CN104560793A - 开菲尔乳杆菌kl22、其筛选方法及应用 - Google Patents

开菲尔乳杆菌kl22、其筛选方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种开菲尔乳杆菌KL22、其筛选方法及应用，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC？No.9669，保藏日期为2014年9月16日。筛选出的开菲尔粒依次通过分离、纯化、糖发酵特性实验、分子生物学鉴定、耐酸耐胆盐特性实验、肠细胞粘附特性实验、抑制有害菌特性实验和菌株发酵特性实验，最终筛选出开菲尔乳杆菌KL22。筛选出的KL22可以制备含有开菲尔乳杆菌KL22的酸牛奶、乳酸菌饮料、菌粉制剂。本发明适用于开菲尔乳杆菌KL22的筛选，及含开菲尔乳杆菌KL22功能性乳制品和益生菌菌粉的制备。

Description

开菲尔乳杆菌KL22、其筛选方法及应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种乳杆菌及其筛选方法，具体涉及一种开菲尔乳杆菌KL22、其筛选方法及应用。
背景技术
目前我国规定可用于食品的益生菌仅有双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌干酪亚种、嗜热链球菌。开菲尔发酵乳具有众多的益生功能，开菲尔粒含多种生理性有益菌，黏附定植于肠道中与病原菌竞争黏附位点、营养物质，其代谢的产物乳酸、醋酸可降低肠道pH值；产生的抑菌物质过氧化氢、细菌素等，能有效抑制致病性微生物在肠道中的定植。因此，从开菲尔粒中筛选具有明显功能特性的乳酸菌具有非常重要的现实意义。
中国发明专利CN102559561A公开了“一种食源性乳酸菌及其应用”，公开了一株食源性乳酸菌，乳酸菌的保藏号为CCTCC NO:M2011381，为从臭豆腐卤液中分离出的一株具有抑菌作用的乳酸菌，可添加到食品中用作食品添加剂。而目前国内外报道表明，采用开菲尔粒发酵的发酵乳具有抑制有害菌的作用，但是采用开菲尔粒制备发酵乳所带有的特殊口味为我国消费者所难以接受，并且直接采用开菲尔粒进行大规模工业化生产，操作步骤繁琐、容易造成污染及批次间差异较大。因此，从开菲尔粒中筛选具有抑菌作用的乳酸菌并将其应用于发酵乳制备中具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题，是提供一种开菲尔乳杆菌KL22（Lactobacilus kefiri strain ）它是从波兰卡里什带回的开菲尔粒中分离筛选出来，该益生菌开菲尔乳杆菌KL22是一株具有很好耐酸耐胆盐特性、发酵特性和黏附肠细胞、抑制有害菌生长的菌株。
本发明的开菲尔乳杆菌（Lactobacilus kefiri）KL22，已于2014年9月16日，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC9669，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的另一个发明目的是筛选出的开菲尔粒，依次通过分离、纯化、糖发酵特性实验、分子生物学鉴定、耐酸耐胆盐特性实验、肠细胞粘附特性实验、抑制有害菌特性实验和菌株发酵特性实验，最终筛选出开菲尔乳杆菌KL22。
本发明还有一个发明目的是开菲尔乳杆菌KL22的应用，制备了含有开菲尔乳杆菌KL22的酸牛奶、乳酸菌饮料、菌粉制剂。与已有乳杆菌相比，开菲尔酸奶乳杆菌KL22对低pH值和高胆汁酸盐具有更强的抗性，具有更好的耐受人消化道不良环境的能力，可以更好地发挥其益生作用。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
一种开菲尔乳杆菌KL22，该菌菌株已于2014年9月16日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC No.9669。
作为本发明的一种限定，其16SrDNA序列结果如下：
TTACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCTGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTAGGCCATTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTAAACCAAAACCATGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTTTGGTGTTAAATCATTCAAATGCAAGCACCTAAAATCAATAACGGAAACGCG
   本发明还提供了上述开菲尔乳杆菌KL22的筛选方法，它按照以下步骤顺序进行：
    （1）开菲尔粒来源
    所选用的开菲尔粒源自波兰卡利什；
    （2）菌株的分离、纯化
a、将开菲尔粒在脱脂奶中活化3代，取开菲尔粒1g，用灭菌生理盐水洗涤后，在灭菌的研钵中研磨成浆，加入9ml生理盐水进行稀释，取1ml稀释液进行稀释，将稀释度为104、105和106稀释液涂布在溴甲酚紫-MRS琼脂平板上；
b、将开菲尔粒按5%的接种量接入灭菌的脱脂奶中，30℃培养24h,吸取开菲尔粒发酵乳1ml，用生理盐水进行适当稀释，取稀释度为106、107、108的稀释液涂布溴甲酚紫-MRS琼脂平板；
