 1999-12-29 | Mcgill University | ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE CONSTRUCTS BASED ON β-ARABINOFURANOSE AND ITS ANALOGUES |
US6503754B1 (en) | 2000-09-07 | 2003-01-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of BH3 interacting domain death agonist expression |
US6646113B1 (en) * | 1998-09-17 | 2003-11-11 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Nucleic acid molecule encoding human survival of motor neuron-interacting protein 1 (SIP1) deletion mutants |
US6210892B1 (en) | 1998-10-07 | 2001-04-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing |
US6465628B1 (en) | 1999-02-04 | 2002-10-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Process for the synthesis of oligomeric compounds |
EP1152009B2 (en) | 1999-02-12 | 2017-09-06 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Novel nucleosides and oligonucleotide analogues |
US9029523B2 (en) | 2000-04-26 | 2015-05-12 | Ceres, Inc. | Promoter, promoter control elements, and combinations, and uses thereof |
US20080281041A1 (en) | 1999-06-07 | 2008-11-13 | Rozema David B | Reversibly Masked Polymers |
US20040002153A1 (en) | 1999-07-21 | 2004-01-01 | Monia Brett P. | Modulation of PTEN expression via oligomeric compounds |
US6284538B1 (en) | 1999-07-21 | 2001-09-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of PTEN expression |
AU6492400A (en) | 1999-07-22 | 2001-02-13 | Genaissance Pharmaceuticals, Inc. | Drug target isogenes: polymorphisms in the prostaglandin-endoperoxide synthase 2gene |
US6677445B1 (en) | 1999-08-27 | 2004-01-13 | Chiron Corporation | Chimeric antisense oligonucleotides and cell transfecting formulations thereof |
IL132972A0 (en) | 1999-11-16 | 2001-03-19 | Yissum Res Dev Co | Pharmaceutical compositions comprising acetylcholinesterase antisense deoxynucleotides for the treatment of muscular and neuromuscular disorders |
US6187545B1 (en) * | 2000-01-19 | 2001-02-13 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense modulation of pepck-cytosolic expression |
US6287860B1 (en) | 2000-01-20 | 2001-09-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of MEKK2 expression |
EP1133993A1 (en) | 2000-03-10 | 2001-09-19 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Substances for the treatment of spinal muscular atrophy |
AP2002002638A0 (en) | 2000-03-27 | 2002-09-30 | Univ Delaware | Targeted chromosomal genomic alternations with modified single stranded oligonucleotides. |
CA2400573A1 (en) | 2000-03-28 | 2001-10-04 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mrna processing |
WO2001077384A2 (de) | 2000-04-07 | 2001-10-18 | Epigenomics Ag | DETEKTION VON SNPs UND CYTOSIN-METHYLIERUNGEN |
KR20020097241A (ko) | 2000-05-04 | 2002-12-31 | 에이브이아이 바이오파마 인코포레이티드 | 스플라이스-영역 안티센스 조성물 및 방법 |
US6777439B2 (en) | 2000-05-30 | 2004-08-17 | Advanced Research & Technology Institute, Inc. | Compositions and methods for identifying agents which modulate PTEN function and PI-3 kinase pathways |
US6727355B2 (en) | 2000-08-25 | 2004-04-27 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Pharmaceutical composition for treatment of Duchenne muscular dystrophy |
CA2437942C (en) | 2000-11-09 | 2013-06-11 | Cold Spring Harbor Laboratory | Chimeric molecules to modulate gene expression |
ATE510847T1 (de) | 2000-11-20 | 2011-06-15 | Univ Illinois | Membrangerüstproteine |
US20040058356A1 (en) | 2001-03-01 | 2004-03-25 | Warren Mary E. | Methods for global profiling gene regulatory element activity |
US6825338B2 (en) * | 2001-03-30 | 2004-11-30 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Labeled oligonucleotides, methods for making same, and compounds useful therefor |
US7507542B2 (en) | 2001-05-08 | 2009-03-24 | Ucb Sa | Method for regulating immune function using the FOXP3 protein |
US20050176025A1 (en) | 2001-05-18 | 2005-08-11 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA interference mediated inhibition of B-cell CLL/Lymphoma-2 (BCL-2) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
WO2002103015A2 (en) | 2001-06-14 | 2002-12-27 | Active Pass Pharmaceuticals, Inc. | Abca10 transporter |
US7407943B2 (en) | 2001-08-01 | 2008-08-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of apolipoprotein B expression |
US7259150B2 (en) | 2001-08-07 | 2007-08-21 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of apolipoprotein (a) expression |
MXPA04004056A (es) | 2001-10-29 | 2004-09-10 | Univ Mcgill | Oligonucleotidos que contienen enlazador aciclico y usos de los mismos. |
