CN104558121A - 一种虎纹蛙抗菌肽及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种虎纹蛙抗菌肽及其编码基因与应用，该虎纹蛙抗菌肽的序列如SEQ？ID？NO：2所示，其编码基因SEQ？ID？NO：1所示；该虎纹蛙抗菌肽及其编码基因可用于制备病原微生物感染疾病的治疗药物。本发明虎纹蛙抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广、抗菌活性强的特点。

Description

一种虎纹蛙抗菌肽及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种虎纹蛙抗菌肽及其编码基因与应用。

背景技术

近年来，随着传统抗生素抗药性的产生，人们开始日益关注抗菌肽的研究。抗菌肽是具有抗菌活性的一类短肽，广泛存在于生物界，是先天免疫的重要防御物质，具有广谱抗菌、抗病毒、抗真菌、抗寄生虫及抗肿瘤等生物活性，且不易产生耐药性，作用机制具有抗生素无法比拟的优越性，能够杀灭已产生耐药性的细菌，并能选择性杀伤肿瘤细胞而不破坏正常细胞。两栖类动物的皮肤在自然进化过程中形成了抵御病原微生物感染的三套防御***，而皮肤抗菌肽是其先天性免疫***的重要组成部分。两栖类作为一类古老的生物，它们的后天获得性免疫***与哺乳动物相比极为脆弱，它们在长期的进化历程中演化形成了一套非常有效的抵御微生物侵袭的防御***，其中蛙皮抗菌肽是其先天防御***的主要成分，具有高效、广谱、不易产生耐药性等特点。

经研究发现，抗菌肽对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色链球菌、大肠杆菌、粪链球菌、绿脓杆菌变形杆菌、草绿色链球菌、乙型溶血链球菌等40多个属均有抑制效果，部分抗菌肽对真菌有杀伤或杀灭作用。来源于非洲爪蟾的抗菌肽magainin以及来源于中国大蹼铃蟾的抗菌肽maximin在微摩尔浓度水平就对肿瘤细胞显示不同程度的杀伤作用。来源于日本马氏蟹血淋巴的抗polyphemusins和tachyplesin，在浓度5μg/mL时就对艾滋病病毒显示出一定的抑制作用。来源于中国大蹼铃蟾皮肤的抗菌maximin 3在浓度为1.5μg/mL时对抗艾滋病病毒的选择系数为7.6。这是首次报道的两栖类动物来源的抗艾滋病病毒抗菌肽。另外，从南美叶泡蛙皮肤得到的抗菌肽dermaseptin对疤疹病毒也显示强烈的抑制作用。来源于蜜蜂的蜂毒肽melitin具有强烈的红细胞溶解活性；来源于两栖类动物的抗菌肽，如中国大蹼铃蟾的抗菌肽maximin H和东方铃蟾的抗菌肽bombinH也显示了强烈的红细胞溶解活性。maximinH在50μg/m L时就可以导致兔红细胞100％的溶解。从两栖类动物Pseudisparadoxa得到的抗菌肽pseudin对控制蝌蚪尾部形态变化的细胞凋亡具有调节作用。Pseudin在结构上与一种细胞凋亡因子DEFY的一段区域显示出很高的相似性。

利用虎纹蛙资源进行虎纹蛙抗菌肽基因的cDNA克隆、序列分析的研究，如果能从虎纹蛙皮肤中获得具有重要价值的生物活性物质，必将拓宽虎纹蛙的开发、利用新途径，具有重要的现实意义，同时唤起人们对两栖类皮肤生物活性肽，尤其是我国特色物种的特殊分子多样性的关注，及重视它们在生物学、生物医学基础研究和天然药物开发中的意义。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种虎纹蛙抗菌肽。