c、将步骤a和b涂布的溴甲酚紫-MRS琼脂平板置于37℃下厌氧培养72h；取上述平板生长良好，具有典型菌落形态并出现颜色变化的菌落进行划线分离，在需氧条件下反复纯化3次；再经革兰氏染色和接触酶反应，挑出革兰氏阳性、接触酶阴性的菌株进行保存备用，共挑选出疑似乳酸菌50株，其中包括38株杆菌和12株球菌;
（3）糖发酵特性实验
将上述分离纯化38株革兰氏阳性、接触酶阴性疑似乳杆菌菌株挑取单菌落进行平板划线，37℃培养48h，分别挑取一接种环菌株接入糖发酵管中于37℃下培养48h，观察颜色变化，最终根据糖发酵实验颜色变化不同将38株菌株分为8类；
（4）分子生物学鉴定
将上述38株菌株进行分子生物学鉴定，通过DNA提取、PCR扩增，16SrDNA测序， NCBI网站blast最终确定38株菌株中包括14株开菲尔乳杆菌、10株保加利亚乳杆菌、8株短乳杆菌、6株瑞士乳杆菌；
（5）耐酸耐胆盐特性实验
将上述14株开菲尔乳杆菌分别挑取1接种环纯化菌株接种到MRS培养基中，于37℃培养48h，取出计数；同时，各取1mL该培养基，分别加入到pH为2.5的磷酸盐缓冲液和3‰含牛胆盐的MRS培养溶液中37℃孵育，于0h、3h进行菌数的测定，并计算其存活率；最终筛选出6株菌，分别为KL02、KL03、KL10、KL18、KL22和KL36；
（6）肠细胞粘附特性实验
将肠上皮细胞以每孔1 mL细胞悬液加入加有盖玻片的24孔板中,于37℃培养箱中孵育48h；待细胞贴壁完全,以无菌PBS洗涤2次,每孔加入1 mL浓度为108 个/mL的乳酸菌悬液,孵育1 h；然后取出盖玻片,用无菌PBS漂洗3次, 然后用质量分数为4%多聚甲醛固定30 min,烘干后用结晶紫染色, 于显微镜下观察，随机挑选20个视野,每个视野50个细胞,计算其表面粘附的乳酸菌数量并取3次实验的平均值表示细胞的粘附能力，最终筛选出4株菌，分别为KL02、KL10、KL18和KL22；
（7）抑制有害菌特性实验
对上述4株具有较好肠上皮细胞黏附特性的菌株进行痢疾志贺氏菌黏附拮抗作用实验，将肠上皮细胞以每孔1 mL细胞悬液加入24孔板中,于37℃培养箱中孵育48h；待细胞贴壁完全,以无菌PBS洗涤2次,每孔加入108个/ml乳酸菌,孵育30min，除去未黏附的乳酸菌，再加入107个/ml的痢疾志贺氏菌，孵育30min；然后取出盖玻片,用无菌PBS漂洗3次, 然后用质量分数为4%多聚甲醛固定30 min,烘干后用结晶紫染色, 于显微镜下观察，随机挑选20个视野,每个视野50个细胞,计算其表面粘附的乳酸菌数量并取3次实验的平均值表示细胞的粘附能力，最终筛选出KL02和KL22两株菌；
（8）菌株发酵特性实验
取鲜牛奶200份，白砂糖18份，调配均匀后，于65℃、15MPa下均质，95℃杀菌300s后，降温至35-40℃，按照106cfu/ml分别接种KL02和KL22，于37℃发酵24h，发酵结束后对发酵样品进行感官品评，根据感官品评结果最终筛选出抑制肠道有害菌作用的开菲尔乳杆菌KL22。
作为本发明的一种限定，步骤（3）中所述的糖发酵管中包括：水杨苷、核糖、***糖、麦芽糖、甘露醇、纤维二塘、蔗糖、棉子糖和山梨醇。
本发明还提供了上述抑制肠道有害菌作用的开菲尔乳杆菌KL22的应用，该开菲尔乳杆菌应用于制备功能性乳制品和益生菌菌粉。
由于采用了上述的技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
1、本发明采用的菌株是由开菲尔粒中筛选出的一株开菲尔乳杆菌KL22，该菌株具有很好的耐酸耐胆盐特性，即通过人体胃和肠道时能够很好的存活，从而可以很好的在人体中发挥益生作用；
2、本发明采用的菌株具有很好的黏附肠道和抑制病原菌的作用，因此具有很好的调节肠道和抑制病原菌侵袭的作用，可用于益生菌菌粉的制备。
3、本发明采用的菌株具有良好的发酵特性，因此，可以将其应用于功能性乳制品的开发中。
本发明适用于开菲尔乳杆菌KL22的筛选，及含开菲尔乳杆菌KL22功能性乳制品和益生菌菌粉的制备。
本发明下面将结合说明书附图与具体实施例作进一步详细说明。
附图说明
图1为本发明实施例1开菲尔乳杆菌KL22与其他乳酸菌基于16SrDNA的菌株进化树图。
具体实施方式
实施例１   开菲尔乳杆菌KL22及其筛选方法
开菲尔乳杆菌KL22，该菌株已于2014年9月16日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC No.9669。
其16SrDNA序列结果如下：
TTACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCTGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTAGGCCATTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTAAACCAAAACCATGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTTTGGTGTTAAATCATTCAAATGCAAGCACCTAAAATCAATAACGGAAACGCG
该菌株基本特征如下表所示：
上述开菲尔乳杆菌KL22的筛选方法，它按照以下步骤顺序进行：
    （1）开菲尔粒来源
    所选用的开菲尔粒源自波兰卡利什；
    （2）菌株的分离、纯化
    a、将开菲尔粒在脱脂奶中活化3代，取开菲尔粒1g，用灭菌生理盐水洗涤后，在灭菌的研钵中研磨成浆，加入9ml生理盐水进行稀释，取1ml稀释液进行稀释，将稀释度为104、105和106稀释液涂布在溴甲酚紫-MRS琼脂平板上；
