CN104531639A - 一种抑菌的几丁质酶解方法 - Google Patents
一种抑菌的几丁质酶解方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104531639A CN104531639A CN201410785605.6A CN201410785605A CN104531639A CN 104531639 A CN104531639 A CN 104531639A CN 201410785605 A CN201410785605 A CN 201410785605A CN 104531639 A CN104531639 A CN 104531639A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- chitin
- chitinase
- enzyme solution
- solution according
- enzymolysis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 title claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 22
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 title abstract 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims abstract description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 10
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 55
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 36
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 14
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 claims description 14
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 12
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 8
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 7
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims description 6
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims description 6
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 claims description 6
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 claims description 6
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims description 6
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 claims description 6
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims description 6
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 6
- 229940059442 hemicellulase Drugs 0.000 claims description 6
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 claims description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 241000030294 Chitinolyticbacter Species 0.000 claims description 3
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical compound C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 abstract description 26
- 239000011347 resin Substances 0.000 abstract description 9
- 229920005989 resin Polymers 0.000 abstract description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 5
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 abstract description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 abstract 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 abstract 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 abstract 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000002051 biphasic effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 abstract 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 12
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 10
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 10
- 238000011169 microbiological contamination Methods 0.000 description 8
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 6
- 239000004160 Ammonium persulphate Substances 0.000 description 5
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 5
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 5
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 235000019395 ammonium persulphate Nutrition 0.000 description 5
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 5
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- BLSQLHNBWJLIBQ-OZXSUGGESA-N (2R,4S)-terconazole Chemical compound C1CN(C(C)C)CCN1C(C=C1)=CC=C1OC[C@@H]1O[C@@](CN2N=CN=C2)(C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)OC1 BLSQLHNBWJLIBQ-OZXSUGGESA-N 0.000 description 4
- 229940089256 fungistat Drugs 0.000 description 4
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001408 fungistatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
一种抑菌的几丁质酶解方法，包括以下步骤：步骤1，微生物发酵产几丁质酶。以产几丁质酶微生物为供试菌，发酵生产几丁质酶，发酵结束后，获得几丁质酶粗酶液，经提纯、透析、浓缩后获得几丁质降解酶；步骤2，酶解几丁质。将几丁质降解酶置于反应釜内，依次加入几丁质粉末、金属离子激活剂、辅助酶制剂和有机试剂，恒温加热并搅拌，待几丁质粉末完全被降解得酶解液；步骤3，产品的回收。离心酶解液，得双相体系，其中上层体系为有机系，下层为水系，用吸附树脂吸附、洗脱，收集洗脱液经处理后获得产品。本发明原料可实现重复利用，转化过程无菌，降低能耗的同时获得高产率，且降解产物生物活性良好，具有显著的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种抑菌的几丁质酶解方法。
背景技术
糖工业是食品行业的基础工业，也是化工、发酵、医药等产品的原料工业。资料显示2012至2013年度，我国糖产量达1306.8万吨，其中作为食品生物技术领域的朝阳产业，功能糖及其衍生物产业在近几年发展迅猛。几丁质作为一种自然界含量仅次于纤维素的多糖，其降解产物及其衍生物在食品、医药、环保、农业、日化等众多领域内应用广泛，已经形成了巨大的市场需求。但是目前几丁质降解产物及其衍生物的生产多为化学法。反应过程需要用到强酸强碱，过程难以控制，且对环境造成极大的污染。
酶法降解几丁质制备氨基葡萄糖具有生产条件温和可控，对环境友好的优点，是目前的研究热点。但是，几丁质降解产物既可以作为菌体利用的碳源，又可作为氮源。转化过程难以控制，极易染菌。在发酵过程中染菌，会使发酵产物N-乙酰氨基葡萄糖/几丁寡糖被所染杂菌迅速消耗，增加产物的分离提取难度，影响产品质量水平。
目前工业应用上常用的防止染菌措施主要利用紫外灭菌器，超声波灭菌器，高压灭菌器等，例如中国专利一种防止糖醇生产物料染菌的新方法（申请号：CN200910256591.8）中利用反应体系内密闭联接紫外灭菌器或超声波灭菌器，对料液进行灭菌，达到无染效果。中国专利一种降低染菌概率的连续发酵扩培装置（CN201220624316.4）中利用蒸汽湿热灭菌达到抑菌效果，并通过合并管道减少开口数量，并减少阀门数量，降低连续发酵扩培过程的染菌概率。尽管上述技术比较成熟，但是存在着设备昂贵，操作危险的缺点，限制了生物制糖业的发展。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抑菌的几丁质酶解方法，操作简单，对酶解的副作用小，且产物易分离。
为解决现有技术问题，本发明采用的技术方案：
一种抑菌的几丁质酶解方法，包括以下步骤：
步骤1，微生物发酵产几丁质酶