US20030219770A1 (en) * | 2001-11-08 | 2003-11-27 | Eshleman James R. | Methods and systems of nucleic acid sequencing |
US20030198983A1 (en) | 2002-02-01 | 2003-10-23 | Affymetrix, Inc. | Methods of genetic analysis of human genes |
US20080207542A1 (en) | 2002-03-26 | 2008-08-28 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA inteference mediated inhibition of hepatitis C virus (HVC) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA) |
AU2003225495B2 (en) | 2002-04-05 | 2009-01-15 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Oligomeric compounds for the modulation HIF-1alpha expression |
US20050130924A1 (en) | 2002-06-26 | 2005-06-16 | Monia Brett P. | Antisense inhibition via RNAse H-independent reduction in mRNA |
WO2004011613A2 (en) | 2002-07-29 | 2004-02-05 | Epigenesis Pharmaceuticals, Inc. | Composition & methods for treatment and screening |
US20050003369A1 (en) | 2002-10-10 | 2005-01-06 | Affymetrix, Inc. | Method for depleting specific nucleic acids from a mixture |
US20040219565A1 (en) | 2002-10-21 | 2004-11-04 | Sakari Kauppinen | Oligonucleotides useful for detecting and analyzing nucleic acids of interest |
AU2003295387A1 (en) * | 2002-11-05 | 2004-06-03 | Isis Parmaceuticals, Inc. | Modified oligonucleotides for use in rna interference |
US7655785B1 (en) | 2002-11-14 | 2010-02-02 | Rosetta Genomics Ltd. | Bioinformatically detectable group of novel regulatory oligonucleotides and uses thereof |
US7250496B2 (en) | 2002-11-14 | 2007-07-31 | Rosetta Genomics Ltd. | Bioinformatically detectable group of novel regulatory genes and uses thereof |
EP1560931B1 (en) | 2002-11-14 | 2011-07-27 | Dharmacon, Inc. | Functional and hyperfunctional sirna |
EP2141233B1 (en) | 2002-11-18 | 2016-10-19 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Antisense design |
CA2515644A1 (en) | 2003-02-10 | 2004-08-19 | Santaris Pharma A/S | Oligomeric compounds for the modulation of ras expression |
WO2004083430A2 (en) | 2003-03-21 | 2004-09-30 | Santaris Pharma A/S | SHORT INTERFERING RNA (siRNA) ANALOGUES |
FR2853663B1 (fr) | 2003-04-14 | 2007-08-31 | Aventis Pharma Sa | Procede d'obtention de lignees de mastocytes a partir de tissus de porcs et procede de production de molecules de type heparine |
WO2005001110A2 (en) | 2003-05-29 | 2005-01-06 | The Salk Institute For Biological Studies | Transcriptional regulation of gene expression by small double-stranded modulatory rna |
WO2004113867A2 (en) | 2003-06-16 | 2004-12-29 | University Of Massachusetts | Exon analysis |
WO2005013901A2 (en) | 2003-07-31 | 2005-02-17 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas |
US7888497B2 (en) | 2003-08-13 | 2011-02-15 | Rosetta Genomics Ltd. | Bioinformatically detectable group of novel regulatory oligonucleotides and uses thereof |
WO2005030928A2 (en) * | 2003-09-23 | 2005-04-07 | Chihiro Koike | PORCINE INVARIANT CHAIN PROTEIN, FULL LENGTH cDNA, GENOMIC ORGANIZATION, AND REGULATORY REGION |
WO2005040379A2 (en) | 2003-10-23 | 2005-05-06 | Sirna Therapeutics, Inc. | RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF RAS GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA) |
GB0324854D0 (en) | 2003-10-24 | 2003-11-26 | Expresson Biosystems Ltd | App/ena antisense |
OA13278A (en) | 2003-10-30 | 2007-01-31 | Coley Pharm Gmbh | C-Class oligonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory potency. |
EP1756137A4 (en) | 2003-11-05 | 2007-10-31 | Univ Texas | DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC PROCEDURES AND COMPOSITIONS CONCERNING PTEN AND BREAST CANCER |
KR20070006709A (ko) | 2003-12-23 | 2007-01-11 | 산타리스 팔마 에이/에스 | Bcl-2의 조절을 위한 올리고머 화합물 |
US20050244851A1 (en) | 2004-01-13 | 2005-11-03 | Affymetrix, Inc. | Methods of analysis of alternative splicing in human |
EP1713332A4 (en) | 2004-01-23 | 2010-08-18 | Avi Biopharma Inc | ANTISENSE OLIGOMERS AND METHOD FOR INDUCTION OF IMMUNOTHERAPY AND IMMUNOSUPPRESSION |
US20050164209A1 (en) | 2004-01-23 | 2005-07-28 | Bennett C. F. | Hepatocyte free uptake assays |
DK1713912T3 (da) | 2004-01-30 | 2013-12-16 | Santaris Pharma As | Modificerede Korte Interfererende RNA (Modificerede siRNA) |
WO2005089169A2 (en) | 2004-03-12 | 2005-09-29 | Exelixis, Inc. | Mptens as modifiers of the pten pathway and methods of use |
US8314226B2 (en) | 2004-03-29 | 2012-11-20 | The General Hospital Corporation | Oligonucleotide complex compositions and methods of use as gene alteration tools |
US7374927B2 (en) | 2004-05-03 | 2008-05-20 | Affymetrix, Inc. | Methods of analysis of degraded nucleic acid samples |