b、将开菲尔粒按5%的接种量接入灭菌的脱脂奶中，30℃培养24h,吸取开菲尔粒发酵乳1ml，用生理盐水进行适当稀释，取稀释度为106、107、108的稀释液涂布溴甲酚紫-MRS琼脂平板；
c、将步骤a和b涂布的溴甲酚紫-MRS琼脂平板置于37℃厌氧培养72h；取上述平板生长良好，具有典型菌落形态并出现颜色变化的菌落进行划线分离，在需氧条件下反复纯化3次；再经革兰氏染色和接触酶反应，挑出革兰氏阳性、接触酶阴性的菌株进行保存备用，共挑选出疑似乳酸菌50株，其中包括38株杆菌和12株球菌;
（3）糖发酵特性实验
将上述分离纯化38株革兰氏阳性、接触酶阴性疑似乳杆菌菌株挑取单菌落进行平板划线，37℃培养48h，分别挑取一接种环菌株接入糖发酵管中进行37℃培养48h，观察颜色变化，最终根据糖发酵实验颜色变化不同将38株菌株分为8类；
其中，糖发酵管中包括：水杨苷、核糖、***糖、麦芽糖、甘露醇、纤维二塘、蔗糖、棉子糖、山梨醇。
注：“+”表示发酵利用；“-”表示不发酵利用。
（4）分子生物学鉴定
将上述38株菌株进行分子生物学鉴定，通过DNA提取、PCR扩增，16SrDNA测序， NCBI网站blast最终确定38株菌株中包括14株开菲尔乳杆菌、10株保加利亚乳杆菌、8株短乳杆菌、6株瑞士乳杆菌；
根据测序结果，该菌株进化树结果如图1所示。
14株开菲尔乳杆菌的16SrDNA测序结果如下：
KL01菌株16SrDNA序列为：
TACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCTGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTAGGCCATTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTAAACCAAAACCATGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTTTCGTGTTAAATCATTCAAATGCAAGCACCTAAAATCAATAACGGAAACGCGTTCGACTG
KL02菌株16SrDNA序列为：
TTACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCTGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTAGGCCATTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTAAACCAAAACCATGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTTTCGTGTTAAATCATTCAAATGCAAGCACCTAAAATCAATAACGGAAACGCGTTCGACTG
KL03菌株16SrDNA序列为：
TTACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCTGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTAGGCCATTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTAAACCAAAACCATGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTTTCGTGTTAAATCATTCAAATGCAAGCACCTAAAATCAATAACGGAAACGCGTTCGACTG
KL10菌株16SrDNA序列为：
TTACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCTGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTAGGCCATTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTAAACCAAAACCATGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTTTCGTGTTAAATCATTCAAATGCAAGCACCTAAAATCAATAACGGAAACGCGTCGACTG
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KL18菌株16SrDNA序列为：
ACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCTGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTAGGCCATTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTAAACCAAAACCATGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTTTCGTGTTAAATCATTCAAATGCAAGCACCTAAAATCAATAACGGAAACGCGTCGACTG