本发明的之一目的在于提供上述虎纹蛙抗菌肽的编码基因。

本发明的之一目的提供上述虎纹蛙抗菌肽在做为制备病原微生物感染疾病的治疗药物方面的应用。

本发明的另一目的在于提供虎纹蛙抗菌肽的编码基因在治疗病原微生物感染疾病方面的应用。

本发明是这样实现的，一种虎纹蛙抗菌肽，其序列如SEQ ID NO：2所示。其中，本发明中的虎纹蛙抗菌肽(Frog1-蛋白)是中国两栖类动物虎纹蛙基因编码的一种单链多肽，分子量1367.673Da，等电点6.04。

本发明进一步提供了上述虎纹蛙抗菌肽的编码基因，其序列如SEQ ID NO：1所示。该编码基因的全氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其中，所述虎纹蛙抗菌肽为该编码基因的第177～213位核苷酸。

本发明进一步提供了上述虎纹蛙抗菌肽在做为制备病原微生物感染疾病的治疗药物方面的应用，以及虎纹蛙抗菌肽的编码基因在治疗病原微生物感染疾病方面的应用。

本发明克服现有技术的不足，提供一种虎纹蛙抗菌肽及其编码基因与应用，通过对虎纹蛙抗菌肽总RNA提取、RNA浓度测定、RNA反转录、引物设计及PCR扩增筛选虎纹蛙抗菌肽、RACE扩增虎纹蛙抗菌肽基因3’端和5’端的引物设计等，获得虎纹蛙抗菌肽基因极其编码的虎纹蛙抗菌肽。其中，虎纹蛙抗菌肽基因扩增引物为：

CaSPI-F：5’-ATGTTCACCATGAAGAAATCCCT-3’，

CaSPI-R：5’-ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3’。

所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定，虎纹蛙抗菌肽编码基因如SEQID NO：1所示，虎纹蛙抗菌肽如SEQ ID NO：2所示，虎纹蛙抗菌肽是一种单链多肽，分子量1367.673Da，等电点6.04。虎纹蛙抗菌肽编码基因的全氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其中，所述虎纹蛙抗菌肽为该编码基因的第177～213位核苷酸。

虎纹蛙抗菌肽基因作为基因工程制备虎纹蛙抗菌肽的应用。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明由虎纹蛙抗菌肽编码基因利用生物信息学方法推导其成熟抗菌肽氨基酸一级序列，人工合成的虎纹蛙抗菌肽具有显著的抗菌作用；本发明虎纹蛙抗菌肽具有结构简单、人工合成方便、抗菌谱系广、抗菌活性强的特点。

附图说明

图1是本发明实施例中3’RACE PCR扩增产物鉴定电泳图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1虎纹蛙抗菌肽基因的克隆