以产几丁质酶微生物为供试菌，将供试菌接种到种子培养基上，在37℃，200rpm初始pH为6 ～ 8的条件下培养，得种子液，再将种子液接种到装有产酶发酵培养基的发酵罐中，在30℃，200 rpm，初始pH为6 ～ 8，通气量1vvm的条件下发酵，获得几丁质酶粗酶液，经提纯、透析、浓缩后获得几丁质降解酶；
步骤2，酶解几丁质
将几丁质降解酶置于反应釜内，依次加入几丁质粉末、金属离子激活剂、辅助酶制剂和有机试剂，恒温加热并搅拌，待几丁质粉末完全被降解，得酶解液；
步骤3，产品的回收
离心酶解液，得双相体系，其中上层体系为有机系，下层为水系，用吸附树脂吸附、洗脱，收集洗脱液经低温浓缩、醇洗、结晶、干燥后获得产品。
作为优选的是，步骤2，所述的金属离子激活剂为Mg2+、Mn2+、Ca2+、Na+、K+、Al3+、Fe2+、Fe3+、Zn2+或Cu2+金属盐中的一种或几种。
作为优选的是，步骤2，所述的金属离子激活剂的终浓度为5-25 mmol/L。
作为优选的是，步骤2，所述的辅助酶制剂包括按质量百分比计的纤维素酶2-60%、半纤维素酶1-15%、淀粉酶5-70%、果胶酶2-40%。
作为优选的是，步骤2，所述的辅助酶制剂占反应体系总质量的0.1-0.3%。
作为优选的是，所述的有机试剂为丙酮、***、正己烷、环己烷、二氯甲烷或石油醚中的一种或多种。
作为优选的是，步骤2，恒温加热的温度为20-37℃，搅拌速度为50-200 rpm。
作为优选的是，所述有机试剂占总体系的体积分数为10-70%。
作为优选的是，所述微生物为Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1或Chitinibactersp.GC72。
有益效果
（1）通过向几丁质酶解体系中加入几丁质酶激活剂和辅助酶制剂，可使酶解效率提高30%左右。
（2）采用向转化体系中加入有机试剂，可有效地防止染菌，降低了安全隐患。提高酶解速度，加快反应进程，缩短12 h反应周期。
（3）有机试剂在酶解结束后，经简单的离心操作及回收，可实现重复利用，避免了对环境的污染，减小了生产成本，具有推广价值。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
步骤1，微生物发酵产几丁质酶
以Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1菌株为几丁质酶生产菌株，种子培养基为（2 g/L葡萄糖，2 g/L蛋白胨，0.7 g/L KH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O，0.4 g/L MgSO4·7H2O， pH 7.0），37℃、200 rpm培养12 h。将种子液以体积分数8%的接种量，接入7.5 L装有产酶发酵培养基的发酵罐，装液量4 L，产酶培养基为（3 g/L粉粒几丁质，3 g/L葡萄糖，3 g/L牛肉浸膏，0.7 g/L KH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O，0.5 g/L MgSO4·7H2O）培养温度30℃，转速为200 rpm，通气量1 vvm，初始pH 7.5，72 h后结束发酵。
将发酵液8000g离心，丢弃菌体，收集上清液后经过硫酸铵沉淀、复溶。将几丁质粗酶液装入透析袋（截留分子量8000 KDa）中，以蒸馏水为透析液，每隔6 h更换一次透析液， 4℃条件下透析24 h后浓缩酶液，浓缩后获得几丁质降解酶。
步骤2，酶解几丁质
向1 L反应釜中加入几丁质降解酶90 U，终浓度为30 g/L的几丁质粉末，并依次加入CaCl2 溶液10mM，辅助酶制剂占反应体系总质量的0.1% ，其中，辅助酶制剂由以下按质量分数计的物质：纤维素酶30%、半纤维素酶10%、淀粉酶20%、果胶酶40%组成。再加入占总体系体积分数40%的正己烷作为抑菌剂，在37℃恒温条件下200 rpm搅拌转化84 h，得酶解液。
步骤3，产品的回收
将酶解液3000g离心处理后，上层有机系用正己烷回收，回收率可达95%。去除底部酶解残渣后下层水系采用吸附树脂吸附的方法吸附所需N-乙酰氨基葡萄糖，经低温浓缩、醇洗、结晶、干燥后获得产品。其中，树脂吸附可采用强极性吸附树脂、弱极性吸附树脂，流速30-450 mL/h，紫外在线检测器210 nm波长检测流出液，采用梯度乙醇洗脱的方法洗脱吸附产物。经液相检测该法获得的N-乙酰氨基葡萄糖纯度高，84 h转化后收率可达95%。
实施例2
步骤1，微生物发酵产几丁质酶
以Chitinibactersp.GC72菌株为几丁质酶生产菌株，种子培养基为（4 g/L葡萄糖，4 g/L蛋白胨，0.7 g/L KH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O，0.4 g/L MgSO4·7H2O，pH 7.0），37℃、200 rpm培养12 h，将种子液以体积分数6%接种量接入装有产酶发酵培养基的7.5 L发酵罐，装液量4 L，产酶培养基为（4 g/L粉粒几丁质，2 g/L葡萄糖，4 g/L牛肉浸膏，0.7 g/L KH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O，0.5 g/L MgSO4·7H2O）培养温度30℃，转速为200 rpm，通气量1 vvm，初始pH 7.5，72 h结束发酵收集发酵液。
将发酵液8000g离心，丢弃菌体，收集上清液后经过硫酸铵沉淀、复溶。将几丁质粗酶液装入透析袋（截留分子量8000 KDa）中，以蒸馏水为透析液，每隔6 h更换一次透析液， 4℃条件下透析24 h后浓缩酶液，浓缩后获得几丁质降解酶。
步骤2，酶解几丁质
