CN104560889A

CN104560889A - 猪流行性腹泻病毒分离技术

Info

Publication number: CN104560889A
Application number: CN201410673855.0A
Authority: CN
Inventors: 李明义; 张玉杰; 刘阳; 李晓林; 张伦; 冯晶晶; 李佳棋; 单学强; 王相芹; 朱浩; 葛栋; 罗济冠; 李世鑫; 李朝阳
Original assignee: SHANDONG SINDER TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANDONG SINDER TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-11-21
Filing date: 2014-11-21
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明提供猪流行性腹泻病毒分离技术。本发明包括以下步骤：用支原体去除剂将Vero细胞的支原体去除，进行细胞培养；对培养后的细胞注入胰蛋白酶的猪流行性腹泻病毒滤液，静置培养，收集猪流行性腹泻病毒液。本发明猪流行性腹泻病毒滤液与去除支原体以后的Vero细胞相互作用，在胰蛋白酶的作用下，产生明显细胞病变效应的时间稳定，没有支原体对细胞的干扰，从而使得收获猪流行性腹泻病毒时，病毒滴度高。由以前的10^3.64半数组织培养感染剂量升高到10^5.38TCID₅₀，提高了近2个滴度；细胞产生病变的时间推后，由以前的24-48h推迟到72h。

Description

猪流行性腹泻病毒分离技术

技术领域

本发明涉及畜用生物制品领域，特别涉及猪流行性腹泻病毒分离技术。

背景技术

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的猪的一种急性肠道传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征。俗称冬季拉稀病。其病原属于冠状病毒科冠状毒病属。

猪流行性腹泻病毒可在猪群中持续存在，各种年龄的猪都易感。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率可达100％，尤其以哺乳仔猪严重。本病主要在冬季多发，夏季也可发生。中国从12月份至次年2月份为本病的高发期。常常是有一头猪发病后，同圈或邻圈的猪在1周内相继发病，病毒多经发病猪的粪便排出，运输车辆、饲养员的鞋子或其他带病毒的动物，都可作为传播媒介，造成较高的死亡率和损失。而现有的方法得到的病毒滴度低，限制高滴度的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗的研制。

现有技术常使用生长良好的Vero细胞，依次进行连续传三代，将第三代的细胞收获冻存，留3瓶T-25方瓶细胞进行后面的实验。将续传后的3瓶T-25方瓶细胞用20μg/ml胰蛋白酶的无血清DMEM洗3遍，10min/遍。将含20μg/ml胰蛋白酶的PEDV滤液2ml，37℃条件下静置1.5h以后注入3瓶T-25方瓶细胞中，每瓶2ml，37℃条件下静置1.0h。弃掉T-25方瓶中液体，然后加入20μg/ml胰蛋白酶的DMEM维持液，37℃静置培养96h，收集猪流行性腹泻病毒液，并对病毒进行稀释。细胞病变效应(CPE)和半数组织培养感染剂量(TCID₅₀)数据记录结果如表1所示。

表1 CPE和TCID₅₀数据记录结果

观察结果

累计结果

病毒稀释	CPE数	无CPE数	CPE(％)	CPE数	无CPE数	CPE(％)
							10^-2	6	0	100	13	0	100
10^-3	5	1	83	7	1	88
							10^-4	2	4	33	2	5	29
10^-5	0	6	0	0	11	0
							10^-6	0	6	0	0	11	0

距离比例＝(88％-50％)/(88％-29％)＝0.64

LogTCID₅₀＝高于50％的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数

＝-3+0.64×(-1)＝-3.64

则：TCID₅₀＝10^-3.64

即：将病毒悬液作10^3.64稀释后，给细胞培养物接种0.1ml，可以使50％的细胞产生CPE。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供猪流行性腹泻病毒分离技术，用以得到高滴度的猪流行性腹泻病毒。

本发明提供了猪流行性腹泻病毒分离技术，为了对披露的实施例的一些方面有一个基本的理解，下面给出了简单的概括。

本发明的猪流行性腹泻病毒分离技术，包括以下步骤：用支原体去除剂将Vero细胞的支原体去除，进行细胞培养；对培养后的细胞注入胰蛋白酶的猪流行性腹泻病毒滤液，静置培养，收集猪流行性腹泻病毒液。

其中，以下菌株保藏于中国典型培养物保藏中心：

猪流行性腹泻病毒HB-JA株

Coronavirus Porcine epidemic

diarrher virus HB-JA strain，PEDV HB-JA；

保藏编号：CCTCC NO：V201429；

保藏日期：2014年10月23日；

保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学；

简称为猪流行性腹泻病毒，英文缩写为PEDV。

本发明的有益效果如下：

本发明猪流行性腹泻病毒滤液与祛除支原体以后的Vero细胞相互作用，在胰蛋白酶的作用下，产生明显细胞病变效应的时间稳定，没有支原体对细胞的干扰，从而使得收获猪流行性腹泻病毒时，病毒滴度高。由以前的10^3.64半数组织培养感染剂量(TCID₅₀)升高到10^5.38TCID₅₀，提高近2个滴度；细胞产生病变的时间推后，由以前的24-48h推迟到72h。