AU2005248147A1 (en) | 2004-05-11 | 2005-12-08 | Alphagen Co., Ltd. | Polynucleotides for causing RNA interference and method for inhibiting gene expression using the same |
US7687616B1 (en) | 2004-05-14 | 2010-03-30 | Rosetta Genomics Ltd | Small molecules modulating activity of micro RNA oligonucleotides and micro RNA targets and uses thereof |
US20050265927A1 (en) | 2004-05-17 | 2005-12-01 | Yale University | Intranasal delivery of nucleic acid molecules |
DK1766010T3 (da) | 2004-06-28 | 2011-06-06 | Univ Western Australia | Antisense-oligonukleotider til induktion af exon-skipping og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
US8029985B2 (en) | 2004-09-01 | 2011-10-04 | Vybion, Inc. | Amplified bioassay |
US7838657B2 (en) | 2004-12-03 | 2010-11-23 | University Of Massachusetts | Spinal muscular atrophy (SMA) treatment via targeting of SMN2 splice site inhibitory sequences |
WO2006063356A1 (en) | 2004-12-10 | 2006-06-15 | Isis Phamaceuticals, Inc. | Regulation of epigenetic control of gene expression |
US7879992B2 (en) | 2005-01-31 | 2011-02-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modification of MyD88 splicing using modified oligonucleotides |
ES2852549T3 (es) | 2005-02-09 | 2021-09-13 | Sarepta Therapeutics Inc | Composición antisentido para tratamiento de la atrofia muscular |
WO2006130201A1 (en) | 2005-03-14 | 2006-12-07 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antigene oligomers inhibit transcription |
US7449297B2 (en) * | 2005-04-14 | 2008-11-11 | Euclid Diagnostics Llc | Methods of copying the methylation pattern of DNA during isothermal amplification and microarrays |
CA2604532C (en) | 2005-04-15 | 2017-03-07 | The Regents Of The University Of California | Small activating rna molecules and methods of use |
US8586719B2 (en) | 2005-04-27 | 2013-11-19 | Pacific Arrow Limited | Triterpenes for modulating gene expression and cell membrane, and as antiprotozoal agents |
EP3470072A1 (en) * | 2005-06-23 | 2019-04-17 | Biogen MA Inc. | Compositions and methods for modulation of smn2 splicing |
US8067571B2 (en) | 2005-07-13 | 2011-11-29 | Avi Biopharma, Inc. | Antibacterial antisense oligonucleotide and method |
WO2007031091A2 (en) | 2005-09-15 | 2007-03-22 | Santaris Pharma A/S | Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression |
EP2431467A3 (en) | 2005-11-17 | 2012-05-02 | Board Of Regents, The University Of Texas | Modulation of gene expression by oligomers targeted to chromosomal DNA |
AU2006315099C1 (en) | 2005-11-21 | 2013-01-10 | Johnson & Johnson Research Pty Limited | Multitargeting interfering RNAs and methods of their use and design |
CN103301475B (zh) | 2005-12-28 | 2016-08-03 | 斯克里普斯研究所 | 药物组合物和表达载体以及调节基因表达的方法和核酸分子的应用 |
US20090011004A1 (en) | 2005-12-30 | 2009-01-08 | Philadelphia Health & Education Corp., D/B/A/ Drexel University Of College Of Medicine | Improved carriers for delivery of nucleic acid agents to cells and tissues |
US7569686B1 (en) | 2006-01-27 | 2009-08-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs |
EP2388328A1 (en) | 2006-01-27 | 2011-11-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomeric compounds and compositions for the use in modulation of micrornas |
KR20130042043A (ko) | 2006-01-27 | 2013-04-25 | 아이시스 파마수티컬즈 인코포레이티드 | 6-변형된 바이시클릭 핵산 유사체 |
WO2007091269A2 (en) | 2006-02-08 | 2007-08-16 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | NOVEL TANDEM siRNAS |
CA3042781C (en) | 2006-04-03 | 2021-10-19 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Pharmaceutical composition comprising anti-mirna antisense oligonucleotides |
AU2006341726B2 (en) | 2006-04-07 | 2012-09-20 | Ipt Pharma Ag | Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy |
JP5731115B2 (ja) | 2006-05-05 | 2015-06-10 | アイシス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッド | 遺伝子発現を調節するための化合物および方法 |
US8629108B2 (en) | 2006-06-27 | 2014-01-14 | Opexa Therapeutics, Inc. | Rheumatoid arthritis T cell vaccine |
CN102614528B (zh) | 2006-08-18 | 2014-02-26 | 箭头研究公司 | 用于体内递送多核苷酸的多缀合物 |
EP2054529B1 (en) | 2006-08-25 | 2014-03-26 | Duke University | Methods for in vivo identification of endogenous mrna targets of micrornas |
WO2008025069A1 (en) | 2006-08-28 | 2008-03-06 | The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research | Methods of modulating cellular activity and compositions therefor |
WO2008029619A1 (fr) | 2006-09-07 | 2008-03-13 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Oligonucléotide antisens ena ayant une action spécifique de la séquence |