1、虎纹蛙皮肤黏液总RNA提取

提取所用离心管、枪头、枪盒等均经0.1％DEPC水浸泡过夜并高压灭菌处理，所用研钵、玻璃匀浆器、镊子及剪刀均经180℃高温处理2.5h。

具体操作步骤为：

取虎纹蛙皮肤黏液样品约100mg加入液氮研磨成粉末，倒入玻璃匀浆器中

↓加入1ml Trizol Reagent进一步研磨样品

将匀浆样品转移至1.5mlEP管(DEPC管)15～30℃放置5min

↓加入200μl氯仿，剧烈振荡3min，4℃，12000×g离心15min

吸取上清至新离心管并加入与上清等体积的异丙醇，室温静置10min

↓4℃，12000×g离心10min

弃上清并加入1ml 75％的乙醇清洗沉淀

↓4℃，7500×g离心10min

弃上清，室温放置干燥，加DEPC水20～50μl溶解，-70℃保存备用。

2、RNA浓度测定：

取1μl上述溶于DEPC水的总RNA置于Nanodrop 2000c测定RNA浓度。根据所测RNA浓度调整反转录时所加RNA模板用量为1μg。

3、RNA反转录：

按照如下配制cDNA合成反应体系并进行反转录反应。

反应条件：

42℃1h

↓

70℃15min

反应结束后将反应液保存于－20℃用于PCR扩增。

4、引物设计及PCR扩增条件：

根据GenBanK中已公布的蛙类等同源物种编码区保守序列和氨基末端测序结果，利用Premier 5.0软件设计上下游引物。

KFB-F：TGTAGGTGCCAAGGGTAG

KFB-R：TGAACAGGTCCACAGAGC

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

以抗菌肽cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增体系如下表：

5、琼脂糖凝胶电泳：

根据分离DNA片段大小，用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶，微波炉中加热融化冷却至50℃左右时加入EB至终浓度为0.5μg/ml，充分混匀后将凝胶倒入微型电泳槽的制胶板上，冷却凝固后，将凝胶放入电泳槽中。取适当量的样品与6×电泳上样缓冲液混合，上样时使用一定大小的DNA Marker。电泳缓冲液为1×TAE，电压选择为120V，待溴酚蓝标示带移至凝胶2/3位置时停止电泳，紫外透射仪下观察。

6、DNA凝胶纯化：

使用上海生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目的片段，具体步骤如下：

(1)琼脂糖凝胶电泳检测并迅速割胶回收目的条带至1.5ml离心管。

(2)加入胶块重量3倍的Buffer B2，50℃水浴5～10min溶胶。

(3)将溶胶液移入吸附柱中，8000×g离心30s，倒掉收集管中液体。

(4)加入500μl Wash Solution，9000×g离心30s，倒掉收集管中液体。

(5)重复步骤(4)一次。

(6)空吸附柱于9000×g离心1min。

(7)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入15～4lμElution Buffer，室温静置1min后，离心1min。保存管中DNA溶液于-20℃备用。

7、连接反应：

按下述条件在0.5ml离心管中建立连接反应体系并16℃反应4h，连接液用于转化。10μl连接反应体系如下：

8、大肠杆菌DH5α的感受态制备：

(1)用无菌铂丝直接醮取-80℃甘油中保存的E.coli BL21菌液，在LB平板表面划线，37℃倒置培养过夜；

(2)从LB平板上挑取单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃，200rmp震荡培养过夜；

(3)取100μl过夜活化的菌液，接入5ml LB新鲜培养基中，200rpm 37℃振荡2.5h左右，至肉眼可见微微混浊。

(4)将培养液转入1.5ml离心管，冰浴10min，4℃4000rpm离心10min。

(5)弃上清，收集菌体，加预冷的1.0ml 0.1M CaCl2，轻悬，冰浴10min，4℃4000rpm离心10min。

(6)弃上清，加100μl 0.1M CaCl2(预冷)，轻悬，冰浴至少4h后可用，若想长期保存，加已灭菌甘油至终浓度15％，于-70℃保存。

9、连接产物转化：

(1)全量(10μl)加入至100μl感受态细胞中，冰中放置30min。

(2)42℃加热45s后，再在冰中放置1min。

(3)加入890μl LB液体培养基，37℃200rpm振荡培养60min。

(4)4000rpm离心1min，弃上清，留菌液，吹打悬浮。

(5)均匀涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB固体培养基平板上培养。

(6)37℃培养箱正面放置1h左右，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养过夜至形成肉眼可见单菌落。

(7)随机挑选若干单菌落接种于5ml含有相应抗生素的LB液体培养基中37℃，200rmp摇床培养4～6h用于菌液PCR鉴定。

10、菌液PCR鉴定：

以培养的菌液为模板，进行PCR扩增，反应体系如下表：

扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将鉴定正确的菌液送至上海桑尼生物公司进行DNA测序。

11、RACE扩增虎纹蛙皮肤黏液中抗菌肽基因3’端和5’端的引物设计：

根据获得的部分抗菌肽基因序列设计用于3′-RACE和5′-RACE的特异性内引物：

5’内引物：CaSPI-F(1)：GGGTCTTGATAGATGTCATAGCG

3’内引物：CaSPI-R(1)：CTTCAGCGTTGACTTCTCCA

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。此外，引物：

3’race outer primer(1)：5′-taccgtcgttccactagtgattt-3′

5’race outer primer(1)：5′-catggctacatgctgacagccta-3′

3’race inner primer(2)：5′-cgcggatcctccactagtgatttcactatagg-3′

5’race inner primer(2)：5′-cgcggatccacagcctactgatgatcagtcgatg-3’

