CN111662966A - 一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：(1)提取供试小麦品种的DNA；(2)对上述步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，所用引物包括26对荧光标记引物，每对引物包括两条具有标签序列的正向引物，其序列如序列表SEQ ID NO.1‑52所示，一条通用的反向引物，其序列如序列表SEQ ID NO.52‑78所示；(3)收集扩增产物的荧光信号，对产物进行分型检测。本发明的指纹图中中，包括26对基于控制小麦产量和品质相关性状的重要功能基因组成的标记组合，对小麦骨干亲本进行功能基因指纹图谱构建，可在短时间内完成小麦骨干亲本功能基因鉴定，具有很高的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及小麦育种及应用技术领域，尤其涉及一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱及其构建方法和应用。
背景技术
小麦属于禾本科的小麦属，它是世界上最早栽培的农作物之一。经过长期的驯化和人工选择，现已成为世界上的粮食作物之一。小麦子粒含有丰富的淀粉、较多的蛋白质、少量的脂肪，还有多种矿物质元素和维生素B，为全球五分之一的人口提供必须的卡路里。因此对其鉴定已为尤为重要。
小麦育种家庄巧生院士在《品种改良与系谱分析》一书中，首次提出骨干亲本的概念：在杂交育种中起着骨干作用，用其培育出数目较多的大面积推广品种，或由其衍生出许多具有广泛应用价值的亲本育种材料。骨干亲本除本身具备优良性状外，还具有高配合力的特点，易与其他亲本杂交育成优良品种。骨干亲本是新品种培育的重要种质类型，是实现品种升级换代的关键。据统计， 1949-2000年我国育成小麦品种2000多个，其血缘涉及的骨干亲本包括：蚂蚱麦、燕大1817、江东门、成都光头、蚰子麦、碧蚂4号、北京8号、西农6028、五一麦、南大2419、阿夫、阿勃、洛夫林10号和墨巴66等，由这些骨干亲本育成的小麦品种在生产中播种面积达到了推广总面积的86％。从历史发展的角度来看，作物育种就是骨干亲本创制和有效利用的历史，它们聚合了多个优良材料的优异片段，骨干亲本的变化基本能够反映不同阶段品种改良的方向，是记录特定历史时期内特定地区农作物生产水平的重要物质载体。因此骨干亲本拥有解决当时条件下重大生产问题的优良特征。从遗传上讲，来自骨干亲本的遗传物质应该对新品种选育具有重要遗传贡献。基因是影响作物性状外在表现的基本功能单元，基于骨干亲本的重要性状基因位点鉴定对深入解析其遗传基础和指导种质创新具有重要意义。
品种鉴定对于品种权保护和产权纠纷具有重要作用，随着分子生物学的发展，分子标记技术的出现为品种鉴定提供了新的手段。但是，传统AFLP、SSR 等指纹图谱存在标记数量有限、检测位点少、位点突变率高、对变异反应比较敏感等缺点。目前的小麦指纹图谱均是基于SSR标记构建，并没有通过功能标记构建指纹图谱，更加没有小麦骨干亲本的功能基因指纹图谱。功能标记来源于控制表型的基因序列内部，在鉴别基因序列的表型功能后，挖掘该序列中的多态性信息及对应序列的表型效应，从而开发出能够区分和预测(复)等位基因及相对性状的DNA标记，即功能标记。功能标记(functional marker)是依据基因序列的多态性开发的，这些基因的不同等位变异与表型直接相关。因此运用功能标记对小麦骨干亲本构建指纹图谱，明确骨干亲本携带的优异基因，对今后育种和总结骨干亲本的形成具有重要的参考价值。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱的构建方法，运用小麦骨干亲本中被鉴定的控制重要农艺性状的功能标记，构建了首个小麦骨干亲本功能基因的指纹图谱，为育种家对小麦骨干亲本的资源的评价和利用提供了科学的理论支撑，弥补了经验育种的不足。
本发明的目的之二在于提供一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱。
本发明的目的之三在于提供一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱在小麦品种鉴定方面的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：
(1)提取供试小麦品种的DNA；
(2)对上述步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，所用引物包括26对荧光标记引物，每对引物包括两条具有标签序列的正向引物，其序列如序列表SEQ ID NO.1-52所示，一条通用的反向引物，其序列如序列表SEQ ID NO.52-78所示；
(3)收集扩增产物的荧光信号，对产物进行分型检测。
进一步地，所述小麦骨干亲本的功能基因包括产量性状相关的基因和品质性状相关的基因：所述产量性状相关的基因包括控制千粒重的基因7个，分别是Sus1-7A、Sus1-7B、Sus2-2A、Sus2-2B、Cwi-4A、TGW6、GS-D1；控制粒型的基因3个，分别是GASR-A1、GW2-6A和GW2-6B；控制穗粒数的基因2 个，分别是CKX-D1和MOC-7A；所述和品质相关的基因包括影响面筋强度的基因3个，分别是Glu-B1、Glu-A1和Glu-D1；影响籽粒硬度的基因3个，分别是Pina-D1、Pinb-D1和Pinb2-B2；影响支链淀粉的基因Wx-B1；影响多酚氧化酶基因Ppo-A1和Ppo-D1；影响过氧化物酶的基因Pod-A1；影响黄色素含量的基因4个，分别是Zds-A1、Lcy-B1、Pds-B1和Psy-B1。
小麦产量三要素为单位面积穗数、每穗粒数和千粒重，三者之间相互依赖、相互影响，改良、聚合产量相关性状及相应基因以达到高产一直是育种工作者不懈追求的目标。本发明中涉及到的表型性状包括千粒重、粒型、穗粒数，其中控制千粒重的基因7个，分别是Sus1-7A、Sus1-7B、Sus2-2A、Sus2-2B、Cwi-4A、 TGW6、GS-D1；控制粒型的基因3个，分别是GASR-A1、GW2-6A和GW2-6B；控制穗粒数的基因2个，分别是CKX-D1和MOC-7A。