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TGGTCCCGAAGGTTACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCTGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTAGGCCATTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTAAACCAAAACCATGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACT
KL22菌株16SrDNA序列为：
TTACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCTGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTAGGCCATTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTAAACCAAAACCATGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTTTGGTGTTAAATCATTCAAATGCAAGCACCTAAAATCAATAACGGAAACGCG
KL24菌株16SrDNA序列为：
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KL30菌株16SrDNA序列为：
GTTACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCTGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTAGGCCATTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTAAACCAAAACCATGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTTTCGTGTTAAATCA
KL31菌株16SrDNA序列为：
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KL36菌株16SrDNA序列为：
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KL40菌株16SrDNA序列为：
ACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCTGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTAGGCCATTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTAAACCAAAACCATGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTTTCGTGTTAAATCATTCAAATGCAAGCACCTAAAATCAATAACGGAAACGCGTTCGACTG
    （5）耐酸耐胆盐特性实验
将上述14株开菲尔乳杆菌分别挑取1接种环纯化菌株接种到MRS培养基中，37℃培养48h，取出计数；同时，各取1mL该培养基，分别加入到pH为2.5的磷酸盐缓冲液和3‰含牛胆盐的MRS培养溶液中37℃孵育，于0h、3h进行菌数的测定，并计算其存活率；最终筛选出6株菌，分别为KL02、KL03、KL10、KL18、KL22和KL36；不同开菲尔乳杆菌耐酸耐胆盐实验结果如表2所示：
表2   不同开菲尔乳杆菌耐酸耐胆盐实验结果
由上表可知，菌株KL02、KL03、KL10、KL18、KL22和KL36在酸液和胆液中的存活率均高于其他菌种，均高于1‰。
（6）肠细胞粘附特性实验
将肠上皮细胞以每孔1 mL细胞悬液加入加有盖玻片的24孔板中,于37℃培养箱中孵育48h；待细胞贴壁完全,以无菌PBS洗涤2次,每孔加入1 mL浓度为108 个/mL的乳酸菌悬液,孵育1 h；然后取出盖玻片,用无菌PBS漂洗3次, 然后用质量分数为4%多聚甲醛固定30 min,烘干后用结晶紫染色, 于显微镜下观察，随机挑选20个视野,每个视野50个细胞,计算其表面粘附的乳酸菌数量并取3次实验的平均值表示细胞的粘附能力，最终筛选出4株菌，分别为KL02、KL10、KL18和KL22；对于不同株开菲尔乳杆菌对肠上皮细胞黏附实验结果如表3所示：
表3  不同株开菲尔乳杆菌对肠上皮细胞黏附实验
由上表可知，菌株KL02、KL10、KL18和KL22对于活的乳酸菌对细胞的黏附率均大于10个/细胞，对于对于灭活的乳酸菌对细胞的黏附率均大于9个/细胞。
（7）抑制有害菌特性实验
对上述4株具有较好肠上皮细胞黏附特性的菌株进行痢疾志贺氏菌黏附拮抗作用实验，将肠上皮细胞以每孔1 mL细胞悬液加入24孔板中,于37℃培养箱中孵育48h；待细胞贴壁完全,以无菌PBS洗涤2次,每孔加入108个/ml乳酸菌,孵育30min，除去未黏附的乳酸菌，再加入107个/ml的痢疾志贺氏菌，孵育30min；然后取出盖玻片,用无菌PBS漂洗3次, 然后用质量分数为4%多聚甲醛固定30 min,烘干后用结晶紫染色, 于显微镜下观察，随机挑选20个视野,每个视野50个细胞,计算其表面粘附的乳酸菌数量并取3次实验的平均值表示细胞的粘附能力，最终筛选出KL02和KL22两株菌；对痢疾志贺氏菌黏附拮抗作用的结果如表4所示：
表4  开菲尔乳杆菌对痢疾志贺氏菌黏附拮抗作用