分别来自于TaKaRa 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0和5′-Full RACE Kit。

12、3’RACE：

利用TaKaRa 3’-Full RACE Core Set Ver.2.0能够通过已知的cDNA序列，高灵敏度、高特异性地扩增cDNA的3’末端的全长序列。具体实验操作方法如下：

(1)反转录反应。反应体系及反应条件如下：

反应条件：

42℃1h

↓

70℃15min

反应结束后用于进行下一步实验。

(2)套式PCR反应

Outer PCR反应

使用TaKaRa LA Taq进行Outer PCR反应时的实验操作如下：

1)PCR反应结束后，取5～10μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR扩增产物。并进行Inner PCR反应。

2)Inner PCR反应。反应体系及反应条件如下：

(3)琼脂糖凝胶电泳

反应结束后，取5～10μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认3’RACEPCR扩增产物。

(4)测序分析

将PCR扩增的目的产物克隆至pMD-18T载体后再进行DNA测序(具体实验操作步骤与前述步骤6～10相同)。

13、5’RACE：

利用5′-Full RACE Kit扩增5’端DNA序列，包括以下具体步骤：

(1)磷酸化处理。

使用Alkaline Phosphatase(CIAP)对Total RNA中裸露的5′磷酸基团进行去磷酸反应。

1)按下列组份配制去磷酸反应液。

2)50℃反应1h。

3)向上述反应液中加入20μl的3M CH3COONa(pH5.2)，130μl的RNaseFree dH₂O后，充分混匀。

4)加入200μl的苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，充分混匀后13000×g室温离心5min，将上层水相转移至新的Microtube中。

5)加入200μl的氯仿，充分混匀后13000×g室温离心5min，将上层水相转移至新的Microtube中。

6)加入2μl的NA Carrier后均匀混合。

7)加入200μl的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10min。

8)13000×g 4℃离心20min，弃上清。

9)加入500μl的70％冷乙醇(RNase Free dH₂O配制)漂洗，13000×g 4℃离心5min，弃上清后干燥。

10)加入7μl的RNase Free dH₂O溶解沉淀，得到CIAP-treated RNA。

(2)“去帽子”反应。

使用Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)去掉mRNA的5’帽子结构，保留一个磷酸基团。

1)按下列组份配制“去帽子”反应液。

2)37℃反应1小时。

3)此反应液为CIAP/TAP-treated RNA。取5μl用于5’RACE Adaptor连接反应，剩余的5μl保存于-80℃。

(3)5’RACE Adaptor的连接。

1)首先配制下列溶液

2)65℃保温5分钟后冰上放置2分钟，然后加入下列试剂

3)16℃反应1h。

4)向上述反应液中加入20μl的3M CH₃COONa(pH5.2)，140μl的RNaseFree dH₂O后，充分混匀。

5)加入200μl的苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，充分混匀后13000×g室温离心5min，将上层水相转移至新的Microtube中。

6)加入200μl的氯仿，充分混匀后13000×g室温离心5min，将上层水相转移至新的Microtube中。

7)加入2μl的NA Carrier后均匀混合。

8)加入200μl的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10min。

9)13000×g 4℃离心20min，弃上清。加入500μl的70％冷乙醇(RNase FreedH₂O配制)漂洗，13000×g 4℃离心5min，弃上清后干燥。

10)加入6μl的RNase Free dH₂O溶解沉淀，得到Ligated RNA。

(4)反转录反应。

1)按下列组份配制反转录反应液。

2)反转录反应条件如下：

30℃10min

↓

42℃1h

↓

70℃15min

3)反应结束后可以进行下一步实验。

(5)Outer PCR反应

(6)Inner PCR反应

(7)琼脂糖凝胶电泳

反应结束后，取5～10μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，图1中，M为DL2000核酸分子量标准，l和2均为扩增产物。从图1中可以确认3’RACE PCR扩增产物。