随着我国经济的发展，人们的生活需求也在不断提高，小麦品质改良在育种目标中的地位也日渐重要。小麦品质包括营养品质和加工品质。加工品质主要与高低分子量麦谷蛋白亚基、多酚氧化酶、黄色素含量、籽粒硬度等因素有关。本发明中涉及到的表型性状包括面筋强度、籽粒硬度、黄色素含量、多酚氧化酶和过氧化物酶，其中影响面筋强度的基因3个，分别是Glu-B1、Glu-A1 和Glu-D1；影响籽粒硬度的基因3个，分别是Pina-D1、Pinb-D1和Pinb2-B2；影响支链淀粉的基因Wx-B1；影响多酚氧化酶基因Ppo-A1和Ppo-D1；影响过氧化物酶的基因Pod-A1；影响黄色素含量的基因4个，分别是Zds-A1、Lcy-B1、 Pds-B1和Psy-B1。
进一步地，上述步骤(1)中DNA的提取过程如下：
A：配置CTAB缓冲液，放入65℃水浴锅中预热；
B：取适量小麦组织经液氮冷却后打碎，加入上述步骤A中预热后的CTAB 缓冲液，混合均匀后水浴加热；
C：将上述步骤B的混合物冷却至室温，加入氯仿和异戊醇的混合溶剂，混合均匀后，离心，取上清液，加入RNaseA，混匀，室温放置一段时间；
D：向上述步骤C的混合物中加入预冷的异丙醇，混合均匀后，静置沉淀，离心后取沉淀加入乙醇溶液洗涤，干燥后即得待测的DNA样品。
进一步地，上述步骤A中CTAB缓冲液的配置过程如下：每升CTAB缓冲液加入20gCTAB，200mL pH＝8.0的1.0M Tris-HCl缓冲液，81g NaCl，40mL 0.5M EDTA，10g 1％PVP。
进一步地，上述步骤C中氯仿和异戊醇的体积比为24:1；上述步骤D中加入0.7倍体积在-20℃预冷的异丙醇。
进一步地，PCR扩增反应体系包括浓度为40ng/μL待测DNA样品2.2μL，KASP LowMixture 2.5μL，Mg2+0.04μL，引物溶液0.056μL，dd H2O 0.204 μL；KASP扩增程序为：94℃，预变性15min；然后95℃，变性20s；65℃梯度退火并延伸25s，10个循环，每个循环下降1℃；最后95℃变性10s；57℃退火并延伸1min，30个循环；4℃保存。
进一步地，上述步骤(2)中PCR扩增中引物溶液的组成为：在体积为100 μL的溶液中包括浓度为100μM的两条正向引物各12μL，通用反向引物30 μL，dd H2O 46μL。
进一步地，上述步骤(3)中待PCR反应完成后，收集扩增产物的荧光信号，对产物进行分型检测，同一位点不同等位变异呈现不同颜色，相同等位变异类型的材料以相同颜色的点通过二维聚类图展示，每个基因的两种等位变异用黑白两种颜色表示，构建小麦的指纹图谱。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱，由上述方法构建得到。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
上述小麦骨干亲本功能基因指纹图谱在小麦品种鉴定方面的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供的小麦骨干亲本功能基因指纹图谱的构建方法中，包括基于产量、品质性状相关基因开发的共26对功能标记，利用PCR扩增技术、KASP基因分型技术对小麦品种进行鉴定，可在短时间内完成小麦骨干亲本功能基因品种鉴定，该图谱基本包含目前育种家所关注的重要产量性状和品质性状相关的基因，对育种产生重大作用的骨干亲本进行扫描和鉴定，为今后育种工作的开展提供理论保障，具有省时、高通量、快速、准确、操作方便、鉴定结果不易受环境影响等优点；与传统基于SSR标记构建的指纹图谱相比，本发明是基于控制小麦中产量、品质性状的26个重要功能基因开发的标记，对小麦骨干亲本品种进行功能基因指纹图谱构建，使用这些标记即可明确材料中是否携带重要的基因，可快速运用于育种实践中，具有很高的应用价值。本发明的方法可以对小麦骨干亲本携带的产量基因和品质基因进行有效甄别，从DNA水平揭示骨干亲本的本质，为小麦品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术支持，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为采用本发明方法得到的14份小麦骨干亲本品种的功能基因指纹图谱。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1
为构建我国首张小麦骨干亲本的功能基因指纹图谱，本发明利用了自 1949-2000年之间对我国小麦育种产生重大贡献的14份骨干亲本，分别为：蚂蚱麦、燕大1817、五一麦、碧蚂4号、江东门、蚰子麦、西农6028、南大2419、成都光头、阿勃、阿夫、北京8号、墨巴66、洛夫林10号。这些骨干亲本对我国小麦育种具有非同凡响的影响，例如：骨干亲本“蚂蚱麦”培育出88个优良品种；另外上世纪56-60年代的骨干亲本“南大2419”、“北京8号”、“阿勃”、“阿夫”等很好的解决了抗锈病问题，使我国小麦平均产量增加了1倍。可见骨干亲本为我国小麦育种进程有巨大推动作用，构建指纹图谱有重要意义。本发明的指纹图谱中涉及的功能基因和表型如表1所示。
表1
(1)小麦基因DNA提取：采用CTAB法提取小麦叶片组织基因组DNA，步骤如下：
A：每升CTAB缓冲液的配制：
表2
将配置好的CTAB缓冲液放入65℃水浴锅中提前预热；
B：将适量小麦叶片组织置于2.0mL离心管中，加入小钢珠，经液氮冷却后迅速用磨样机打碎；
C：加入预热的2X CTAB缓冲液800μL，待充分混匀后，置于65℃水浴锅 30min以上，水浴期间每隔几分钟颠倒混匀；
D：待水浴结束后冷却至室温，加入800μL的氯仿/异戊醇(体积比为24:1)，颠倒混匀数次至无明显的分层，4℃12000rpm离心5-10min；
E：小心吸取上清液于1.5mL离心管中，加入5μL RNaseA，混匀，37℃放置至少15min；
F：加入0.7倍体积-20℃预冷的异丙醇，缓慢上下颠倒混匀，静置30-60min 充分沉淀DNA；4℃下12000rpm离心5min；
G：弃上清或挑出DNA沉淀，加入800μL 70％乙醇，上下颠倒洗涤，12000 rpm离心2min，倒掉上清液,重复洗涤2次,放于室温或者通风厨晾干，无酒精味；
H：加入100μL 1X TE(pH＝8.0)溶解DNA,1％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA，测浓度，并将DNA稀释至40ng/μL。剩余的DNA样品-20℃保存以待备用。
(2)对上述步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，所用引物包括26对荧光标记引物，每对引物包括两条具有标签序列的正向引物，其序列如序列表SEQ ID NO.1-52所示，其中标签序列为：FAM(5’AAGGTGACCAAAGTTCATGCT 3’) 和HEX(5’AAGGTCGGAGTCAACGGATT 3’)，一条通用的反向引物，其序列如序列表SEQ ID NO.52-78所示，以保证扩增总长度<120bp，详见表3，扩增过程如下：在384孔荧光定量板上进行，每孔的混合反应体系共计5.0μL。混合反应体系配制过程为：包括浓度为40ng/μL待测DNA样品2.2μL，KASP Low Mixture2.5μL，Mg2+0.04μL，引物溶液0.056μL，dd H2O 0.204μL；引物溶液的组成为：在体积为100μL的溶液中包括浓度为100μM的两条正向引物各12μL，通用反向引物30μL，dd H2O 46μL。
KASP扩增程序为：94℃，预变性15min；然后95℃，变性20s；65℃梯度退火并延伸25s，10个循环，每个循环下降1℃；最后95℃变性10s；57℃退火并延伸1min，30个循环；4℃保存；
(3)待反应完成后，利用QuantStudioTM 7Flex荧光定量仪(Applied Biosystemsby Life Technologies)收集扩增产物的荧光信号，对产物分型检测；通过QuantStudioTMReal-time PCR Software v1.3(Applied Biosystems by Life Technologies)实现数据的可视化及结果判读，同一位点不同等位变异呈现不同颜色，相同等位变异类型的材料以相同颜色的点通过二维聚类图展示，以阴性对照(ddH2O)为判定基点，14份骨干亲本根据其携带的等位变异类型将以不同颜色的点呈现在相应坐标上，在上述26个基因位点的基础上，构建了14份小麦骨干亲本的指纹图谱，其中每个基因的两种等位变异用黑白两种颜色表示，结果如表3和图1所示。
表3
本发明提供的小麦骨干亲本功能基因指纹图谱的构建方法中，包括和产量、品质性状相关的基因共26个，利用其差异位点开发的功能标记，利用PCR扩增技术、KASP基因分型技术对小麦品种进行鉴定，可在短时间内完成小麦骨干亲本功能基因品种鉴定，该图谱基本包含目前育种家所关注的重要农艺性状，对育种产生重大作用的骨干亲本进行扫描和鉴定，为今后育种工作的开展提供理论保障，具有省时、高通量、快速、准确、操作方便、鉴定结果不易受环境影响等优点；与传统基于SSR标记构建的指纹图谱相比，本发明是基于控制小麦产量、品质性状的26个重要功能基因开发的标记，对小麦骨干亲本品种进行功能基因指纹图谱构建，使用这些标记即可明确骨干亲本是否携带重要的基因，可快速运用于育种实践中，具有很高的应用价值。本发明的方法可以对小麦骨干亲本携带的功能基因进行有效甄别，从DNA水平揭示骨干亲本形成的原因，为小麦品种选育过程中优异种质的合理利用提供了技术支持，具有良好的应用前景。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
序列表
<110> 遵义医科大学
<120> 一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱及其构建方法和应用
<160> 77
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc taagtgtaac ttctccgcaa cg 42
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat tacctaagtg taacttctcc gcaaca 46
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaggtgacc aagttcatgc tgtggaatat tagtgatggc gtgag 45
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtcgga gtcaacggat tgtggaatat tagtgatggc gtgac 45
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtgacc aagttcatgc tatagtatga aacctgctgc ggag 44
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaggtcgga gtcaacggat tatagtatga aacctgctgc ggac 44
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaggtgacc aagttcatgc taactgccaa caacttcgct a 41
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaggtcgga gtcaacggat tttgtctagt accccgctct g 41
<210> 9
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaaggtgacc aagttcatgc tctcatgctc acagccgcc 39
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaaggtcgga gtcaacggat tcctcatgct cacagccgct 40
<210> 11
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaggtgacc aagttcatgc tgcacctagc aataaataaa cgggag 46
<210> 12
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaaggtcgga gtcaacggat tagaaaaaag ccattaaata aacgggac 48
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 14
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaggtcgga gtcaacggat tcatccgtat gtagtcccaa ttgaa 45
<210> 15
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gaaggtgacc aagttcatgc tgacgacctg cacctttctg t 41
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gaaggtcgga gtcaacggat tgacgacctg cacctttctg a 41