由上表可知，菌株KL02和KL22对痢疾志贺氏菌对细胞的黏附率无论是活菌状态还是灭活菌状态均小于KL10和KL18。
（8）菌株发酵特性
取鲜牛奶200份，白砂糖18份，调配均匀后，于65℃、15MPa下均质，95℃杀菌300s后，降温至35-40℃，分别接种KL02和KL22 106cfu/ml，于37℃发酵24h，发酵结束后对发酵样品进行感官品评，根据感官品评结果最终筛选出抑制肠道有害菌作用的开菲尔乳杆菌KL22，结果如表5所示：
表5  开菲尔乳杆菌发酵特性
菌株 所制酸奶的口感 所制酸奶的香气
KL02发酵乳 发涩，偏酸 香气一般
KL22发酵乳 顺滑，酸度适中 香气充裕
实施例2   含开菲尔乳酸菌KL22的乳酸菌饮料的制备
  将纯牛奶  50份，水  30份，蔗糖  5份混合均匀于110℃下灭菌15min制备培养基液；
  将106cfu/ml的开菲尔乳杆菌KL22 、106cfu/ml的保加利亚乳杆菌和106cfu/ml 的嗜热链球菌接入培养基液中混匀，37℃发酵至pH至4.2-4.6，终止发酵，冷却灌装。冷藏保存。
实施例3   含开菲尔乳酸菌KL22的益生菌菌粉的制备
    原料组成：开菲尔乳杆菌KL22  3%，植物乳杆菌  3%、嗜酸乳杆菌  1%、
乳双歧杆菌  1%、干酪乳杆菌  2%，低聚果糖（益生元）  80%、草莓提取物10%；
    该益生菌菌粉制备工艺为：按配方比例称取菌粉、低聚果糖、草莓提取物进行混合，在真空分装机上进行分装，2g/袋（其中活性乳酸菌总数≥4×1010cfu/袋），贴标入库，冷藏保存。
对比例
    对开菲尔乳杆菌KL22、保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、双歧乳杆菌及干酪乳杆菌（活菌、灭活菌）进行肠上皮细胞黏附实验和肠上皮细胞痢疾志贺氏菌黏附拮抗作用实验，实验结果分别如表6和表7所示：
表6 不同乳酸菌细胞黏附实验
表7   不同乳酸菌对致病菌肠上皮细胞黏附拮抗实验
由表6和表7所示，开菲尔乳杆菌KL22与保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌相比具有很好的肠上皮细胞黏附作用和抑制有害菌对肠上皮细胞的黏附作用。提示了开菲尔乳杆菌KL22可能在抑制有害菌对人体肠道侵袭方面具有更好的作用。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作出的简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明权利要求的保护范围。
Organization Applicant
----------------------
      Street : 鹿泉区石铜路36号
      City : 河北省
      State : 石家庄市
      Country : 中国
      PostalCode :
      PhoneNumber : 0311-80813256
      FaxNumber :
      EmailAddress :
<110> OrganizationName : 石家庄君乐宝乳业有限公司
 
Application Project
-------------------
<120> Title :开菲尔乳杆菌KL22、其筛选方法及应用
 
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
Sequence
--------
<213> OrganismName : Lactobacilus kefiri strain
<400> PreSequenceString :
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<212> Type : RNA
<211> Length : 1412
      SequenceName : KL22
      SequenceDescription :
 

Claims (5)

1.开菲尔乳杆菌KL22 、其筛选方法及应用，其特征在于：该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号：CGMCC No.9669，保藏日期为2014年9月16日。
2.根据权利要求1所述的开菲尔乳杆菌KL22，其特征在于：其16SrDNA序列结果如下：
TTACCTCACCGGCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTTGCTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAAGGGAACGCCTAATCTCTTAGGTTGGCAGAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCTCCTGGTTTCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCAAGATGTCAACAGTTACTCTGACACCTGTTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGAGCCGAAACCCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCCTCTCAGGTCGGCTACGTATCATTGCCTTGGTAGGCCATTACCTTACCAACAAGCTAATACGCCGCGGGTCCATCCTAAAGTGATAGCCGAAGCCATCTTTTAAACCAAAACCATGTGGTTTTGGTTGTTATACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATCCCCTACTTCAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACTCGTTTGGTGTTAAATCATTCAAATGCAAGCACCTAAAATCAATAACGGAAACGCG。