WO2008036282A1 (en) | 2006-09-18 | 2008-03-27 | The Regents Of The University Of Californina | Upregulating activity or expression of bdnf to mitigate cognitive impairment in asymptomatic huntington's subjects |
EP2410053B2 (en) | 2006-10-18 | 2020-07-15 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense compounds |
CA2681568C (en) | 2006-11-23 | 2019-01-08 | Querdenker Aps | Oligonucleotides for modulating target rna activity |
EP2064350B1 (en) | 2006-11-27 | 2013-01-02 | Ludwig Institute for Cancer Research Ltd. | Expression of foxp3 by cancer cells |
CA2676039A1 (en) | 2007-01-19 | 2008-07-24 | The Regents Of The University Of Michigan | Adrb2 cancer markers |
ITMI20070127A1 (it) | 2007-01-29 | 2008-07-30 | Fond I R C C S | Proteine e-o peptidi per la prevenzione e-o cura di malattie neurodegenerative |
WO2008103761A2 (en) | 2007-02-20 | 2008-08-28 | Sequenom, Inc. | Methods and compositions for cancer diagnosis and treatment based on nucleic acid methylation |
US7858592B2 (en) | 2007-02-26 | 2010-12-28 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Interfering RNAs against the promoter region of P53 |
US8580756B2 (en) | 2007-03-22 | 2013-11-12 | Santaris Pharma A/S | Short oligomer antagonist compounds for the modulation of target mRNA |
WO2008141282A2 (en) | 2007-05-11 | 2008-11-20 | The Regents Of The University Of Michigan | Materials and methods for foxp3 tumor suppression |
CN101821390A (zh) | 2007-06-14 | 2010-09-01 | 米尔克斯治疗有限责任公司 | 用于调节靶rna活性的寡核苷酸 |
US20090082297A1 (en) | 2007-06-25 | 2009-03-26 | Lioy Daniel T | Compositions and Methods for Regulating Gene Expression |
AU2008271050B2 (en) * | 2007-06-29 | 2014-11-06 | Sarepta Therapeutics, Inc. | Tissue specific peptide conjugates and methods |
WO2009027349A2 (en) | 2007-08-24 | 2009-03-05 | Oryzon Genomics Sa | Treatment and prevention of neurodegenerative diseases |
ES2463665T3 (es) | 2007-10-04 | 2014-05-28 | Stella Aps | Tratamiento de combinación para el tratamiento de infección por virus de la hepatitis C |
WO2009046397A2 (en) | 2007-10-04 | 2009-04-09 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Modulating gene expression with agrna and gapmers targeting antisense transcripts |
ITRM20070523A1 (it) | 2007-10-05 | 2009-04-06 | Consiglio Nazionale Ricerche | Acido nucleico codificante per una proteina regolatrice specifica della trascrizione dell'utrofina proteina da esso codificata e sue applicazioni |
RU2010119775A (ru) | 2007-11-09 | 2011-12-27 | Айсис Фармасьютикалс,Инк. (Us) | Модулирование экспрессии фактора 7 |
EP2219680A2 (en) | 2007-11-13 | 2010-08-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for modulating protein expression |
US8937217B2 (en) | 2007-12-18 | 2015-01-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Down-regulation of gene expression using artificial microRNAs |
WO2009090182A1 (en) | 2008-01-14 | 2009-07-23 | Santaris Pharma A/S | C4'-substituted - dna nucleotide gapmer oligonucleotides |
CN102282259A (zh) | 2008-03-07 | 2011-12-14 | 森尼斯科技术公司 | 与有义构建体实现期望多核苷酸的表达的用途相组合的、sirna实现内源基因的减量调节的用途 |
US8361980B2 (en) | 2008-03-07 | 2013-01-29 | Santaris Pharma A/S | Pharmaceutical compositions for treatment of microRNA related diseases |
EP2274423A2 (en) | 2008-04-04 | 2011-01-19 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleosides and having reduced toxicity |
AU2009235941A1 (en) | 2008-04-07 | 2009-10-15 | Riken | RNA molecules and uses thereof |
US8916532B2 (en) | 2008-04-28 | 2014-12-23 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods for enhancing utrophin production via inhibition of microRNA |
AU2009256243A1 (en) | 2008-06-04 | 2009-12-10 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Modulation of gene expression through endogenous small RNA targeting of gene promoters |
CA2635187A1 (en) | 2008-06-05 | 2009-12-05 | The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University | Oligonucleotide duplexes and uses thereof |
DK2310505T3 (en) | 2008-06-30 | 2017-10-16 | Roche Innovation Ct Copenhagen As | ANTIDOT oligomers |
JP2011529686A (ja) | 2008-07-29 | 2011-12-15 | ザ ボード オブ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティー オブ テキサス システム | ポリグルタミンタンパク質発現の選択的阻害 |
US20110237606A1 (en) | 2008-09-26 | 2011-09-29 | Agency Of Science, Technology And Research | 3-Deazaneplanocin Derivatives |
CN102239260B (zh) | 2008-10-03 | 2017-04-12 | 库尔纳公司 | 通过抑制针对载脂蛋白‑a1的天然反义转录物治疗载脂蛋白‑a1相关疾病 |
US20100112042A1 (en) | 2008-10-16 | 2010-05-06 | Mdrna, Inc. | Processes and Compositions for Liposomal and Efficient Delivery of Gene Silencing Therapeutics |
AU2009315665A1 (en) | 2008-11-17 | 2010-05-20 | Arrowhead Research Corporation | Compositions and methods for inhibiting expression of factor VII genes |
GB0821457D0 (en) | 2008-11-24 | 2008-12-31 | Trillion Genomics Ltd | Oligonucleotides |
MX366774B (es) | 2008-12-04 | 2019-07-24 | Curna Inc | Uso de oligonucleótidos antisentido en la inhibición de transcrito antisentido natural para sirtuina 1. |
JP6091752B2 (ja) | 2008-12-04 | 2017-03-08 | クルナ・インコーポレーテッド | Epoに対する天然アンチセンス転写物の抑制によるエリスロポエチン(epo)関連疾患の治療 |
US8927511B2 (en) | 2008-12-04 | 2015-01-06 | Curna, Inc. | Treatment of vascular endothelial growth factor (VEGF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to VEGF |
CA2745811C (en) | 2008-12-04 | 2021-07-13 | Joseph Collard | Treatment of tumor suppressor gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to the gene |
CA2750561C (en) | 2009-01-26 | 2017-10-10 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Compositions and methods for silencing apolipoprotein c-iii expression |
JP6066035B2 (ja) | 2009-02-12 | 2017-01-25 | クルナ・インコーポレーテッド | グリア細胞由来神経栄養因子(gdnf)関連疾病の、gdnfに対する天然アンチセンス転写物の抑制による治療 |
US9074210B2 (en) | 2009-02-12 | 2015-07-07 | Curna, Inc. | Treatment of brain derived neurotrophic factor (BDNF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to BDNF |
US20120040857A1 (en) | 2009-02-13 | 2012-02-16 | The General Hospital Corporation | Isolation of factors that associate directly or indirectly with chromatin |
EP2963116B1 (en) | 2009-03-04 | 2020-11-11 | CuRNA, Inc. | Treatment of sirtuin 1 (sirt1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to sirt 1 |
US9464287B2 (en) | 2009-03-16 | 2016-10-11 | Curna, Inc. | Treatment of nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2 (NRF2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to NRF2 |
MX2011009752A (es) | 2009-03-17 | 2011-09-29 | Opko Curna Llc | Tratamiento de enfermedades relacionadas a homologo tipo delta 1(dlk1) por inhibicion de transcrito antisentido natural a homologo tipo delta (dlk1). |
CN102625840A (zh) | 2009-04-10 | 2012-08-01 | 肌肉学研究协会 | 用于治疗疾病的三环dna反义寡核苷酸、组合物和方法 |
EP2421972A2 (en) | 2009-04-24 | 2012-02-29 | The Board of Regents of The University of Texas System | Modulation of gene expression using oligomers that target gene regions downstream of 3' untranslated regions |
CN102639151B (zh) | 2009-05-01 | 2017-03-22 | 库尔纳公司 | 通过针对hbf/hbg的天然反义转录物的抑制治疗血红蛋白(hbf/hbg)相关疾病 |
WO2010129746A2 (en) | 2009-05-06 | 2010-11-11 | Curna, Inc. | Treatment of tristetraproline (ttp) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ttp |
JP5883782B2 (ja) | 2009-05-06 | 2016-03-15 | クルナ・インコーポレーテッド | 脂質輸送代謝遺伝子に対する天然アンチセンス転写物の抑制による脂質輸送代謝遺伝子関連疾患の治療 |
CN102459597B (zh) | 2009-05-08 | 2020-06-30 | 库尔纳公司 | 通过针对dmd家族的天然反义转录物的抑制治疗肌营养蛋白家族相关疾病 |
CA2762369C (en) | 2009-05-18 | 2021-12-28 | Joseph Collard | Treatment of reprogramming factor related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a reprogramming factor |
EP2432882B1 (en) | 2009-05-22 | 2019-12-25 | CuRNA, Inc. | TREATMENT OF TRANSCRIPTION FACTOR E3 (TFE3) and INSULIN RECEPTOR SUBSTRATE 2 (IRS2) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO TFE3 |
CN103221541B (zh) | 2009-05-28 | 2017-03-01 | 库尔纳公司 | 通过抑制抗病毒基因的天然反义转录物来治疗抗病毒基因相关疾病 |
CA2765700C (en) | 2009-06-16 | 2021-01-05 | Opko Curna, Llc | Treatment of collagen gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a collagen gene |
ES2629339T3 (es) | 2009-06-16 | 2017-08-08 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con la paraoxonasa 1 (pon1) por inhibición de transcrito antisentido natural a pon1 |
US8859515B2 (en) | 2009-06-24 | 2014-10-14 | Curna, Inc. | Treatment of tumor necrosis factor receptor 2 (TNFR2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to TNFR2 |
CN102482672B (zh) | 2009-06-26 | 2016-11-09 | 库尔纳公司 | 通过抑制唐氏综合征基因的天然反义转录物治疗唐氏综合征基因相关疾病 |
JP2014501097A (ja) | 2009-07-06 | 2014-01-20 | アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッド | 生物由来物質の産生を高めるための組成物及び方法 |
WO2011009624A1 (en) | 2009-07-22 | 2011-01-27 | Cenix Bioscience Gmbh | Delivery system and conjugates for compound delivery via naturally occurring intracellular transport routes |
WO2011010706A1 (ja) | 2009-07-23 | 2011-01-27 | 武田薬品工業株式会社 | Fgf21シスエレメント結合物質 |
CA2768947C (en) | 2009-07-24 | 2018-06-19 | Opko Curna, Llc | Treatment of sirtuin (sirt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a sirtuin (sirt) |
US9234199B2 (en) | 2009-08-05 | 2016-01-12 | Curna, Inc. | Treatment of insulin gene (INS) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an insulin gene (INS) |
EP2464731B1 (en) | 2009-08-11 | 2016-10-05 | CuRNA, Inc. | Treatment of adiponectin (adipoq) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to an adiponectin (adipoq) |
EP2467482A4 (en) | 2009-08-21 | 2013-12-11 | Curna Inc | TREATMENT OF DISEASES RELATED TO "CIP PROTEIN CHIP EXTREME (PROTEIN INTERACTING WITH HSP70)" BY INHIBITION OF CHIP NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT |
CA2771172C (en) | 2009-08-25 | 2021-11-30 | Opko Curna, Llc | Treatment of 'iq motif containing gtpase activating protein' (iqgap) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to iqgap |
WO2011025862A2 (en) | 2009-08-28 | 2011-03-03 | Curna, Inc. | Treatment of atp-binding cassette sub-family b member 1 (abcb1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to abcb1 |
WO2011038205A2 (en) | 2009-09-25 | 2011-03-31 | Curna, Inc. | Treatment of growth hormone (gh) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to gh |
DK2480669T3 (en) | 2009-09-25 | 2018-02-12 | Curna Inc | TREATMENT OF FILAGGRIN- (FLG) RELATED DISEASES BY MODULATING FLG EXPRESSION AND ACTIVITY |
WO2011048125A1 (en) | 2009-10-20 | 2011-04-28 | Santaris Pharma A/S | Oral delivery of therapeutically effective lna oligonucleotides |
KR101138048B1 (ko) | 2009-11-06 | 2012-04-23 | 성균관대학교산학협력단 | Bdnf의 발현을 증가시키는 신규 펩타이드 및 이를 포함하는 알츠하이머병 또는 파킨슨병의 예방 및 치료용 약학 조성물 |
JP6025567B2 (ja) | 2009-12-16 | 2016-11-16 | カッパーアールエヌエー,インコーポレイテッド | 膜結合転写因子ペプチダーゼ、部位1(mbtps1)に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるmbtps1関連性疾患の治療 |
WO2011079263A2 (en) | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Curna, Inc. | Treatment of uncoupling protein 2 (ucp2) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ucp2 |
US8940708B2 (en) | 2009-12-23 | 2015-01-27 | Curna, Inc. | Treatment of hepatocyte growth factor (HGF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to HGF |
RU2611186C2 (ru) | 2009-12-29 | 2017-02-21 | Курна, Инк. | ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ОПУХОЛЕВЫМ БЕЛКОМ 63 (р63), ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К р63 |
RU2615450C2 (ru) | 2009-12-29 | 2017-04-04 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с ядерным респираторным фактором 1(nrf1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к nrf1 |
CN102791862B (zh) | 2009-12-31 | 2017-04-05 | 库尔纳公司 | 通过抑制胰岛素受体底物2(irs2)和转录因子e3(tfe3)的天然反义转录物而治疗irs2相关疾病 |
US8946181B2 (en) | 2010-01-04 | 2015-02-03 | Curna, Inc. | Treatment of interferon regulatory factor 8 (IRF8) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IRF8 |
WO2011085066A2 (en) | 2010-01-06 | 2011-07-14 | Curna, Inc. | Treatment of pancreatic developmental gene related diseases by inhibition of natural antisense transcript to a pancreatic developmental gene |
CA2786535C (en) | 2010-01-11 | 2019-03-26 | Curna, Inc. | Treatment of sex hormone binding globulin (shbg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to shbg |
RU2611192C2 (ru) | 2010-01-25 | 2017-02-21 | Курна, Инк. | ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С РНКазой Н1, ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К РНКазе Н1 |
US9574191B2 (en) | 2010-02-03 | 2017-02-21 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Selective inhibition of polyglutamine protein expression |
WO2011097582A2 (en) | 2010-02-08 | 2011-08-11 | Opko Curna Llc | Treatment of arachidonate 12-lipoxygenase, 12r type (alox12b) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to alox12b |
WO2011097641A1 (en) | 2010-02-08 | 2011-08-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions useful in treatment of diseases or conditions related to repeat expansion |
EP2539452B1 (en) | 2010-02-22 | 2016-07-27 | CuRNA, Inc. | Treatment of pyrroline-5-carboxylate reductase 1 (pycr1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to pycr1 |
EP2550360B1 (en) | 2010-03-24 | 2017-08-30 | Mirrx Therapeutics A/s | Bivalent antisense oligonucleotides |
ES2657969T3 (es) | 2010-04-02 | 2018-03-07 | Curna, Inc. | Tratamiento de enfermedades relacionadas con el Factor 3 estimulante de colonias (CSF3) por inhibición del transcrito antisentido natural a CSF3 |
EP2556160A4 (en) | 2010-04-09 | 2013-08-21 | Curna Inc | TREATMENT OF ILLNESSES ASSOCIATED WITH FIBROBLASTIC GROWTH FACTOR 21 (FGF21) BY INHIBITION OF THE NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT AGAINST FGF21 |