向1 L反应釜中加入几丁质降解酶90 U，终浓度为30 g/L的几丁质粉末，向反应釜中加入MgSO4 溶液15mM，辅助酶制剂占反应体系总质量的0.2% ，其中，辅助酶制剂由以下按质量分数计的物质：含纤维素酶30%、半纤维素酶10%，淀粉酶20%、果胶酶40%组成。再加入占总体系体积分数60%的正己烷作为抑菌剂，在37℃恒温条件下200 rpm搅拌转化84 h，得酶解液。
步骤3，产品的回收
将酶解液3000g离心处理后，上层有机系用正己烷回收，回收率可达95%。去除底部酶解残渣后下层水系采用吸附树脂吸附的方法吸附所需N-乙酰氨基葡萄糖，经低温浓缩、醇洗、结晶、干燥后获得产品。其中，树脂吸附可采用强极性吸附树脂、弱极性吸附树脂，流速30-450 mL/h，紫外在线检测器210 nm波长检测流出液，采用梯度乙醇洗脱的方法洗脱吸附产物。经液相检测该法获得的N-乙酰氨基葡萄糖纯度高，24 h转化后收率可达40%，84 h转化后收率可达90%。
实施例3
步骤1，微生物发酵产几丁质酶
以Chitinibactersp.GC72菌株为几丁质酶生产菌株，种子培养基为（4 g/L葡萄糖，4 g/L蛋白胨，0.7 g/L KH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O，0.4 g/L MgSO4·7H2O，pH 7.0），37℃、200 rpm培养12 h，将种子液以体积分数6%接种量接入装有产酶发酵培养基的7.5 L发酵罐，装液量4 L，产酶培养基为（4 g/L粉粒几丁质，2 g/L葡萄糖，4 g/L牛肉浸膏，0.7 g/L KH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O，0.5 g/L MgSO4·7H2O）培养温度30℃，转速为200 rpm，通气量1 vvm，初始pH 7.5，72 h结束发酵收集发酵液。
将发酵液8000g离心，丢弃菌体，收集上清液后经过硫酸铵沉淀、复溶。将几丁质粗酶液装入透析袋（截留分子量8000 KDa）中，以蒸馏水为透析液，每隔6 h更换一次透析液， 4℃条件下透析24 h后浓缩酶液，浓缩后获得几丁质降解酶。
步骤2，酶解几丁质
向1 L反应釜中加入几丁质降解酶90 U，终浓度为30 g/L的几丁质粉末，加入向反应釜中加入MgSO4 溶液15mM，辅助酶制剂占反应体系总质量的0.3% ，其中，辅助酶制剂由以下按质量分数计的物质：纤维素酶10%、半纤维素酶40%，淀粉酶25%，果胶酶25%。再加入占总体系体积分数60%的正己烷作为抑菌剂，在37℃恒温条件下200 rpm搅拌转化84 h，得酶解液。
步骤3，产品的回收
将酶解液进行3000g离心处理后，上层有机系用正己烷回收，回收率可达95%。去除底部酶解残渣后下层水系采用吸附树脂吸附的方法吸附所需N-乙酰氨基葡萄糖，经低温浓缩、醇洗、结晶、干燥后获得产品。其中，树脂吸附可采用强极性吸附树脂、弱极性吸附树脂，流速30-450 mL/h，紫外在线检测器210 nm波长检测流出液，采用梯度乙醇洗脱的方法洗脱吸附产物。经液相检测该法获得的N-乙酰氨基葡萄糖纯度高，24 h转化后收率可达48%，96 h转化后收率可达99%。
对比例1
步骤1，微生物发酵产几丁质酶
以Chitinibactersp.GC72菌株为几丁质酶生产菌株，种子培养基为（4 g/L葡萄糖，4 g/L蛋白胨，0.7 g/L KH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O，0.4 g/L MgSO4·7H2O，pH 7.0），37℃、200 rpm培养12 h，将种子液以体积分数6%接种量接入装有产酶发酵培养基的7.5 L发酵罐，装液量4 L，产酶培养基为（4 g/L粉粒几丁质，2 g/L葡萄糖，4 g/L牛肉浸膏，0.7 g/L KH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O，0.5 g/L MgSO4·7H2O）培养温度30℃，转速为200 rpm，通气量1 vvm，初始pH 7.5，72 h结束发酵收集发酵液。
将发酵液8000g离心，丢弃菌体，收集上清液后经过硫酸铵沉淀、复溶。将几丁质粗酶液装入透析袋（截留分子量8000 KDa）中，以蒸馏水为透析液，每隔6 h更换一次透析液， 4℃条件下透析24 h后浓缩酶液，浓缩后获得几丁质降解酶。
步骤2，酶解几丁质
向1 L反应釜中加入几丁质降解酶90 U，终浓度为30 g/L的几丁质粉末，在37℃恒温条件下200 rpm搅拌转化84 h。
步骤3，产品的回收
将酶解液3000g离心处理后，经液相检测获得的N-乙酰氨基葡萄糖，24 h时转化后收率可达35%，由于体系染菌，96 h未检出N-乙酰氨基葡萄糖的存在。
对比例2
步骤1，微生物发酵产几丁质酶
以Chitinibactersp.GC72菌株为几丁质酶生产菌株，种子培养基为（4 g/L葡萄糖，4 g/L蛋白胨，0.7 g/L KH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O，0.4 g/L MgSO4·7H2O，pH 7.0），37℃、200 rpm培养12 h，将种子液以体积分数6%接种量接入装有产酶发酵培养基的7.5 L发酵罐，装液量4 L，产酶培养基为（4 g/L粉粒几丁质，2 g/L葡萄糖，4 g/L牛肉浸膏，0.7 g/L KH2PO4，0.3 g/L K2HPO4·3H2O ，0.5 g/L MgSO4·7H2O）培养温度30℃，转速为200 rpm，通气量1 vvm，初始pH 7.5，72 h结束发酵收集发酵液。
将发酵液8000g离心，丢弃菌体，收集上清液后经过硫酸铵沉淀、复溶。将几丁质粗酶液装入透析袋（截留分子量8000 KDa）中，以蒸馏水为透析液，每隔6 h更换一次透析液， 4℃条件下透析24 h后浓缩酶液，浓缩后获得几丁质降解酶。