3.一种如权利要求1或2所述的开菲尔乳杆菌KL22的筛选方法，其特征在于它按照以下步骤顺序进行：
    （1）开菲尔粒来源
    所选用的开菲尔粒源自波兰卡里什；
    （2）菌株的分离、纯化
a、将开菲尔粒在脱脂奶中活化3代，取活化后的开菲尔粒1g，用灭菌生理盐水洗涤后，在灭菌的研钵中研磨成浆，加入9ml生理盐水进行稀释，取1ml稀释液进行稀释，将稀释度为104、105和106稀释液涂布在溴甲酚紫-MRS琼脂平板上；
b、将开菲尔粒按5%的接种量接入灭菌的脱脂奶中，30℃培养24h,吸取开菲尔粒发酵乳1ml，用生理盐水进行适当稀释，取稀释度为106、107、108的稀释度涂布溴甲酚紫-MRS琼脂平板；
c、将步骤a和b涂布的溴甲酚紫-MRS琼脂平板置于37℃下厌氧培养72h；取上述平板生长良好，具有典型菌落形态并出现颜色变化的菌落进行划线分离，在需氧条件下反复纯化3次；再经革兰氏染色和接触酶反应，挑出革兰氏阳性、接触酶阴性的菌株进行保存备用，共挑选出乳酸菌50株，其中包括38株杆菌和12株球菌;
（3）糖发酵特性实验
将上述分离纯化的38株革兰氏阳性、接触酶阴性乳杆菌菌株挑取单菌落进行平板划线，37℃培养48h，分别挑取一接种环菌株接入糖发酵管中于37℃下培养48h，观察颜色变化，最终根据糖发酵实验颜色变化不同将38株菌株分为8类；
（4）分子生物学鉴定
将上述38株菌株进行分子生物学鉴定，通过DNA提取、PCR扩增，16SrDNA测序， NCBI网站blast最终确定38株菌株中包括14株开菲尔乳杆菌、10株保加利亚乳杆菌、8株短乳杆菌、6株瑞士乳杆菌；
（5）耐酸耐胆盐特性实验
将上述14株开菲尔乳杆菌分别挑取1接种环纯化菌株接种到MRS培养基中，于37℃下培养48h，取出计数；同时，各取1mL接种后的培养基，分别加入到pH为2.5的磷酸盐缓冲液和3‰含牛胆盐的MRS培养溶液中，37℃孵育，于0h、3h进行菌数的测定，并计算其存活率；最终筛选出6株菌，分别为KL02、KL03、KL10、KL18、KL22和KL36；
（6）肠细胞粘附特性实验
将肠上皮细胞以每孔1 mL细胞悬液加入加有盖玻片的24孔板中,于37℃培养箱中孵育48h；待细胞贴壁完全,以无菌PBS洗涤2次,每孔加入1 mL浓度为108 个/mL的乳酸菌悬液,孵育1 h；然后取出盖玻片,用无菌PBS漂洗3次, 然后用质量分数为4%多聚甲醛固定30 min,烘干后用结晶紫染色, 于显微镜下观察，随机挑选20个视野,每个视野50个细胞,计算其表面粘附的乳酸菌数量并取3次实验的平均值表示细胞的粘附能力，最终筛选出4株菌，分别为KL02、KL10、KL18和KL22；
（7）抑制有害菌特性实验
对上述4株具有较好肠上皮细胞黏附特性的菌株进行痢疾志贺氏菌黏附拮抗作用实验，将肠上皮细胞以每孔1 mL细胞悬液加入24孔板中,于37℃培养箱中孵育48h；待细胞贴壁完全,以无菌PBS洗涤2次,每孔加入108个/ml乳酸菌,孵育30min，除去未黏附的乳酸菌，再加入107个/ml的痢疾志贺氏菌，孵育30min；然后取出盖玻片,用无菌PBS漂洗3次, 然后用质量分数为4%多聚甲醛固定30 min,烘干后用结晶紫染色, 于显微镜下观察，随机挑选20个视野,每个视野50个细胞,计算其表面粘附的乳酸菌数量并取3次实验的平均值表示细胞的粘附能力，最终筛选出KL02和KL22两株菌；
（8）菌株发酵特性
取鲜牛奶200份，白砂糖18份，调配均匀后，于65℃、15MPa下均质，95℃杀菌300s后降温至35-40℃，按照106cfu/ml分别接种KL02和KL22，于37℃发酵24h，发酵结束后对发酵样品进行感官品评，根据感官品评结果最终筛选出抑制肠道有害菌作用的开菲尔乳杆菌KL22。
4.根据权利要求3所述的开菲尔乳杆菌KL22的筛选方法，其特征在于步骤（3）中所述的糖发酵管中包括：水杨苷、核糖、***糖、麦芽糖、甘露醇、纤维二塘、蔗糖、棉子糖和山梨醇。
5.权利要求 1 所述的开菲尔乳杆菌KL22的应用，其特征在于：该开菲尔酸奶乳杆菌应用于制备功能性乳制品和益生菌菌粉。
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Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106858606A (zh) * 2016-12-28 2017-06-20 石家庄君乐宝乳业有限公司 具有抗氧化功能的益生菌粉及其制备方法
ITUB20160708A1 (it) * 2016-02-12 2017-08-12 Probiotical Spa Uso di ceppi di batteri appartenenti alla specie Lactobacillus kefiri in pediatria per generare e/o mantenere lo stato di omeostasi.
CN107058161A (zh) * 2016-12-29 2017-08-18 石家庄君乐宝乳业有限公司 具有抗氧化功能的高加索酸奶乳杆菌jmcc0101、其筛选方法及应用
WO2017137920A3 (en) * 2016-02-12 2017-10-26 Probiotical S.P.A. Use of bacterial strains belonging to the species lactobacillus kefiri in paediatrics to generate and/or maintain a state of homeostasis
CN107927168A (zh) * 2017-12-17 2018-04-20 石家庄君乐宝乳业有限公司 一种含有开菲尔乳杆菌的发酵乳及其制备方法
CN109266584A (zh) * 2018-10-18 2019-01-25 扬州大学 一株具有肥大细胞活性调节作用的纤毛型鼠李糖乳杆菌及其用途
CN110106113A (zh) * 2019-05-10 2019-08-09 深圳大学 一株高加索酸奶乳杆菌msr101及其应用
CN110141584A (zh) * 2019-05-21 2019-08-20 黑龙江大学 一种开菲尔乳杆菌m11在抑菌及作为治疗ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的应用
CN110141583A (zh) * 2019-05-21 2019-08-20 黑龙江大学 一种开菲尔乳杆菌m3在抑菌及作为治疗ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的应用
CN110317757A (zh) * 2019-07-16 2019-10-11 自然资源部第三海洋研究所 一株具降胆固醇及富硒作用的植物乳杆菌hj-s2及其应用
IT201800005359A1 (it) * 2018-05-14 2019-11-14 Ceppo probiotico Lactobacillus kefiri SGL 13 e suo uso per la prevenzione e il trattamento delle infiammazioni intestinali e nella prevenzione delle neoplasie intestinali
CN111500750A (zh) * 2020-04-07 2020-08-07 湖南师范大学 从湖羊乳中定向筛选益生菌菌种的方法
CN113355271A (zh) * 2021-08-10 2021-09-07 中国农业大学 提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法及其应用
CN114606157A (zh) * 2022-03-01 2022-06-10 武汉工控工业技术研究院有限公司 双歧杆菌微生物制剂及其在开菲尔乳酒制备中的应用
CN116536186A (zh) * 2022-08-22 2023-08-04 扬州大学 一种可发酵大豆低聚糖的短乳杆菌及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘倩: "开菲尔粒中一株高加索酸奶乳杆菌的分离及鉴定", 《黑龙江医药》 *
张丽霞: "国外开菲尔粒中乳酸菌的分离纯化与鉴定研究", 《江西农业学报》 *
阳大海: "开菲尔粒中优势菌的筛选及鉴定", 《安徽农业科学》 *

Cited By (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITUB20160708A1 (it) * 2016-02-12 2017-08-12 Probiotical Spa Uso di ceppi di batteri appartenenti alla specie Lactobacillus kefiri in pediatria per generare e/o mantenere lo stato di omeostasi.