为了上述以及相关的目的，一个或多个实施例包括后面将详细说明并在权利要求中特别指出的特征。

附图说明

图1是本发明的猪流行性腹泻病毒接毒细胞示意图；

图2是本发明的未进行接毒的对照细胞；

图3是本发明实施例电泳图；

图4是本发明实施例细胞病变48小时时的光镜照片；

图5是本发明实施例细胞病变72小时时的光镜照片。

具体实施方式

以下优选实施例，对本发明作详细描述，以使本领域的技术人员能够实践它们。

下面对本发明做详细描述。

猪流行性腹泻病毒分离技术，包括以下步骤：用支原体去除剂将Vero细胞的支原体去除，进行细胞培养；对培养后的细胞注入胰蛋白酶的猪流行性腹泻病毒滤液，静置培养，收集猪流行性腹泻病毒液。

其中，本发明猪流行性腹泻病毒滤液与祛除支原体以后的Vero细胞相互作用，在胰蛋白酶的作用下，产生明显细胞病变效应的时间稳定，没有支原体对细胞的干扰，从而使得收获猪流行性腹泻病毒时，病毒滴度高。由以前的10^3.5TCID₅₀升高到10^5.5TCID₅₀，提高2个滴度；细胞产生病变的时间推后，由以前的24-48h推迟到72h。支原体去除剂选用Sigma去除试剂盒试剂。

在一些说明性实施例中，所述细胞培养包括：将所述去除支原体的Vero细胞连续传2-4代，使用牛胰蛋白酶的无血清DMEM维持液将经过续传2-4代的所述Vero细胞洗2-4遍。

在一些说明性实施例中，所述去除支原体的Vero细胞连续传3代。

在一些说明性实施例中，将经过续传2-4代的所述Vero细胞洗3遍。

在一些说明性实施例中，所述牛胰蛋白酶的无血清DMEM维持液为50μg/ml。

在一些说明性实施例中，所述对培养后的细胞注入胰蛋白酶的猪流行性腹泻病毒滤液的步骤包括：将牛胰蛋白酶的猪流行性腹泻病毒滤液注入洗过的所述第2-4代细胞，37℃条件下静置，弃掉液体，加入牛胰蛋白酶的DMEM维持液，37℃静置培养，收集猪流行性腹泻病毒液。

其中，牛胰蛋白酶是一种较普通胰酶(例如，猪胰酶)裂解PEDV的S蛋白效率高的一种蛋白酶，裂解产生的PEDV S1基因片段和PEDV S2的基因片段增强PEDV对Vero细胞的感染力。

在一些说明性实施例中，所述牛胰蛋白酶的猪流行性腹泻病毒滤液使用前在37℃条件下，静置1.5h。

在一些说明性实施例中，所述猪流行性腹泻病毒分离技术还包括以下步骤：将所述猪流行性腹泻病毒液在-20℃条件下冻融1-3次；冻融后将所述猪流行性腹泻病毒进行盲传处理。

在一些说明性实施例中，所述冻融次数为一次。

其中，将所述猪流行性腹泻病毒液冻融一次，保证猪流行性腹泻病毒活力，使猪流行性腹泻病毒彻底从细胞内释放出来，盲传细胞病变效应(CPE)稳定。

实施例1

取生长良好的Vero细胞，用支原体去除剂处理细胞，依次进行连续传三代，将第三代的细胞收获冻存，留6瓶T-25方瓶细胞进行后面的实验。处理组：将预留的3瓶T-25方瓶细胞培养至85％的密度，用50μg/ml牛胰蛋白酶的无血清DMEM洗3遍，10min/遍。将含50μg/ml牛胰蛋白酶的PEDV滤液6ml，37℃条件下静置1.5h以后注入3瓶T-25方瓶细胞中，每瓶2ml，37℃条件下静置1.0h。弃掉T-25方瓶中液体，然后加入50μg/ml牛胰蛋白酶的DMEM维持液，37℃静置培养96h，收集猪流行性腹泻病毒液。对照组：将预留的3瓶T-25方瓶细胞培养至85％的密度，用50μg/ml牛胰蛋白酶的无血清DMEM洗3遍，10min/遍。将含50μg/ml牛胰蛋白酶的PBS(磷酸盐缓冲液)液6ml，37℃条件下静置1.5h以后注入3瓶T-25方瓶细胞中，每瓶2ml，37℃条件下静置1.0h。弃掉T-25方瓶中液体，然后加入50μg/ml牛胰蛋白酶的DMEM维持液，37℃静置培养96h，然后收集培养液。

按照上述步骤将对照组和处理组第一次收获的细胞培养液在-20℃冻融一次，然后重复上述步骤进行盲传处理，至第3-5代，处理组Vero细胞即可出现明显的细胞病变；而对照组Vero细胞则没有任何可见变化。