EP2558578B1 (en) | 2010-04-13 | 2015-10-28 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for inhibition of nucleic acids function |
RU2018110642A (ru) | 2010-05-03 | 2019-02-27 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с сиртуином (sirt), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к сиртуину (sirt) |
TWI531370B (zh) | 2010-05-14 | 2016-05-01 | 可娜公司 | 藉由抑制par4天然反股轉錄本治療par4相關疾病 |
TW201201819A (en) | 2010-05-19 | 2012-01-16 | Opko Curna Llc | Treatment of BCL2-like 11 (BCL2L11) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to BCL2L11 |
AR081295A1 (es) | 2010-05-19 | 2012-08-01 | Opko Curna Llc | Tratamiento de enfermedades relacionadas con lim homeobox 2(lhx2) mediante la inhibicion del transcripto antisentido natural a polinucleotidos lhx2 |
NO2576784T3 (zh) | 2010-05-26 | 2018-04-14 | ||
EP3299464B1 (en) | 2010-05-26 | 2019-10-02 | CuRNA, Inc. | Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1 |
US9518259B2 (en) | 2010-06-15 | 2016-12-13 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for modulating interaction between proteins and target nucleic acids |
US20120004278A1 (en) | 2010-06-18 | 2012-01-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Linc rnas in cancer diagnosis and treatment |
CN109112126A (zh) | 2010-06-23 | 2019-01-01 | 库尔纳公司 | 通过抑制电压门控钠通道α亚基(SCNA)的天然反义转录物而治疗SCNA相关疾病 |
GB201010557D0 (en) | 2010-06-23 | 2010-08-11 | Mina Therapeutics Ltd | RNA molecules and uses thereof |
CN102309757B (zh) | 2010-07-09 | 2014-09-17 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | Foxp3及调节性t细胞的调节因子及其应用 |
TW201209163A (en) | 2010-07-12 | 2012-03-01 | Opko Curna Llc | Treatment of BCL2 binding component 3 (BBC3) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to BBC3 |
NO2593547T3 (zh) | 2010-07-14 | 2018-04-14 | ||
WO2012027033A1 (en) * | 2010-07-19 | 2012-03-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for modulating target nuclear and sub-nuclear nucleic acid molecules in cells and animals |
JP5981428B2 (ja) | 2010-07-19 | 2016-08-31 | アイオーニス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッドIonis Pharmaceuticals,Inc. | 筋緊張性ジストロフィー・プロテインキナーゼ(dmpk)発現の調整 |
WO2012018881A2 (en) | 2010-08-03 | 2012-02-09 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for the regulation of rna |
WO2012024478A2 (en) | 2010-08-19 | 2012-02-23 | Opko Curna Llc | Treatment of nicotinamide phosphoribosyltransferase (nampt) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to nampt |
PL2614369T3 (pl) | 2010-09-10 | 2016-08-31 | Epizyme Inc | Sposób określania przydatności inhibitorów ludzkiego ezh2 w leczeniu |
CA2813901C (en) | 2010-10-06 | 2019-11-12 | Curna, Inc. | Treatment of sialidase 4 (neu4) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to neu4 |
US9222088B2 (en) | 2010-10-22 | 2015-12-29 | Curna, Inc. | Treatment of alpha-L-iduronidase (IDUA) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to IDUA |
DK2633052T3 (en) | 2010-10-27 | 2018-07-16 | Curna Inc | TREATMENT OF INTERFERON-RELATED DEVELOPMENT REGULATOR 1 (IFRD1) -RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENCE TRANSCRIPT TO IFRD1 |
US9714427B2 (en) | 2010-11-11 | 2017-07-25 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for unsilencing imprinted genes |
US9920317B2 (en) | 2010-11-12 | 2018-03-20 | The General Hospital Corporation | Polycomb-associated non-coding RNAs |
WO2012065143A1 (en) | 2010-11-12 | 2012-05-18 | The General Hospital Corporation | Polycomb-associated non-coding rnas |
US10000752B2 (en) | 2010-11-18 | 2018-06-19 | Curna, Inc. | Antagonat compositions and methods of use |
CN103459599B (zh) | 2010-11-23 | 2017-06-16 | 库尔纳公司 | 通过抑制nanog的天然反义转录物而治疗nanog相关疾病 |
EP2655621B1 (en) | 2010-12-20 | 2018-05-23 | The General Hospital Corporation | Polycomb-associated non-coding rnas |
US9206479B2 (en) | 2011-02-09 | 2015-12-08 | University Of Rochester | Methods and compositions related to Staufen 1 binding sites formed by duplexing Alu elements |
WO2012144220A1 (en) | 2011-04-22 | 2012-10-26 | Oncotherapy Science, Inc. | Ezh2 as target gene for cancer therapy and diagnosis |
US8557787B2 (en) | 2011-05-13 | 2013-10-15 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Diagnostic, prognostic and therapeutic uses of long non-coding RNAs for cancer and regenerative medicine |
RU2620980C2 (ru) | 2011-06-09 | 2017-05-30 | Курна, Инк. | Лечение заболеваний, связанных с фратаксином (fxn), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта fxn |