步骤2，酶解几丁质
向1 L反应釜中加入几丁质降解酶90 U，终浓度为30 g/L的几丁质粉末，加入向反应釜中加入MgSO4 溶液15mM，辅助酶制剂占反应体系总质量的0.3%，其中，辅助酶制剂由以下按质量分数计的物质：含纤维素酶50%、半纤维素酶10%，淀粉酶10%，果胶酶30%组成。再加入体积分数60%的正己烷作为抑菌剂，在20℃条件下200 rpm搅拌转化84 h，得酶解液。
步骤3，产品的回收
将酶解液3000g离心处理后，上层有机系用正己烷回收，回收率可达95%。去除底部酶解残渣后下层水系采用吸附树脂吸附的方法吸附所需N-乙酰氨基葡萄糖，经低温浓缩、醇洗、结晶、干燥后获得产品。其中，树脂吸附可采用强极性吸附树脂、弱极性吸附树脂，流速30-450 mL/h，紫外在线检测器210 nm波长检测流出液，采用梯度乙醇洗脱的方法洗脱吸附产物。经液相检测该法获得的N-乙酰氨基葡萄糖纯度高，24 h转化后收率为28%，96 h转化后收率为71%。
通过上述实施例和对比例的结果可知，本发明抑菌材料可实现重复利用，转化过程无菌，降低能耗的同时获得高产率，其中，几丁质酶激活剂和辅助酶制剂的添加，可使酶解效率提高30%左右。有机试剂的应用可以抑制转化体系染菌，使96 h后的转化体系N-乙酰氨基葡萄糖的收率由0最高升至99%，且降解产物生物活性良好，具有显著的经济效益。
Claims (9)
1. 一种抑菌的几丁质酶解方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，微生物发酵产几丁质酶
以产几丁质酶微生物为供试菌，将供试菌接种到种子培养基上，在37℃，200 rpm，初始pH为6 ～ 8的条件下培养，得种子液，再将种子液接种到装有产酶发酵培养基的发酵罐中，在30℃，200 rpm，初始pH为6 ～ 8，通气量1vvm的条件下发酵，获得几丁质酶粗酶液，经提纯、透析、浓缩后获得几丁质降解酶；
步骤2，酶解几丁质
将几丁质降解酶置于反应釜内，依次加入几丁质粉末、金属离子激活剂、辅助酶制剂和有机试剂，恒温加热并搅拌，待几丁质粉末完全被降解，得酶解液；
步骤3，产品的回收
离心酶解液，得双相体系，其中上层体系为有机系，下层为水系，下层水系用吸附树脂吸附、洗脱，收集洗脱液经低温浓缩、醇洗、结晶、干燥后获得产品。
2. 根据权利要求1所述的抑菌的几丁质酶解方法，其特征在于：步骤2，所述的金属离子激活剂为Mg2+、Mn2+、Ca2+、Na+、K+、Al3+、Fe2+、Fe3+、Zn2+或Cu2+金属盐中的一种或几种。
3. 根据权利要求1所述的抑菌的几丁质酶解方法，其特征在于：步骤2，所述的金属离子激活剂的终浓度为5-25 mmol/L。
4. 根据权利要求1所述的抑菌的几丁质酶解方法，其特征在于：步骤2，所述的辅助酶制剂包括以下按质量百分比计的纤维素酶2-60%、半纤维素酶1-15%、淀粉酶5-70%、果胶酶2-40%。
5. 根据权利要求1所述的抑菌的几丁质酶解方法，其特征在于：步骤2，所述的辅助酶制剂占反应体系总质量的0.1-0.3%。
6. 根据权利要求1所述的抑菌的几丁质酶解方法，其特征在于：所述的有机试剂为丙酮、***、正己烷、环己烷、二氯甲烷或石油醚中的一种或多种。
7. 根据权利要求1所述的抑菌的几丁质酶解方法，其特征在于：步骤2，恒温加热的温度为20-37℃，搅拌速度为50-200 rpm。
8. 根据权利要求1所述的抑菌的几丁质酶解方法，其特征在于：所述有机试剂占总体系的体积分数为10-70%。
9. 根据权利要求1所述的抑菌的几丁质酶解方法，其特征在于：所述微生物为Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1或Chitinibactersp.GC72。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410785605.6A CN104531639B (zh) | 2014-12-18 | 2014-12-18 | 一种抑菌的几丁质酶解方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410785605.6A CN104531639B (zh) | 2014-12-18 | 2014-12-18 | 一种抑菌的几丁质酶解方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104531639A true CN104531639A (zh) | 2015-04-22 |
| CN104531639B CN104531639B (zh) | 2017-12-22 |
Family
ID=52847273
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410785605.6A Expired - Fee Related CN104531639B (zh) | 2014-12-18 | 2014-12-18 | 一种抑菌的几丁质酶解方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104531639B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105316377A (zh) * | 2015-11-13 | 2016-02-10 | 南京工业大学 | 一种产n-乙酰氨基葡萄糖的工艺 |