将对照组的Vero细胞和处理组的Vero细胞，用光学显微镜观察。如图1所示，对照组细胞未见病毒噬斑；如图2所示，而经过PEDV处理组却发现有许多病毒噬斑(图中深棕色区域)存在，形成一个个大的空斑。

随着处理组Vero细胞盲传的进行，Vero细胞的病变效应逐渐稳定下来，取处理组盲传病变效应稳定后的第8代细胞培养液进行半数组织培养感染剂量(TCID₅₀)试验，数据记录结果如表2所示。

将收获的对照组和处理组细胞培养液反复冻融三次，提取RNA并反转录，进行聚合酶链反应(PCR)，扩增PEDV特异性M基因，上、下游引物分别为：上游(5’-ATGTCTAACGGTTCTATTCCCG-3’)；下游(5’-TTAGACTAAATGAAGCACTTTCTC-3’),结果如图3所示。处理组电泳后出现目的条带，如白色箭头所示大小约500bp左右，对照组未发现目的条带。将目的条带进行切胶回收，连接，转化，测序后到NCBI上BLAST比对发现，图中目的条带的确是PEDV特异性M基因的片段。如下所示序列：

ATGTCTAACGGTTCTATTCCCGTTGATGAGGTGATTCAACACCTTAGAAACTGGAATTTCACATGGAATATCATACTGAC

GATACTACTTGTAGTGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTACTCTGCGTTCTTGTATGGTGTCAAGATGGCTATTCTATGGA

TACTTTGGCCTCTTGTGTTAGCACTGTCACTTTTTGATGCATGGGCTAGCTTTCAGGTCAATTGGGTCTTTTTTGCTTTC

AGCATCCTTATGGCTTGCATCACTCTTATGCTGTGGATAATGTACTTTGTCAATAGCATTCGGTTGTGGCGCAGGACACA

TTCTTGGTGGTCTTTCAATCCTGAAACAGACGCGCTTCTCACAGATAGTGAGAAAGTGCTTCATTTAGTCTAA

表2 实施例1CPE(细胞致病作用)和TCID₅₀数据记录结果

距离比例＝(67％-50％)/(67％-22％)＝0.38

LogTCID₅₀＝高于50％的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数＝-5+0.38×(-1)＝-5.38

则：TCID₅₀＝10^-5.38

即：将病毒悬液作10^5.38稀释后，给细胞培养物接种0.1ml，可以使50％的细胞产生CPE。

利用本发明的方法，由以前的10^3.64TCID₅₀升高到10^5.38TCID₅₀，提升了近2个滴度。

使用本发明公开的猪流行性腹泻病毒分离技术，细胞产生病变的时间推后，由以前的24-48h推迟到72h。

如图4所示，48h仅有极少的细胞出现融合，形成合包体，但大面积的细胞病变效应还未出现；如图5所示，72h后融合的细胞逐渐形成一个个大的肉眼可见的空斑，病变效应明显。

熟练的技术人员可以针对每个特定应用，以变通的方式实现所描述的功能，但是，这种实现决策不应解释为背离本公开的保护范围。

Claims

1.猪流行性腹泻病毒分离技术，其特征在于，包括以下步骤：

用支原体去除剂将Vero细胞的支原体去除，进行细胞培养；对培养后的细胞注入胰蛋白酶的猪流行性腹泻病毒滤液，静置培养，收集猪流行性腹泻病毒液。

2.根据权利要求1所述的分离技术，其特征在于，所述细胞培养包括：

将所述去除支原体的Vero细胞连续传2-4代，使用牛胰蛋白酶的无血清DMEM维持液将经过续传2-4代的所述Vero细胞洗2-4遍。

3.根据权利要求2所述的分离技术，其特征在于，所述去除支原体的Vero细胞连续传3代。

4.根据权利要求2所述的分离技术，其特征在于，将经过续传2-4代的所述Vero细胞洗3遍。

5.根据权利要求2所述的分离技术，其特征在于，所述牛胰蛋白酶的无血清DMEM维持液为50μg/ml。

6.根据权利要求2所述的分离技术，其特征在于，所述对培养后的细胞注入胰蛋白酶的猪流行性腹泻病毒滤液的步骤包括：

将牛胰蛋白酶的猪流行性腹泻病毒滤液注入洗过的所述第2-4代细胞，37℃条件下静置，弃掉液体，加入牛胰蛋白酶的DMEM维持液，37℃静置培养，收集猪流行性腹泻病毒液。

7.根据权利要求6所述的分离技术，其特征在于，所述牛胰蛋白酶的猪流行性腹泻病毒滤液使用前在37℃条件下，静置1.5h。

8.根据权利要求1所述的分离技术，其特征在于，所述猪流行性腹泻病毒分离技术还包括以下步骤：将所述猪流行性腹泻病毒液在-20℃条件下冻融1-3次；冻融后将所述猪流行性腹泻病毒进行盲传处理。

9.根据权利要求8所述的分离技术，其特征在于，所述冻融次数为一次。

10.根据权利要求1所述的分离技术，其特征在于，所述Vero细胞为非洲绿猴肾细胞。