EP2723902A4 (en) | 2011-06-24 | 2015-02-18 | Murdoch Childrens Res Inst | TREATMENT AND DIAGNOSIS OF EPIGENETIC DISORDERS AND DISEASES |
CA2844144A1 (en) | 2011-07-05 | 2013-01-10 | The General Hospital Corporation | Rna-yy1 interactions |
WO2013036403A1 (en) | 2011-09-06 | 2013-03-14 | Curna, Inc. | TREATMENT OF DISEASES RELATED TO ALPHA SUBUNITS OF SODIUM CHANNELS, VOLTAGE-GATED (SCNxA) WITH SMALL MOLECULES |
US9580708B2 (en) | 2011-09-14 | 2017-02-28 | Rana Therapeutics, Inc. | Multimeric oligonucleotides compounds |
WO2013080784A1 (ja) | 2011-11-30 | 2013-06-06 | シャープ株式会社 | メモリ回路とその駆動方法、及び、これを用いた不揮発性記憶装置、並びに、液晶表示装置 |
ITMI20120275A1 (it) | 2012-02-24 | 2013-08-25 | Biogenera Societa A Responsabilita Limitata | Oligonucleotidi per la modulazione dell'espressione genica e loro usi |
JP2015511494A (ja) | 2012-03-15 | 2015-04-20 | キュアナ,インク. | 脳由来神経栄養因子(bdnf)に対する天然アンチセンス転写物の阻害によるbdnf関連の疾患の処置 |
EP3511416A1 (en) | 2012-05-16 | 2019-07-17 | Translate Bio MA, Inc. | Compositions and methods for modulating gene expression |
JP2016522674A (ja) | 2012-05-16 | 2016-08-04 | ラナ セラピューティクス インコーポレイテッド | 遺伝子発現を調節するための組成物及び方法 |
EP2849801A4 (en) | 2012-05-16 | 2016-05-25 | Rana Therapeutics Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING THE EXPRESSION OF APOA1 AND ABCA1 |
SG11201407486PA (en) | 2012-05-16 | 2014-12-30 | Rana Therapeutics Inc | Compositions and methods for modulating utrn expression |
EP2850187A4 (en) | 2012-05-16 | 2016-01-20 | Rana Therapeutics Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR PTEN EXPRESSION MODULATION |
EA201492116A1 (ru) | 2012-05-16 | 2015-05-29 | Рана Терапьютикс, Инк. | Композиции и способы для модулирования экспрессии mecp2 |
CN104602714A (zh) | 2012-05-16 | 2015-05-06 | Rana医疗有限公司 | 用于调节bdnf表达的组合物和方法 |
AU2013262699A1 (en) | 2012-05-16 | 2015-01-22 | Rana Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating ATP2A2 expression |
AU2013262649A1 (en) | 2012-05-16 | 2015-01-22 | Rana Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating smn gene family expression |
US20150232836A1 (en) | 2012-05-16 | 2015-08-20 | Rana Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating gene expression |
AP2014008100A0 (en) | 2012-05-16 | 2014-12-31 | Gen Hospital Corp | Compositions and methods for modulating hemoglobingene family expression |
WO2014025887A1 (en) | 2012-08-07 | 2014-02-13 | The General Hospital Corporation | Selective reactivation of genes on the inactive x chromosome |
WO2014043544A1 (en) | 2012-09-14 | 2014-03-20 | Rana Therapeutics, Inc. | Multimeric oligonucleotide compounds |
CN104837996A (zh) | 2012-11-15 | 2015-08-12 | 罗氏创新中心哥本哈根有限公司 | 抗apob反义缀合物化合物 |
US10590412B2 (en) | 2013-04-19 | 2020-03-17 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for modulation nucleic acids through nonsense mediated decay |
AU2014274730A1 (en) | 2013-06-07 | 2016-01-21 | Rana Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for modulating FOXP3 expression |
CN105324119A (zh) | 2013-06-16 | 2016-02-10 | 国立大学法人东京医科齿科大学 | 具有外显子跳跃效应的双链反义核酸 |
WO2015035476A1 (en) | 2013-09-16 | 2015-03-19 | University Of Western Sydney | Modulation of gene expression |
-
2013
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-
2014
- 2014-12-15 ZA ZA2014/09228A patent/ZA201409228B/en unknown
-
2015
- 2015-09-17 HK HK15109139.6A patent/HK1208700A1/zh unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0999270A1 (en) * | 1998-10-09 | 2000-05-10 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Method of regulating SMN gene expression |
US20110086833A1 (en) * | 2008-05-27 | 2011-04-14 | Paushkin Sergey V | Methods for treating spinal muscular atrophy |
WO2011032109A1 (en) * | 2009-09-11 | 2011-03-17 | Sma Foundation | Biomarkers for spinal muscular atrophy |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2021190226A1 (zh) * | 2020-03-24 | 2021-09-30 | 中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心 | 单碱基编辑介导的剪接修复在制备治疗脊髓性肌萎缩症中的应用 |
WO2023020421A1 (en) * | 2021-08-16 | 2023-02-23 | Hangzhou Jiayin Biotech Ltd. | Regulation of imprinting silenced genes by smn1 and snrpn expression and uses thereof |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2850186A4 (en) | 2016-01-27 |
DK2850186T3 (en) | 2019-04-08 |
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US10059941B2 (en) | 2018-08-28 |
AU2013262649A1 (en) | 2015-01-22 |
WO2013173638A1 (en) | 2013-11-21 |
ZA201409228B (en) | 2016-07-27 |
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EA201492123A1 (ru) | 2015-10-30 |
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