WO2017137920A3 (en) * 2016-02-12 2017-10-26 Probiotical S.P.A. Use of bacterial strains belonging to the species lactobacillus kefiri in paediatrics to generate and/or maintain a state of homeostasis
CN108779433A (zh) * 2016-02-12 2018-11-09 波比奥泰克股份公司 属于开菲尔乳杆菌种的细菌菌株在用于产生和/或维持体内稳态状态的儿科学中的应用
CN106858606A (zh) * 2016-12-28 2017-06-20 石家庄君乐宝乳业有限公司 具有抗氧化功能的益生菌粉及其制备方法
CN107058161A (zh) * 2016-12-29 2017-08-18 石家庄君乐宝乳业有限公司 具有抗氧化功能的高加索酸奶乳杆菌jmcc0101、其筛选方法及应用
CN107058161B (zh) * 2016-12-29 2020-11-03 石家庄君乐宝乳业有限公司 具有抗氧化功能的高加索酸奶乳杆菌jmcc0101、其筛选方法及应用
CN107927168A (zh) * 2017-12-17 2018-04-20 石家庄君乐宝乳业有限公司 一种含有开菲尔乳杆菌的发酵乳及其制备方法
CN107927168B (zh) * 2017-12-17 2021-03-26 石家庄君乐宝乳业有限公司 一种含有开菲尔乳杆菌的发酵乳及其制备方法
IT201800005359A1 (it) * 2018-05-14 2019-11-14 Ceppo probiotico Lactobacillus kefiri SGL 13 e suo uso per la prevenzione e il trattamento delle infiammazioni intestinali e nella prevenzione delle neoplasie intestinali
WO2019220329A1 (en) * 2018-05-14 2019-11-21 Sintal Dietetics S.R.L. Probiotic strain lactobacillus kefiri sgl 13 and use thereof for the prevention and treatment of intestinal inflammation and in the prevention of intestinal neoplasms
CN109266584A (zh) * 2018-10-18 2019-01-25 扬州大学 一株具有肥大细胞活性调节作用的纤毛型鼠李糖乳杆菌及其用途
CN109266584B (zh) * 2018-10-18 2020-09-08 扬州大学 一株具有肥大细胞活性调节作用的纤毛型鼠李糖乳杆菌及其用途
CN110106113A (zh) * 2019-05-10 2019-08-09 深圳大学 一株高加索酸奶乳杆菌msr101及其应用
US11786568B2 (en) * 2019-05-10 2023-10-17 Shenzhen University Strain of caucasus yoghurt lactobacillus MSR101 and use thereof
US20220056401A1 (en) * 2019-05-10 2022-02-24 Shezhen University Strain of caucasus yoghurt lactobacillus msr101 and use thereof
CN110141584A (zh) * 2019-05-21 2019-08-20 黑龙江大学 一种开菲尔乳杆菌m11在抑菌及作为治疗ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的应用
CN110141583B (zh) * 2019-05-21 2022-12-20 黑龙江大学 一种开菲尔乳杆菌m3在抑菌及作为治疗ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的应用
CN110141584B (zh) * 2019-05-21 2022-12-20 黑龙江大学 一种开菲尔乳杆菌m11在抑菌及作为治疗ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的应用
CN110141583A (zh) * 2019-05-21 2019-08-20 黑龙江大学 一种开菲尔乳杆菌m3在抑菌及作为治疗ⅱ型糖尿病药剂的活性成分的应用
CN110317757A (zh) * 2019-07-16 2019-10-11 自然资源部第三海洋研究所 一株具降胆固醇及富硒作用的植物乳杆菌hj-s2及其应用
CN111500750A (zh) * 2020-04-07 2020-08-07 湖南师范大学 从湖羊乳中定向筛选益生菌菌种的方法
CN113355271A (zh) * 2021-08-10 2021-09-07 中国农业大学 提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法及其应用
CN113355271B (zh) * 2021-08-10 2021-11-09 中国农业大学 提高乳酸菌酸胁迫抗性的方法及其应用
CN114606157A (zh) * 2022-03-01 2022-06-10 武汉工控工业技术研究院有限公司 双歧杆菌微生物制剂及其在开菲尔乳酒制备中的应用
CN114606157B (zh) * 2022-03-01 2023-07-14 湖北省微工生物技术研究有限公司 双歧杆菌微生物制剂及其在开菲尔乳酒制备中的应用
CN116536186A (zh) * 2022-08-22 2023-08-04 扬州大学 一种可发酵大豆低聚糖的短乳杆菌及其应用
CN116536186B (zh) * 2022-08-22 2023-12-12 扬州大学 一种可发酵大豆低聚糖的短乳杆菌及其应用

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