(8)测序分析

将PCR扩增的目的产物克隆至pMD-18T载体后再进行DNA测序(具体实验操作步骤与前述步骤6～10相同)。

14、虎纹蛙抗菌肽基因序列测定和结果：

提取质粒DNA用双脱氧法测定核苷酸序列，使用仪器为Appliedbiosystems373A全自动核苷酸序列测定仪。基因测定的结果如SEQ ID NO:1所示，利用生物信息学方法推导人工合成，及抗菌实验验证(如实施例2)的虎纹蛙抗菌肽编码蛋白如SEQ ID NO:2所示。虎纹蛙抗菌肽基因核苷酸的序列表现为：序列长度为331个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：虎纹蛙皮肤黏液。编码虎纹蛙抗菌肽成熟序列的为虎纹蛙抗菌肽基因177～213位核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，该虎纹蛙抗菌肽基因作为基因工程制备虎纹蛙抗菌肽的应用。

实施例2虎纹蛙抗菌肽(CaSPI)抗菌活性检测及最小抑菌浓度确定

试验菌株：大肠杆菌Escherichia coli，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，枯草芽孢杆菌Bacillus dysenteriae，以上菌种均有实验室保存。抗菌试验用虎纹蛙抗菌肽样品按R V C A S F P L P I C Y序列合成，样品合成后按2mg/mL浓度，用0.1M磷酸氢钠盐缓冲溶液(PH 6.0)配制成溶液，置-20℃冰箱备用。

取过夜培养的菌液100μL均匀涂布于LB固态培养基表面，在培养基表面十字形放入0.5cm直径的灭过菌的滤纸片，每个滤纸片上分别加入20μL合成的虎纹蛙抗菌肽样品，用等量用0.1M磷酸氢钠盐缓冲溶液(PH 6.0)做对照。然后，37℃倒置培养20小时，观察是否有抑菌圈形成。有抑菌圈形成的表明有抗菌活性，进一步进行最小抑菌浓度的测定。

测定最小抑菌浓度时，按标准的抗菌检测方法，以LB液体培养基作为培养介质。挑取适量活化后的菌种于LB液体培养基中，37℃培养20小时。取一定量的LB液体培养基，再加入一定量的经0.22cm孔径膜过滤的溶解于0.1M磷酸氢钠盐缓冲溶液(PH 6.0)的样品，按照二倍稀释法稀释成一系列浓度梯度，37℃培养20小时，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。样品蛋白浓度采用以下公式进行计算：

Protein concentration(mg/mL)＝(A215nm-A225nm)(0.144。

抑菌体系建立如下，在1.9mL培养基中加入经0.22cm孔径膜过滤的溶解于0.1M磷酸氢钠盐缓冲溶液(PH 6.0)的样品，0.1mL作为第一管，混匀后取1mL加入第2管，依次倍比稀释，自第8管吸出1mL弃去，第9管系对照管，如下表所示：

将各管中加入已校正的菌液(105cfu/mL)0.05mL，混匀后放置37℃培养18h，于600nm波长处测定光吸收。最小抑菌浓度为看不见细菌生长的最低样品浓度。样品蛋白浓度采用以下公式进行计算：

Protein concentration(mg/mL)＝(A215nm-A225nm)(0.144。

抗菌检测结果表明，合成的虎纹蛙抗菌肽CaSPI对试验菌株均具有抗菌活性，CaSPI对大肠杆菌的抑制弱于枯草芽孢杆菌，强于金黄色葡萄球菌。

虎纹蛙抗菌肽CaSPI的最小抑菌浓度结果如下表所示：

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种虎纹蛙抗菌肽，其特征在于，其序列如SEQ ID NO：2所示。

2.权利要求1所述的虎纹蛙抗菌肽的编码基因，其特征在于，其序列如SEQ ID NO：1所示。

3.权利要求1所述的虎纹蛙抗菌肽在做为制备病原微生物感染疾病的治疗药物方面的应用。

4.权利要求2所述的虎纹蛙抗菌肽的编码基因在治疗病原微生物感染疾病方面的应用。