<210> 17
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gaaggtgacc aagttcatgc taagagacca gcagatcgat g 41
<210> 18
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gaaggtcgga gtcaacggat taagagacca gcagatcgat c 41
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gaaggtgacc aagttcatgc tgtgaagaat aaaggcctca t 41
<210> 20
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
gaaggtcgga gtcaacggat tgtgaagaat aaaggcctca c 41
<210> 21
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gaaggtgacc aagttcatgc tccatgcact tggacctaat ag 42
<210> 22
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gaaggtcgga gtcaacggat tccatgcact tggacctaat ac 42
<210> 23
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gaaggtgacc aagttcatgc tggatcgatc tcctgaacag gatgtc 46
<210> 24
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gaaggtcgga gtcaacggat tggatcgatc tcctgaacag gatgtg 46
<210> 25
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gaaggtgacc aagttcatgc tcatattgca atctctatga ggctag 46
<210> 26
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gaaggtcgga gtcaacggat tcatattgca atctctatga ggctac 46
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gaaggtgacc aagttcatgc tttcgacgac cggctcttcc cg 42
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gaaggtcgga gtcaacggat tttcgacgac cggctcttcc ca 42
<210> 29
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gaaggtgacc aagttcatgc tgatttgatc catgccctct c 41
<210> 30
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gaaggtcgga gtcaacggat tgatttgatc catgccctct t 41
<210> 31
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gaaggtgacc aagttcatgc tcaattgctt atgttctgtt gtatgg 46
<210> 32
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gaaggtcgga gtcaacggat tcaattgctt atgttctgtt gtacat 46
<210> 33
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gaaggtgacc aagttcatgc tagcaatggg ggagactgct ggagg 45
<210> 34
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gaaggtcgga gtcaacggat tagcaatggg ggagactgct ggaga 45
<210> 35
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gaaggtcgga gtcaacggat tgcggtgtcc ttgagcttct ca 42
<210> 36
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
gaaggtgacc aagttcatgc ttttatttaa aatttgatga acttttcata aac 53
<210> 37
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gaaggtcgga gtcaacggat ttttatttaa aatttgatga acttttcaca aat 53
<210> 38
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gaaggtgacc aagttcatgc tggtcgatga gatcccgtac aa 42
<210> 39
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gaaggtcgga gtcaacggat tggtcgatga gatcccgtac ag 42
<210> 40
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gaaggtgacc aagttcatgc tgttggtgtc atttgtaaag ccca 44
<210> 41
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
gaaggtcgga gtcaacggat tgttggtgtc atttgtaaag cccc 44
<210> 42
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gaaggtgacc aagttcatgc tctgcgcttc accaacggtg ttgacgtcg 49
<210> 43
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gaaggtcgga gtcaacggat tctgcgcttc accaacggtg ttgacgtca 49
<210> 44
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gaaggtgacc aagttcatgc tatgcatgca tgcatgcgt 39
<210> 45
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gaaggtcgga gtcaacggat tcgtcgatag tctcatgcat atgc 44
<210> 46
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gaaggtgacc aagttcatgc tgccaagaaa tgtcgctctc ag 42
<210> 47
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
gaaggtcgga gtcaacggat tgccaagaaa tgtcgctctc at 42
<210> 48
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gaaggtgacc aagttcatgc tataactgct caccccccac c 41
<210> 49
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gaaggtcgga gtcaacggat tcacggtaga ggagccggtt c 41
<210> 50
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gaaggtgacc aagttcatgc tcggaaagct tagaaatgca cgg 43
<210> 51
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gaaggtcgga gtcaacggat tcggaaagct tagaaatgca cgt 43
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
cgaagaagct tggcctggat agtat 25
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ttcttctctc gttggcctta tcgc 24
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tactaaaaag gtattaccca agtgtaactt 30
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
atgaaggccc tcttcctcat agg 23
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gtcacctggc ccacaaaatg 20
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
tgttttggtg gtggtgaaga tga 23
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
accctagtat tgtaccttag ttcaaac 27
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
caaacccacg cagggacaag t 21
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tactggcctg gcggtacatg at 22
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
gcctaatttg attcttccac ac 22
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
aagccgacgc ggattttgaa 20
<210> 63
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
cgaaagcgtc gaaccaagga atcctc 26
<210> 64
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
ggcagaaatg tattagcaaa caaaacc 27
<210> 65
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
aaggaagtcc gggctcatgg tggggtca 28
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ctgtcgttca acatcattgt ctg 23
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
atggttatgc ttgaatggaa gagc 24
<210> 68
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gctgtggatg cggctcaggg cgcg 24
<210> 69
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
actgctgagt acaatgccgc gatccca 27
<210> 70
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
catcgaattg aagaaaagtt cacgc 25
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
cgagctaggg tttgttgcga gc 22
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
aggcttgtca aaacgtgggg tcc 23
<210> 73
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gtgaagtaga cttgacccgt aacttgat 28
<210> 74
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
aacttttcac ggtgaacag 19
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
caagaatttt gggacggagg ga 22
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
atatgtaggg caggaagggc 20
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
cacctctaat ccaatgcgat cc 22
Claims (10)
1.一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取供试小麦骨干亲本材料的DNA；
(2)对上述步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，所用引物包括26对荧光标记引物，每对引物包括两条具有标签序列的正向引物，其序列如序列表SEQ ID NO.1-52所示，一条通用的反向引物，其序列如序列表SEQ ID NO.52-78所示；
(3)收集扩增产物的荧光信号，对产物进行分型检测。
2.根据权利要求1所述一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱的构建方法，其特征在于，所述小麦的功能基因包括产量性状相关的基因和品质性状相关的基因：所述产量性状相关的基因包括控制千粒重的基因7个，分别是Sus1-7A、Sus1-7B、Sus2-2A、Sus2-2B、Cwi-4A、TGW6、GS-D1；控制粒型的基因3个，分别是GASR-A1、GW2-6A和GW2-6B；控制穗粒数的基因2个，分别是CKX-D1和MOC-7A；所述和品质相关的基因包括影响面筋强度的基因3个，分别是Glu-B1、Glu-A1和Glu-D1；影响籽粒硬度的基因3个，分别是Pina-D1、Pinb-D1和Pinb2-B2；影响支链淀粉的基因Wx-B1；影响多酚氧化酶基因Ppo-A1和Ppo-D1；影响过氧化物酶的基因Pod-A1；影响黄色素含量的基因4个，分别是Zds-A1、Lcy-B1、Pds-B1和Psy-B1。
3.根据权利要求1所述一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱的构建方法，其特征在于，上述步骤(1)中DNA的提取过程如下：
A：配置CTAB缓冲液，放入65℃水浴锅中预热；
B：取适量小麦叶片组织经液氮冷却后打碎，加入上述步骤A中预热后的CTAB缓冲液，混合均匀后水浴加热；
C：将上述步骤B的混合物冷却至室温，加入氯仿和异戊醇的混合溶剂，混合均匀后，离心，取上清液，加入RNaseA，混匀，室温放置一段时间；
D：向上述步骤C的混合物中加入预冷的异丙醇，混合均匀后，静置沉淀，离心后取沉淀加入乙醇溶液洗涤，干燥后即得待测的DNA样品。
4.根据权利要求3所述一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱的构建方法，其特征在于，上述步骤A中CTAB缓冲液的配置过程如下：每升CTAB缓冲液加入20g CTAB，200mL pH＝8.0的1.0M Tris-HCl缓冲液，81g NaCl，40mL 0.5M EDTA，10g 1％PVP。
5.根据权利要求3所述一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱的构建方法，其特征在于，上述步骤C中氯仿和异戊醇的体积比为24:1；上述步骤D中加入0.7倍体积在-20℃预冷的异丙醇。
6.根据权利要求1所述一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱的构建方法，其特征在于，PCR扩增反应体系包括浓度为40ng/μL待测DNA样品2.2μL，KASP Low Mixture 2.5μL，Mg2+0.04μL，引物溶液0.056μL，dd H2O 0.204μL；扩增程序为：94℃，预变性15min；然后95℃，变性20s；65℃梯度退火并延伸25s，10个循环，每个循环下降1℃；最后95℃变性10s；57℃退火并延伸1min，30个循环；4℃保存。
7.根据权利要求6所述一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱的构建方法，其特征在于，上述步骤(2)中PCR扩增中引物溶液的组成为：在体积为100μL的溶液中包括浓度为100μM的两条正向引物各12μL，通用反向引物30μL，dd H2O 46μL。
8.根据权利要求7所述一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱的构建方法，其特征在于，上述步骤(3)中待PCR反应完成后，收集扩增产物的荧光信号，对产物进行分型检测，同一位点不同等位变异呈现不同颜色，相同等位变异类型的材料以相同颜色的点通过二维聚类图展示，每个基因的两种等位变异用黑白两种颜色表示，构建小麦的指纹图谱。
9.一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱，其特征在于，由权利要求1至8任一项所述方法构建得到。
10.如权利要求9所述小麦骨干亲本功能基因指纹图谱在小麦品种鉴定方面的应用。
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| CN202010605872.6A CN111662966A (zh) | 2020-06-29 | 2020-06-29 | 一种小麦骨干亲本功能基因指纹图谱的构建方法及其应用 |
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2020
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