| CN108559765A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-09-21 | 南京工业大学 | 一种生物酶法从小龙虾壳中提取n-乙酰氨基葡萄糖与虾青素的方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101942401A (zh) * | 2009-12-31 | 2011-01-12 | 江南大学 | 一株产几丁质酶菌株及高产几丁质酶的方法 |
| CN103571810A (zh) * | 2012-08-07 | 2014-02-12 | 湖南鸿鹰生物科技有限公司 | 一种优化的发酵高产几丁质酶的方法 |
| CN104130961A (zh) * | 2014-07-25 | 2014-11-05 | 南京工业大学 | 一株产几丁质酶的菌株及其在酶解几丁质中的应用 |
-
2014
- 2014-12-18 CN CN201410785605.6A patent/CN104531639B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101942401A (zh) * | 2009-12-31 | 2011-01-12 | 江南大学 | 一株产几丁质酶菌株及高产几丁质酶的方法 |
| CN103571810A (zh) * | 2012-08-07 | 2014-02-12 | 湖南鸿鹰生物科技有限公司 | 一种优化的发酵高产几丁质酶的方法 |
| CN104130961A (zh) * | 2014-07-25 | 2014-11-05 | 南京工业大学 | 一株产几丁质酶的菌株及其在酶解几丁质中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 林建成 等: "有机溶剂及变性剂对南美白对虾体壁几丁质酶的影响", 《海洋通报》 * |
| 邱君志 等: "有机溶剂对蜡蚧茵几丁质酶的影响", 《激光生物学报》 * |
| 黄小红 等: "有机溶剂对苏云金芽孢杆菌几丁质酶的影响", 《应用与环境生物学报》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105316377A (zh) * | 2015-11-13 | 2016-02-10 | 南京工业大学 | 一种产n-乙酰氨基葡萄糖的工艺 |
| CN108559765A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-09-21 | 南京工业大学 | 一种生物酶法从小龙虾壳中提取n-乙酰氨基葡萄糖与虾青素的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104531639B (zh) | 2017-12-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108441528B (zh) | 一种高效产细菌纤维素的培养基 | |
| CN101870739B (zh) | 多粘类芽孢杆菌胞外多糖及其应用 | |
| CN104388496B (zh) | 一种酶法降解几丁质生产n‑乙酰氨基葡萄糖的方法 | |
| CN101831474B (zh) | 一种海藻糖的生产方法 | |
| CN102850410A (zh) | 一种从啤酒废酵母中提取海藻多糖的方法 | |
| CN104911135B (zh) | 一种海藻糖合酶生产菌株及其应用 | |
| CN107686854A (zh) | 利用裂褶菌发酵体系自产内切酶对裂褶多糖进行降解改性的方法 | |
| CN104651339B (zh) | 微泡菌属发酵生产褐藻胶裂解酶的培养基及其发酵方法 | |
| CN104531639B (zh) | 一种抑菌的几丁质酶解方法 | |
| CN111826308B (zh) | 一株海洋沉积物来源的几丁质高效降解菌及其应用 | |
| CN102703542B (zh) | 一种超声波场辅助微生物转化合成乳糖酸的方法 | |
| CN102653746A (zh) | 微生物发酵生产低温β-半乳糖苷酶的方法 | |
| CN104726515A (zh) | 一种富含岩藻糖的细菌胞外多糖的提取方法 | |
| CN104673767A (zh) | 一种阿魏酸酯酶的生产方法 | |
| CN102653749A (zh) | 微生物发酵生产低温壳聚糖酶的方法 | |
| CN104004699A (zh) | 一种全细胞催化产乳果糖的方法 | |
| CN103695407B (zh) | 一种提高栖热菌海藻糖合成酶含量的方法 | |
| CN106701638A (zh) | 一种蛭弧菌微生态制剂的发酵制备方法 | |
| CN104152510A (zh) | 一种利用胨冻样类芽孢杆菌发酵蔗糖生产多聚果糖的生产方法 | |
| CN110283808B (zh) | 一种褐藻胶裂解酶的培养方法 | |
| CN113186237B (zh) | 一种利用定向拆分的内切半乳聚糖酶生产***半乳低聚糖的方法 | |
| CN112674257A (zh) | 一种高降解黄曲霉毒素b1的生物方法 | |
| CN114369558B (zh) | 一株粘质沙雷氏菌及其在生产柚苷酶中的应用 | |
| CN113278546B (zh) | 一株高效产酶的枯草芽孢菌株lc1-1及其产酶方法和应用 | |
| CN103045486B (zh) | 再育镰刀菌zjb-09150及在生物合成烟酸中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20171222 Termination date: 20191218 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |